CN104109688A

CN104109688A - 一种链霉菌基因组dna大片段体内随机敲除的方法

Info

Publication number: CN104109688A
Application number: CN201410351442.0A
Authority: CN
Inventors: 路志群; 邢述永; 李文雪; 邓自发
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2034-07-23
Also published as: CN104109688B

Abstract

本发明公开了一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，包括：1）构建系列重组质粒pTNL_101、pTNL_103、pTNL_104、pTNL_105为第一个sceS酶切位点随机导入质粒；2）将所构建的重组质粒pTNL_101、pTNL_103、pTNL_104、pTNL_105导入天蓝色链霉菌M145，构建随机染色体大片段缺失的突变子库1；3）构建系列重组质粒pTNL_102为第二个sceS酶切位点随机导入质粒，导入突变子库1，获得突变子库2；4）R2YE平板筛选出大片段敲除突变子，精细定位染色体删除区段，并在出发菌株中进行定位敲除予以验证。本发明可以有效随机去除染色体区域可以去除的部分，目前定位结果表明敲除片段长度在2kb-100kb之间，为改造链霉菌为抗生素异源表达宿主和底盘生物提供依据。

Description

一种链霉菌基因组 DNA 大片段体内随机敲除的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法。

背景技术

链霉菌属于高GC含量的革兰氏阳性细菌，是放线菌中的一个大的类群。链霉菌具有复杂的发育和分化周期，在固体培养基上呈丝状生长并产生孢子。链霉菌属的不同种中鉴定了约6000种抗生素和生理活性物质，占已报道的微生物来源药物的约一半（Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot (Tokyo) 58(1):1-26）。天蓝色链霉菌是链霉菌研究的模式菌株，遗传背景研究相对清晰。2002年，天蓝色链霉菌完成全基因组测序（Bentley S. D, K. F. Chater, A. M. Cerdeno-Tarraga, G. L. Challis, N. R. Thomson, K. D. James, D. E. Harris, M. A. Quail, H. Kieser, D. Harper, A. Bateman, S. Brown, G. Chandra, C. W. Chen, M. Collins, A. Cronin, A. Fraser, A. Goble, J. Hidalgo, T. Hornsby, S. Howarth, C. H. Huang, T. Kieser, L. Larke, L. Murphy, K. Oliver, S. O'Neil, E. Rabbinowitsch, M. A. Rajandream, K. Rutherford, S. Rutter, K. Seeger, D. Saunders, S. Sharp, R. Squares, S. Squares, K. Taylor, T. Warren, A. Wietzorrek, J. Woodward, B. G. Barrell, J. Parkhill, and D. A. Hopwood. 2002. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature 417:141-147.），目前已经开发出商用的DNA芯片检测平台，可以对染色体水平的差异进行即时快速地分析。

构建基因缺失突变是研究微生物生理及基因功能的常用方法。由于链霉菌生长慢，常规的基因敲除方法耗时较长，不适合大规模基因缺失突变研究。转座子插入突变是一个相对快速有效的基因失活方式，可以很快建立一个覆盖全基因组的基因插入失活突变库。转座子插入缺失可以大致分为体内体外两种。2001年，Gehring等报道利用Tn5转座子对已有的天蓝色链霉菌基因组文库进行随机插入突变，建立了一个以大肠杆菌为宿主的突变文库，抽提突变文库后使用原生质体转化和接合转移等手段转入天蓝色链霉菌M145中，抗性筛选双交换后得到了一个在基因组上随机插入的突变库，平板筛选得到5个带有明显表型变化的突变株，发现了一些调控基因（Gehring A. M., Nodwell J. R., Beverley S. M., Losick R. 2000. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 97(17):9642-7.）。随后的2004年，他们用相同的方法又发现了另外一些生物合成相关的酶影响了天蓝色链霉菌M145的表型（Gehring A. M., Wang S. T., Kearns D. B., Storer N. Y., Losick R. 2004. Novel genes that influence development in Streptomyces coelicolor. J Bacteriol. 186(11):3570-7.）。该方法可以做到基因组范围内的随机突变，但是转座子的转座突变过程在大肠杆菌内完成，仍需要将突变子从大肠杆菌导入链霉菌中，影响了效率。

