CN110878321A - 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体。本发明提供一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体，所述表达载体包括APOBEC1‑Cas9D10A融合蛋白表达元件和sgRNA表达元件，所述APOBEC1‑Cas9D10A融合蛋白表达元件包括第一启动子表达元件、APOBEC1表达元件和Cas9D10A表达元件，所述sgRNA表达元件包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。本发明提供了一种新的用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体，所述表达载体能够在肺炎克雷伯菌中高效简单地进行碱基编辑，包括碱基转变、基因失活等，还可以在不借助lambda‑Red重组系统和重组模板，仅需要一次电转化操作便可实现高效碱基编辑。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体。
背景技术
肺炎克雷伯菌是一种非常重要的革兰氏阴性人类病原细菌，能够引起一系列的社区和医院获得性感染，例如重症肺炎、细菌性肝脓肿、泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。肺炎克雷伯菌强大的感染和致病能力主要归因于两个方面。一方面，一些肺炎克雷伯菌株具有高毒力和高粘液质表型，可以分泌多种杀伤人体细胞的毒力物质，并且高粘液质还有助于细胞定植和形成生物膜等；另一方面，一些肺炎克雷伯菌株在进化过程中逐渐获得了对包括碳青霉烯类抗生素在内的多种抗生素的抵抗能力，其感染人体后很难找到有效的治疗药物。近几十年来，随着抗生素的广泛使用，各种耐药型肺炎克雷伯菌开始出现，目前肺炎克雷伯菌已经成为临床上仅次于大肠埃希菌的第二大条件致病菌。因此，迫切需要开发针对耐药型肺炎克雷伯菌的新型治疗方法。
近年来，以CRISPR-Cas9系统为代表的基因组编辑技术在多种物种中得到了广泛使用。 CRISPR-Cas9系统最初来源于细菌和古生菌的免疫系统，是微生物对抗外源核酸和噬菌体入侵的一种主动防御手段。目前广泛使用的CRISPR-Cas9系统由一种核酸内切酶Cas9和一种小引导RNA(sgRNA)两部分组成。Cas9核酸内切酶能够与sgRNA结合，通过sgRNA的5’端的20bp spacer序列与基因组DNA碱基互补配对识别靶向基因，并在特点位点处切割基因组DNA，造成DNA双链断裂。在重组系统的协助下，细胞可以利用外源重组模板对断裂的双链DNA进行定向修复，达到基因组编辑的目的。目前，我们课题组通过导入lambda-Red 重组系统，成功在肺炎克雷伯菌中开发了CRISPR-Cas9系统。
用于修复断裂双链DNA的lambda-Red重组系统必须先于CRISPR-Cas9系统表达。为了在肺炎克雷伯菌中应用CRISPR-Cas9系统，我们课题组构建了pCasKP/pSGKP双质粒系统。该系统为了实现基因组编辑功能，必须进行两次电转化遗传操作，分别将pCasKP和pSGKP质粒依次导入到肺炎克雷伯菌中。此外，CRISPR-Cas9系统虽然对肺炎克雷伯菌染色体DNA具有很高的编辑效率，但是对质粒DNA的编辑效果很差。与染色体DNA双链断裂后会造成致死性损伤不同，质粒DNA双链断裂后不会造成致死性损伤，从而失去筛选压力。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体，所述表达载体包括APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件和sgRNA表达元件，所述APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件包括第一启动子表达元件、APOBEC1表达元件和Cas9D10A表达元件，所述APOBEC1表达元件的序列如SEQ ID NO.63所示，所述Cas9D10A 表达元件的序列如SEQ ID NO.65所示，所述sgRNA表达元件包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件，所述sgRNA框架元件的序列如SEQ ID NO.60所示。
在本发明一些实施方式中，APOBEC1表达元件和Cas9D10A表达元件之间还设有linker 表达元件，所述linker表达元件的序列如SEQ ID NO.64所示；
在本发明一些实施方式中，所述第一启动子表达元件的序列如SEQ ID NO.62所示。
在本发明一些实施方式中，所述APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件自5’端至3’端依次包括第一启动子表达元件、APOBEC1表达元件、linker表达元件和Cas9D10A表达元件。
在本发明一些实施方式中，所述多克隆位点包括一个或多个BsaI酶切位点。
在本发明一些实施方式中，所述第二启动子表达元件的序列如SEQ ID NO.59所示。
在本发明一些实施方式中，所述sgRNA表达元件自5’端至3’端依次包括第二启动子表达元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体还包括抗性基因表达元件，优选为肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因表达元件，更优选为kmR表达元件。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体还包括毒性蛋白基因表达元件，优选为肺炎克雷伯菌株敏感毒性蛋白基因表达元件，更优选为sacB表达元件。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体还包括质粒复制子，所述质粒复制子优选为 ColE1。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体还包括控制元件，所述控制元件优选为rop。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体是由pET质粒构建获得，优选为pET28a质粒。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体所对应的spacer片段为3-8位胞嘧啶的spacer 片段。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体所对应的spacer片段的长度为19～21个碱基序列。
在本发明一些实施方式中，所述表达载体的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明另一方面提供一种工程菌，包括所述的表达载体。
在本发明一些实施方式中，所述工程菌的保藏号为CCTCC M 2018529。
本发明另一方面提供所述的表达载体、或所述的工程菌在肺炎克雷伯菌的基因编辑中的用途。
本发明另一方面提供一种肺炎克雷伯菌构建试剂盒，包括所述的表达载体。
本发明另一方面提供一种肺炎克雷伯菌的构建方法，包括：将所述的表达载体的多克隆位点插入spacer序列，所得质粒转染肺炎克雷伯菌，培养、筛选。
附图说明
图1显示为本发明质粒结构示意图。
图2显示为本发明pBECKP质粒在肺炎克雷伯菌中实现高效碱基编辑示意图。
图3显示为本发明pBECKP质粒在肺炎克雷伯菌中的活性窗口鉴定结果。
具体实施方式
本发明发明人经过大量研究，发现可以通过APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白和sgRNA，形成sgRNA与APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白的复合物，引导APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白定位到基因组的任何靶标位置，实现碱基编辑，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种表达载体，所述表达载体通常用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)基因编辑，所述表达载体包括APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件和sgRNA 表达元件，所述APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件包括第一启动子表达元件、APOBEC1 表达元件和Cas9D10A表达元件，所述sgRNA表达元件包括第二启动子元件、多克隆位点和 sgRNA框架元件。所述APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件和sgRNA表达元件两部分为核心元件，sgRNA能够与APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白形成复合物，从而可以引导APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白定位到基因组的任何靶标位置，接着APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白中的Cas9D10A nickase切割基因组靶点处与sgRNA的spacer序列相同那条DNA单链，APOBEC1脱氨酶脱去基因组靶点处与sgRNA的spacer序列互补那条DNA单链活性窗口期中的胞嘧啶核苷的氨基，将其转化为尿嘧啶核苷。随后，细胞会对基因组单链DNA断裂处进行修复，借助修复过程中的DNA修复和复制机制，尿嘧啶核苷转会变为胸腺嘧啶核苷，实现碱基编辑。
本发明所提供的表达载体中，APOBEC1表达元件和Cas9D10A表达元件之间还可以设有 linker表达元件，例如，所述APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件自5’端至3’端依次包括第一启动子表达元件、APOBEC1表达元件、linker表达元件和Cas9D10A表达元件。在本发明一优选实施方式中，所述第一启动子表达元件的序列如SEQ ID NO.62所示，所述APOBEC1表达元件的序列可以如SEQ ID NO.63所示，所述linker表达元件的序列如SEQ IDNO.64所示，所述Cas9D10A表达元件的序列可以如SEQ ID NO.65所示。
本发明所提供的表达载体中，所述sgRNA表达元件自5’端至3’端依次包括第二启动子表达元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。在本发明一优选实施方式中，所述sgRNA框架元件的序列如SEQ ID NO.60所示，所述多克隆位点可以包括一个或多个BsaI酶切位点，所述第二启动子表达元件的序列如SEQ ID NO.59所示。
本发明所提供的表达载体中，所述表达载体还包括抗性基因表达元件，所述抗性基因表达元件主要用于表达肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因，从而可以使肺炎克雷伯菌株在含有抗性基因的培养条件下培养，以对肺炎克雷伯菌株进行筛选。在本发明一优选实施方式中，所述抗性基因表达元件为肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因表达元件，更优选为kmR表达元件，其GenBank登录号为CT025832。
本发明所提供的表达载体中，所述表达载体还包括毒性蛋白基因表达元件，所述毒性蛋白基因表达元件主要用于表达肺炎克雷伯菌株敏感毒性蛋白基因，从而可以使肺炎克雷伯菌株在含有毒性蛋白基因的培养条件下难以存活，以对肺炎克雷伯菌株进行筛选。在本发明一优选实施方式中，所述毒性蛋白基因表达元件为肺炎克雷伯菌株敏感毒性蛋白基因表达元件，优选为蔗糖敏感毒性蛋白基因表达元件，更优选为sacB表达元件，其序列详见GenBank登录号MH587685。
本发明所提供的表达载体中，所述表达载体是由pET质粒构建获得，优选由为pET28a 质粒构建获得。本发明所提供的表达载体中，包含了pET质粒系统中至少部分的backbone 片段。在本发明一优选实施方式中，所述表达载体还包括质粒复制子，所述质粒复制子更优选为ColE1，其序列详见GenBank登录号MH587685。所述表达载体还包括控制元件，所述控制元件更优选为rop，其序列详见GenBank登录号MH587685。
本发明所提供的表达载体中，还可以在多克隆位点插入合适的spacer片段，本领域技术人员可选择合适的针对肺炎克雷伯菌基因编辑的spacer片段。此外，本发明发明人以外发现，当所述spacer片段为3-8位胞嘧啶的spacer片段时(即，基因编辑时所使用的spacer片段的第3-8位，其中一位为C，例如，可以是第3、4、5、6、7或8位)，基因编辑的转变效率很高，而3-8位之外的胞嘧啶转变率则急剧降低，所以本发明所提供的表达载体是一种spacer 活性窗口为3-8位的表达载体，所述表达载体所对应的spacer片段的长度通常为19、20、或21个碱基序列。
在本发明一优选实施方式中，所述表达载体的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二方面提供一种工程菌，包括如本发明第一方面所提供的表达载体。所述工程菌可以是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。在本发明一优选实施方式中，所述工程菌为保藏号为 CCTCC M 2018529的工程菌。
本发明第三方面提供如本发明第一方面所提供的表达载体和/或如本发明第二方面所提供的工程菌在肺炎克雷伯菌的基因编辑中的用途，所述用途可以是例如碱基转变、基因失活等。本发明所提供的表达载体所对应的表达系统，可以在不切断DNA双链的情况下，直接将胞嘧啶核苷转变为胸腺嘧啶核苷，为基因组编辑提供了一个新途径。由于编辑过程中不涉及DNA双链断裂和筛选压力，因此表达系统对包括染色体和质粒在内的所有位点都可以实现高效的碱基编辑。考虑到大量的毒性基因和抗生素抗性基因位于肺炎克雷伯菌的内源质粒上，表达系统将极大加快与致病和感染相关功能基因的筛选速率。
本发明第四方面提供一种肺炎克雷伯菌构建试剂盒，包括如本发明第一方面所提供的表达载体。
本发明第五方面提供一种肺炎克雷伯菌的构建方法，包括：将如本发明第一方面所提供的表达载体的多克隆位点插入spacer序列，所得质粒转染肺炎克雷伯菌，培养、筛选。
本发明提供了一种新的用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体，所述表达载体能够在肺炎克雷伯菌中高效简单地进行碱基编辑，包括碱基转变、基因失活等，还可以在不借助 lambda-Red重组系统和重组模板，仅需要一次电转化操作便可实现高效碱基编辑。此外，对包括染色体和质粒在内的所有基因组位点均可进行编辑，与传统的CRISPR-Cas9系统相比，可应用范围更加广泛。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
各实施例中使用的生物材料来源如下：
pUC57-sgRNA质粒(购自金唯智生物科技有限公司，全基因合成)；
pET28a质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P0023)；
pCVD422质粒(购自美国addgene公司，货号：11074)；
pnCasSA-BEC质粒(本实验室构建，已保藏至中国典型培养物保藏中心(CCTCC，保藏号：CCTCC M 2018031)；
感受态大肠杆菌DH5alpha菌株(购自康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0808S)；
肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株(购自美国ATCC公司，货号：13883)。
含有pBECKP质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.08.07，保藏号为：CCTCC M 2018529。
各实施例中使用的LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507002-0250；LB固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507003-0250； MH固体培养基购自英国OXOID公司，货号：CM0337B；卡那霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：K103024-5g。
实施例1
pBECKP质粒构建：
pBECKP质粒的组成如附图1所示，其序列为SEQ ID NO：1。
TGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGACGCGTATTGGGATGGTACCGGGCCCCCCCTC GAGGTCGACGGTATCGATACGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAATCG GCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTGTTCAAGGATGCTGTCTT TGACAACAGATGTTTTCTTGCCTTTGATGTTCAGCAGGAAGCTAGGCGCAAACGTTGAT TGTTTGTCTGCGTAGAATCCTCTGTTTGTCATATAGCTTGTAATCACGACATTGTTTCCTTT CGCTTGAGGTACAGCGAAGTGTGAGTAAGTAAAGGTTACATCGTTAGGATCAAGATCCA TTTTTAACACAAGGCCAGTTTTGTTCAGCGGCTTGTATGGGCCAGTTAAAGAATTAGAA ACATAACCAAGCATGTAAATATCGTTAGACGTAATGCCGTCAATCGTCATTTTTGATCCGC GGGAGTCAGTGAACAGATACCATTTGCCGTTCATTTTAAAGACGTTCGCGCGTTCAATTT CATCTGTTACTGTGTTAGATGCAATCAGCGGTTTCATCACTTTTTTCAGTGTGTAATCATC GTTTAGCTCAATCATACCGAGAGCGCCGTTTGCTAACTCAGCCGTGCGTTTTTTATCGCT TTGCAGAAGTTTTTGACTTTCTTGACGGAAGAATGATGTGCTTTTGCCATAGTATGCTTT GTTAAATAAAGATTCTTCGCCTTGGTAGCCATCTTCAGTTCCAGTGTTTGCTTCAAATACT AAGTATTTGTGGCCTTTATCTTCTACGTAGTGAGGATCTCTCAGCGTATGGTTGTCGCCTG AGCTGTAGTTGCCTTCATCGATGAACTGCTGTACATTTTGATACGTTTTTCCGTCACCGTC AAAGATTGATTTATAATCCTCTACACCGTTGATGTTCAAAGAGCTGTCTGATGCTGATACG TTAACTTGTGCAGTTGTCAGTGTTTGTTTGCCGTAATGTTTACCGGAGAAATCAGTGTAG AATAAACGGATTTTTCCGTCAGATGTAAATGTGGCTGAACCTGACCATTCTTGTGTTTGG TCTTTTAGGATAGAATCATTTGCATCGAATTTGTCGCTGTCTTTAAAGACGCGGCCAGCG TTTTTCCAGCTGTCAATAGAAGTTTCGCCGACTTTTTGATAGAACATGTAAATCGATGTGT CATCCGCATTTTTAGGATCTCCGGCTAATGCAAAGACGATGTGGTAGCCGTGATAGTTTGCGACAGTGCCGTCAGCGTTTTGTAATGGCCAGCTGTCCCAAACGTCCAGGCCTTTTGCA GAAGAGATATTTTTAATTGTGGACGAATCGAACTCAGGAACTTGATATTTTTCATTTTTTT GCTGTTCAGGGATTTGCAGCATATCATGGCGTGTAATATGGGAAATGCCGTATGTTTCCTT ATATGGCTTTTGGTTCGTTTCTTTCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCTCCTGCCAGCAGTGC GGTAGTAAAGGTTAATACTGTTGCTTGTTTTGCAAACTTTTTGATGTTCATCGTTCATGTC TCCTTTTTTATGTACTGTGTTAGCGGTCTGCTTCTTCCAGCCCTCCTGTTTGAAGATGGCA AGTTAGTTACGCACAATAAAAAAAGACCTAAAATATGTAAGGGGTGACGCCAAAGTATA CACTTTGCCCTTTACACATTTTAGGTCTTGCCTGCTTTATCAGTAACAAACCCGCGCGATT