CN109221927A - 一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质及其在制备提高免疫力的制剂中的应用 - Google Patents

一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质及其在制备提高免疫力的制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质及其在制备提高免疫力的制剂中的应用。本发明通过研究培养基配比、料水比、接种量和发酵时间各单因素对蛹虫草固态发酵黄粉虫菌质中虫草素含量的影响；然后以上述单因素实验结果为依据，采用四因素三水平的正交优化实验，得出最佳发酵工艺为：黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉质量比6:4，料水比10:8，接种量25%，发酵时间共11天，发酵物中虫草素含量为8.63 mg/g。本发明开拓了黄粉虫这一昆虫资源的新应用，提高了黄粉虫的附加值，同时，也促进了蛹虫草新产品的开发。

Description

一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质及其在制备提高免 疫力的制剂中的应用
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质及其在制备提高免疫力的制剂中的应用。
背景技术
黄粉虫含丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、微量元素及氨基酸等营养成分，目前主要用于制作简单的菜肴以及添加到经济型动物饲料中，黄粉虫优质蛋白资源有待进一步开发。黄粉虫原来被看作贮藏害虫，随着仓储条件和虫害控制加强，仓储环境中的黄粉虫数量减少，已进入养殖阶段，近几年山东省黄粉虫产量迅速增长，使得山东很多地区出现滞销现象。目前，对于黄粉虫的开发还仅仅局限在传统的方式，只能被加工为饲料、罐头、饼干等，这大大降低了黄粉虫本身的价值，而且由于加工方式以及销售困难，致使大量黄粉虫资源被浪费。
蛹虫草与冬虫夏草同属异种，含虫草素、虫草酸、虫草多糖等生物活性成分，具有抗菌、抗衰老、抗肿瘤、提高机体免疫力等功效，但目前市场产品价格昂贵，市场推广性差。人们经济水平和健康意识不断提高，对食品的营养性和保健性越来越重视，而蛹虫草营养全面且能增强机体免疫力。野生蛹虫草存在资源稀缺、生产周期长、菌种退化和价格昂贵等问题。
发明内容
本发明的发明目的是提供了一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质及其在制备提高免疫力的制剂中的应用。本发明把食用真菌与食用昆虫结合在一起，利用蛹虫草菌的发酵能力，黄粉虫为其发酵提供所需的营养物质，采用蛹虫草固态发酵技术，将发酵物中虫草素含量提高到约8mg/g；将黄粉虫幼虫粉作为主要发酵基质，开拓了黄粉虫这一昆虫资源的新应用，提高了黄粉虫的附加值，同时，也促进了蛹虫草新产品的开发。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质，所述发酵菌质的制备方法包括以下步骤：
(1)、将蛹虫草菌接种到培养基中制备种子培养液；
(2)、称取黄粉虫粉和大米混匀作为发酵基质，并添加水，接入蛹虫草菌种子液进行暗培养；
(3)暗培养结束后，再将其置于光照下培养；制得的培养基即为发酵菌质。
进一步的：所述步骤(2)中黄粉虫粉与大米的质量比例为5∶5～9∶1。
进一步的：所述步骤(2)中发酵基质和水的料水比为10∶6～10∶14。
进一步的：所述步骤(2)中接种量为10％～30％。
进一步的：所述步骤(2)中暗培养为5天。
进一步的：所述步骤(3)中光照培养为6天。
进一步的：最佳条件为黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉配比6∶4，料水比10∶8，接种量25％，发酵时间共11天。
本发明还提供了所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质在制备提高免疫力的制剂中的应用。
进一步的：所述发酵菌质浓度为2～10mg/mL逐渐增大时，其对DPPH自由基的清除率、对羟自由基的清除能力和还原能力逐渐提高。