Ikeda等采用体内转座子插入突变用于除虫链霉菌研究，通过带有Tn3家族转座子Tn4560的温敏质粒转入除虫链霉菌，得到了8个营养缺陷型突变子、10个产生寡霉素而不产生阿维菌素的突变株、5个产生阿维菌素不产生寡霉素的突变株和1个只产生阿维菌素B1a和B2a产物的突变株（Ikeda H., Takada Y., Pang C. H., Tanaka H., Omura S. 1993. Transposon mutagenesis by Tn4560 and applications with avermectin-producing Streptomyces avermitilis. J Bacteriol. 175(7):2077-82.）。Weaden等将带有插入序列IS6100的温敏质粒转入除虫链霉菌，也得到了营养缺陷突变株（Weaden J., Dyson P. 1998. Transposon mutagenesis with IS6100 in the avermectin-producer Streptomyces avermitilis. Microbiology 144 ( Pt 7):1963-70.）。Pitman等发表了利用IS6家族来源的微型转座子Tn1792进行除虫链霉菌全基因组的随机插入突变，分别得到了bld表型相关、whi表型相关和不产寡霉素的除虫链霉菌突变株（Pitman A., Herron P., Dyson P. 2002. Cointegrate resolution following transposition of Tn1792 in Streptomyces avermitilis facilitates analysis of transposon-tagged genes. J Microbiol Methods 49(1):89-96.）。最近，Bilyk等在天蓝色链霉菌M145和白色链霉菌中表达了（Streptomyces albus）经过密码子优化的Haematobia irritans来源的转座子Himar1，同时得到了满意的转座效果（Bilyk B, Weber S, Myronovskyi M, Bilyk O, Petzke L, Luzhetskyy A. 2013. In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1. Appl Microbiol Biotechnol. 97(1):351-9.）。该转座子插入热点为AT富集区，预示进一步研究中，我们可以组合使用不同来源的微型转座子对相关链霉菌进行插入缺失研究并开发更好的基于转座子的链霉菌基因组研究手段。

IS204是诺卡氏菌来源的微型转座子，Ya等首先发现向星形诺卡菌（Nocardia asteroids mexicana）YP21中转入大肠杆菌和诺卡氏菌穿梭质粒pCY104时，质粒分子量变大，随后的克隆测序表明在质粒上插入了微型转座子。测序表明该转座子和文献报道的链霉菌来源的IS1096和Tn4652同源（Yao W., Yang Y., Chiao J. 1994. IS204, an insertion sequence from Nocardia asteroides (mexicana) YP21. Plasmid 32(3):262-9.）。Zhang等对该微型转座子进行了进一步的研究，发现IS204衍生的微型转座子可以在模式菌株天蓝色链霉菌基因组内进行高效随机插入，并且Southern 杂交表明其在天蓝色链霉菌染色体范围内随机插入后只有稳定的一个拷贝（Zhang X., Bao Y., Shi X., Ou X., Zhou P., Ding X. 2012. Efficient transposition of IS204-derived plasmids in Streptomyces coelicolor. J Microbiol Methods 88(1): 67-72.），相关技术已经申请了专利。Ou等利用该微型转座子筛选得到了天蓝色链霉菌内影响发育分化的基因和负调控十一烷基灵菌红素的新基因（Ou X., Zhang B., Zhang L., Zhao G., Ding X. 2009. Characterization of rrdA, a TetR family protein gene involved in the regulation of secondary metabolism in Streptomyces coelicolor. Appl Environ Microbiol 75(7):2158-65.）。研究表明，IS204来源的微型转座子适应范围广，可以用于不同链霉菌染色体的随机插入突变。通过预先在染色体上导入该转座子的转座酶，随后导入带有转座特异序列的质粒，同样可以使该质粒在染色体范围内随机插入（Hopwood DA. 1999. Forty years of genetics with Streptomyces: from in vivo through in vitro to in silico. Microbiology 145 ( Pt 9):2183-2202.）。