TACTTTTCGACCTCATTCTATTAGACTCTCGTTTGGATTGCAACTGGTCTATTTTCCTCTTT TGTTTGATAGAAAATCATAAAAGGATTTGCAGACTACGGGCCTAAAGAACTAAAAAATC TATCTGTTTCTTTTCATTCTCTGTATTTTTTATAGTTTCTGTTGCATGGGCATAAAGTTGCA 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ATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGA ACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCG AAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTC TTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGC ACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTT ATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTAC TTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGT TTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGC CTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAA TGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAA CTTCGACTTAGCTGAAGATACCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCT CGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAA CCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGC GCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAACTCTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCT CAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTC GAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAG TTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAAT CGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTATCATTCCACATCAAAT CCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAA AGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACC CCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATT ACTCCATGGAATTTTGAGAAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGA GAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTT TACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGG GCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGATCAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTAT TCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAAT TGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGG TACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAA TGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATT GAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAA GAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAG ACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGG AACTTTATTCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCA CAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCC AGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCA TGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGAC TCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAA AGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAAC GAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTG GACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGAC AATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAA TGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGC TTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAAT CACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACG ATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTC AGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGAC GCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGT GAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGA ACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTT AAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCA ATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAA AGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGG TTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAA GGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCT AGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTA TTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAG GCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCT GTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGTGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTAC GAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGC ACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCC TAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCC ATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCA GCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGA GGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGA TTTGTCACAGCTTGGGGGTGACTGATGGCTGGTTGGCGTACTGTTGTGGTAAATACCAA GCTTGATATCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTCGAGACCATTGGTCTC AGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAA GTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAG TTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCATCCCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCTCG AGCATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTCACTCATTAGGCACCGGGATCTCGACCGATGCCCT TGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCC GCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGG GTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGC GGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAAC GTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCCCACGGGTGCGCATGATC GTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAA TGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACC TGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAA GTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTG TGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTG GTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATG TTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCC ATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCC TTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAG CTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCT TTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGC TCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCA GGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGC GATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC ACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGC GCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCG GTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGG AAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTT GCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAA GTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAG CTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCT CCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTA GGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCG CCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTC TTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTG CTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCA CCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGA TCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC ACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAA GGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCA ACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGC GACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCA AAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAA TTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCA CCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTG AAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAA TTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAA CGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAG TCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTG ATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGG ACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTG AGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATAT GAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGG ATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCG AAAAGTGCCACCTG(SEQ ID NO：1)
pCasKP质粒的具体构建方法如下：
(1)在金唯智生物科技有限公司全基因合成sgRNA基因，并克隆到该公司载体库中pUC57-Kan质粒的EcoRV位点处，获得pUC57-sgRNA质粒。pUC57-Kan质粒原始序列参见金唯智生物技术有限公司网站。合成的sgRNA基因序列如下：
其中加粗的部分为J23119启动子序列，具体序列如下：
TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGT(SEQ ID NO：59)；
添加单下划线的部分为两个BsaI酶切位点；
添加双下划线的部分为sgRNA框架序列，具体序列如下：
(2)以pET28a质粒为模板，PCR扩增得到它的backbone片段；以pUC57-sgRNA质粒为模板，PCR扩增得到它的sgRNA基因片段。
用于PCR扩增的引物序列为：
扩增pET28a质粒backbone片段5’引物序列：
5’-CTCACTCATTAGGCACCGGG-3’(SEQ ID NO：3)
扩增pET28a质粒backbone片段3’引物序列：
5’-CAGGTGGCACTTTTCGGGG-3’(SEQ ID NO：4)
扩增sgRNA基因片段5’引物序列：
5’-accaagcttgatatcttgacagctagctcagtcctagg-3’(SEQ ID NO：5)
扩增sgRNA基因片段3’引物序列：
5’-caggaattcgatatcaaaaaaagcaccgactcggtgccac-3’(SEQ ID NO：6)
使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述两个DNA片段分别进行扩增，反应体系为：32μl ddH2O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimestarBuffer，1.5μl 5’Primer(10μM)，1.5μl 3’Primer(10μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s， 54℃ 30s，72℃ 3min，共28个循环；最后72℃ 10min。
使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对上述两个PCR产物分别进行回收。产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
将上述两个DNA片段组装成一个环形质粒。反应体系为：2μl pET28a质粒backbone片段，2μl sgRNA基因片段，4μl ddH2O，2μl 5×In-Fusion Enzyme Premix。反应所使用的5×In-Fusion Enzyme Premix购自TKARA公司，货号：638909。反应条件为50℃ 15min；之后4℃ hold。
将上述10μl反应产物转化到大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞中，并涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待转化液被固体培养基吸收后转置于37℃培养箱倒置培养。培养14-16h后，将固体培养基上长出的转化子菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。抽提的质粒送金唯智生物科技有限公司进行测序确认，经测序确认正确的质粒用于下一步实验。
(3)以pCVD422质粒为模板，PCR扩增得到它的sacB蛋白基因片段；将上一步得到的质粒，使用HindIII限制性内切酶单酶切线性化。
用于PCR扩增的引物序列为：
扩增sacB蛋白基因片段5’引物序列：
5’-GAAAAGTGCCACCTGTGTAAAACGACGGCCAGTGAAT-3’(SEQ ID NO：7)
扩增sacB蛋白基因片段3’引物序列：