进一步的：所述发酵菌质在20～100mg/mL范围内，随着浓度增加，对超氧阴离子自由基的清除率增大。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明利用黄粉虫这一优质动物蛋白资源，将蛹虫草菌用来发酵黄粉虫，缓解了我国即将面临的蛋白质资源危机，为昆虫功能食品的开发提供科学依据。将蛹虫草资源和黄粉虫高蛋白资源结合，通过固态发酵得到富含较高虫草素的菌质。既充分利用了昆虫蛋白资源，提升昆虫产品价值，又缩短生产周期长，提高生产效率，降低成本。通过严谨的小鼠实验研究发酵物的抗氧化活性及免疫活性为新型昆虫功能性的研发提供数据参考。
附图说明
图1是虫草素标准曲线实验结果图；
图2是黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉不同配比对黄粉虫菌质中虫草素含量实验结果图；
图3是不同料水比对黄粉虫发酵菌质中虫草素含量影响的实验结果图；
图4是不同接种量对黄粉虫菌质中虫草素含量影响的实验结果图；
图5是不同发酵时间对黄粉虫发酵菌质中虫草素含量影响的实验结果图；
图6是不同浓度发酵菌质对DPPH自由基的清除能力实验结果图；
图7是不同浓度发酵菌质对超氧阴离子自由基的清除能力实验结果图；
图8是不同浓度发酵菌质对羟自由基的清除能力实验结果图；
图9是不同浓度发酵菌质的还原能力实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1：利用蛹虫草菌固态发酵黄粉虫的发酵菌质的制备方法
1、蛹虫草菌株的活化
将蛹虫草菌株接种于PDA固体平板培养基上，25℃恒温避光培养6天，至菌丝长满斜面培养基且洁白致密无杂菌，4℃冰箱避光保存备用。
2、蛹虫草菌液体种子的制备
500mL三角瓶装入200mL培养基，121℃灭菌30min，挑选活化好菌丝体洁白致密的蛹虫草斜面培养基，用接种铲铲取3块约5mm2的菌丝块转接到液体培养基中。130r/min、23℃恒温振荡避光培养3天，使菌丝球均匀布满液体培养基，用于黄粉虫固体培养基的接种。
3、蛹虫草菌固态发酵黄粉虫
精确称取20g发酵基质(黄粉虫粉和大米的混合物)和量取16mL蒸馏水， 500mL三角瓶中121℃灭菌30min，灭菌结束后，放于超净工作台中冷却，每瓶接入25％的蛹虫草菌种子液，玻璃棒搅拌均匀，期间严格无菌操作。25℃恒温培养箱中避光培养6天，每隔8小时振荡一次，使固体培养基上均匀长满白色小颗粒状。暗培养结束后，再将其置于300lx光照下培养4天，每隔8小时振荡一次，防止结块，培养基颜色有白色变为橘黄色。取出长满菌丝的固体培养基，冷冻干燥，干燥好的培养基即为制得的发酵菌质，经粉碎机粉碎4℃冰箱保存。
实施例2：虫草素含量的测定
蛹虫草菌黄粉虫发酵物中虫草素的含量测定使用安捷伦1260型高效液相色谱分析仪，C18色谱柱(4.6mm×150mm)流动相为乙腈∶水＝1∶9，流速为0.8mL/min，进样量5μL，柱温25℃，检测波长为260nm。将虫草素标准品用20％乙醇溶解配制出1mg/mL溶液，再分别稀释成6.25、12.5、25、50、100μg/mL的标准液，均用0.22μm微孔过滤膜后备用。分别进样测定后，以虫草素为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标制作标准曲线，见图1。虫草素标准曲线方程为y＝22.384x-48.15，相关系数R2＝0.9997，线性范围为6.25～100μg/mL。
称取所述黄粉虫发酵菌质粉末5g，加入125mL的20％乙醇，称重后，置于超声清洗仪中40℃，浸提30min，冷却至室温，称重后用20％乙醇补足丢失的重量，混匀过滤收集浸提液，用孔径0.22μm的膜过滤，4℃短时间保藏待测。
每个实验因素发酵三瓶，以减少实验误差。使用SPSS统计软件对结果进行差异显著分析，实验数据用来表示。依据虫草素标准曲线。计算出发酵物虫草素含量。
实施例3：蛹虫草菌固态发酵黄粉虫工艺的单因素试验
1、黄粉虫粉与大米粉不同配比对黄粉虫菌质中虫草素含量的影响
将干燥的黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉分别以5∶5、6∶4、7∶3、9∶1的比例混合，加水量按料水比10∶8(g/mL)，121℃灭菌30min，接种量15％，发酵温度25℃，先暗环境培养5天，见光培养4天，每隔8小时振荡一次，防止结块。实验结果见图2。