已有研究表明用于天蓝色链霉菌的重组敲除相关的操作有传统重组敲除方法和以cosmid文库为工具的PCR-targeting技术（Gust B, Challis GL, Fowler K, Kieser T, Chater KF. 2003. PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proc Natl Acad Sci U S A 100(4):1541-1546.）。基因组编辑核酸酶（Gene-editing nucleases）包括包括三大类：锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs），转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和归巢核酸内切酶（engineered meganucleases），它们的成功使用被《自然—方法学》评为2011年度研究方法。天蓝色链霉菌M145基因组中不存在归巢核酸内切酶I-sce I酶切位点，使用天蓝色链霉菌偏好的密码子，对I-sce I进行全基因密码子优化（命名为sceS），利用基因合成技术合成后导入天蓝色链霉菌中，成功实现了天蓝色链霉菌放线紫红素生物合成基因簇的无痕敲除（Zhiqun Lu, Pengfei Xie, and Zhongjun Qin. 2010. Promotion of markerless deletion of the actinorhodin biosynthetic gene cluster in Streptomyces coelicolor. Acta Biochimica et Biophysica Sinica 42 (10) :717-21.）。相比其他方法，sceS系统具有无痕、快速和高效等优点，尤其适用于基因组大片段敲除和重要次级代谢产物生物合成基因簇的组合生物化学研究。

随着测序的普及和功能基因组学研究的发展，人们认识到用于维持微生物基本生存和繁殖需要的基因数远远少于目前微生物拥有的基因数量。以生殖支原体为例，实验发现其需要的最少基因数仅为387个（John I. Glass, Nacyra Assad-Garcia, Nina Alperovich, Shibu Yooseph, Matthew R. Lewis, Mahir Maruf, Clyde A. Hutchison III, Hamilton O. Smith*, J. Craig Venter. 2006. Essential genes of a minimal bacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 425–430.）。基因组缩减可以增加前体供应降低微生物遗传网络之间的复杂度和冗余度，起到“精简机构”的作用，是目前研究的热点。通过基因组缩减得到性状不变或改良的微生物菌株在大肠杆菌内得到了证明：Posfai等通过Red和I-sce I系统，在MDS12的基础之上连续去除基因组内的K岛和可移动元件等“垃圾序列”，得到了MDS41、MDS 42和MDS43等系列菌株，相对于MG1655，基因组分别缩小了14.28%、14.3%和15.27%。其中，MDS42的电转化效率相比出发菌株MG1655有了2个数量级的提高，基本上达到常用的基因组文库构建用大肠杆菌DH10B的电转化水平。通过进一步对MDS42进行苏氨酸产生的相关途径改造，得到的菌株MDS205相比野生株苏氨酸产量提高了83%，证明通过缩减基因组非必需区域可以得到一些性状改良的优秀菌株（Posfai G, Plunkett G, Feher T, et a1. 2006. Emergent properties of reduced-genome Escheriehia coli[J]. Science 312(5776):1044-1046.）。除此之外，枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母，裂殖酵母等都曾经或正在进行基因组的缩减工作。值得提出的是，当酿酒酵母基因组缩减了531.5kb（5%），产乙醇量提高了1.8倍，产甘油量提高2倍（覃重军, 周敏. 合成,重构和改造微生物基因组. 生物产业技术, 2010年卷05期.）；日本旭硝子公司通过无标记敲除手段去除裂殖酵母的7个蛋白酶降解基因和非必需区段，并将基因导入到基因组上的稳定基因座的方法，使人生长激素的分泌量提高至出发菌株的40倍（久保田. 日本旭硝子公司成功制造出最小基因组工厂. 生物产业技术, 2009年卷01期.）。最小基因组、底盘生物的改造和细胞工厂构建等系列研究目前都在关注染色体大片段的删除，它们之间存在一定程度的联系和区别：最小基因组研究能够维持微生物基本生长所需的最少基因数量；底盘生物改造关注于一个背景清晰地微生物“基底”用于遗传网络的研究与表达；在改造过程中，如何删去合适的染色体“非必需”区段，在不影响宿主生长的前提下去除杂质、表达更多的目标产物是细胞工厂研究的目标。

