KR20110122434A - 랄스토니아 속 미생물의 유전자를 불활성화시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 랄스토니아 속 미생물에서 유전자를 불활성화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 레반수크라제(levansucrase) 유전자 sacB와 선택적 마커및 선택적 마커의 제거를 위한 특정염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 세포간의 접합을 이용하여 형질전환한 후, 수크로즈가 풍부한 배지 조건에서 표적 유전자를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 랄스토니아 속 미생물에서의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법 및 이를 이용하여 표적 유전자가 불활성화된 미생물을 제조하는 방법을 이용하면, 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 변이 미생물을 효과적으로 제공함으로써 랄스토니아 속 미생물의 유전적 연구에 유용하다.

Description

랄스토니아 속 미생물의 유전자를 불활성화시키는 방법 {Method for Inactivating a Target Gene in the Genus Ralstonia}

본 발명은 랄스토니아 속 미생물에서 유전자를 불활성화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 레반수크라제(levansucrase) 유전자 sacB와 선택적 마커 및 선택적 마커의 제거를 위한 특정염기서열을 포함하는 자가 복제 가능한 재조합 벡터를 세포 간의 접합을 이용하여 형질전환(transformation)한 후, 수크로즈(sucrose)가 풍부한 배지 조건에서 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다.

알카리제네스(Alcaligenes) 속, 큐프리아비두스(Cupriavidus) 속, 와우터시아(Wautersia) 속은 랄스토니아 속과 동일 미생물 그룹을 지칭하는 동의어이다. 랄스토니아 유트로파는 질소 부족 조건과 같은 성장 제한 조건에서 PHB (poly[R-(-)-3-hydroxybutyrate)와 같은 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoate) 바이오폴리머를 생산하고, 유기 물질 탄소원이 없는 조건에서도 이산화탄소와 수소를 탄소원과 에너지원으로 사용하여 자랄 수 있는 그람 음성 무기 독립 영양 생물이다. 또한, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)는 페놀과 같은 방향족 물질을 분해할 수 있어서 생물학적 분해 (bioremediation) 분야에서 각광받고 있는 균주이며, 고 세포 농도 (high cell density)로 배양이 가능해서 산업적으로 높은 잠재력이 있다. 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)는 알카리제네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus), 큐프리아비두스 네케이터 (Cupriavidus necator), 와우터시아 유트로파 (Wautersia eutropha)로도 불린다. 랄스토니아 솔라나시럼 (Ralstonia solanacearum)은 가지, 토마토, 감자, 고추 등 가지과의 작물에 풋마름병을 유발하는 병원균이다.

최근 생명 공학의 발전에 따라, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 랄스토니아 솔라나시럼(Ralstonia solanacearum), 랄스토니아 메탈리두란스 (Ralstonia metallidurans), 랄스토니아 피케티 (Ralstonia pickettii) 등 랄스토니아 속 미생물의 게놈 서열 분석이 해독되면서 그 응용 가능성이 높아지고 있다 (Pohlmann et al., Nat. Biotechnol., 10:1257~1262, 2006; Salanoubat et al., Nature, 415:497~502, 2002; DOE Joint Genome Institute (http://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/pub/main.cgi)). 따라서 게놈 해독 정보를 이용하여 그 응용 가능성을 높이기 위한 랄스토니아 속 미생물의 게놈에 직접 유전자 조작을 가할 수 있는 도구가 필수적이다.

게놈의 변형은 세포 내에 표적 미생물의 게놈과 상동성 (homology)을 가지는 DNA를 세포 내로 도입시키고, 도입된 DNA를 숙주 게놈 DNA와 재조합을 시켜 달성될 수 있다 (Po¨tter et al., Microbiology, 151:825~833, 2005; Ewering et al., Metab. Eng., 8:587~602, 2006).

바실러스 서브틸리스의 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자는 세포 내에서 표적 미생물의 게놈과 재조합을 일어나게 하는 마커 유전자로 적합하다고 알려져 있다 (Steinmetz et al ., Mol . Gen . Genet ., 191:138~144, 1983). 5 % 이상의 수크로즈의 존재 하에서 sacB 유전자를 지닌 세포는 성장할 수 없고, 세포의 성장은 유전자 재조합에 의한 레반수크라제(levansucrase) 의 손실 또는 불활성화 후에 가능하다. 이러한 sacB 유전자를 이용한 유전자 재조합에 의한 유전자 불활성화는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움(Corynebacterium) 등에서 sacB 유전자를 포함하는 선형 DNA 단편 또는 셔틀 벡터를 이용하여 수행되었다.

특허출원 제 10-2003-7011376 호는 가나마이신(Kanamycin) 내성을 매개하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)의 sacB 유전자 마커를 가진 표적 미생물에서 복제되지 않는 플라스미드 벡터를 이용해서 코리네박테리움 (Corynebacterium)과 브레비박테리움 (Brevibacterium)에서 표적 유전자의 변형 방법을 제시하였다. 특허출원 제 10-2004-0007527 호는 젠타마이신(Gentamycin) 내성 유전자와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 sacB 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 코리네박테리움(Corynebacterium)의 표적 유전자의 증폭과 파괴 및 치환과 같은 변형 방법을 제시하였다. 특허출원 제 10-2004-0070017 호는 sacB 유전자를 포함하는 선형 DNA 단편을 이용하여 생물막 (biofilm) 형성이 억제된 대장균 변이주 및 이의 제조 방법을 제시하였다.

그러나, 종래에 사용된 sacB 유전자를 포함하는 벡터는 표적 유전자를 불활성화 시킨 후에 표적 유전자 속에 존재하는 선택적 마커인 항생제 내성 유전자를 제거하기 위하여, 다른 항생제 내성 유전자를 포함하는 벡터를 넣어주어야 하는 단점이 있었다. 이러한 한계 때문에 하나의 표적 미생물에서 여러 개의 표적 유전자를 불활성화시키려면, 다른 항생제를 가진 벡터를 각각 제작하여야 해서 방법상 번거롭고 시간이 낭비되는 많은 문제점이 있었다. 또한, DNA 트랜스퍼(transfer) 효율이 좋은 균주의 경우에는 일렉트로포레이션(electrophoration) 방법에 의해 선형 DNA나 셔틀벡터를 세포 내로 용이하게 도입할 수 있지만, DNA 트랜스퍼(transfer) 효율이 좋지 않은 균주에서는 이러한 방법상으로는 한계가 있어서 자가복제 가능한 재조합벡터를 사용할 필요가 있었다.