由图2可知，发酵物中虫草素的含量随着黄粉虫含量的增加呈现先升高后降低的趋势。当黄粉虫粉与大米粉比例达到6∶4时，蛹虫草发酵黄粉虫发酵物的虫草素含量达到最高8.56mg/g；其后，随着黄粉虫含量的增加，发酵物中虫草素含量呈递减状态。蛹虫草菌丝体的生长需要氮源和碳源，黄粉虫粉和大米粉来提供相应的营养因子，其在适当比例时，恰好适合蛹虫草菌丝体的生长及虫草素的生成。
2、料水比对黄粉虫菌质中虫草素含量的影响
黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉按5∶5配制培养基，混匀，按料液比10∶6、10∶8、 10∶10、10∶12、10∶14(g/mL)加入蒸馏水，121℃灭菌30min，接种量15％，发酵温度25℃，先暗环境培养5天，见光培养4天，每隔8小时振荡一次，防止结块。实验结果如图3所示。
由图3可知，随着发酵中加水量的增加，蛹虫草菌发酵黄粉虫发酵物中虫草素含量先升高后逐渐降低。当料液比为10∶8时，发酵物中虫草素含量达到最高8.32mg/g。料水比过大时，使黄粉虫粉和大米粉的培养基较干，不适合蛹虫草菌发酵；料液比过小时，使培养基含水量变高，粘性增加，易结块，透气性变差，菌丝体的供氧量降低，菌丝体只长在基质的表面，无法渗透到基质里面，最终使得培养基发酵不彻底，甚至易染杂菌。
3、接种量对黄粉虫菌质中虫草素含量的影响
黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉按5∶5配制培养基，混匀，加水量按料水比10∶8 (g/mL)，121℃灭菌30min，接种量分别为10％、15％、20％、25％、30％，发酵温度25℃，先暗环境培养5天，见光培养4天，每隔8小时振荡一次，防止结块。结果如图4所示。
由图4可知，蛹虫草菌黄粉虫发酵物中虫草素含量随着接种量的增加，呈现先逐渐升高后降低的趋势。当接种量在20％时，发酵物中虫草素的含量到达最高 8.46mg/g。实验中，接种量的大小直接影响发酵基质中蛹虫草菌的生长快慢。当接种量过少时，基质接种面积小，菌丝体生长缓慢，基质发酵不彻底，降低了生产效率；接种量过大时，蛹虫草菌丝体生长较快，不易染杂菌，但也容易在基质表面形成菌膜限制内部菌丝体的生长，同时代谢废物增加，也会影响虫草素等有益物质的产生。
4、发酵时间对黄粉虫菌质中虫草素含量的影响
黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉按5∶5配制培养基，混匀，加水量按料水比10∶8 (g/mL)，121℃灭菌30min，接种量15％，发酵温度25℃，先暗环境培养5天，分别见光培养3、4、5、6、7天，每隔8小时振荡一次，防止结块。
由图5可知，随着发酵时间的增加，增加见光发酵时间，蛹虫草菌发酵黄粉虫发酵物中虫草素含量先升高后降低。发酵时间在9～10d(见光时间为4～5d) 时，发酵物中虫草素含量达到最高8.53mg/g。发酵前段，随着发酵时间的增加，虫草素等发酵产物不断积累；当发酵时间过长时，蛹虫草菌丝体发生老化现象，虫草素积累速度降低，同时可能还伴随着虫草素的分解，因此应严格把握好发酵时间。
实施例4：蛹虫草菌固态发酵黄粉虫工艺的正交优化实验
在上述单因素实验结果的基础上，采用L9(34)正交优化实验设计，以培养基配比、料水比、接种量和发酵时间为影响因素，以菌质中虫草素含量为指标，研究这四因素之间的关系，确定它们之间的最佳组合，确定蛹虫草菌发酵黄粉虫的最佳发酵条件，因素水平见表1。
表1.正交实验因素和水平
以培养基配比、料水比、接种量和发酵时间为四因素，以单因素实验结果为基础，选取与最佳条件相邻的三水平，测定发酵后的虫草素含量，进一步研究蛹虫草菌发酵黄粉虫的最佳工艺，实验结果见表2。
表2.正交优化实验结果及统计分析
由表2可知，对菌质中虫草素含量的极差分析可知，RA＞RB＞RD＞RC，可以看出不同因素对蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质中虫草素含量的影响主次顺序为：培养基配比＞料水比＞发酵时间＞接种量。即培养基配比对发酵物中虫草素含量影响最大，其次是料水比和发酵时间，接种量对其影响最小。并确定最佳发酵工艺组合为A2B2C3D3，即蛹虫草发酵黄粉虫最佳条件为黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉配比6∶4，料水比10∶8，接种量25％，发酵时间共11天。