模式菌株天蓝色链霉菌基因组大小约为8.7 Mb，目前已知的次级代谢产物生物合成基因簇已超过20个；除虫链霉菌基因组大小约为9 Mb，其中次级代谢产物生物合成基因簇所占基因组大小约为6.4%（Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A, Shinose M, Kikuchi H, Shiba T, Sakaki Y, Hattori M, Omura S. 2003. Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis. Nat Biotechnol. 21(5):526-531.）。这些次生代谢产物生物合成基因簇序列的存在都可能影响到目的产物生物合成基因簇的工作。实践表明，链霉菌作为抗生素生物合成的宿主菌具有先天优势。随着抗生素生物合成研究的深入及合成生物学的发展，链霉菌作为宿主改造用于抗生素的异源表达已成为关注的方向，如Gomez-Escribano等在天蓝色链霉菌M145基因组中删除放线紫红素（ACT）、十一烷基灵菌红素（RED）、CPK和CDA生物合成基因簇，总长约173 kb，导入氯霉素和纺锤菌素基因簇后产量均得到了提高。在此基础上进一步将点突变后的编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因和核糖体蛋白S12的rpsL基因替换原有染色体上的相关基因，氯霉素和纺锤菌素的产量分别提高了40倍和30倍（Gomez-Escribano J. P., Bibb M. J. 2011. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microb Biotechnol. 4(2):207-15.）。Komatsue等在工业菌株除虫链霉菌染色体上系统地去除了1.4Mb 的非必需区，该菌株不带内源的主要次级代谢产物生物合成基因簇。通过抗生素异源表达验证，可以高效表达来自灰色链霉菌（S. griseus）的链霉素（streptomycin）、带小棒链霉菌（S. clavuligerus）的头霉素C（cephamycin C）和来自钝项螺旋藻（S. platensis）Mer-11107 的抗肿瘤药物pladienolide（Komatsu M, Uchiyama T, Omura S, Cane DE, Ikeda H. 2010. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 107 (6):264 6-2651.）。

链霉菌作为重要的微生物遗传研究菌株和重要的抗生素生产菌株，基因组大片段敲除技术目前大致分为以下三种：（1）传统方法构建敲除或替换载体，（2）建立在基因组文库基础之上的PCR-targeting方法，（3）sceS敲除系统，这些方法均为定点敲除技术，无法做到大规模随机敲除。全基因组范围内的随机敲除方式分为基于基因组文库的大肠杆菌微型转座子随机突变系统和基于链霉菌自身的体内微型转座子随机插入突变系统。链霉菌的大片段敲除系统只能定位敲除染色体上的特定区段；微型转座子系统虽然高效方便，不能用于基因组大片段敲除。合成生物学时代可能要求对链霉菌在基因组水平上进行大规模改造，培育出用于天然产物调控研究和异源表达的底盘生物。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，有效随机去除染色体区域可以去除的部分，为改造链霉菌为抗生素异源表达宿主和底盘生物提供依据。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，包括以下步骤：

1）构建系列重组质粒pTNL_101或pTNL_103或pTNL_104或pTNL_105为第一个SceS酶切位点随机导入质粒，各质粒中转座酶编码序列之前分别带有ermE启动子、neo启动子、hrdB基因启动子和tcp830诱导型启动子；

2）将所构建的重组质粒pTNL_101或pTNL_103或pTNL_104或pTNL_105导入天蓝色链霉菌M145，构建随机染色体大片段缺失的突变子库tn1；

3）构建系列重组质粒pTNL_102为第二个SceS酶切位点随机导入质粒，导入突变子库1，获得突变子库tn2；

4）利用大肠杆菌ET12567导入重组质粒pLu_101至突变子库tn2，通过硫链丝菌素诱导表达归巢核酸内切酶SceS，酶切染色体上随机导入的SceS酶切位点，促进染色体上随机导入的两个重叠的不完整的卡那霉素抗性基因片段发生重组，去除之间的染色体片段，通过涂布卡那霉素的方式筛选得到转座子突变子库tn3；

5）利用R₂YE平板评估大片段敲除突变子或利用质粒挽救的方法精细定位染色体删除区段。

步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_101以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、ermE启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_103以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、neo启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_104以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、hrdB基因启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_105以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、tcp830诱导型启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