이에, 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스의 레반수크라제 효소를 코딩하는 유전자 sacB 유전자, 선택적 마커 및 선택적 마커의 제거를 위한 특정서열을 포함하는, 숙주 미생물 내에서 자가 복제 가능한 재조합 벡터를 완성하였다. 또한, 상기 재조합 벡터를 세포 간의 접합을 이용하여 랄스토니아 속 미생물에 전달하여 형질전환을 시킨 후, 수크로즈가 풍부한 조건에서 sacB 유전자를 발현시켜 게놈의 표적 유전자와 선택적 마커인 항생제 내성 유전자를 재조합시킴으로써 표적 유전자를 불활성화시키는 방법을 완성하였다. 또한, 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터를 랄스토니아 속 미생물에 도입하여 선택적 마커의 제거를 위한 특정염기서열의 재조합이 일어남으로써 선택적 마커를 용이하게 제거하여 표적 유전자를 불활성화시킨 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 레반수크라제(levansucrase) 유전자 sacB, 선택적 마커, 선택적 마커의 제거를 위한 특정서열 및 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열을 포함하는, 자가 복제 가능한 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 이용하여 랄스토니아 속 미생물을 형질전환시킨 후, 형질전환된 랄스토니아 속 미생물을 수크로즈가 함유된 배지에서 배양하여 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물에 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터를 도입하여 재조합 효소의 발현에 의해 선택적 마커의 제거를 위한 특정서열의 재조합이 일어남으로써, 상기 선택적 마커를 제거하여 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 변이 미생물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스의 레반수크라제 효소를 코딩하는 유전자 sacB 유전자; 선택적 마커인 항생제 내성 유전자; 선택적 마커의 제거를 위한 특정염기서열; 및 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터를 랄스토니아 속 미생물에 도입하고, 재조합 벡터가 도입된 랄스토니아 속 미생물을 수크로즈가 함유된 배지에서 배양하여 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물에 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터를 도입하여 재조합 효소의 발현에 의해 선택적 마커의 제거를 위한 특정염기서열의 재조합이 일어남으로써, 상기 선택적 마커를 제거하는 단계를 포함하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제공한다.

본 발명의 sacB 유전자, 선택적 마커인 항생제 내성 유전자, 선택적 마커의 제거를 위한 특정서열 및 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하면, Cre 또는 Flp 등의 재조합효소에 의한 loxP 또는 FRT 부위 등의 재조합에 의하여 항생제 내성 유전자를 용이하게 제거할 수 있고, 추가적인 유전자의 효율적인 불활성화가 가능하여, 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자를 빠르고 간편하게 불활성화시키는데 유용하다.

본 발명에 따른 랄스토니아 속 미생물에서의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법 및 이를 이용하여 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법을 이용하면, 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 변이 미생물을 효과적으로 제공함으로써 랄스토니아 속 미생물의 유전적 연구를 촉진시킬 수 있어 유용하다.

도 1은 sacB 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 셔틀 벡터(pSMCm)를 이용하여 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자 acnB를 불활성화 시키는 방법에 관한 개략적인 모식도이다.
도 2는 sacB 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 셔틀 벡터(pSMCm)를 세포 간의 접합을 이용하여 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)에 전달하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 형질 전환된 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 sacB 유전자의 발현을 위해 수크로즈를 포함한 배지에서 계대 배양한 후 유전자 변이 미생물을 스크리닝하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 pSMCmacnB 벡터의 개열지도이다.
도 5는 pTaccreTc 벡터의 개열지도이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서,

(a) 바실러스 서브틸리스의 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자;

(b) 선택적 마커;

(c) loxP, mutant loxP 및 FRT 자리로 구성된 군에서 선택되는 선택적 마커 제거용 염기서열; 및

(d) 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 복제 기점(origin of relication)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 세포 간의 접합에 의한 DNA 전이를 가능하게 하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있고, 상기 세포 간의 접합에 의한 DNA 전이를 가능하게 하는 유전자는 mob 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 mutant loxP 자리는 lox71 및lox66 자리인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 선택적 마커는 숙주 미생물 내의 표적 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열 사이에 존재하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에서, 선택적 마커가 표적 미생물의 게놈 서열과 상동적인 서열 구획 사이에 존재함으로써, 재조합 효율이 낮은 랄스토니아 속 미생물과 같은 균주에서 첫 번째 교차가 일어난 후 야생형(wild type)으로 돌아가는 빈도를 낮추게 되어, 이중 교차 재조합(double crossover recombunation)이 잘 일어날 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 구성하는 선택적 마커의 제거를 위한 염기서열은 선택적 마커의 양 끝에 각각 존재하고, 선택적 마커 및 선택적 마커 제거용 염기서열을 포함하는 염기서열은 표적 유전자와 상동 재조합을 일으키는 두 상동 부위 사이에 존재함으로써, 결국 선택적 마커 제거용 염기서열은 상동부위와 선택적 마커 사이에 위치하는 구성을 이루게된다.

본 발명의 실시예에서, 상기 재조합 벡터를 구성하는 lox71-CmR-lox66는 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자의 주변 서열로서 표적 유전자와 재조합 벡터 간의 상동 재조합을 매개하는 상동 부위 1과 상동 부위 2 사이에 존재한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 pSMCmacnB 일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터를 이용하여 랄스토니아 속 미생물에서의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법은,

(a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 랄스토니아 속 미생물에 도입하고, 상기 재조합 벡터가 도입된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계; 및

(b) 상기 선별된 미생물을 수크로즈가 함유된 배지에서 배양하여 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계를 포함한다.

본 발명의 실시예에서, 상기 재조합 벡터를 이용하여 랄스토니아 속 미생물을 형질전환한 후, 수크로즈가 함유된 배지에서 배양하여 표적 유전자의 상동적 부위와 재조합 벡터의 상동적 부위 간의 이중 교차 재조합이 일어남으로써, 표적 유전자의 불활성화가 가능하다.

상기 재조합 벡터는 대장균 S17-1 (E. coli S17-1)에 일렉트로포레이션 (electrophoration) 방법을 통하여 전달될 수 있으며, 대장균 S17-1(E. coli S17-1)과 랄스토니아 간의 접합에 의해서 상기 재조합 벡터가 랄스토니아 속 미생물에 전달될 수 있다. 그리고 나서, 상기 재조합 벡터를 포함하는 랄스토니아 속 미생물을 수크로즈가 포함된 배지에 배양하여 sacB 유전자에 코딩되는 레반수크라제(levansucrase)를 발현시켜 독성을 유발시킨다. 레반수크라제(levansucrase)는 수크로즈를 포도당(glucose)과 과당(fructose)로 분해하고, 독성이 있는 과당 중합체인 레반(levan)을 합성한다. 이 때, 상기 레반(levan)이 미생물에 대해 독성을 가지고 있기 때문에, sacB 유전자를 지닌 미생물은 수크로즈가 포함된 배지에서 생존하지 못한다.