依据正交实验结果的最佳发酵方案，即黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉配比6∶4，料水比10∶8，接种量25％，发酵时间共11天，进行验证实验，测定菌质中虫草素含量为8.63mg/g，与理论预期结果相近，且重复性较好，从而验证正交优化实验结果可靠。
对正交实验结果方差分析和显著性检验。结果见表3。
表3.正交优化实验结果方差分析
实验水平在α＝0.10情况下，分析实验各因素的显著性。由表3可知，F培养基配比＞F临界值，即因素A培养基配比对菌质中虫草含量有明显影响；因素 B料水比、因素C接种量和因素D发酵时间对菌质中虫草素含量的影响不显著。
实施例5：黄粉虫菌质体外抗氧化能力的测定方法
1、黄粉虫菌质清除DPPH自由基能力的测定
参考Brand-Williams等修订的DPPH法，DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼) 是稳定的有机自由基，溶于乙醇，其溶液呈深紫红色，在517nm下有特征吸收峰，当DPPH自由基接触抗氧化剂时，与孤对电子结合，使深紫红色的DPPH 自由基溶液被还原呈黄色，517nm处吸光值降低，其降低程度与接受电子数量呈定量关系，因此可以用吸光值的变化定量分析DPPH自由基清除率。
精确吸取0.5mL不同浓度(2、4、6、8、10mg/mL)的样品溶液加入试管中，加入2.4mLDPPH溶液(无水乙醇配制，浓度为0.2mmol/L)，再加入浸提试剂使每个试管补足4mL，充分混匀，静置黑暗处反应30min，在517nm测定吸光值，以浸提试剂代替样品溶液，作为对照实验，以无水乙醇代替DPPH溶液作样品参照实验，每管做三个平行。DPPH自由基清除能力计算公式为：
式中：A1为样品管的吸光值；A2为样参管的吸光值；A0为对照管的吸光值。
实验结果如图6所示。随着蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质浓度增大，其对DPPH 自由基的清除率也升高。2～4mg/mL比4～10mg/mL下菌质清除DPPH自由基能力变化大。经验证，浓度大于10mg/mL后，菌质对DPPH自由基的清除能力逐渐趋于平稳，不在继续升高。当蛹虫草菌发酵黄粉虫发酵物浓度为10mg/mL 时，其对DPPH自由基的清除率达到80.34％，其IC50为5.08mg/mL。
2、黄粉虫菌质清除超氧阴离子能力的测定
测定采用邻苯三酚自氧化法，原理是邻苯三酚在碱性条件下快速自氧化，产生O2 -和深色中间产物，在4min以内有色中间产物的积累与反应时间呈现线性关系，同时在316nm处具有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化的程度与O2 -的浓度成正相关，某抗氧化物质与O2 -结合，可抑制有色中间产物的积累，因此，用紫外分光光度计定量测定某抗氧化物质对超氧阴离子自由基的清除作用。
实验设置空白管、空损管、样损管和样未损管，吸取5mL lmmol/mL的 Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)加入各管中，随后在空白管和空损管中各加50μL浸提试剂，样损管和样未损管各加等体积不同浓度(2、4、6、8、10mg/mL)样品溶液，充分混匀后25℃水浴静置20min，以下实验操作均在25℃水浴锅中进行，向空白管和样损管中分别加入40μL 10mmol/L的盐酸，充分混匀，向空损管中加入40μL 25mmol/L邻苯三酚，计时30秒后向样品管中加入等体积邻苯三酚。3min后，再向空损管中加入50μL 50mg/mL的DTT，3min 30s后向样品管中加入等体积DTT，最后向空白管和样损管中加入50μLDTT。室温下静置15 min，316nm测定吸光值。每管做三个平行。超氧阴离子自由基清除率的计算公式为：
式中：A1为空损管的吸光值；A2为样损管的吸光值；A3为样未损管的吸光值。
实验结果如图7所示。蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质在20～100mg/mL范围内，随着浓度增加，对超氧阴离子自由基的清除率增大。经验证，浓度大于100mg/mL 时，蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对超氧阴离子自由基的清除率逐渐趋于平稳，不在继续增加。浓度是100mg/mL时，其对超氧阴离子自由基的清除率为66.30％， IC50为86.73mg/mL。