步骤3）中，所述的重组质粒pTNL_102以pDZY101为模板，PCR带IRR和oriC的片段，随后克隆入带有oriT的壮观霉素抗性基因，最后克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO2所示。

步骤4）中，所述的质粒挽救的方法精细定位染色体删除区段，具体过程为：限制性内切酶ApaⅠ在天蓝色链霉菌染色体上分布均匀，利用该酶酶切染色体后自连转化大肠杆菌，抗性筛选大肠杆菌并抽提质粒，测序即能精确定位敲除区段。

本发明随机将SceS的识别位点带入天蓝色链霉菌基因组中后诱导SceS表达并进行体内酶切，链霉菌随后通过重组修复将两个随机位点之间的DNA片段丢失。重组臂为人为设计的两个卡那霉素抗性基因不完整片段，经过重组后可以形成一个完整的卡那霉素抗性基因，便于用kanamycin平板进行突变子的筛选。实现表明，本发明可以有效随机去除染色体区域可以去除的部分，目前定位结果表明敲除片段长度可在2kb-100kb之间，甚至可以筛选到大于该敲除区域的突变子。

有益效果：有现有技术相比，本发明的方法不仅可以快速得到基因组随机大片段缺失突变库，而且可以利用随机大片段缺失的优点，进行染色体不同区域内影响同一抗生素产量的未知功能的基因的发现，是进行链霉菌底盘生物改造和细胞工厂研究的有力工具。同时，本发明在不影响放线紫红素产量或天蓝色链霉菌生长和表型的前提下，精简天蓝色链霉菌M145和ZM11的基因组规模，通过比较尝试，为改造链霉菌为抗生素异源表达宿主和底盘生物提供依据。实现表明，本发明可以有效随机去除染色体区域可以去除的部分，目前定位结果表明敲除片段长度在2kb-100kb之间，甚至可以筛选到大于该敲除区域的突变子。

附图说明

图1是链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法的流程图；

图2是pTNL_101质粒的结构示意图；

图3是pTNL_103质粒的结构示意图；

图4是pTNL_104质粒的结构示意图；

图5是pTNL_105质粒的结构示意图；

图6是pTNL_102质粒的结构示意图；

图7是质粒挽救的方法鉴定缺失部分片段染色体0.8%琼脂糖凝胶电泳图；

图8是卡那霉素抗性染色体大片段随机缺失突变子的表型结果图；

图9是突变库tn3随机挑取菌落在添加卡那霉素的MS固体平板上的表型结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受这些实施例子的限制。

实施例1

一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，流程图如图1所示，包括以下步骤：

1）质粒构建：pTNL_101、pTNL_102、pTNL_103、pTNL_104和pTNL_105等重组质粒在pDZY101（CN102154268A）基础上采用PCR和常规分子克隆手段完成。

pTNL_101：以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、ermE启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在其上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段（名称为aphII-S，序列如SEQ ID NO.1所示），其结构示意图如图2所示。

pTNL_103、pTNL_104和pTNL_105构建方法同pTNL_101，区别在于启动转座酶的启动子不同，分别为neo启动子、hrdB基因启动子和tcp830诱导型启动子，其结构示意图分别如图3、图4、图5所示。

pTNL_102：以pDZY101为模板，PCR带IRR和oriC的片段，随后克隆入带有oriT的壮观霉素抗性基因，最后克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段（名称为aphII-X，序列如SEQ ID NO.2所示），其结构示意图如图6所示。

2）将所构建的重组质粒pTNL_101或pTNL_103或pTNL_104或pTNL_105导入天蓝色链霉菌M145，构建随机染色体大片段缺失的突变子库tn1；将重组质粒pTNL_102，导入突变子库1，获得突变子库tn2；

3）利用大肠杆菌ET12567导入重组质粒pLu_101（Zhiqun Lu, Pengfei Xie, and Zhongjun Qin. 2010. Promotion of markerless deletion of the actinorhodin biosynthetic gene cluster in Streptomyces coelicolor. Acta Biochimica et Biophysica Sinica 42 (10) :717-21.）至突变子库tn2（pLu_101上带有sceS基因（accession no. HM355590）和ΦC31整合位点），该质粒通过硫链丝菌素诱导表达归巢核酸内切酶SceS，酶切染色体上随机导入的SceS酶切位点，促进染色体上随机导入的两个重叠的不完整的卡那霉素抗性基因片段发生重组，去除之间的染色体片段，通过涂布卡那霉素的方式简单筛选得到转座子突变子库tn3；以上操作方法也可参照链霉菌操作手册(Kieser et al., 2000)进行。