또한, 수크로즈가 포함된 배지에 선택적 마커인 항생제가 포함되어 있기 때문에, sacB 유전자가 제거되고 항생제 내성 유전자를 가지고 있는 미생물만이 생존할 수 있게 된다. 이를 위해서는 재조합 벡터에서 표적 유전자의 상동적 부위와 표적 미생물의 게놈 간의 재조합에 의해서 sacB 유전자는 제거되고, 선택적 마커인 항생제 내성 유전자는 표적 미생물의 게놈에 남아 있어야 한다 (도 1). 따라서, 표적 유전자가 불활성화된 미생물 변이주는 수크로즈와 선택적 마커인 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 선별할 수 있다. 이 때, 유전자 불활성화를 위해서는 재조합 벡터와 표적 유전자의 상동적 부위 간의 이중 교차 재조합(double crossover recombination)이 일어나야 하고, 이를 위해서는 수크로즈와 선택적 마커인 항생제를 포함하는 배지에서 여러 번 계대 배양을 수행하여야 한다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법은,

(a) 본 발명에 따른 재조합 벡터를 랄스토니아 속 미생물에 도입하고, 상기 재조합 벡터가 도입된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계;

(b) 상기 선별된 미생물을 수크로즈가 함유된 배지에서 배양하여 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계; 및

(c) 상기 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 랄스토니아 속 미생물에 loxP 자리를 재조합하는 효소, mutant loxP 자리를 재조합하는 효소 및 FRT 자리를 재조합하는 효소로 구성된 군에서 선택되는 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터를 도입하여, 재조합 효소의 발현에 의해 선택적 마커의 제거를 위한 염기서열의 재조합이 일어남으로써 상기 선택적 마커를 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터는 loxP 자리 또는 mutant loxP 자리를 재조합하는 Cre 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터는 pTaccreTc 인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터는 FRT 자리를 재조합하는 Flp 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법일 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 표적 유전자가 불활성화된 변이 미생물은 direct colony PCR에 의해 확인될 수 있으며, 상기 (d) 단계에서 항생제 내성 유전자는 세포 접합에 의해 전달되는 Cre 재조합효소(recombinase)를 포함하는 셔틀 벡터 pTaccreTc의 발현에 의해서 제거될 수 있다. Cre 재조합 효소 (recombinase)의 발현은 배지에 IPTG의 추가에 의해서 유도된다. 표적 미생물 게놈 내부에서 표적 유전자와 재조합된 lox71-CmR-lox66 카세트는 Cre 재조합 효소 (recombinase)의 발현에 의해서 lox71과 lox66 자리가 재조합되면서 클로람페니콜 내성 유전자가 제거된다. 상기 방법을 이용하여 표적 유전자를 불활성화시킨 후 항생제 내성 유전자를 용이하게 제거함으로써 효율적인 추가 표적 유전자의 불활성화가 가능하고, 하나의 표적 미생물에서 여러 개의 표적 유전자를 용이하게 불활성화시킬 수 있다.

Cre 재조합 효소는 특정한 염기서열(loxP 서열)을 인식하고, 이 서열 사이에서 DNA 사슬의 절단, 사슬의 교환과 결합 공정을 전부 행하는 특이적인 DNA 재조합효소이고, Flp 재조합 효소는 특정한 염기서열(FRT 서열)을 인식하여 이 서열 사이에서 부위 특이적 재조합을 일으킨다. loxP 서열은 34 염기의 DNA 서열로 이루어지고, 2 개의 13염기의 역방향 반복서열(inverted repeat) 사이에는 스페이서 영역이라고 불리우는 8 염기의 서열이 존재한다 (loxP 서열: 5'- ATAACTTCGTATA atgtatgc TATACGAAGTTAT -3'). FRT 서열은 8 염기 스페이서에 의해 분리되는 두 개의 13 염기 반복서열을 포함한다(FRT 서열: 5'- GAAGTTCCTATTC tctagaaa GTATAGGAACTTC -3').

본 발명에서, lox71, lox66 자리는 mutant loxP 자리여서 표적 미생물 내에 여러 개의 loxP 자리가 있을 경우에, 원하지 않는 loxP 자리가 Cre 재조합 효소에 의해 재조합되는 것을 방지할 수 있다(lox71 서열:5'-TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3', lox66 서열: 5'- TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'). 또한, lox71, lox66 자리는 다른 mutant loxP 자리(lox76-lox75, lox43-lox44)에 비하여 선택적 마커를 제거하기 위한 재조합 효율이 매우 좋고, 재조합을 한 후에 원치 않는(reverse) 방향으로 반응이 일어나거나 목적 부위가 아닌 원하지 않는 loxP 자리와 재조합이 일어나는 효율이 매우 낮은 장점이 있어서, Cre 재조합 효소가 lox71, lox66 자리를 인식하여 선택적 마커를 유용하게 제거할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 랄스토니아 속 미생물은 랄스토니아 유트로파, 알카리제네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus), 큐프리아비두스 네케이터 (Cupriavidus necator), 와우터시아 유트로파 (Wautersia eutropha), 랄스토니아 솔라나시럼 (Ralstonia solanacearum), 랄스토니아 메탈리두란스 (Ralstonia metallidurans), 랄스토니아 피케티 (Ralstonia pickettii), 큐프리아비두스 바시렌시스 (Cupriavidus basilensis), 큐프리아비두스 캄피넨시스 (Cupriavidus campinensis), 큐프리아비두스 지라르디 (Cupriavidus gilardii), 큐프리아비두스 메탈리두란스 (Cupriavidus metallidurans), 큐프리아비두스 옥살라티쿠스 (Cupriavidus oxalaticus), 큐프리아비두스 파우큘러스 (Cupriavidus pauculus), 큐프리아비두스 레스피라큘리 (Cupriavidus respiraculi), 큐프리아비두스 타이와넨시스 (Cupriavidus taiwanensis), 큐프리아비두스 라하리스 (Cupriavidus laharis), 와우터시아 누마주엔시스 (Wautersia numazuensis), 랄스토니아 데투스큐라넨스 (Ralstonia detusculanense), 랄스토니아 인시디오사 (Ralstonia insidiosa), 랄스토니아 마니토리리티카 (Ralstonia mannitolilytica), 랄스토니아 시지키 (Ralstonia syzygii), 와우터시아 바시렌시스 (Wautersia basilensis), 와우터시아 캄피넨시스 (Wautersia campinensis), 와우터시아 지라르디 (Wautersia gilardii), 와우터시아 메탈리두란스 (Wautersia metallidurans), 와우터시아 옥살라티쿠스 (Wautersia oxalaticus), 와우터시아 파우큘러스 (Wautersia pauculus), 와우터시아 레스피라큘리 (Wautersia respiraculi), 와우터시아 타이와넨시스 (Wautersia taiwanensis), Cupriavidus sp., Wautersia sp., Ralstonia sp. 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 랄스토니아 유트로파를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자는 클로람페니콜(Chloramphenicol), 가나마이신(Kanamycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 엠피실린(Ampicillin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 설폰아마이드(Sulfonamide)계 항생제, 스트랩토마이신(Streptomycin) 내성 유전자 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 클로람페니콜 내성 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 불활성 돌연변이 기술(Knockout Mutation Technology)을 이용하여 랄스토니아 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 표적 유전자를 재조합에 의해 불활성화시킨 상기 변이 미생물 또는 균주는, 불활성화 시킨 목적 유전자에 따라 특정 용도로 이용할 수 있다. 가장 대표적으로, 본 발명의 랄스토니아 속 미생물 변이 균주는 PHB 과잉 생산 등에 효과적으로 이용할 수 있다.