3、黄粉虫菌质清除羟自由基能力的测定
清除羟自由基能力测定原理以fenton反应为基础： Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-。体系中Fe2+与邻二氮菲形成红色配合物，536nm有特征吸收峰，随着反应进行最大吸收波长处的吸光值逐渐减弱，抗氧化成分与羟自由基结合，可减弱氧化作用，因此相应的吸光值变化减小。
实验设空白管、未损管、损伤管、样参管和样品管，吸取3.25mL pH＝7.4 的磷酸盐缓冲溶液加入各管中，空白管、未损管和样参管分别加入0.75、0.25 和0.75mL的蒸馏水，再空白管、未损管、损伤管均加入1mL的浸提试剂，样参管和样品管加入1mL样品溶液，充分混匀，再未损管、损伤管和样品管均加入0.25mL 7.5mmol/L的邻二氮菲，混匀后再向加过邻二氮菲的试管中加入0.25 mL 7.5mmol/L的硫酸亚铁，迅速混匀，最后，向损伤管和样品管加入0.25mL 1％的H2O2，37℃水浴90min后在536nm下测定吸光值。每管做三个平行。羟自由基清除能力的计算公式为：
式中：A1为未损管的吸光值；A2为损伤管的吸光值；A3为样参管的吸光值； A4为样品管的吸光值。实验结果如图8所示。当蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质浓度在2～10mg/mL逐渐增大时，其对对羟自由的清除能力也会随着提高。也可发现浓度在2～4mg/mL比4～10mg/mL下菌质清除羟自由基能力变化大。经验证，浓度大于10mg/mL后，菌质对DPPH自由基的清除能力逐渐趋于平稳，不在继续升高。当浓度在10mg/mL时，其清除率达到77.28％，IC50为6.61mg/mL。
4、黄粉虫菌质还原能力的测定
抗氧化剂在抗氧化的同时，释放出电子给自由基，从而清除自由基。抗氧化剂的还原力与其抗氧化活性之间存在关系，还原力越强，抗氧化活性越强。本实验样品中的抗氧化成分能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁(亚铁氰化钾)，二价铁(亚铁氰化钾)进一步和三氯化铁反应生成在700nm处有最大吸光度的普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3)，因此，700nm处吸光值的高低间接反映抗氧化剂的还原能力大小，吸光度越大，还原能力越强。
参照丁艳如等的方法改良实验，加入稀释样品1mL、0.2mol/L(pH＝6.6)的磷酸盐缓冲溶液0.2mL、1％铁氰化钾溶液0.5mL于离心管中，混匀，于50℃反应20min，迅速冷却后加入10％三氯乙酸溶液1mL，混匀，5000r/min离心 10min，取出上清液；在试管中依次加入上清液1.5mL、蒸馏水3mL、1％三氯化铁溶液0.2mL，混匀，静置10min，以蒸馏水作空白对照，700nm下测吸光度值。
实验结果如图9所示。浓度在2～10mg/mL范围时，随着蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质浓度增大，其还原能力也升高。浓度2～6mg/mL比6～10mg/mL下菌质还原能力变化大。当浓度在10mg/mL时，还原能力达到0.967。
实施例6：蛹虫草菌发酵黄粉虫的发酵菌质的抗氧化活性研究
1、蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠体重增加量的影响
实验选取8周龄，体重为18～22g的健康雄性昆明SPF级小白鼠，60只，随机分为空白组、D-半乳糖致衰老模型组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，共6组，每组10只。室温控制在22～25℃，通风良好，小鼠自由摄食、饮水，适应性饲养一周。小鼠适应环境后按表4进行实验，每隔12小时投放一次粮食和水。其中，维生素C溶液按100mg/(kg bw·d)灌胃，D-半乳糖溶液按200mg/(kg bw·d)皮下注射，灌胃和皮下注射均遵循等体积原则，以保证每只老鼠受相同伤害处理。小鼠自由采食、取水。饲养42天，每天观察记录小鼠的体征及精神状态，每周称一次体重。
表4.对各组小鼠的不同处理
表5.黄粉虫菌质对小鼠体重的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