4）利用R₂YE平板评估大片段敲除突变子或利用质粒挽救的方法精细定位染色体删除区段。

R₂YE培养基是天蓝色链霉菌放线紫红素产生的理想培养基，利用R₂YE固体平板可以直观的观察天蓝色链霉菌的产色素情况。通过平板观察初步得到一些在放线紫红素产量上发生变化或生长和表型和出发菌株M145无明显变化的缺失菌株。

通过质粒挽救（plasmid rescue）方法进行缺失区段的定位。具体过程为：限制性内切酶ApaⅠ在天蓝色链霉菌染色体上分布均匀（约2000-4000个碱基含有一个酶切位点），利用该酶酶切染色体后自连转化大肠杆菌，抗性筛选大肠杆菌并抽提质粒，测序即能精确定位敲除区段。

实施例2

将质粒pTNL101和pDZY101转化大肠杆菌ET12567，分别挑取单菌落接入5mL LB液体培养基培养过夜，以1%的接种量转接100mL的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀值约为0.3，离心后使用2×YT培养基洗涤两次，加入3mL 2×YT培养基混匀菌体，分成6等份待用。使用6mL 2×YT培养基，加入天蓝色链霉菌孢子悬液120μL，50℃处理10min后分成6等份，与上述菌体混匀后离心涂布MS固体培养基。30℃培养20h后在3个pTNL101结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和阿泊拉菌素抗生素（终浓度分别为30μg/mL和50μg/mL），3个pDZY101结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和阿泊拉菌素（终浓度分别为30μg/mL和50μg/mL），继续30℃培养3d后进行平板菌落计数，分别计算转座子的效率（效率与文献基本一致，约为2 × 10⁻ ⁶CFU）。收集以上长出的天蓝色链霉菌M145（突变库tn1）孢子悬液，将带有重组质粒pTNL102的ET12567结合转移以上孢子悬液，离心涂布MS固体培养基。30℃培养20h后在3个pTNL102结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库tn1）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和壮观霉素（终浓度分别为30μg/mL和100μg/mL），长出的链霉菌单菌落集合命名为突变库tn2，30℃培养7-10天收集突变库2菌落产生的混合孢子，制成适当浓度悬液（1.0×10⁸-10⁹ cfu/mL），最后将带有重组质粒pLu101的ET12567结合转移以上孢子悬液（突变库2），30℃培养20h后在3个pLu101结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库2）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和卡那霉素（终浓度分别为30μg/mL和30μg/mL），长出的菌落（突变库tn3）可能已经发生了基因组DNA大片段的随机敲除，对结果进行鉴定。

对突变库tn3随机挑取有抗性的链霉菌单菌落11个，在含有40μg/mL的卡那霉素的TSB培养基中培养3-5天，使用质粒挽救的方法获取经过插入后重组得到的缺失片段。具体过程为：限制性内切酶ApaⅠ在天蓝色链霉菌染色体上分布均匀（约2000-4000个碱基含有一个酶切位点），利用该酶酶切染色体后自连转化大肠杆菌，抗性筛选大肠杆菌并抽提质粒，测序即能精确定位敲除区段。

质粒电泳结果如图7所示，可见大小不同，初步证明这些菌落可能被随机缺失了染色体上的部分片段。进一步设计测序引物（pTNL_cx1: TGTCGAATGCGCGCAGTGA和pTNL_cx2: AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA）对图7中的1、2和10号质粒进行测序验证，结果表明1号突变子染色体缺失部位为bp2800865-bp2803038（染色体上精确位置），缺失区段大小为2173bp。2号突变子染色体缺失部位为bp3442713-bp3454900，缺失区段大小为12169bp。10号突变子染色体缺失部位为bp86184-bp186814bp，缺失区段大小为100630bp。