본 발명에서 유전자의 "불활성화"란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당 유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.

본 발명에서 "상동적 부위"와 "재조합 부위"는 서로 같은 의미로 사용될 수 있으며, 같은 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있는 다른 영역의 DNA와 상동적 재조합을 일으킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 '목적 유전자의 상동적 부위'라고 함은 목적 유전자의 DNA와 상동적 재조합을 일으킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 말하는 것이다.

본 발명에서 "선택적 마커"는 특정 유전자의 산물을 말하는 것으로, 이 산물을 포함하는 미생물은 포함되지 않은 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 나타내어 쉽게 구별할 수 있게 된다.

본 발명에서 "스크리닝"은 특정한 미생물을 구별하여 선택하는 작업을 의미하며, 여기에서 특정한 미생물이란 다른 미생물에는 없는 특정한 표현형 또는 특정 DNA 서열을 가지는 것을 포함하는 개념이다.

본 발명에서 "상동성" 또는 "상동적"이란 재조합이 일어나는 부위에 적용되며, 두 DNA가 서로 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오타이드 서열을 공유하고 있음을 의미한다.

본 발명에서 "형질 전환"은 특정 외래의 DNA 가닥을 세포 밖에서 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 가닥을 포함한 숙주 미생물은 형질 전환된 미생물이라 한다.

본 발명에서 "제한 효소"는 특정한 DNA 뉴클레오타이드에 서열에 결합하여 DNA 내부를 절단하는 효소를 통칭한다.

본 발명에서 "셔틀 벡터"는 두 이종 미생물 양쪽에서 복제 가능한 원점을 최소한 하나 이상 가지고 있거나, 각 미생물에서만 복제 가능한 원점을 모두 가지고 있어서 두 이종 미생물에서 모두 안정적으로 복제 가능한 벡터를 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 시시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 랄스토니아 유트로파의 플라스미드를 이용하여 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 유전자를 불활성화하는 방법만을 예시하였으나, 이 외에 다른 종류의 벡터와 다른 종류의 랄스토니아 (Ralstonia) 속 미생물을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다. 또한, Cre 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터를 도입하여 loxP 자리의 재조합이 일어남으로써 선택적 마커를 제거하는 방법만을 예시하였으나, Flp 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터를 도입하여 FRT 자리의 재조합이 일어남으로써 선택적 마커를 제거하는 것 역시 당업자에게는 자명한 사항이라 할 것이고, 나아가 RS 자리를 특이적으로 인식하는 R 재조합 효소 또는 gix 자리를 인식하는 Gin 재조합 효소를 이용하여서도 선택적 마커를 유용하게 제거함으로써, 본 발명에 따라 랄스토니아 속 미생물을 불활성화시키는 것은 자명한 사항이라 할 것이다.

랄스토니아 유트로파( Ralstonia eutropha )에서 sacB 유전자를 발현하는 벡터의 제작

랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 표적 유전자를 불활성화 시키는 재조합 벡터를 구축하기 위해서 우선 대장균 (E. coli) 복제 기점, 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자, 가나마이신(Kanamycin) 내성 유전자를 포함하는 pSacHR06(Park et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104:7797-7802, 2007) 플라스미드에 세포 간의 접합에 의한 DNA 전이를 가능하게 하는 유전자 (mob)를 클로닝하여야 한다. 상기 pSacHR06 플라스미드를 XbaI 제한 효소를 처리하고, 세포 간의 접합에 의한 DNA 전이를 가능하게 하는 유전자 (mob)를 포함하는 pBBR1MCS2 벡터를 XbaI 제한 효소 자리를 포함하도록 mob 유전자를 PCR로 증폭하여 이를 XbaI을 처리하여 상기 두 단편을 접합하여 pSacHR06-mob 플라스미드를 완성하였다. 이에 사용된 프라이머쌍들의 염기서열은 아래와 같다(밑줄 친 부분은 XbaⅠsite이다).

PRmobF: 5' - CCGCTCTAGACAATTCCGGTTCGCTTGCTG - 3' (서열번호 2)

PRmobR: 5' - CCGCTCTAGAACATATCCACGGGCTGGCAA - 3' (서열번호 3)

표적 미생물의 표적 유전자의 상동적 부위 1을 클로닝하기 위해 pSacHR06-mob 플라스미드를 BamHI과 PstI 제한 효소를 처리하고, 표적 유전자의 상동적 부위 1을 BamHI과 PstI 제한 효소 자리를 포함하도록 PCR로 증폭하여 완성된 표적 유전자의 상동적 부위 1 단편을 BamHI과 PstI 제한효소로 처리하여, 상기 두 단편을 접합하여 pSMH1 플라스미드를 완성하였다. 그리고 표적 미생물의 표적 유전자의 상동적 부위 2을 클로닝하기 위해 pSMH1 플라스미드를 SalI과 SphI 제한 효소를 처리하고, 표적 유전자의 상동적 부위 2을 SalI과 SphI 제한 효소 자리를 포함하도록 PCR로 증폭하여 완성된 표적 유전자의 상동적 부위 2 단편을 SalI과 SphI 제한효소로 처리하여, 상기 두 단편을 접합하여 pSMH12 플라스미드를 완성하였다. 이에 사용된 프라이머쌍들의 염기서열은 아래와 같다.

PRacnBH_BamHI: 5' - ATATGGATCCGAACATCCCAGCGGCAATTT - 3' (서열번호 4)

PRacnBH_PstI: 5'- TGCTGAAGTGGATGATCGCC - 3' (서열번호 5)

PRacnBH_SalI: 5'- ATATGTCGACATGAACGGGATGTCTTCGCC - 3' (서열번호 6)

PRacnBH_SphI: 5'- ATCCGCATGCGGGGAAACCCTTTCAGCTTG - 3' (서열번호 7)

그리고, 마지막으로 표적 미생물의 표적 유전자의 서열과 상동성이고 상동적 재조합을 매개하는 상동적 부위 1과 2 사이에 변이 미생물의 스크리닝을 위한 클로람페니콜 내성 유전자를 클로닝 하였다. 이를 위해 pKD3 플라스미드로부터 lox71와 lox66 자리와 PstI 제한 효소 자리를 포함하하여 lox71-CmR-lox66 카세트를 PCR로 증폭하고, pSMH12 플라스미드와 lox71-CmR-lox66 카세트를 PstI 제한 효소 처리를 한 후, 접합하여 pSMCm 플라스미드를 완성하였다. lox71와 lox66 자리는 게놈에 남아있는 선택적 마커인 항생제 내성 유전자을 제거하기 위해 Cre 재조합 효소의 발현에 의해 재조합이 일어나는 자리이다. 이에 사용된 프라이머쌍들의 염기서열은 아래와 같다(밑줄 친 부분은 PstI site이고 굵은 글씨는 각각 lox71와 lox66 site이다).