由表5可知，在42天喂养期间，小鼠体重均有增加，其中模型组小鼠平均体重增加量最小，阳性对照组小鼠平均体重增加量最大。模型组小鼠体重增加量明显低于空白组小鼠，模型组与低剂量组和中剂量组小鼠体重增加量无明显差异，明显高于高剂量组小鼠。数据分析可知，小鼠体重增加量与饲料中黄粉虫发酵菌质添加量呈正比，高剂量组与正常组和阳性对照组比较小鼠体重增加量无明显差异，表明黄粉虫发酵菌质可改善衰老小鼠体重减轻的现象。
实施例7：小鼠血浆和肝部的抗氧化活性指标测定
1、小鼠处死及血浆和肝脏组织样品的前处理
建模和给药42天后，称量体重，分组依次眼球取血并颈椎脱臼处死，解剖取出小鼠完整的肝脏组织。小鼠全血3000r/min离心10min，收集上层血清，分装后贮存于-80℃冰箱中；肝脏组织置于4℃生理盐水中洗净，吸水纸吸干多余水分，剪取部分肝尖组织加入9倍预冷的生理盐水制成10％的组织匀浆，3000r/min 低温离心10min，吸取上清液，分装后贮存于-80℃冰箱中。
2、小鼠肝部组织蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝法测定小鼠肝脏组织的蛋白质含量，使用蛋白质定量测试盒，按照试剂盒说明书要求，以蒸馏水代替样品做空白，以标准溶液代替样品做对照， 595nm处测定吸光值，依据吸光值计算小鼠肝脏中蛋白质的含量。
3、小鼠血浆和肝脏中丙二醛(MDA)含量的测定
丙二醛(MDA)是细胞膜遭受氧自由基攻击，膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应产生的降解产物，MDA含量的高低可以反应细胞遭受氧自由基攻击损伤的程度。MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成红色物质，532nm 有特征吸收峰。依据丙二醛(MDA)测试盒说明书，取小鼠的血液及肝脏组织匀浆，测定其MDA含量。
4、蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠血浆和肝脏中丙二醛含量的影响
表6.发酵菌质对小鼠血浆和肝脏中丙二醛含量的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
丙二醛(MDA)评价衰老的重要指标，MDA含量越高，机体氧化损伤程度越大。由表6可知，模型组与空白组比较，小鼠血浆和肝脏中MDA含量，模型组均高于空白组且差异显著，说明实验建立D-半乳糖致亚急性衰老的模型成功。随着黄粉虫发酵菌质剂量的增加，MDA在血浆和肝脏中的含量逐渐降低。血浆和肝脏中的MDA在中剂量组时，就与空白组无明显差异，说明达到正常组水平。同时，中、高剂量组与阳性对照组比较，MDA含量差异不明显，说明中、高剂量组的黄粉虫发酵菌质具有较好的抗氧化能力，使衰老模型小鼠机体基本恢复正常水平。
5、小鼠血浆和肝脏中清除羟自由基能力的测定
羟自由基作为氧自由基的一份子，是反应活性最强的氧自由基，是仅次于 F-强氧化剂，是机体氧化反应的中间介质，几乎与所有的细胞内生物大分子发生反应，当机体衰老抗氧化能力降低或是细胞受损时，体内羟自由基的数量会相对增加。Fenton反应体系中，H2O2的量与·OH量呈正比，当给予电子受体后，用 griess溶液显色，生成红色物质，其颜色与·OH量呈正比关系。利用37℃反应1 min，体系中H2O2浓度降低1mmol/L为一个清除羟自由基能力单位，依据羟自由基测定试剂盒，测定并计算出小鼠血清及肝脏组织对羟自由基的清除能力。
表7.黄粉虫发酵菌质对小鼠血浆和肝脏中小鼠血浆和肝脏清除羟自由基能力的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
由表7可知，模型组与空白组比较，小鼠血浆和肝脏的清除羟自由基能力低且差异显著，说明D-半乳糖致衰老模型建模成功。随着黄粉虫发酵菌质剂量的增加，血浆和肝脏的清除羟自由基能力也逐渐增大。低剂量组与模型组无明显差异，但中剂量组和高剂量组与模型组差异显著，与空白组比较无显著性差异，说明中、高剂量组小鼠羟自由清除能力已恢复健康小鼠水平。
6、小鼠血浆和肝脏中过氧化氢酶(CAT)活力的测定