如图8所示，测序的3个突变子的表型在R₂YE培养基（R₂YE培养基：蔗糖103 g，K₂SO₄ 0.25 g，MgCl₂.6H₂O 10.12 g，葡萄糖10 g，Casamino acid 0.1 g，微量元素液2 mL，酵母提取物5 g，TES 5.73 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L。1×10⁵ Pa灭菌20 min后每100 mL 加入KH₂PO₄（0.5%）1.0 mL，CaCl₂.2H₂O（5M）0.4mL，NaOH（1 mol/L）0.7mL，L-脯氨酸（20%）1.5mL。微量元素液：ZnCl₂ 40 mg，FeCl₃.6H₂O 200 mg，CuCl₂.2H₂O 10 mg，MnCl₂.4H₂O 10 mg，Na₂B₄O₇.10H₂O 10 mg，(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 10 mg，蒸馏水1 L）上表型不同，30℃培养3天，结果显示1号缺失突变菌株表型和出发菌株相似，2、11和12号片段缺失菌株表型和出发菌株相比已发生变化。

实施例3

将质粒pTNL103和pDZY101转化大肠杆菌ET12567，分别挑取单菌落接入5mL LB液体培养基培养过夜，以1%的接种量转接100mL的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀值约为0.3，离心后使用2×YT培养基洗涤两次，加入3mL 2×YT培养基混匀菌体，分成6等份待用。使用6mL 2×YT培养基，加入天蓝色链霉菌孢子悬液120μL，50℃处理10min后分成6等份，与上述菌体混匀后离心涂布MS固体培养基。30℃培养20h后在3个pTNL101结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和阿泊拉菌素抗生素（终浓度分别为30μg/mL和50μg/mL），3个pDZY101结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和阿泊拉菌素（终浓度分别为30μg/mL和50μg/mL），继续30℃培养3d后进行平板菌落计数，分别计算转座子的效率（效率较实施例2低）。收集以上长出的M145孢子，制成悬液，将带有重组质粒pTNL102的ET12567结合转移以上孢子悬液，离心涂布MS固体培养基。30℃培养20h后在3个pTNL103结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库tn1）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和壮观霉素（终浓度分别为30μg/mL和100μg/mL），长出的链霉菌单菌落集合命名为突变库tn2，30℃培养7-10天收集突变库2菌落产生的混合孢子，制成适当浓度悬液（1.0×10⁸-10⁹ cfu/mL），最后以将带有重组质粒pLu101的ET12567结合转移以上孢子悬液，30℃培养20h后在3个pLu101结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库2）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和卡那霉素（终浓度分别为30μg/mL和30μg/mL），长出的菌落（突变库tn3）已经发生了基因组DNA大片段的随机敲除，对结果进行鉴定。鉴定方法同实施例2，结果显示已经成功实现链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除。

实施例4

将质粒pTNL104和pDZY101转化大肠杆菌ET12567，分别挑取单菌落接入5mL LB液体培养基培养过夜，以1%的接种量转接100mL的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀值约为0.3，离心后使用2×YT培养基洗涤两次，加入3mL 2×YT培养基混匀菌体，分成6等份待用。使用6mL 2×YT培养基，加入天蓝色链霉菌孢子悬液120μL，50℃处理10min后分成6等份，与上述菌体混匀后离心涂布MS固体培养基。30℃培养20h后在3个pTNL101结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和阿泊拉菌素抗生素（终浓度分别为30μg/mL和50μg/mL），3个pDZY101结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和阿泊拉菌素（终浓度分别为30μg/mL和50μg/mL），继续30℃培养3d后进行平板菌落计数，分别计算转座子的效率（效率较实施例2低3个数量级）。收集以上长出的M145孢子，制成悬液，将带有重组质粒pTNL102的ET12567结合转移以上孢子悬液，离心涂布MS固体培养基。30℃培养20h后在3个pTNL104结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库tn1）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和壮观霉素（终浓度分别为30μg/mL和100μg/mL），长出的链霉菌单菌落集合命名为突变库tn2，30℃培养7-10天收集突变库2菌落产生的混合孢子，制成适当浓度悬液（1.0×10⁸-10⁹ cfu/mL），最后以将带有重组质粒pLu101的ET12567结合转移以上孢子悬液，30℃培养20h后在3个pLu101结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库2）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和卡那霉素（终浓度分别为30μg/mL和30μg/mL），长出的菌落（突变库tn3）已经发生了基因组DNA大片段的随机敲除，对结果进行鉴定。鉴定方法同实施例2，结果显示已经成功实现链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除。