5’-tgcctaatgagtgagcaggaaacagctatgaccatgc-3’(SEQ ID NO：8)
使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述DNA片段进行扩增，反应体系为：32μl ddH2O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×Primestar Buffer，1.5μl 5’Primer (10μM)，1.5μl 3’Primer(10μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s，54℃ 30s，72℃ 2min，共28个循环；最后72℃ 10min。
使用NEB公司的HindIII限制性内切酶和10×Cutsmart Buffer对上一步得到的质粒进行单酶切线性化，反应体系为：34μl ddH2O，10μl上一步得到的质粒(100ng/μl)，1μlHindIII-HF， 5μl 10×Cutsmart Buffer。体系配置完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃ 1h。
使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR 产物和酶切产物分别进行回收。产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
将上述两个DNA片段组装成一个环形质粒。反应体系为：2μl线性化质粒，2μl sacB基因片段，4μl ddH2O，2μl 5×In-Fusion Enzyme Premix。反应所使用的5×In-FusionEnzyme Premix 购自TKARA公司，货号：638909。反应条件为50℃ 15min；之后4℃ hold。
将上述10μl反应产物转化到大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞中，并涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待转化液被固体培养基吸收后转置于37℃培养箱倒置培养。培养14-16h后，将固体培养基上长出的转化子菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。抽提的质粒送金唯智生物科技有限公司进行测序确认，经测序确认正确的质粒用于下一步实验。
(4)以pnCasSA-BEC质粒为模板，PCR扩增得到它的APOBEC1-Cas9D10A蛋白基因片段(对应APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件)，具体序列如下：
GCAAACATGCTTTGGGTAAACATGTAGGTATTAACGTCAATGCGACAATAGTAGCAT TGATTAAATGAGAATTAGTAAGTGTTTTACTTACTAAATTTTATTTAACCTAAAAATGAAC CACCTGGATGTGTGGGATTAAAAAGTGAAGAGAGGAGGACATATCACATGAGTAGCGA AACCGGTCCGGTTGCAGTGGATCCGACCCTGCGCCGTCGCATTGAACCGCACGAGTTTG AAGTGTTCTTTGATCCGCGCGAGCTGCGCAAAGAAACTTGCCTGCTGTACGAGATTAAC TGGGGTGGCCGCCATAGCATCTGGCGCCATACCAGCCAGAACACCAATAAGCACGTGGA AGTGAATTTTATTGAAAAATTTACCACCGAGCGCTACTTCTGCCCTAATACCCGCTGCAG CATCACCTGGTTTCTGAGCTGGAGCCCGTGCGGCGAATGTAGTCGCGCCATTACCGAGT TCCTGAGCCGCTATCCGCATGTGACCCTGTTCATCTACATCGCCCGTCTGTACCATCACGC CGATCCGCGCAATCGCCAAGGTCTGCGTGATCTGATTAGCAGCGGTGTGACCATCCAGATCATGACCGAACAAGAGAGCGGCTATTGCTGGCGCAACTTCGTGAACTATTCTCCGAGC AACGAAGCCCACTGGCCGCGTTATCCGCATCTGTGGGTGCGCCTGTATGTGCTGGAGCT GTACTGCATCATCCTGGGCCTGCCGCCTTGCCTGAATATTCTGCGCCGTAAACAGCCGCA ACTGACATTCTTCACCATCGCACTGCAGAGCTGCCATTATCAGCGCCTGCCGCCGCACAT TTTATGGGCCACCGGTCTGAAAAGCGGTAGTGAAACTCCGGGCACAAGCGAAAGCGCA ACCCCGGAAAGTGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCGGCACAAATAGCGTCGG ATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAA ATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAG AGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAA GAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGT TTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCA TCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATC ATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGC CTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGAT AATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAA GAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGT AAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTT ATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATT TGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTT ATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGAT GCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAG CTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAG TTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGA TATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAA TTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGC TGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAG CTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAG AAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGC AATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTT GAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTT GATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTT ACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGC ATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAA AAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTG TTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCT AAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGA TATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAAC ATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGG TTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAAC AATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCAT GATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGA TAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTA CAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAA TATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGC GAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAA GAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAA AATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATG TCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAA CGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAA AAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTT TGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTAT CAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATA GTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTA CCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGA GATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTG ATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATG TTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTC TTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATT CGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGG GCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGA AAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTC GGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATA GTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAG AAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGA AAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGG CTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAAT TTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAA AAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGT GAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGT TGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAAC GATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCT TTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGATGGCTGGTTGGCGTACT GTTGTGGTAAATACC(SEQ ID NO.61)
其中，第一启动子表达元件的序列如下：
GCAAACATGCTTTGGGTAAACATGTAGGTATTAACGTCAATGCGACAATAGTAGCAT TGATTAAATGAGAATTAGTAAGTGTTTTACTTACTAAATTTTATTTAACCTAAAAATGAAC CACCTGGATGTGTGGGATTAAAAAGTGAAGAGAGGAGGACATATCAC(SEQ ID NO.62)
APOBEC1表达元件的序列如下：
ATGAGTAGCGAAACCGGTCCGGTTGCAGTGGATCCGACCCTGCGCCGTCGCATTGA ACCGCACGAGTTTGAAGTGTTCTTTGATCCGCGCGAGCTGCGCAAAGAAACTTGCCTGC TGTACGAGATTAACTGGGGTGGCCGCCATAGCATCTGGCGCCATACCAGCCAGAACACC AATAAGCACGTGGAAGTGAATTTTATTGAAAAATTTACCACCGAGCGCTACTTCTGCCCT AATACCCGCTGCAGCATCACCTGGTTTCTGAGCTGGAGCCCGTGCGGCGAATGTAGTCGCGCCATTACCGAGTTCCTGAGCCGCTATCCGCATGTGACCCTGTTCATCTACATCGCCCG TCTGTACCATCACGCCGATCCGCGCAATCGCCAAGGTCTGCGTGATCTGATTAGCAGCGG TGTGACCATCCAGATCATGACCGAACAAGAGAGCGGCTATTGCTGGCGCAACTTCGTGA ACTATTCTCCGAGCAACGAAGCCCACTGGCCGCGTTATCCGCATCTGTGGGTGCGCCTGT ATGTGCTGGAGCTGTACTGCATCATCCTGGGCCTGCCGCCTTGCCTGAATATTCTGCGCCGTAAACAGCCGCAACTGACATTCTTCACCATCGCACTGCAGAGCTGCCATTATCAGCGC CTGCCGCCGCACATTTTATGGGCCACCGGTCTGAAA(SEQ ID NO.63)
Linker表达原件的序列如下：
AGCGGTAGTGAAACTCCGGGCACAAGCGAAAGCGCAACCCCGGAAAGT(SEQ ID NO.64)
Cas9D10A表达元件的序列如下：
GATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTG ATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCG CCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGG AAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATT TGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATC GACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTT GGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAA AAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCA TATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGAT GTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCT ATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAG ACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGA ATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGA AGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCG CAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTT TACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAAT GATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACA ACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAG GTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGA AAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCA AGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCAT GCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATT GAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTC GTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAA GTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAA AATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTT ATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTT CAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACC GTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATT TCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTA TTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTT AACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCA CCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACG TTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGAT TTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTT TGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTA AAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATT GAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTA TGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCT GTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGA GACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACA TTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTG ATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAA AACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTA ACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCA ATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAA TACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCT AAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATT ACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATA TCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATG ATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAAT ATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCC TCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTG CCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTA CAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAG CTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCC GTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGAT TGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACC TAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAG AATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAG CTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTT GTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAG CGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAG ACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTG GAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTAC AAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACG CATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA(SEQ ID NO.65)
将上一步得到的质粒，再次使用HindIII限制性内切酶单酶切线性化。
用于PCR扩增的引物序列为：
扩增APOBEC1-Cas9D10A蛋白基因片段5’引物序列：
5’-gggcataaagttgcaagcttgcaaacatgctttgggtaaac-3’(SEQ ID NO：9)
扩增APOBEC1-Cas9D10A蛋白基因片段3’引物序列：
5’-gctgtcaagatatcaagcttggtatttaccacaacagtacgcc-3’(SEQ ID NO：10)
使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述DNA片段进行扩增，反应体系为：32μl ddH2O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×Primestar Buffer，1.5μl 5’Primer (10μM)，1.5μl 3’Primer(10μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s， 56℃ 30s，72℃ 4min，共30个循环；最后72℃ 10min。
使用NEB公司的HindIII限制性内切酶和10×Cutsmart Buffer对上一步得到的质粒进行单酶切线性化，反应体系为：34μl ddH2O，10μl上一步得到的质粒(100ng/μl)，1μlHindIII-HF， 5μl 10×Cutsmart Buffer。体系配置完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃ 1h。
使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR 产物和酶切产物分别进行回收。产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
将上述两个DNA片段组装成一个环形质粒。反应体系为：3μl线性化质粒，2μlAPOBEC1-Cas9D10A蛋白基因片段，3μl ddH2O，2μl 5×In-Fusion Enzyme Premix。反应所使用的5×In-Fusion Enzyme Premix购自TKARA公司，货号：638909。反应条件为50℃15min；之后4℃ hold。构建获得的编辑质粒pBECKP图谱如图1所示，其中，ColE1：质粒复制子； kmR：卡那霉素抗性基因；sacB：蔗糖毒性蛋白基因；rpsLSA promoter：APOBEC1-Cas9D10A 融合蛋白基因表达的启动子；XTEN linker：APOBEC1蛋白与Cas9D10A蛋白的连接区域； J23119promoter：表达sgRNA的启动子；BsaI位点：用于无缝克隆spacer片段；sgRNA：sgRNA 基因片段；rop：控制质粒拷贝数的蛋白基因。
将上述10μl反应产物转化到大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞中，并涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待转化液被固体培养基吸收后转置于37℃培养箱倒置培养。培养14-16h后，将固体培养基上长出的转化子菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。抽提的质粒送金唯智生物科技有限公司进行测序确认，经测序确认正确的质粒即为pBECKP质粒，用于后续实验。含有正确pBECKP质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M2018529。
该pBECKP质粒的特征在于能够兼容大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，在这两种细菌中都可以复制传代；在于该质粒带有卡那霉素抗性，能够用于肺炎克雷伯菌株筛选；在于含有两个BsaI 酶切位点，能够用来插入spacer片段；在于能够在肺炎克雷伯菌中稳定表达APOBEC-Cas9D10A融合蛋白，进行基因组碱基编辑；在于含有sacB蔗糖敏感基因，不能在含有5％蔗糖的LB培养基中存活，能够在在肺炎克雷伯菌株中完成质粒的消除。
实施例2
pBECKP质粒在肺炎克雷伯菌中实现碱基转变：
使用pBECKP质粒可以在肺炎克雷伯菌中实现对不同基因的高效碱基转变，即由胞嘧啶转变为胸腺嘧啶(C→T)。本实验在肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株的dhaK基因中挑选了2个富含胞嘧啶的spacer位点进行碱基转变实验。附图2A为采用pBECKP质粒在肺炎克雷伯菌中进行碱基转变的原理示意图。
(1)先在目标基因上选定某一NGG(N为任意碱基)序列前面20个碱基的DNA片段(20个碱基被称为spacer，NGG不包含在其中)。该步骤的基本要求：为使spacer片段能插入到pBECKP质粒中，需使用以下模板设计引物：
5’-tagtNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNcaaa-5’
在本实验中，选定的dhaK基因的第1个spacer序列(SEQ ID NO：11)为： 5’-GAACCATCATCGCCAGTCCG-3’，设计的引物序列如下：
dhaK-spacer-F1：5’-tagtGAACCATCATCGCCAGTCCG-3’(SEQ ID NO：12)
dhaK-spacer-R1：5’-aaacCGGACTGGCGATGATGGTTC-3’(SEQ ID NO：13)
在本实验中，选定的dhaK基因的第2个spacer序列(SEQ ID NO：14)为： 5’-GAACCATCATCGCCAGTCCG-3’，设计的引物序列如下：
dhaK-spacer-F2：5’-tagtCGCCTCGCCGAGCGTCGACG-3’(SEQ ID NO：15)
dhaK-spacer-R2：5’-aaacCGTCGACGCTCGGCGAGGCG-3’(SEQ ID NO：16)
在金唯智生物科技有限公司合成上述四条引物，并按照实施例四的步骤将两种dhaK_spacer分别插入到实施例一得到的pBECKP质粒中，分别得到pBECKP-dhaK1质粒和pBECKP-dhaK2质粒。得到的pBECKP-dhaK1质粒和pBECKP-dhaK2质粒送到金唯智生物科技有限公司测序，测序确认正确的质粒用于后续实验。
(2)将构建的pBECKP-dhaK1质粒和pBECKP-dhaK2质粒按实施例六的操作步骤转入肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株中。挑取单克隆菌落，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。使用生工生物工程(上海) 股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒从菌株中提取基因组DNA。
以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增dhaK基因部分。反应体系为：10μl EstaqMastermix(康为世纪公司)，1μl基因组DNA(30-100ng/μl)，0.5μl dhaK-seq-F(10μM)，0.5μl dhaK-seq-R(10μM)，8μl ddH2O。PCR循环如下：95℃ 3min；之后95℃ 30s，54℃ 30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃ 10min。PCR反应结束后，将成功扩增的PCR产物送到金唯智科技有限公司进行DNA测序，以验证spacer中胞嘧啶是否转变为胸腺嘧啶。
优选地，本步骤的特征在于进行PCR验证的的引物均位于两个dhaK-spacer的上下游，这样使用同一对验证引物即可对两个dhaK-spacer的碱基转变结果都进行扩增和测序验证。
本实验使用的dhaK基因验证引物序列为：
dhaK-seq-F：5’-CCGACCATTATTATCGCTGAC-3’(SEQ ID NO：17)
dhaK-seq-R：5’-CGCTGTTGAGATAGGACGCT-3’(SEQ ID NO：18)
其中dhaK-seq-F还作为测序引物。
实验结果显示(如图2B所示)，对于每个dhaK-spacer位点，在选取的8个单克隆菌落中，都有一些胞嘧啶碱基成功转变为胸腺嘧啶碱基。
(3)对已经确认碱基转变成功的肺炎克雷伯菌各菌株，按实施例七的操作步骤可以消除菌株中的质粒。
实施例3
pBECKP质粒在肺炎克雷伯菌中实现基因失活：
使用pBECKP质粒可以在肺炎克雷伯菌中实现对不同基因的高效基因失活。当选择的 spacer序列活性窗口内存在CAA、CAG、CGA或TGG中任意一种密码子时，pBECKP系统会将其转变为终止密码子TAA、TAG或TGA，提前终止蛋白质翻译过程，从而实现基因失活。在肺炎克雷伯菌中，pBECKP系统的spacer序列可转变范围为3-8位，称之为活性窗口，具体测定过程参见实施例九。本实验挑选了位于肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株染色体的fosA 基因和位于肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株内源质粒的blaKPC-2基因分别进行基因失活实验。
(1)对于染色体上fosA基因，本实验选定基因内的spacer可将fosA基因中第92位的色氨酸(TGG)突变为终止密码子(TAA)，从而获得fosA基因失活的肺炎克雷伯菌株。本实验选定的fosA-spacer序列(SEQ ID NO：19)为：5’-CAGCTTCCAGATCGCCACGC-3’，该序列位于基因组DNA的反义链。按照实施例二步骤(1)的要求设计fosA-spacer的引物，具体序列如下：
fosA-spacer-F：5’-tagtCAGCTTCCAGATCGCCACGC-3’(SEQ ID NO：20)
fosA-spacer-R：5’-aaacGCGTGGCGATCTGGAAGCTG-3’(SEQ ID NO：21)
在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并按照实施例四的步骤将fosA_spacer 插入到实施例一得到的pBECKP质粒中，得到pBECKP-fosA质粒。得到的pBECKP-fosA质粒送到金唯智生物科技有限公司测序，测序确认正确的质粒用于后续实验。
(2)将构建的pBECKP-fosA质粒按照实施例六的操作步骤转入肺炎克雷伯菌NCTC9633 菌株中。挑取单克隆菌落，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup 柱式细菌基因组DNA提取试剂盒从菌株中提取基因组DNA。
以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增fosA基因部分。反应体系为：10μl EstaqMastermix (康为世纪公司)，1μl基因组DNA(30-100ng/μl)，0.5μl fosA-seq-F(10μM)，0.5μl fosA-seq-R (10μM)，8μl ddH2O。PCR循环如下：95℃ 3min；之后95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 1min，共 30个循环；最后72℃ 10min。PCR反应结束后，将成功扩增的PCR产物送到金唯智科技有限公司进行DNA测序，以验证fosA-spacer中第92位的色氨酸对应的TGG序列是否突变为终止密码子TAA序列。
本实验使用的fosA基因验证引物序列为：
fosA-seq-F：5’-TTGAGATGCTGATGCTGTGG-3’(SEQ ID NO：22)
fosA-seq-R：5’-AAGGTGGCGATGGAGTGAAT-3’(SEQ ID NO：23)
其中fosA-seq-F还作为测序引物。
实验结果显示，在选取的8个单克隆菌落中，fosA基因的第92位的色氨酸全部成功突变为终止密码子。
(3)对已经确认fosA基因的第92位的色氨酸成功突变为终止密码子的单克隆菌落，按实施例七的操作步骤消除菌株中的质粒，用于后续实验。
(4)肺炎克雷伯菌的fosA基因与磷霉素的耐受能力相关。当fosA基因失去功能时，肺炎克雷伯菌对磷霉素的耐受能力会下降。按照实施例八的操作步骤，在上一步已消除质粒的单克隆菌落中随机挑取一个进行抑菌圈实验，其结果与预期一致。如附图2C所示，与野生型菌株相比，磷霉素药敏纸片对fosA突变菌株的抑菌圈更大，表明fosA基因已经失活。
(5)为了进一步验证pBECKP系统能否失活位于肺炎克雷伯菌内源质粒上的基因，我们在blaKPC-2基因内选定一个spacer，可将blaKPC-2基因中第164位的色氨酸(TGG)突变为终止密码子(TAA)，从而获得fosA基因失活的肺炎克雷伯菌株。本实验选定的blaKPC-2-spacer 序列(SEQ ID NO：24)为:5’-CCAGCTCCCAGCGGTCCAGA-3’，该序列位于质粒DNA 的反义链。按照实施例二步骤(1)的要求设计fosA-spacer的引物，具体序列如下：
blaKPC-2-spacer-F：5’-tagtCCAGCTCCCAGCGGTCCAGA-3’(SEQ ID NO：25)
blaKPC-2-spacer-R：5’-aaacTCTGGACCGCTGGGAGCTGG-3’(SEQ ID NO：26)
在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并按照实施例四的步骤将blaKPC-2_spacer 插入到实施例一得到的pBECKP质粒中，得到pBECKP-blaKPC-2质粒。得到的pBECKP-blaKPC-2质粒送到金唯智生物科技有限公司测序，测序确认正确的质粒用于后续实验。
(6)将构建的pBECKP-blaKPC-2质粒按照实施例六的操作步骤转入肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株中。挑取单克隆菌落，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在 30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒从菌株中提取基因组DNA。
以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增blaKPC-2基因部分。反应体系为：10μl EstaqMastermix(康为世纪公司)，1μl基因组DNA(30-100ng/μl)，0.5μl fosA-seq-F(10μM)，0.5μl fosA-seq-R(10μM)，8μl ddH2O。PCR循环如下：95℃ 3min；之后95℃ 30s，54℃ 30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃ 10min。PCR反应结束后，将成功扩增的PCR产物送到金唯智科技有限公司进行DNA测序，以验证blaKPC-2-spacer中第164位的色氨酸对应的TGG序列是否突变为终止密码子TAA序列。
本实验使用的blaKPC-2基因验证引物序列为：
blaKPC-2-seq-F：5’-ATGTCACTGTATCGCCGTCT-3’(SEQ ID NO：27)
blaKPC-2-seq-R：5’-TTTTCAGAGCCTTACTGCCC-3’(SEQ ID NO：28)
其中blaKPC-2-seq-F还作为测序引物。
实验结果显示，在选取的8个单克隆菌落中，blaKPC-2基因的第164位的色氨酸全部成功突变为终止密码子。
(7)对已经确认blaKPC-2基因的第164位的色氨酸成功突变为终止密码子的单克隆菌落，按实施例七的操作步骤消除菌株中的质粒，用于后续实验。
(8)肺炎克雷伯菌的blaKPC-2基因与碳青霉烯类抗生素的耐受能力相关。当blaKPC-2基因失去功能时，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐受能力会下降。按照实施例八的操作步骤，在上一步验证突变成功的单克隆菌落中随机挑取一个进行抑菌圈实验，其结果与预期一致。如附图2D所示，与野生型菌株相比，亚胺培南(碳青霉烯类抗生素的代表药物)药敏纸片对blaKPC-2突变菌株的抑菌圈显著增大，表明blaKPC-2基因已经失活。
实施例4
将spacer片段插入pBECKP质粒：
为了使pBECKP质粒表达的sgRNA能够定位到基因组的靶位点处，需要将靶位点的spacer序列插入到sgRNA基因中，其插入方法如下：
(1)现在目标基因上选定某一NGG(N代表A/T/G/C任意碱基)序列前的20个碱基序列(这20个碱基序列称为spacer，NGG不包含在其中，spacer序列的GC比例控制在20～80％)。本步骤的特征在于：为使spacer片段能插入pSGKP质粒，需要在spacer序列正义链5’端加上tagt接头，同时在spacer序列反义链5’端加上aaac接头。将上述带接头的spacer正义链和反义链序列在金唯智生物科技有限公司分别合成为两条引物。