过氧化物酶(CAT)是机体重要的抗氧化酶，它可将机体新陈代谢产生的过氧化氢分解成水和氧，使机体免受有机氢过氧化物的损害，延缓细胞的衰老，其活性可以反应机体抗氧化能力。钼酸铵可以迅速终止过氧化氢酶分解过氧化氢的反应，并与剩余的过氧化氢作用产生淡黄色络合物，在405nm处测定其吸光值，依据过氧化物酶(CAT)测试盒说明书操作，并计算出小鼠血清及肝脏组织中CAT的活力。
表8.黄粉虫发酵菌质对小鼠血浆和肝脏中过氧化氢酶活力的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
由表8可知，与空白组比较，D-半乳糖致衰老模型组小鼠血浆和肝脏中过氧化氢酶活力明显低，说明D-半乳糖致衰老模型已建成。低、中、高剂量组，随着剂量的增加，小鼠血浆和肝脏中过氧化氢酶活力逐渐升高。低剂量组血浆中的 CAT与模型组无明显差异，但中、高剂量组差异显著，肝脏组织中CAT含量低、中、高剂量组与模型组均有明显差异，且高剂量组小鼠血浆和肝脏中CAT活力与空白组比较，无明显差异，说明剂量达到高剂量组水平时，衰老小鼠血浆和肝脏中CAT活力已经恢复正常水平。
7、小鼠血浆和肝脏中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力的测定
超氧化物歧化酶(SOD)对超氧阴离子自由基(O2-·)有特殊的抑制作用，使其发生歧化作用，生成为O2和H2O2。机体超氧化物歧化酶水平与自由基含量呈负相关，可反映机体抗氧化能力。本实验利用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应，产生超氧阴离子自由基，而后氧化羟胺反应生成亚硝酸盐，加入显色剂显紫红色，测定550nm处的吸光值。若体系中含SOD，对超氧阴离子自由基有清除作用，使亚硝酸盐含量减少，吸光值变小。依据总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒说明测定并计算出小鼠血清及肝脏组织中T-SOD的活力。
表9.黄粉虫发酵菌质对小鼠血浆和肝脏中总超氧歧化酶活力的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
超氧化物歧化酶(SOD)是机体重要的抗氧化酶，它具有特异性抑制超氧阴离子自由基的能力。由表9可知，模型组T-SOD活力低于空白组且差异显著，说明D-半乳糖致衰老模型建成。低、中、高剂量组T-SOD活力随黄粉虫发酵菌质剂量增加而升高，低剂量组与空白组小鼠差异显著，但中、高剂量时，T-SOD 活力与空白组已无明显差异，说明中剂量组小鼠T-SOD活性已经恢复健康小鼠水平。
8、小鼠血浆和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的测定
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)也是机体重要的内源性抗氧化酶类，它可催化还原型GSH和H2O2的反应，生成水和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，起到清除自由基保护膜结构的作用。酶促反应的速度反应GSH-Px活力，通过测定GSH 的消耗量计算GSH-Px的活力，谷胱甘肽与二硫代二硝基苯甲酸反应，形成5- 硫代二硝基苯甲酸阴离子，产物呈黄色，测定412nm处吸光值。实验用GSH-Px 测试盒测定小白鼠血浆和肝脏中GSH-Px活力。
表10.黄粉虫发酵菌质对小鼠血浆和肝脏中总谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)也是机体重要的抗氧化酶，它的活力可以用来衡量机体抗氧化能力的强弱。由表10可知，模型组GSH-Px活力明显低于空白组，说明D-半乳糖致衰老模型建模成功。低、中、高剂量小鼠血浆中GSH-Px 活力均明显高于模型组，且中剂量组GSH-Px活力与空白组无明显差异，说明中剂量组小鼠血浆中的GSH-Px活力已经正常小鼠水平；而肝脏中GSH-Px的活力，中、高剂量小鼠明显高于模型组，且高剂量组GSH-Px活力与空白组无明显差异，说明高剂量组小鼠肝脏中的GSH-Px活力已经恢复正常小鼠水平。
实施例8：蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质免疫活性研究
本实验运用D-半乳糖致衰老模型，以脾脏指数、胸腺指数、血清中IgG、IgM 以及白细胞介素-4和干扰素-γ的含量为指标，研究蛹虫草菌发酵黄粉虫发酵物对 D-半乳糖致衰老小鼠的免疫功能的影响，探讨其延缓免疫衰老的作用机制。