PRloxCm_lox71:

5'-AATTCTGCAG TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCATTTAAATGGCGCGCCTTA-3' (서열번호 8)

PRloxCm1_lox66:

5'-AATTCTGCAG TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAAGCCCTGGGCCAACTTTT-3' (서열번호 9)

형질전환된 랄스토니아 유트로파에서 acnB 유전자의 불활성화 확인

상기 방법으로 완성된 재조합 벡터를 이용한 유전자 불활성화가 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)에서 성공적으로 작동하는지 확인하기 위해, 미생물의 중심 대사 중 하나인 TCA cycle에 속한 acnB (NCBI GeneID:4456731) 유전자를 대상으로 불활성화를 시도하였다.

먼저, 상기 방법으로 pSacHR06에 표적 유전자인 acnB의 상동적 부위 1과 2를 클로닝하였고, 상동적 부위 1과 2에 클로람페니콜 내성 유전자를 클로닝하여 pSMCmacnB 플라스미드를 완성하였다.

상기 완성된 pSMCmacnB 플라스미드를 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)에 전달하여 형질전환 (transformation)하기 위해, 일렉트로포레이션 (electrophoration) 방법을 이용하여 대장균 S17-1 (E. coli S17-1)에 전달한 후, 상기 pSMCmacnB 플라스미드를 포함하는 대장균 S17-1(E. coli S17-1)을 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)와 1:1로 섞은 후 LB 고체 배지에서 배양하여 세포 간의 접합을 수행하였다. 그 후, pSMCmacnB 플라스미드를 포함하는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)를 스크리닝하기 위해서 pSMCmacnB 플라스미드를 포함하는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)만 생존할 수 있는 조건에서 배양하였다 (도 2).

그 후, sacB 유전자를 발현시키기 위해 pSMCmacnB 플라스미드를 포함하는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)는 10% 수크로즈, 2% 과당 (fructose), 클로람페니콜 내성 유전자(300㎍/mL)를 포함하는 LB 고체 배지에 30℃에서 배양하였다 (도 3). 이 배지 조건에서 sacB 유전자가 코딩하는 레반수크라제(levansucrase)가 발현되어 미생물에 독성 물질인 레반 (levan)을 생성하게 된다. 따라서, 상기 배지 조건에서 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)가 생존하기 위해서는 sacB 유전자가 제거되고, 클로람페니콜 내성 유전자는 남아 있어야 한다. 이를 위해서는 pSMCmacnB 플라스미드의 상동적 부위 1, 2가 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 acnB 유전자의 상동적 부위와 이중 교차 재조합(double crossover recombination)이 일어나야 한다 (도 1). 이를 위해서 여러 번 계대 배양을 해야 하고, 본 발명에서는 acnB 유전자 불활성화를 위해서 5일간 30℃에서 10% 수크로즈, 2% 과당(fructose), 클로람페니콜 내성 유전자(300㎍/mL)를 포함하는 LB 고체 배지에 배양하였다. 표적 유전자인 acnB 유전자와 클로람페니콜 내성 유전자와의 성공적인 대체는 direct colony PCR과 시퀀싱 (sequencing)에 의해서 확인되었다.

acnB 유전자가 불활성화된 랄스토니아 유트로파의 제조

표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)를 제조하기 위해, 상기 acnB 유전자가 불활성화된 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 게놈 내부에 남아있는 선택적 마커인 클로람페니콜 내성 유전자를 제거하였다. 선택적 마커인 클로람페니콜 내성 유전자는 세포 접합에 의해 전달되는 Cre 재조합 효소 (recombinase)를 포함하는 재조합 벡터 pTaccreTc(Lab stock)의 발현에 의해서 제거될 수 있다. pTaccreTc벡터는 pTac15k(Qian et al., Biotechnology and Bioengineering, 104:651-662, 2009)벡터에 Cre 재조합 효소를 코딩하는 Cre 유전자를 클로닝한 후 IPTG로 inducible 할 수 있도록 lacIq 유전자를 클로닝하였고, 또한 재조합 벡터가 세포 간 접합 (conjugation)에 의해 도입된 균주를 selection할 수 있는 마커인 테트라사이클린(tetracycline)내성 유전자를 클로닝하고, 그 다음 세포 간 접합에 의한 재조합 벡터의 도입을 위한 mob 유전자를 클로닝하여 제작하였다. Cre 재조합 효소 (recombinase)의 발현은 배지에 IPTG의 추가에 의해서 유도된다. 표적 미생물 게놈 내부에서 표적 유전자와 재조합된 lox71-CmR-lox66 카세트는 Cre 재조합 효소 (recombinase)의 발현에 의해서 lox71과 lox66 자리가 재조합되면서 클로람페니콜 내성 유전자가 제거된다. 이로써, 상기 방법을 이용하여 하나의 표적 미생물에서 여러 개의 표적 유전자를 불활성화시킬 수 있다.