(2)将设计合成的两条spacer引物进行磷酸化并以碱基互补配对方式退火成双链DNA，具体反应体系如下：5μl spacer-F(100μM)，5μl spacer-R(100μM),1μlT4polynucleotide kinase (NEB公司)，5μl 10×T4DNA ligase Buffer(NEB公司)，34μlddH2O。反应条件如下：37℃温育1h，然后加热到95℃温育3min，再以每10s降温0.5℃的速度缓慢降温到25℃。上述反应过程在PCR仪中进行。反应结束后使用ddH2O稀释100倍，用于后续反应。
(3)使用NEB公司的BsaI限制性内切酶和10×Cutsmart Buffer将环状的pBECKP质粒切割为线性化质粒，反应体系为：34.0μl ddH2O，10.0μl pSGKP(100ng/μl)，1.0μl BsaI-HF， 5.0μl 10×Cutsmart Buffer。体系配置完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃ 1h。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行回收。产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
(4)将步骤(2)中获得的双链DNA插入到步骤(3)获得的BsaI线性化pBECKP质粒中，反应体系为：1μl上述100倍稀释的磷酸化双链DNA，1μl上述BsaI线性化的pBECKP 质粒，1μl10×T4DNA ligase Buffer(NEB公司)，0.5μl T4DNA ligase(NEB公司)，最后加入适量ddH2O至总体积为10μl。将该反应体系置于16℃连接过夜。
(5)将上述10μl反应产物转化到大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞中，并涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待转化液被固体培养基吸收后转置于37℃培养箱倒置培养。培养14-16h后，将固体培养基上长出的转化子菌株转接保存，并用生工生物工程 (上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。抽提的质粒送金唯智生物科技有限公司进行测序，经测序确认插入正确spacer的pBECKP质粒用于后续实验。
实施例5
野生型肺炎克雷伯菌感受态细胞的制备：
将甘油管保藏的肺炎克雷伯菌菌株在LB固体培养基划线，在恒温培养箱中30℃倒置培养过夜。在LB固体培养基上挑取一个新鲜的单克隆菌落，接种到5ml LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。第二天取其中1ml菌液接种到100ml LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速继续振荡培养。当菌液的OD600达到约0.7时，将菌液置于冰上冰浴20min。然后在预冷的4℃离心机中以7200g的转速离心5min收集菌体，弃去培养基上清，将离心管底部的菌体沉淀用20ml预冷的10％v/v甘油溶液(已用 0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。以同样的离心转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用 20ml预冷的10％v/v甘油溶液(已用0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。以同样的离心转速离心，弃去上清后用500μl预冷的10％v/v甘油溶液(已用0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。将得到的重悬菌液以50μl等份分装到无菌EP管中，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。
实施例6
将质粒通过电转化转入肺炎克雷伯菌感受态细胞：
取一管实施例五中制备的肺炎克雷伯菌电感受态细胞，在冰上放置3-5min，待其融化后加入约500ng已成功插入spacer的pBECKP质粒(不超过5μl)，轻轻混匀。使用移液枪将混匀后的细菌质粒混合物转入预冷的2mm电转杯(Bio_Rad公司)，并在冰上静置5min。擦净电转杯外壁的冷凝水，在GenePulser Xcell电击仪(Bio_Rad公司)中进行电击。电击参数为：2.5kV，200Ω，25μF，正常的电击时间为4.8-5.3ms之间。电击后立即加入1ml LB培养液洗出电击后的细胞，转入无菌的EP管中，在37℃摇床中以200rpm/min的转速复苏培养1.5h。取100μl复苏液涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待菌液被吸收后，于37℃培养箱中倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌才能在培养基上生长。
实施例7
肺炎克雷伯菌中pBECKP质粒的消除：
挑取一个已经完成碱基编辑的肺炎克雷伯菌单克隆菌落，接种到5ml LB液体培养基中，在37℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。第二天用无菌接种环沾取菌液在含有5％蔗糖的LB固体培养基平板上划线，并在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。由于pBECKP质粒上带有蔗糖敏感基因sacB，它表达的分泌型蔗糖果聚糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成有毒的高分子量的果聚糖，造成细胞死亡。只有那些pBECKP质粒被消除的细菌，才能在含有蔗糖的培养基上存活下来。
为确认pBECKP质粒都被消除，从上述含有蔗糖的固体平板上随机挑取一些单克隆菌落，分别在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板与不含抗生素的LB固体培养基平板上划线。在37℃恒温培养箱倒置培养过夜后，仅能在不含抗生素的LB固体培养基平板上生长的菌落，即消除pBECKP质粒的菌落，对其进行培养与保种。
实施例8
肺炎克雷伯菌的抗生素抑菌圈实验：
将不同的肺炎克雷伯菌株接种到LB液体培养基，在37℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。第二天将菌液离心后，弃去上清液，用无菌的生理盐水将菌体沉淀重悬，并调整菌体浓度到0.5麦氏浊度，然后再用无菌的生理盐水进行十倍稀释。用无菌棉签沾取稀释后的菌液，在MH固体培养基平板表面涂布。待菌液被平板吸收后，在平板中央轻轻放置一片带有相应抗生素的药敏纸片，然后置于35℃恒温培养箱正置培养20h至抑菌圈出现。随后测量各抑菌圈的直径，并拍照记录。
实施例9
pBECKP系统在肺炎克雷伯菌中活性窗口的鉴定：
为了鉴定pBECKP系统在肺炎克雷伯菌中的活性窗口，我们系统地检测了该系统在10 个不同spacer序列中的编辑情况，这些spacer的具体序列如下：
筛选C2位碱基转变的spacer：
5’-TCTTGAGCACCACCGCTGAG-3’(SEQ ID NO：29)
筛选C3位碱基转变的spacer：
5’-CTCGTTGCGCGCATAGCGCG-3’(SEQ ID NO：30)
筛选C4位碱基转变的spacer：
5’-GTTCATTGTGAATTCACTGG-3’(SEQ ID NO：31)
筛选C5位碱基转变的spacer：
5’-ATATCAATCCCGGCTATTAA-3’(SEQ ID NO：32)
筛选C6位碱基转变的spacer：
5’-GGCCTCGCCGAGCGTCGACG-3’(SEQ ID NO：33)
筛选C6C7位碱基转变的spacer：
5’-AGGATCCGCACCACCTGCCC-3’(SEQ ID NO：34)
筛选C7位碱基转变的spacer：
5’-GTGGAACAACCTCGCCCGGC-3’(SEQ ID NO：35)
筛选C5C8位碱基转变的spacer：
5’-GTTCCATCATCGCCAGTCCG-3’(SEQ ID NO：36)
筛选C7C8位碱基转变的spacer：
5’-GAGCGACCCGGCGATCCGGG-3’(SEQ ID NO：37)
筛选C9位碱基转变的spacer：
5’-CGGATAATCCTGCACGCGC-3’(SEQ ID NO：38)
这些spacer按照实施例二步骤(1)的要求设计了相应的引物，具体序列如下：
筛选C2位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtTCTTGAGCACCACCGCTGAG-3’(SEQ ID NO：39)
筛选C2位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacCTCAGCGGTGGTGCTCAAGA-3’(SEQ ID NO：40)
筛选C3位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtCTCGTTGCGCGCATAGCGCG-3’(SEQ ID NO：41)
筛选C3位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacCGCGCTATGCGCGCAACGAG-3’(SEQ ID NO：42)
筛选C4位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtGTTCATTGTGAATTCACTGG-3’(SEQ ID NO：43)
筛选C4位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacCCAGTGAATTCACAATGAAC-3’(SEQ ID NO：44)
筛选C5位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtATATCAATCCCGGCTATTAA-3’(SEQ ID NO：45)
筛选C5位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacTTAATAGCCGGGATTGATAT-3’(SEQ ID NO：46)
筛选C6位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtGGCCTCGCCGAGCGTCGACG-3’(SEQ ID NO：47)
筛选C6位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacGGTCGACGCTCGGCGAGGCG-3’(SEQ ID NO：48)
筛选C6C7位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtAGGATCCGCACCACCTGCCC-3’(SEQ ID NO：49)
筛选C6C7位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacGGGCAGGTGGTGCGGATCCT-3’(SEQ ID NO：50)
筛选C7位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtGTGGAACAACCTCGCCCGGC-3’(SEQ ID NO：51)
筛选C7位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacGCCGGGCGAGGTTGTTCCAC-3’(SEQ ID NO：52)
筛选C5C8位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtGTTCCATCATCGCCAGTCCG-3’(SEQ ID NO：53)
筛选C5C8位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacCGGACTGGCGATGATGGAA-3’(SEQ ID NO：54)
筛选C7C8位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtGAGCGACCCGGCGATCCGGG-3’(SEQ ID NO：55)
筛选C7C8位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacCCCGGATCGCCGGGTCGCTC-3’(SEQ ID NO：56)
筛选C9位碱基转变的spacer的5’引物序列：
5’-tagtCGGATAATCCTGCACGCGCA-3’(SEQ ID NO：57)
筛选C9位碱基转变的spacer的3’引物序列：
5’-aaacTGCGCGTGCAGGATTATCCG-3’(SEQ ID NO：58)
将这些spacer引物按照实施例四的步骤插入的pBECKP质粒中，经测序正确后，再按照实施例六的步骤转化到肺炎克雷伯菌中，并检测它们的碱基转变结果。实验结果如图3所示，在spacer的3-8位胞嘧啶的转变效率很高，而3-8位之外的胞嘧啶转变效率急剧降低，因此 pBECKP系统在肺炎克雷伯菌中的活性窗口为3-8位。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
保藏日期：2018年08月07日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
保藏单位地址：中国武汉武汉大学
保藏编号：CCTCC NO：M 2018529
分类命名：Escherichia coli DH5α-pBECKP大肠杆菌DH5α-pBECKP
序列表
<110> 上海科技大学
<120> 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体
<160> 65
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10256
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtga attgacgcgt attgggatgg taccgggccc cccctcgagg 60
tcgacggtat cgatacggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat aatcggcatt 120
ttcttttgcg tttttatttg ttaactgtta attgtccttg ttcaaggatg ctgtctttga 180
caacagatgt tttcttgcct ttgatgttca gcaggaagct aggcgcaaac gttgattgtt 240
tgtctgcgta gaatcctctg tttgtcatat agcttgtaat cacgacattg tttcctttcg 300
cttgaggtac agcgaagtgt gagtaagtaa aggttacatc gttaggatca agatccattt 360
ttaacacaag gccagttttg ttcagcggct tgtatgggcc agttaaagaa ttagaaacat 420
aaccaagcat gtaaatatcg ttagacgtaa tgccgtcaat cgtcattttt gatccgcggg 480
agtcagtgaa cagataccat ttgccgttca ttttaaagac gttcgcgcgt tcaatttcat 540
ctgttactgt gttagatgca atcagcggtt tcatcacttt tttcagtgtg taatcatcgt 600
ttagctcaat cataccgaga gcgccgtttg ctaactcagc cgtgcgtttt ttatcgcttt 660
gcagaagttt ttgactttct tgacggaaga atgatgtgct tttgccatag tatgctttgt 720
taaataaaga ttcttcgcct tggtagccat cttcagttcc agtgtttgct tcaaatacta 780
agtatttgtg gcctttatct tctacgtagt gaggatctct cagcgtatgg ttgtcgcctg 840
agctgtagtt gccttcatcg atgaactgct gtacattttg atacgttttt ccgtcaccgt 900
caaagattga tttataatcc tctacaccgt tgatgttcaa agagctgtct gatgctgata 960
cgttaacttg tgcagttgtc agtgtttgtt tgccgtaatg tttaccggag aaatcagtgt 1020
agaataaacg gatttttccg tcagatgtaa atgtggctga acctgaccat tcttgtgttt 1080
ggtcttttag gatagaatca tttgcatcga atttgtcgct gtctttaaag acgcggccag 1140
cgtttttcca gctgtcaata gaagtttcgc cgactttttg atagaacatg taaatcgatg 1200
tgtcatccgc atttttagga tctccggcta atgcaaagac gatgtggtag ccgtgatagt 1260
ttgcgacagt gccgtcagcg ttttgtaatg gccagctgtc ccaaacgtcc aggccttttg 1320
cagaagagat atttttaatt gtggacgaat cgaactcagg aacttgatat ttttcatttt 1380
tttgctgttc agggatttgc agcatatcat ggcgtgtaat atgggaaatg ccgtatgttt 1440
ccttatatgg cttttggttc gtttctttcg caaacgcttg agttgcgcct cctgccagca 1500
gtgcggtagt aaaggttaat actgttgctt gttttgcaaa ctttttgatg ttcatcgttc 1560
atgtctcctt ttttatgtac tgtgttagcg gtctgcttct tccagccctc ctgtttgaag 1620
atggcaagtt agttacgcac aataaaaaaa gacctaaaat atgtaagggg tgacgccaaa 1680
gtatacactt tgccctttac acattttagg tcttgcctgc tttatcagta acaaacccgc 1740
gcgatttact tttcgacctc attctattag actctcgttt ggattgcaac tggtctattt 1800
tcctcttttg tttgatagaa aatcataaaa ggatttgcag actacgggcc taaagaacta 1860
aaaaatctat ctgtttcttt tcattctctg tattttttat agtttctgtt gcatgggcat 1920
aaagttgcaa gcttgcaaac atgctttggg taaacatgta ggtattaacg tcaatgcgac 1980
aatagtagca ttgattaaat gagaattagt aagtgtttta cttactaaat tttatttaac 2040
ctaaaaatga accacctgga tgtgtgggat taaaaagtga agagaggagg acatatcaca 2100
tgagtagcga aaccggtccg gttgcagtgg atccgaccct gcgccgtcgc attgaaccgc 2160
acgagtttga agtgttcttt gatccgcgcg agctgcgcaa agaaacttgc ctgctgtacg 2220
agattaactg gggtggccgc catagcatct ggcgccatac cagccagaac accaataagc 2280
acgtggaagt gaattttatt gaaaaattta ccaccgagcg ctacttctgc cctaataccc 2340
gctgcagcat cacctggttt ctgagctgga gcccgtgcgg cgaatgtagt cgcgccatta 2400
ccgagttcct gagccgctat ccgcatgtga ccctgttcat ctacatcgcc cgtctgtacc 2460
atcacgccga tccgcgcaat cgccaaggtc tgcgtgatct gattagcagc ggtgtgacca 2520
tccagatcat gaccgaacaa gagagcggct attgctggcg caacttcgtg aactattctc 2580