实施例5

将质粒pTNL105和pDZY101转化大肠杆菌ET12567，分别挑取单菌落接入5mL LB液体培养基培养过夜，以1%的接种量转接100mL的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀值约为0.3，离心后使用2×YT培养基洗涤两次，加入3mL 2×YT培养基混匀菌体，分成6等份待用。使用6mL 2×YT培养基，加入天蓝色链霉菌孢子悬液120μL，50℃处理10min后分成6等份，与上述菌体混匀后离心涂布MS固体培养基。3个pTNL105结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上( atc终浓度300ng/mL），30℃培养20h后继续在3个平板上涂布萘啶酮酸、硫链丝菌素和阿泊拉菌素（终浓度分别为30μg/mL、30μg/mL和50μg/mL）。3个pDZY101结合转移的天蓝色链霉菌M145固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和阿泊拉菌素（终浓度分别为30μg/mL和50μg/mL），继续30℃培养3d后进行平板菌落计数，分别计算转座子的效率（效率同实施例2基本一致）。收集以上长出的M145孢子，制成悬液，将带有重组质粒pTNL102的ET12567结合转移以上孢子悬液，离心涂布MS固体培养基。30℃培养20h后在3个pTNL102结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库tn1）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和壮观霉素（终浓度分别为30μg/mL和100μg/mL），长出的链霉菌单菌落集合命名为突变库2，30℃培养7-10天收集突变库tn2菌落产生的混合孢子，制成适当浓度悬液（1.0×10⁸-10⁹ cfu/mL），最后以将带有重组质粒pLu101的ET12567接合转移以上孢子悬液，30℃培养20h后在3个pLu101结合转移的天蓝色链霉菌M145（突变库2）固体MS培养基上涂布萘啶酮酸和卡那霉素（终浓度分别为30μg/mL和30μg/mL），长出的菌落（突变库tn3）可以随机挑取菌落进行缺失区段的精确定位以进一步确定染色体上的缺失区位。

该突变库建成后，随机挑选了部分卡那霉素抗性的突变子，划线添加有卡那霉素的MS（黄豆饼粉20 g，甘露醇20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，卡那霉素终浓度50μg/mL）固体培养基平板，30℃培养3-4天，对部分突变子和出发菌株Streptomyces coelicolor M145在这两种培养基上的表型进行了比较，结果如图9所示，表明这些菌均有卡那霉素抗性，和Streptomyces coelicolor M145相比，没有长出菌落的位置为S. coelicolor M145，有一些突变子表型已经产生变化，说明已经随机去除了染色体上的区段。

SEQUENCE LISTING

<110> 南通大学

<120> 一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法

<130> 100

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 838

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> aphII-S序列

<400> 1

gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 60

cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 120

atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 180

gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 240

ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 300

gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 360

cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 420

gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 480

tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 540

gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 600

tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 660

catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 720

ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 780

ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgg 838

<210> 2

<211> 770

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> aphII-X序列

<400> 2

caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 60

tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 120

tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt 180

ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 240

gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 300

ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 360

ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 420

aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 480

aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 540

gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 600

gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 660

ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 720

ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 770

Claims

1.一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_101以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、ermE启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

3.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_103以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、neo启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

4.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_104以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、hrdB基因启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

5.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_105以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、tcp830诱导型启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

6.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤3）中，所述的重组质粒pTNL_102以pDZY101为模板，PCR带IRR和oriC的片段，随后克隆入带有oriT的壮观霉素抗性基因，最后克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO2所示。

7.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤4）中，所述的质粒挽救的方法精细定位染色体删除区段，具体过程为：限制性内切酶ApaⅠ在天蓝色链霉菌染色体上分布均匀，利用该酶酶切染色体后自连转化大肠杆菌，抗性筛选大肠杆菌并抽提质粒，测序即能精确定位敲除区段。