이상으로, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통사의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Inactivating a Tafget Gene in the Genus Ralstonia <130> P10-B044 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8766 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSMCmacnB <400> 1 gggtaccgag cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcggat ccgaacatcc 60 cagcggcaat ttggtggtgg tggtggcgta tgccacccgt caagccggcg aaatccaaat 120 acaaaagggc cccgcaagcg gggccccttc ttcatgccag cctgactgcg cggcttacac 180 cgtcacgccg tcggccactt ccttgaagtc ctcgatctgg tcgaagttca tgtacttgta 240 gatcttgtcg ccattggcgt tgagcacgcc catgtcggcc atgtactctt ccttggtcgg 300 gatacggccc aggcgcgagc agatcgccgc cagttcggcg gaacccaggt acacgttggt 360 gttcttgccc aggcggttcg ggaagttacg cgtgctggtc gacatcaccg tggcgccttc 420 gcgcacctgt gcctggttgc ccatgcacag cgagcagccc ggcatttcgg tgcgggcacc 480 ggcggtgccg aacacgccat agtggccttc ctcggtcagc tgcttctggt ccatcttggt 540 cggcggagcc acccacagct tgaccgggat gtcgcgcttg ccttccagca gcttggaggc 600 tgcgcggaag tggccgatgt tggtcatgca cgaaccgata aacacttcgt cgatcttggc 660 gccggccacc tcggacagcg tcttgacgtc gtccgggtcg ttcgggcagg ccacgatcgg 720 ctcatgcacg tcggccaggt cgatctcgat cacggcggcg tattcggcgt cggcgtccgg 780 ctccagcagc ttgggatcgg ccagccacgc ttccatggcc ttgatgcggc gctgcagtac 840 cgttcgtata gcatacatta tacgaagtta tcatttaaat ggcgcgcctt acgccccgcc 900 ctgccactca tcgcagtact gttgtattca ttaagcatct gccgacatgg aagccatcac 960 aaacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat 1020 atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa 1080 aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt 1140 tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa 1200 actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat 1260 ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg 1320 ccatacgtaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat 1380 aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg 1440 tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc 1500 attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag 1560 ctcctgaaaa tctcgacaac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt 1620 gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg 1680 gcttcataac ttcgtatagc atacattata cgaacggtac tgcaggaatt cgatatcacg 1740 ctagtcgaca tgaacgggat gtcttcgccg gtgaaccaca gcaccgagtt ggtggcggac 1800 ttgcggctgg agccggtacc gaccacgtct cccacgtagg cgaccaggtg gcccttttcc 1860 ttcagcgatt caatgaactt gaccgggccg cgcttgccgt cttcttccgg ctggaacgca 1920 gcgccttcgc gcttgttctt cagcatggcc agcgcgtgca tcgggatgtc cgggcgggtg 1980 gtggcgtccg gggccggcga caggtcgtcg gtgttggttt cgcccggcac cttgaacacg 2040 gtgatggtca ggctttgcgg cacttccgga cggctggtga accactcggc gtcggcccag 2100 ctttgcagca cggccttggc gttggcattg ccctggtcgg ccttttcctt cacatcgtgg 2160 aaggcgtcga acatcagcag ggtcttcttc agcgcctcgg cggcgacggt gcccacttcg 2220 gcatcgtcca gcagctcgat cagcggcgag atgttgtagc cgcccagcat ggtgcccagc 2280 agctcggtcg ccttggcgcg cgagatcagc gcgcactttt ccttgcccag cgccacggcg 2340 gccaggtacg aggccttgac cttggcggcg tcatccacgc cggccggcac gcggtaggtg 2400 atcagctcca ccagggtctg ctcttcaccg gcgggcgggt tcttcagcag ttcgaccagc 2460 tcggccgtct gcttggcggt caggggcaga ggggggatgc caagcgcggc gcgctcggcc 2520 acatgtgcgc gatagttttc aagcatggga acctgctgag taattaggtt tagaaaatct 2580 cgttacgtcg cgattgtagt ctgaagccgc tccccggtca aatgtcttat atcttatata 2640 agagtgaaga caaaaaacat catgcaaatc aacgtattgg agattggatg acgtgcaaac 2700 ccacatgaat cactacccga ctggcgtagt agggaatgca tggcggcgct accgcgcccc 2760 tgcccggcgg cccggccagg aatcgcggca gcttgcaccg gcactcaagt tcgcatgcac 2820 gcgtgtgcac ccatgggacg tcctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 2880 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 2940 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 3000 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 3060 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 3120 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 3180 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 3240 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 3300 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 3360 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 3420 gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 3480 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 3540 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 3600 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacccatggg tgcacgacgt 3660 cgctagcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc 3720 gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg 3780 gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga 3840 tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccacgttgtg 3900 tctcaaaatc tctgatgtta cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa 3960 ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg 4020 tcttgctcga ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg 4080 gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat 4140 gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag 4200 atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc 4260 cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag 4320 gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg 4380 cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt 4440 ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac 4500 gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataagct tttgccattc 4560 tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag 4620 gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat 4680 cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt 4740 caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat 4800 gagtttttct aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact 4860 tgacgggacg gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca 4920 cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact 4980 ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg 5040 gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgct 5100 caaagatgca ggggtaaaag ctaaccgcat ctttaccgac aaggcatccg gcagttcaac 5160 agatcgggaa gggctggatt tgctgaggat gaaggtggag gaaggtgatg tcattctggt 5220 gaagaagctc gaccgtcttg gccgcgacac cgccgacatg atccaactga taaaagagtt 5280 tgatgctcag ggtgtagcgg ttcggtttat tgacgacggg atcagtaccg acggtgatat 5340 ggggcaaatg gtggtcaccg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctccac 5400 cgcggtggcg gccgctctag acaattccgg ttcgcttgct gtccataaaa ccgcccagtc 5460 tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt ctctttgcgc ttgcgttttc 5520 ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catcccaggt ggcacttttc ggggaaatgt 5580 gcgcgcccgc gttcctgctg gcgctgggcc tgtttctggc gctggacttc ccgctgttcc 5640 gtcagcagct tttcgcccac ggccttgatg atcgcggcgg ccttggcctg catatcccga 5700 ttcaacggcc ccagggcgtc cagaacgggc ttcaggcgct cccgaaggtc tcgggccgtc 5760 tcttgggctt gatcggcctt cttgcgcatc tcacgcgctc ctgcggcggc ctgtagggca 5820 ggctcatacc cctgccgaac cgcttttgtc agccggtcgg ccacggcttc cggcgtctca 5880 acgcgctttg agattcccag cttttcggcc aatccctgcg gtgcataggc gcgtggctcg 5940 accgcttgcg ggctgatggt gacgtggccc actggtggcc gctccagggc ctcgtagaac 6000 gcctgaatgc gcgtgtgacg tgccttgctg ccctcgatgc cccgttgcag ccctagatcg 6060 gccacagcgg ccgcaaacgt ggtctggtcg cgggtcatct gcgctttgtt gccgatgaac 6120 tccttggccg acagcctgcc gtcctgcgtc agcggcacca cgaacgcggt catgtgcggg 6180 ctggtttcgt cacggtggat gctggccgtc acgatgcgat ccgccccgta cttgtccgcc 6240 agccacttgt gcgccttctc gaagaacgcc gcctgctgtt cttggctggc cgacttccac 6300 cattccgggc tggccgtcat gacgtactcg accgccaaca cagcgtcctt gcgccgcttc 6360 tctggcagca actcgcgcag tcggcccatc gcttcatcgg tgctgctggc cgcccagtgc 6420 tcgttctctg gcgtcctgct ggcgtcagcg ttgggcgtct cgcgctcgcg gtaggcgtgc 6480 ttgagactgg ccgccacgtt gcccattttc gccagcttct tgcatcgcat gatcgcgtat 6540 gccgccatgc ctgcccctcc cttttggtgt ccaaccggct cgacgggggc agcgcaaggc 6600 ggtgcctccg gcgggccact caatgcttga gtatactcac tagactttgc ttcgcaaagt 6660 cgtgaccgcc tacggcggct gcggcgccct acgggcttgc tctccgggct tcgccctgcg 6720 cggtcgctgc gctcccttgc cagcccgtgg atatgttcta gactttacgg tatcgccgct 6780 cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 6840 tggggttcgc tagaggatcg atccttttta acccatcaca tatacctgcc gttcactatt 6900 atttagtgaa atgagatatt atgatatttt ctgaattgtg attaaaaagg caactttatg 6960 cccatgcaac agaaactata aaaaatacag agaatgaaaa gaaacagata gattttttag 7020 ttctttaggc ccgtagtctg caaatccttt tatgattttc tatcaaacaa aagaggaaaa 7080 tagaccagtt gcaatccaaa cgagagtcta atagaatgag gtcgaaaagt aaatcgcgcg 7140 ggtttgttac tgataaagca ggcaagacct aaaatgtgta aagggcaaag tgtatacttt 7200 ggcgtcaccc cttacatatt ttaggtcttt ttttattgtg cgtaactaac ttgccatctt 7260 caaacaggag ggctggaaga agcagaccgc taacacagta cataaaaaag gagacatgaa 7320 cgatgaacat caaaaagttt gcaaaacaag caacagtatt aacctttact accgcactgc 7380 tggcaggagg cgcaactcaa gcgtttgcga aagaaacgaa ccaaaagcca tataaggaaa 7440 catacggcat ttcccatatt acacgccatg atatgctgca aatccctgaa cagcaaaaaa 7500 atgaaaaata tcaagttcct gaattcgatt cgtccacaat taaaaatatc tcttctgcaa 7560 aaggcctgga cgtttgggac agctggccat tacaaaacgc tgacggcact gtcgcaaact 7620 atcacggcta ccacatcgtc tttgcattag ccggagatcc taaaaatgcg gatgacacat 7680 cgatttacat gttctatcaa aaagtcggcg aaacttctat tgacagctgg aaaaacgctg 7740 gccgcgtctt taaagacagc gacaaattcg atgcaaatga ttctatccta aaagaccaaa 7800 cacaagaatg gtcaggttca gccacattta catctgacgg aaaaatccgt ttattctaca 7860 ctgatttctc cggtaaacat tacggcaaac aaacactgac aactgcacaa gttaacgtat 7920 cagcatcaga cagctctttg aacatcaacg gtgtagagga ttataaatca atctttgacg 7980 gtgacggaaa aacgtatcaa aatgtacagc agttcatcga tgaaggcaac tacagctcag 8040 gcgacaacca tacgctgaga gatcctcact acgtagaaga taaaggccac aaatacttag 8100 tatttgaagc aaacactgga actgaagatg gctaccaagg cgaagaatct ttatttaaca 8160 aagcatacta tggcaaaagc acatcattct tccgtcaaga aagtcaaaaa cttctgcaaa 8220 gcgataaaaa acgcacggct gagttagcaa acggcgctct cggtatgatt gagctaaacg 8280 atgattacac actgaaaaaa gtgatgaaac cgctgattgc atctaacaca gtaacagatg 8340 aaattgaacg cgcgaacgtc tttaaaatga acggcaaatg gtacctgttc actgactccc 8400 gcggatcaaa aatgacgatt gacggcatta cgtctaacga tatttacatg cttggttatg 8460 tttctaattc tttaactggc ccatacaagc cgctgaacaa aactggcctt gtgttaaaaa 8520 tggatcttga tcctaacgat gtaaccttta cttactcaca cttcgctgta cctcaagcga 8580 aaggaaacaa tgtcgtgatt acaagctata tgacaaacag aggattctac gcagacaaac 8640 aatcaacgtt tgcgccaagc ttcctgctga acatcaaagg caagaaaaca tctgttgtca 8700 aagacagcat ccttgaacaa ggacaattaa cagttaacaa ataaaaacgc aaaagaaaat 8760 gccgat 8766 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccgctctaga caattccggt tcgcttgctg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgctctaga acatatccac gggctggcaa 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atatggatcc gaacatccca gcggcaattt 30 