cgagcaacga agcccactgg ccgcgttatc cgcatctgtg ggtgcgcctg tatgtgctgg 2640
agctgtactg catcatcctg ggcctgccgc cttgcctgaa tattctgcgc cgtaaacagc 2700
cgcaactgac attcttcacc atcgcactgc agagctgcca ttatcagcgc ctgccgccgc 2760
acattttatg ggccaccggt ctgaaaagcg gtagtgaaac tccgggcaca agcgaaagcg 2820
caaccccgga aagtgataag aaatactcaa taggcttagc tatcggcact aattccgttg 2880
gatgggctgt cataaccgat gaatacaaag taccttcaaa gaaatttaag gtgttgggga 2940
acacagaccg tcattcgatt aaaaagaatc ttatcggtgc cctcctattc gatagtggcg 3000
aaacggcaga ggcgactcgc ctgaaacgaa ccgctcggag aaggtataca cgtcgcaaga 3060
accgaatatg ttacttacaa gaaattttta gcaatgagat ggccaaagtt gacgattctt 3120
tctttcaccg tttggaagag tccttccttg tcgaagagga caagaaacat gaacggcacc 3180
ccatctttgg aaacatagta gatgaggtgg catatcatga aaagtaccca acgatttatc 3240
acctcagaaa aaagctagtt gactcaactg ataaagcgga cctgaggtta atctacttgg 3300
ctcttgccca tatgataaag ttccgtgggc actttctcat tgagggtgat ctaaatccgg 3360
acaactcgga tgtcgacaaa ctgttcatcc agttagtaca aacctataat cagttgtttg 3420
aagagaaccc tataaatgca agtggcgtgg atgcgaaggc tattcttagc gcccgcctct 3480
ctaaatcccg acggctagaa aacctgatcg cacaattacc cggagagaag aaaaatgggt 3540
tgttcggtaa ccttatagcg ctctcactag gcctgacacc aaattttaag tcgaacttcg 3600
acttagctga agataccaaa ttgcagctta gtaaggacac gtacgatgac gatctcgaca 3660
atctactggc acaaattgga gatcagtatg cggacttatt tttggctgcc aaaaacctta 3720
gcgatgcaat cctcctatct gacatactga gagttaatac tgagattacc aaggcgccgt 3780
tatccgcttc aatgatcaaa ctctacgatg aacatcacca agacttgaca cttctcaagg 3840
ccctagtccg tcagcaactg cctgagaaat ataaggaaat attctttgat cagtcgaaaa 3900
acgggtacgc aggttatatt gacggcggag cgagtcaaga ggaattctac aagtttatca 3960
aacccatatt agagaagatg gatgggacgg aagagttgct tgtaaaactc aatcgcgaag 4020
atctactgcg aaagcagcgg actttcgaca acggtatcat tccacatcaa atccacttag 4080
gcgaattgca tgctatactt agaaggcagg aggattttta tccgttcctc aaagacaatc 4140
gtgaaaagat tgagaaaatc ctaacctttc gcatacctta ctatgtggga cccctggccc 4200
gagggaactc tcggttcgca tggatgacaa gaaagtccga agaaacgatt actccatgga 4260
attttgagaa agttgtcgat aaaggtgcgt cagctcaatc gttcatcgag aggatgacca 4320
actttgacaa gaatttaccg aacgaaaaag tattgcctaa gcacagttta ctttacgagt 4380
atttcacagt gtacaatgaa ctcacgaaag ttaagtatgt cactgagggc atgcgtaaac 4440
ccgcctttct aagcggagat cagaagaaag caatagtaga tctgttattc aagaccaacc 4500
gcaaagtgac agttaagcaa ttgaaagagg actactttaa gaaaattgaa tgcttcgatt 4560
ctgtcgagat ctccggggta gaagatcgat ttaatgcgtc acttggtacg tatcatgacc 4620
tcctaaagat aattaaagat aaggacttcc tggataacga agagaatgaa gatatcttag 4680
aagatatagt gttgactctt accctctttg aagatcggga aatgattgag gaaagactaa 4740
aaacatacgc tcacctgttc gacgataagg ttatgaaaca gttaaagagg cgtcgctata 4800
cgggctgggg acgattgtcg cggaaactta tcaacgggat aagagacaag caaagtggta 4860
aaactattct cgattttcta aagagcgacg gcttcgccaa taggaacttt attcagctga 4920
tccatgatga ctctttaacc ttcaaagagg atatacaaaa ggcacaggtt tccggacaag 4980
gggactcatt gcacgaacat attgcgaatc ttgctggttc gccagccatc aaaaagggca 5040
tactccagac agtcaaagta gtggatgagc tagttaaggt catgggacgt cacaaaccgg 5100
aaaacattgt aatcgagatg gcacgcgaaa atcaaacgac tcagaagggg caaaaaaaca 5160
gtcgagagcg gatgaagaga atagaagagg gtattaaaga actgggcagc cagatcttaa 5220
aggagcatcc tgtggaaaat acccaattgc agaacgagaa actttacctc tattacctac 5280
aaaatggaag ggacatgtat gttgatcagg aactggacat aaaccgttta tctgattacg 5340
acgtcgatca cattgtaccc caatcctttt tgaaggacga ttcaatcgac aataaagtgc 5400
ttacacgctc ggataagaac cgagggaaaa gtgacaatgt tccaagcgag gaagtcgtaa 5460
agaaaatgaa gaactattgg cggcagctcc taaatgcgaa actgataacg caaagaaagt 5520
tcgataactt aactaaagct gagaggggtg gcttgtctga acttgacaag gccggattta 5580
ttaaacgtca gctcgtggaa acccgccaaa tcacaaagca tgttgcacag atactagatt 5640
cccgaatgaa tacgaaatac gacgagaacg ataagctgat tcgggaagtc aaagtaatca 5700
ctttaaagtc aaaattggtg tcggacttca gaaaggattt tcaattctat aaagttaggg 5760
agataaataa ctaccaccat gcgcacgacg cttatcttaa tgccgtcgta gggaccgcac 5820
tcattaagaa atacccgaag ctagaaagtg agtttgtgta tggtgattac aaagtttatg 5880
acgtccgtaa gatgatcgcg aaaagcgaac aggagatagg caaggctaca gccaaatact 5940
tcttttattc taacattatg aatttcttta agacggaaat cactctggca aacggagaga 6000
tacgcaaacg acctttaatt gaaaccaatg gggagacagg tgaaatcgta tgggataagg 6060
gccgggactt cgcgacggtg agaaaagttt tgtccatgcc ccaagtcaac atagtaaaga 6120
aaactgaggt gcagaccgga gggttttcaa aggaatcgat tcttccaaaa aggaatagtg 6180
ataagctcat cgctcgtaaa aaggactggg acccgaaaaa gtacggtggc ttcgatagcc 6240
ctacagttgc ctattctgtc ctagtagtgg caaaagttga gaagggaaaa tccaagaaac 6300
tgaagtcagt caaagaatta ttggggataa cgattatgga gcgctcgtct tttgaaaaga 6360
accccatcga cttccttgag gcgaaaggtt acaaggaagt aaaaaaggat ctcataatta 6420
aactaccaaa gtatagtctg tttgagttag aaaatggccg aaaacggatg ttggctagcg 6480
ccggagtgct tcaaaagggg aacgaactcg cactaccgtc taaatacgtg aatttcctgt 6540
atttagcgtc ccattacgag aagttgaaag gttcacctga agataacgaa cagaagcaac 6600
tttttgttga gcagcacaaa cattatctcg acgaaatcat agagcaaatt tcggaattca 6660
gtaagagagt catcctagct gatgccaatc tggacaaagt attaagcgca tacaacaagc 6720
acagggataa acccatacgt gagcaggcgg aaaatattat ccatttgttt actcttacca 6780
acctcggcgc tccagccgca ttcaagtatt ttgacacaac gatagatcgc aaacgataca 6840
cttctaccaa ggaggtgcta gacgcgacac tgattcacca atccatcacg ggattatatg 6900
aaactcggat agatttgtca cagcttgggg gtgactgatg gctggttggc gtactgttgt 6960
ggtaaatacc aagcttgata tcttgacagc tagctcagtc ctaggtataa tactagtcga 7020
gaccattggt ctcagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat 7080
caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttgat atcgaattcc tgcagcccgg 7140
gggatccact agttctagag cggccgccac cgcggtggag ctcatcccaa tggcgcgccg 7200
agcttggctc gagcatggtc atagctgttt cctgctcact cattaggcac cgggatctcg 7260
accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac 7320
tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc 7380
agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct 7440
gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc 7500
caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc atggcggccc cacgggtgcg 7560
catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 7620
gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc 7680
gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 7740
gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc 7800
ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct 7860
ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc 7920
atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac 7980
ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc 8040
ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga 8100
gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct 8160
ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 8220
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 8280
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 8340
cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 8400
atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 8460
ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 8520
ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 8580
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 8640
tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 8700
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 8760
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 8820
tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 8880
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 8940
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 9000
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 9060
actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 9120
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 9180
tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 9240
tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 9300
tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt 9360
caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat 9420
gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat 9480
gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat 9540
gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc 9600
aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa 9660
acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg 9720
gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat 9780
cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt 9840
gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa 9900
cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt 9960
atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac 10020
cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag 10080
aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat 10140
ttgatgctcg atgagttttt ctaagaatta attcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 10200
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctg 10256
<210> 2
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatctt gacagctagc 60
tcagtcctag gtataatact agtcgagacc attggtctca gttttagagc tagaaatagc 120
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 180
tttgatatcg aattcctgca gcccggggga tccactagtt ctagagcggc cgccaccgcg 240
gtggagctc 249
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcactcatt aggcaccggg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggtggcac ttttcgggg 19
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accaagcttg atatcttgac agctagctca gtcctagg 38
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggaattcg atatcaaaaa aagcaccgac tcggtgccac 40
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaaagtgcc acctgtgtaa aacgacggcc agtgaat 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcctaatga gtgagcagga aacagctatg accatgc 37
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggcataaag ttgcaagctt gcaaacatgc tttgggtaaa c 41
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctgtcaaga tatcaagctt ggtatttacc acaacagtac gcc 43
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaccatcat cgccagtccg 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tagtgaacca tcatcgccag tccg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaccggact ggcgatgatg gttc 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaccatcat cgccagtccg 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tagtcgcctc gccgagcgtc gacg 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaccgtcga cgctcggcga ggcg 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccgaccatta ttatcgctga c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgctgttgag ataggacgct 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cagcttccag atcgccacgc 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tagtcagctt ccagatcgcc acgc 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaacgcgtgg cgatctggaa gctg 24
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgagatgct gatgctgtgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaggtggcga tggagtgaat 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccagctccca gcggtccaga 20
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tagtccagct cccagcggtc caga 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaactctgga ccgctgggag ctgg 24
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgtcactgt atcgccgtct 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttttcagagc cttactgccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcttgagcac caccgctgag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctcgttgcgc gcatagcgcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gttcattgtg aattcactgg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atatcaatcc cggctattaa 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggcctcgccg agcgtcgacg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aggatccgca ccacctgccc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtggaacaac ctcgcccggc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gttccatcat cgccagtccg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gagcgacccg gcgatccggg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cggataatcc tgcacgcgc 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tagttcttga gcaccaccgc tgag 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaacctcagc ggtggtgctc aaga 24
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tagtctcgtt gcgcgcatag cgcg 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aaaccgcgct atgcgcgcaa cgag 24
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tagtgttcat tgtgaattca ctgg 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aaacccagtg aattcacaat gaac 24
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tagtatatca atcccggcta ttaa 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aaacttaata gccgggattg atat 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tagtggcctc gccgagcgtc gacg 24
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aaacggtcga cgctcggcga ggcg 24
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tagtaggatc cgcaccacct gccc 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aaacgggcag gtggtgcgga tcct 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tagtgtggaa caacctcgcc cggc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
aaacgccggg cgaggttgtt ccac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tagtgttcca tcatcgccag tccg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aaaccggact ggcgatgatg gaa 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tagtgagcga cccggcgatc cggg 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aaaccccgga tcgccgggtc gctc 24
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tagtcggata atcctgcacg cgca 24
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aaactgcgcg tgcaggatta tccg 24
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagt 35
<210> 60
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83
<210> 61
<211> 5036
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gcaaacatgc tttgggtaaa catgtaggta ttaacgtcaa tgcgacaata gtagcattga 60
ttaaatgaga attagtaagt gttttactta ctaaatttta tttaacctaa aaatgaacca 120
cctggatgtg tgggattaaa aagtgaagag aggaggacat atcacatgag tagcgaaacc 180
ggtccggttg cagtggatcc gaccctgcgc cgtcgcattg aaccgcacga gtttgaagtg 240
ttctttgatc cgcgcgagct gcgcaaagaa acttgcctgc tgtacgagat taactggggt 300
ggccgccata gcatctggcg ccataccagc cagaacacca ataagcacgt ggaagtgaat 360
tttattgaaa aatttaccac cgagcgctac ttctgcccta atacccgctg cagcatcacc 420
tggtttctga gctggagccc gtgcggcgaa tgtagtcgcg ccattaccga gttcctgagc 480
cgctatccgc atgtgaccct gttcatctac atcgcccgtc tgtaccatca cgccgatccg 540
cgcaatcgcc aaggtctgcg tgatctgatt agcagcggtg tgaccatcca gatcatgacc 600
gaacaagaga gcggctattg ctggcgcaac ttcgtgaact attctccgag caacgaagcc 660
cactggccgc gttatccgca tctgtgggtg cgcctgtatg tgctggagct gtactgcatc 720
atcctgggcc tgccgccttg cctgaatatt ctgcgccgta aacagccgca actgacattc 780
ttcaccatcg cactgcagag ctgccattat cagcgcctgc cgccgcacat tttatgggcc 840
accggtctga aaagcggtag tgaaactccg ggcacaagcg aaagcgcaac cccggaaagt 900
gataagaaat actcaatagg cttagctatc ggcacaaata gcgtcggatg ggcggtgatc 960
actgatgaat ataaggttcc gtctaaaaag ttcaaggttc tgggaaatac agaccgccac 1020
agtatcaaaa aaaatcttat aggggctctt ttatttgaca gtggagagac agcggaagcg 1080
actcgtctca aacggacagc tcgtagaagg tatacacgtc ggaagaatcg tatttgttat 1140
ctacaggaga ttttttcaaa tgagatggcg aaagtagatg atagtttctt tcatcgactt 1200
gaagagtctt ttttggtgga agaagacaag aagcatgaac gtcatcctat ttttggaaat 1260
atagtagatg aagttgctta tcatgagaaa tatccaacta tctatcatct gcgaaaaaaa 1320
ttggtagatt ctactgataa agcggatttg cgcttaatct atttggcctt agcgcatatg 1380
attaagtttc gtggtcattt tttgattgag ggagatttaa atcctgataa tagtgatgtg 1440
gacaaactat ttatccagtt ggtacaaacc tacaatcaat tatttgaaga aaaccctatt 1500
aacgcaagtg gagtagatgc taaagcgatt ctttctgcac gattgagtaa atcaagacga 1560
ttagaaaatc tcattgctca gctccccggt gagaagaaaa atggcttatt tgggaatctc 1620
attgctttgt cattgggttt gacccctaat tttaaatcaa attttgattt ggcagaagat 1680
gctaaattac agctttcaaa agatacttac gatgatgatt tagataattt attggcgcaa 1740
attggagatc aatatgctga tttgtttttg gcagctaaga atttatcaga tgctatttta 1800
ctttcagata tcctaagagt aaatactgaa ataactaagg ctcccctatc agcttcaatg 1860
attaaacgct acgatgaaca tcatcaagac ttgactcttt taaaagcttt agttcgacaa 1920
caacttccag aaaagtataa agaaatcttt tttgatcaat caaaaaacgg atatgcaggt 1980
tatattgatg ggggagctag ccaagaagaa ttttataaat ttatcaaacc aattttagaa 2040
aaaatggatg gtactgagga attattggtg aaactaaatc gtgaagattt gctgcgcaag 2100
caacggacct ttgacaacgg ctctattccc catcaaattc acttgggtga gctgcatgct 2160
attttgagaa gacaagaaga cttttatcca tttttaaaag acaatcgtga gaagattgaa 2220
aaaatcttga cttttcgaat tccttattat gttggtccat tggcgcgtgg caatagtcgt 2280
tttgcatgga tgactcggaa gtctgaagaa acaattaccc catggaattt tgaagaagtt 2340
gtcgataaag gtgcttcagc tcaatcattt attgaacgca tgacaaactt tgataaaaat 2400
cttccaaatg aaaaagtact accaaaacat agtttgcttt atgagtattt tacggtttat 2460
aacgaattga caaaggtcaa atatgttact gaaggaatgc gaaaaccagc atttctttca 2520
ggtgaacaga agaaagccat tgttgattta ctcttcaaaa caaatcgaaa agtaaccgtt 2580
aagcaattaa aagaagatta tttcaaaaaa atagaatgtt ttgatagtgt tgaaatttca 2640
ggagttgaag atagatttaa tgcttcatta ggtacctacc atgatttgct aaaaattatt 2700
aaagataaag attttttgga taatgaagaa aatgaagata tcttagagga tattgtttta 2760
acattgacct tatttgaaga tagggagatg attgaggaaa gacttaaaac atatgctcac 2820
ctctttgatg ataaggtgat gaaacagctt aaacgtcgcc gttatactgg ttggggacgt 2880
ttgtctcgaa aattgattaa tggtattagg gataagcaat ctggcaaaac aatattagat 2940
tttttgaaat cagatggttt tgccaatcgc aattttatgc agctgatcca tgatgatagt 3000
ttgacattta aagaagacat tcaaaaagca caagtgtctg gacaaggcga tagtttacat 3060
gaacatattg caaatttagc tggtagccct gctattaaaa aaggtatttt acagactgta 3120
aaagttgttg atgaattggt caaagtaatg gggcggcata agccagaaaa tatcgttatt 3180
gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga aaaattcgcg agagcgtatg 3240
aaacgaatcg aagaaggtat caaagaatta ggaagtcaga ttcttaaaga gcatcctgtt 3300
gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt atctccaaaa tggaagagac 3360
atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg attatgatgt cgatcacatt 3420
gttccacaaa gtttccttaa agacgattca atagacaata aggtcttaac gcgttctgat 3480
aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag tagtcaaaaa gatgaaaaac 3540
tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac gtaagtttga taatttaacg 3600
aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg gttttatcaa acgccaattg 3660
gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt tggatagtcg catgaatact 3720
aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag tgattacctt aaaatctaaa 3780
ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag tacgtgagat taacaattac 3840
catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa ctgctttgat taagaaatat 3900
ccaaaacttg aatcggagtt tgtctatggt gattataaag tttatgatgt tcgtaaaatg 3960
attgctaagt ctgagcaaga aataggcaaa gcaaccgcaa aatatttctt ttactctaat 4020
atcatgaact tcttcaaaac agaaattaca cttgcaaatg gagagattcg caaacgccct 4080
ctaatcgaaa ctaatgggga aactggagaa attgtctggg ataaagggcg agattttgcc 4140