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgctgaagtg gatgatcgcc 20 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atatgtcgac atgaacggga tgtcttcgcc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atccgcatgc ggggaaaccc tttcagcttg 30 <210> 8 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aattctgcag taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttatcattta aatggcgcgc 60 ctta 64 <210> 9 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aattctgcag taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgaagcc ctgggccaac 60 tttt 64 <210> 10 <211> 8786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTaccreTc <400> 10 cagaattcga gctcggtacc atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat 60 taccggtcga tgcaacgagt gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc 120 gccaggcgtt ttctgagcat acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg 180 catggtgcaa gttgaataac cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt 240 atcttctata tcttcaggcg cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc 300 agctaaacat gcttcatcgt cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt 360 cactggttat gcggcggatc cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg 420 ctctagcgtt cgaacgcact gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc 480 gctgccagga tatacgtaat ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta 540 tagccgaaat tgccaggatc agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt 600 taatccatat tggcagaacg aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta 660 gcctgggggt aactaaactg gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc 720 cgaataacta cctgttttgc cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca 780 gccagctatc aactcgcgcc ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg 840 gcgctaagga tgactctggt cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg 900 gagccgcgcg agatatggcc cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg 960 gctggaccaa tgtaaatatt gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg 1020 caatggtgcg cctgctggaa gatggcgatt agtctagagt cgacctgcag gcatgcaagc 1080 ttggctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca 1140 gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc ccacctgacc 1200 ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg tctccccatg 1260 cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc 1320 tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa tccgccggga 1380 gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa 1440 actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta 1500 caaactcttt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 1560 aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 1620 gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 1680 cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 1740 tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 1800 tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag 1860 agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtaa ttcactggcc 1920 gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 1980 gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 2040 caacagttgc gggggggggg ggaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt 2100 gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat 2160 acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgagtca tcccaggtgg 2220 cacttttcgg ggaaatgtgc gcgcccgcgt tcctgctggc gctgggcctg tttctggcgc 2280 tggacttccc gctgttccgt cagcagcttt tcgcccacgg ccttgatgat cgcggcggcc 2340 ttggcctgca tatcccgatt caacggcccc agggcgtcca gaacgggctt caggcgctcc 2400 cgaaggtctc gggccgtctc ttgggcttga tcggccttct tgcgcatctc acgcgctcct 2460 gcggcggcct gtagggcagg ctcatacccc tgccgaaccg cttttgtcag ccggtcggcc 2520 acggcttccg gcgtctcaac gcgctttgag attcccagct tttcggccaa tccctgcggt 2580 gcataggcgc gtggctcgac cgcttgcggg ctgatggtga cgtggcccac tggtggccgc 2640 tccagggcct cgtagaacgc ctgaatgcgc gtgtgacgtg ccttgctgcc ctcgatgccc 2700 cgttgcagcc ctagatcggc cacagcggcc gcaaacgtgg tctggtcgcg ggtcatctgc 2760 gctttgttgc cgatgaactc cttggccgac agcctgccgt cctgcgtcag cggcaccacg 2820 aacgcggtca tgtgcgggct ggtttcgtca cggtggatgc tggccgtcac gatgcgatcc 2880 gccccgtact tgtccgccag ccacttgtgc gccttctcga agaacgccgc ctgctgttct 2940 tggctggccg acttccacca ttccgggctg gccgtcatga cgtactcgac cgccaacaca 3000 gcgtccttgc gccgcttctc tggcagcaac tcgcgcagtc ggcccatcgc ttcatcggtg 3060 ctgctggccg cccagtgctc gttctctggc gtcctgctgg cgtcagcgtt gggcgtctcg 3120 cgctcgcggt aggcgtgctt gagactggcc gccacgttgc ccattttcgc cagcttcttg 3180 catcgcatga tcgcgtatgc cgccatctcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct 3240 gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat 3300 cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt 3360 gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt 3420 ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc 3480 cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt 3540 gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt 3600 aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt 3660 gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa 3720 atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt 3780 gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga 3840 atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct 3900 tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg 3960 cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacac 4020 tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg 4080 ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc 4140 aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct acaacaaagc tctcatcaac cgtggctccc 4200 tcactttctg gctggatgat ggggcgattc aggcctggta tgagtcagca acaccttctt 4260 cacgaggcag acctcagcgc cccccccccc cgcaaactat taactggcga actacttact 4320 ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 4380 ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 4440 gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 4500 atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 4560 ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 4620 attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4680 ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccttaata 4740 agatgatctt cttgagatcg ttttggtctg cgcgtaatct cttgctctga aaacgaaaaa 4800 accgccttgc agggcggttt ttcgaaggtt ctctgagcta ccaactcttt gaaccgaggt 4860 aactggcttg gaggagcgca gtcaccaaaa cttgtccttt cagtttagcc ttaaccggcg 4920 catgacttca agactaactc ctctaaatca attaccagtg gctgctgcca gtggtgcttt 4980 tgcatgtctt tccgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcgga 5040 ctgaacgggg ggttcgtgca tacagtccag cttggagcga actgcctacc cggaactgag 5100 tgtcaggcgt ggaatgagac aaacgcggcc ataacagcgg aatgacaccg gtaaaccgaa 5160 aggcaggaac aggagagcgc acgagggagc cgccaggggg aaacgcctgg tatctttata 5220 gtcctgtcgg gtttcgccac cactgatttg agcgtcagat ttcgtgatgc ttgtcagggg 5280 ggcggagcct atggaaaaac ggctttgccg cgggatataa gttgtaattc tcatgtttga 5340 cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt 5400 caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac cgtcaccctg 5460 gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatatcgtc 5520 cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc gttgatgcaa 5580 tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg cccagtcctg 5640 ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac acccgtcctg 5700 tggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct 5760 ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg 5820 agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc 5880 atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg 5940 ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc cttgagagcc 6000 ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg 6060 actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc 6120 ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga 6180 atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag 6240 aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc 6300 gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg 6360 atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt 6420 caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct gatcgtcacg 6480 gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc 6540 ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc 6600 tgaatggaag ccggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc 6660 aattcttgcc cgcggccctc tcacttccct gttaagtatc ttcctggcat cttccaggaa 6720 atctccgccc cgttcgtaag ccatttccgc tcgccgcagt cgaacgaccg agcgtagcga 6780 gtcagtgagc gaggaagcgg aatatatcct gtatcacata ttctgctgac gcaccggtgc 6840 agcctttttt ctcctgccac atgaagcact tcactgacac cctcatcagt gccaacatag 6900 taagccagta tacactccgc tagcgtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 6960 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 7020 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 7080 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 7140 cgcgcgaggc agcagatcaa ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca 7200 ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat 7260 tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct 7320 cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg 7380 aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac 7440 tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc 7500 cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg 7560 tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg 7620 cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg 7680 tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca 7740 tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 7800 cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc 7860 tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac 7920 gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg 7980 gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg 8040 ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata 8100 ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc 8160 tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca 8220 atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa 8280 ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 8340 tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctggttt 8400 gacagcttat catcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa 8460 gctgtggtat ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcggccggcc acgatgcgtc 8520 cggcgtagag gatccggagc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc 8580 agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc 8640 tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca 8700 aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg 8760 agcggataac aatttcacac aggaaa 8786