acagtgcgca aagtattgtc catgccccaa gtcaatattg tcaagaaaac agaagtacag 4200
acaggcggat tctccaagga gtcaatttta ccaaaaagaa attcggacaa gcttattgct 4260
cgtaaaaaag actgggatcc aaaaaaatat ggtggttttg atagtccaac ggtagcttat 4320
tcagtcctag tggttgctaa ggtggaaaaa gggaaatcga agaagttaaa atccgttaaa 4380
gagttactag ggatcacaat tatggaaaga agttcctttg aaaaaaatcc gattgacttt 4440
ttagaagcta aaggatataa ggaagttaaa aaagacttaa tcattaaact acctaaatat 4500
agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg ctagtgccgg agaattacaa 4560
aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt ttttatattt agctagtcat 4620
tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa aacaattgtt tgtggagcag 4680
cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg aattttctaa gcgtgttatt 4740
ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 4800
atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctccc 4860
gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac gatatacgtc tacaaaagaa 4920
gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc tttatgaaac acgcattgat 4980
ttgagtcagc taggaggtga ctgatggctg gttggcgtac tgttgtggta aatacc 5036
<210> 62
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gcaaacatgc tttgggtaaa catgtaggta ttaacgtcaa tgcgacaata gtagcattga 60
ttaaatgaga attagtaagt gttttactta ctaaatttta tttaacctaa aaatgaacca 120
cctggatgtg tgggattaaa aagtgaagag aggaggacat atcac 165
<210> 63
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
atgagtagcg aaaccggtcc ggttgcagtg gatccgaccc tgcgccgtcg cattgaaccg 60
cacgagtttg aagtgttctt tgatccgcgc gagctgcgca aagaaacttg cctgctgtac 120
gagattaact ggggtggccg ccatagcatc tggcgccata ccagccagaa caccaataag 180
cacgtggaag tgaattttat tgaaaaattt accaccgagc gctacttctg ccctaatacc 240
cgctgcagca tcacctggtt tctgagctgg agcccgtgcg gcgaatgtag tcgcgccatt 300
accgagttcc tgagccgcta tccgcatgtg accctgttca tctacatcgc ccgtctgtac 360
catcacgccg atccgcgcaa tcgccaaggt ctgcgtgatc tgattagcag cggtgtgacc 420
atccagatca tgaccgaaca agagagcggc tattgctggc gcaacttcgt gaactattct 480
ccgagcaacg aagcccactg gccgcgttat ccgcatctgt gggtgcgcct gtatgtgctg 540
gagctgtact gcatcatcct gggcctgccg ccttgcctga atattctgcg ccgtaaacag 600
ccgcaactga cattcttcac catcgcactg cagagctgcc attatcagcg cctgccgccg 660
cacattttat gggccaccgg tctgaaa 687
<210> 64
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
agcggtagtg aaactccggg cacaagcgaa agcgcaaccc cggaaagt 48
<210> 65
<211> 4104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gataagaaat actcaatagg cttagctatc ggcacaaata gcgtcggatg ggcggtgatc 60
actgatgaat ataaggttcc gtctaaaaag ttcaaggttc tgggaaatac agaccgccac 120
agtatcaaaa aaaatcttat aggggctctt ttatttgaca gtggagagac agcggaagcg 180
actcgtctca aacggacagc tcgtagaagg tatacacgtc ggaagaatcg tatttgttat 240
ctacaggaga ttttttcaaa tgagatggcg aaagtagatg atagtttctt tcatcgactt 300
gaagagtctt ttttggtgga agaagacaag aagcatgaac gtcatcctat ttttggaaat 360
atagtagatg aagttgctta tcatgagaaa tatccaacta tctatcatct gcgaaaaaaa 420
ttggtagatt ctactgataa agcggatttg cgcttaatct atttggcctt agcgcatatg 480
attaagtttc gtggtcattt tttgattgag ggagatttaa atcctgataa tagtgatgtg 540
gacaaactat ttatccagtt ggtacaaacc tacaatcaat tatttgaaga aaaccctatt 600
aacgcaagtg gagtagatgc taaagcgatt ctttctgcac gattgagtaa atcaagacga 660
ttagaaaatc tcattgctca gctccccggt gagaagaaaa atggcttatt tgggaatctc 720
attgctttgt cattgggttt gacccctaat tttaaatcaa attttgattt ggcagaagat 780
gctaaattac agctttcaaa agatacttac gatgatgatt tagataattt attggcgcaa 840
attggagatc aatatgctga tttgtttttg gcagctaaga atttatcaga tgctatttta 900
ctttcagata tcctaagagt aaatactgaa ataactaagg ctcccctatc agcttcaatg 960
attaaacgct acgatgaaca tcatcaagac ttgactcttt taaaagcttt agttcgacaa 1020
caacttccag aaaagtataa agaaatcttt tttgatcaat caaaaaacgg atatgcaggt 1080
tatattgatg ggggagctag ccaagaagaa ttttataaat ttatcaaacc aattttagaa 1140
aaaatggatg gtactgagga attattggtg aaactaaatc gtgaagattt gctgcgcaag 1200
caacggacct ttgacaacgg ctctattccc catcaaattc acttgggtga gctgcatgct 1260
attttgagaa gacaagaaga cttttatcca tttttaaaag acaatcgtga gaagattgaa 1320
aaaatcttga cttttcgaat tccttattat gttggtccat tggcgcgtgg caatagtcgt 1380
tttgcatgga tgactcggaa gtctgaagaa acaattaccc catggaattt tgaagaagtt 1440
gtcgataaag gtgcttcagc tcaatcattt attgaacgca tgacaaactt tgataaaaat 1500
cttccaaatg aaaaagtact accaaaacat agtttgcttt atgagtattt tacggtttat 1560
aacgaattga caaaggtcaa atatgttact gaaggaatgc gaaaaccagc atttctttca 1620
ggtgaacaga agaaagccat tgttgattta ctcttcaaaa caaatcgaaa agtaaccgtt 1680
aagcaattaa aagaagatta tttcaaaaaa atagaatgtt ttgatagtgt tgaaatttca 1740
ggagttgaag atagatttaa tgcttcatta ggtacctacc atgatttgct aaaaattatt 1800
aaagataaag attttttgga taatgaagaa aatgaagata tcttagagga tattgtttta 1860
acattgacct tatttgaaga tagggagatg attgaggaaa gacttaaaac atatgctcac 1920
ctctttgatg ataaggtgat gaaacagctt aaacgtcgcc gttatactgg ttggggacgt 1980
ttgtctcgaa aattgattaa tggtattagg gataagcaat ctggcaaaac aatattagat 2040
tttttgaaat cagatggttt tgccaatcgc aattttatgc agctgatcca tgatgatagt 2100
ttgacattta aagaagacat tcaaaaagca caagtgtctg gacaaggcga tagtttacat 2160
gaacatattg caaatttagc tggtagccct gctattaaaa aaggtatttt acagactgta 2220
aaagttgttg atgaattggt caaagtaatg gggcggcata agccagaaaa tatcgttatt 2280
gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga aaaattcgcg agagcgtatg 2340
aaacgaatcg aagaaggtat caaagaatta ggaagtcaga ttcttaaaga gcatcctgtt 2400
gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt atctccaaaa tggaagagac 2460
atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg attatgatgt cgatcacatt 2520
gttccacaaa gtttccttaa agacgattca atagacaata aggtcttaac gcgttctgat 2580
aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag tagtcaaaaa gatgaaaaac 2640
tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac gtaagtttga taatttaacg 2700
aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg gttttatcaa acgccaattg 2760
gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt tggatagtcg catgaatact 2820
aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag tgattacctt aaaatctaaa 2880
ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag tacgtgagat taacaattac 2940
catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa ctgctttgat taagaaatat 3000
ccaaaacttg aatcggagtt tgtctatggt gattataaag tttatgatgt tcgtaaaatg 3060
attgctaagt ctgagcaaga aataggcaaa gcaaccgcaa aatatttctt ttactctaat 3120
atcatgaact tcttcaaaac agaaattaca cttgcaaatg gagagattcg caaacgccct 3180
ctaatcgaaa ctaatgggga aactggagaa attgtctggg ataaagggcg agattttgcc 3240
acagtgcgca aagtattgtc catgccccaa gtcaatattg tcaagaaaac agaagtacag 3300
acaggcggat tctccaagga gtcaatttta ccaaaaagaa attcggacaa gcttattgct 3360
cgtaaaaaag actgggatcc aaaaaaatat ggtggttttg atagtccaac ggtagcttat 3420
tcagtcctag tggttgctaa ggtggaaaaa gggaaatcga agaagttaaa atccgttaaa 3480
gagttactag ggatcacaat tatggaaaga agttcctttg aaaaaaatcc gattgacttt 3540
ttagaagcta aaggatataa ggaagttaaa aaagacttaa tcattaaact acctaaatat 3600
agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg ctagtgccgg agaattacaa 3660
aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt ttttatattt agctagtcat 3720
tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa aacaattgtt tgtggagcag 3780
cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg aattttctaa gcgtgttatt 3840
ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 3900
atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctccc 3960
gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac gatatacgtc tacaaaagaa 4020
gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc tttatgaaac acgcattgat 4080
ttgagtcagc taggaggtga ctga 4104
Claims (12)
1.一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体，所述表达载体包括APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件和sgRNA表达元件，所述APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件包括第一启动子表达元件、APOBEC1表达元件和Cas9D10A表达元件，所述APOBEC1表达元件的序列如SEQ ID NO.63所示，所述Cas9D10A表达元件的序列如SEQ ID NO.65所示，所述sgRNA表达元件包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件，所述sgRNA框架元件的序列如SEQID NO.60所示。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，APOBEC1表达元件和Cas9D10A表达元件之间还设有linker表达元件，所述linker表达元件的序列如SEQ ID NO.64所示；
和/或，所述第一启动子表达元件的序列如SEQ ID NO.62所示。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述APOBEC1-Cas9D10A融合蛋白表达元件自5’端至3’端依次包括第一启动子表达元件、APOBEC1表达元件、linker表达元件和Cas9D10A表达元件。
4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述多克隆位点包括一个或多个BsaI酶切位点；
和/或，所述第二启动子表达元件的序列如SEQ ID NO.59所示；
和/或，所述sgRNA表达元件自5’端至3’端依次包括第二启动子表达元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。
5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括如下技术特征中的一个或多个：
A1)所述表达载体还包括抗性基因表达元件，优选为肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因表达元件，更优选为kmR表达元件；
A2)所述表达载体还包括毒性蛋白基因表达元件，优选为肺炎克雷伯菌株敏感毒性蛋白基因表达元件，更优选为sacB表达元件；
A3)所述表达载体还包括质粒复制子，所述质粒复制子优选为ColE1；
A4)所述表达载体还包括控制元件，所述控制元件优选为rop。
6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是由pET质粒构建获得，优选为pET28a质粒；
和/或，所述表达载体所对应的spacer片段为3-8位胞嘧啶的spacer片段；
和/或，所述表达载体所对应的spacer片段的长度为19～21个碱基序列。
7.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种工程菌，包括如权利要求1-7任一权利要求所述的表达载体。
9.如权利要求8所述的工程菌，其特征在于，其保藏号为CCTCC M 2018529。
10.如权利要求1-7任一权利要求所述的表达载体、或如权利要求8-9任一权利要求所述的工程菌在肺炎克雷伯菌的基因编辑中的用途。
11.一种肺炎克雷伯菌构建试剂盒，包括如权利要求1-7任一权利要求所述的表达载体。
12.一种肺炎克雷伯菌的构建方法，包括：将如权利要求1-7任一权利要求所述的表达载体的多克隆位点插入spacer序列，所得质粒转染肺炎克雷伯菌，培养、筛选。
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2018
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| Publication number | Publication date |
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