Claims (18)

1. (a) 바실러스 서브틸리스의 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자;
   (b) 선택적 마커;
   (c) loxP, mutant loxP 및 FRT 자리로 구성된 군에서 선택되는 선택적 마커 제거용 염기서열; 및
   (d) 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열
   을 포함하는 재조합 벡터.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 복제 기점(origin of relication)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 세포 간의 접합에 의한 DNA 전이를 가능하게 하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 세포 간의 접합에 의한 DNA 전이를 가능하게 하는 유전자는 mob 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 mutant loxP자리는 lox71 및 lox66 자리인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 선택적 마커는 숙주 미생물 내의 표적 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열 사이에 존재하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
7. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 pSMCmacnB.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 선택적 마커는 클로람페니콜(Chloramphenicol), 가나마이신(Kanamycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 엠피실린(Ampicillin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 설폰아마이드(Sulfonamide)계 항생제 및 스트랩토마이신(Streptomycin) 내성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 선택적 마커인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
9. 다음의 단계를 포함하는 랄스토니아 속 미생물의 표적 유전자를 불활성화시키는 방법:
   (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터를 랄스토니아 속 미생물에 도입하고, 상기 재조합 벡터가 도입된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계; 및
   (b) 상기 선별된 미생물을 수크로즈가 함유된 배지에서 배양하여 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 미생물은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)인 것을 특징으로 하는 표적 유전자를 불활성화시키는 방법.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 선택적 마커는 클로람페니콜(Chloramphenicol), 가나마이신(Kanamycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 엠피실린(Ampicillin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 설폰아마이드(Sulfonamide)계 항생제 및 스트랩토마이신(Streptomycin) 내성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 선택적 마커인 것을 특징으로 하는 표적 유전자를 불활성화시키는 방법.
    
12. 다음의 단계를 포함하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터를 랄스토니아 속 미생물에 도입하고, 상기 재조합 벡터가 도입된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계;
    (b) 상기 선별된 미생물을 수크로즈가 함유된 배지에서 배양하여 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 랄스토니아 속 미생물을 선별하는 단계; 및
    (c) 상기 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 랄스토니아 속 미생물에 loxP 자리를 재조합하는 효소, mutant loxP 자리를 재조합하는 효소 및 FRT 자리를 재조합하는 효소로 구성된 군에서 선택되는 재조합효소를 포함하는 셔틀벡터를 도입하여, 재조합 효소의 발현에 의해 선택적 마커의 제거를 위한 염기서열의 재조합이 일어남으로써 상기 선택적 마커를 제거하는 단계.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터는 loxP 자리 또는 mutant loxP 자리를 재조합하는 Cre 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법.
    
14. 제12항에 있어서, 상기 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터는 pTaccreTc인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법.
    
15. 제12항에 있어서, 상기 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터는 FRT 자리를 재조합하는 Flp 재조합 효소를 포함하는 셔틀벡터인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법.
    
16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랄스토니아 속 미생물은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법.
    
17. 제12항에 있어서, 상기 선택적 마커는 클로람페니콜(Chloramphenicol), 가나마이신(Kanamycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 엠피실린(Ampicillin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 설폰아마이드(Sulfonamide)계 항생제 및 스트랩토마이신(Streptomycin) 내성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 선택적 마커인 것을 특징으로 하는 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물을 제조하는 방법.
    
18. 제12항의 방법에 의해 제조된 표적 유전자가 불활성화된 랄스토니아 속 미생물.

Images