1.小鼠分组与饲喂
60只8周龄18～22g的健康雄性昆明SPF级小白鼠适应性饲养一周后，随机分为空白组、模型组、维生素C阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，共6组，每组10只。室温稳定在22～25℃，适当通风，小鼠自由取食饮水，适应性饲养一周。小鼠适应环境后按表11进行实验，每隔12小时投放一次粮食和水。其中，维生素C溶液按100mg/(kg bw·d)灌胃，D-半乳糖溶液按200mg/(kg bw·d)皮下注射，灌胃和皮下注射均遵循等体积原则，以保证每只老鼠受相同伤害处理。小鼠自由采食、取水。饲养42天，每天观察记录小鼠的体征及精神状态。
表11对各组小鼠的不同处理
2.小鼠取血与解剖
小鼠最后进食12h后，眼球取血，然后颈椎脱臼处理，解剖观察各脏器状态，并分离成完整的肝脏、胸腺、脾脏，放于无菌生理盐水中漂洗，吸水纸吸干多余的水分，精确称重，-80℃冰箱贮存。小鼠全血3000r/min离心10min，收集上层血清，分装后贮存于-80℃冰箱中。
3.蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠免疫功能影响的指标测定
脾脏是机体最大的外周免疫器官，胸腺是机体重要的中枢免疫器官，免疫器官指数反映了免疫器官的发育和免疫功能。
胸腺、脾脏剥离出，无菌生理盐水清洗，吸水纸吸干多余水分，电子分析天平精确称取重量。以脏器重量(mg)与小鼠体重(g)比值，表示相应脏器指数。
蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠免疫器官指数的影响，结果如表12所示。
表12.黄粉虫发酵菌质对小鼠免疫器官指数的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
由表12可知，模型组与空白组比较，免疫器官指数明显低于空白组，说明 D-半乳糖致衰老模型建模成功。与模型组比较，低、中、高剂量组的脾脏指数和胸腺指数明显升高。低剂量组的胸腺指数和脾脏指数，与空白组比较无明显差异，说明低剂量组时，脾脏、胸腺重量达到正常小鼠的水平。随着黄粉虫发酵物剂量的增加，高剂量组与阳性组比较无明显差异，说明黄粉虫发酵物高剂量组已达到阳性组小鼠水平，但低、中、高剂量组之间的胸腺指数差异显著，而脾脏指数无明显差异。
4、蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠血浆中免疫球蛋白G(IgG)含量影响的测定
免疫球蛋白G(IgG)占血浆总免疫球白75％，主要有浆细胞合成，能与抗原特异性结合，是再次免疫应答中产生的主要抗体。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，往预先包被免疫球蛋白G(IgG)抗体的包被微孔中，依次加入样品、标准品、被标记过的检测抗体，经过37℃恒温温育，彻底洗涤。用底物TMB发生显色反应，底物在过氧化物酶的作用下变为蓝色，然后与酸反应最终变成黄色。颜色的深浅和样品中的IgG含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定OD值，计算样品浓度。
由表13可知，与空白组比较，模型组小鼠血浆中IgG含量明显低，说明D- 半乳糖致衰老模型建模成功。与模型组对比，低、中、高剂量组小鼠血浆中IgG 含量显著升高。黄粉虫发酵菌质低、中剂量组与空白组比较差异显著，与阳性组比较无明显差异，高剂量组与阳性对照组比较，差异显著，说明低、中剂量组已达到阳性组小鼠水平，高剂量组效果高于阳性对照组，且低、中、高剂量组之间差异显著。
表13.黄粉虫发酵菌质对小鼠血浆中IgG含量的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
5、蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠血浆中免疫球蛋白M(IgM)含量影响的测定
免疫球蛋白M是机体对抗抗原最先出现的抗体，也是分子量最大的免疫球蛋白，血清中IgM含量的高低可以反应机体免疫功能。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，往预先包被免疫球蛋白M(IgM)抗体的包被微孔中，依次加入样品、标准品、被标记过的检测抗体，经过37℃恒温温育，彻底洗涤。用底物TMB发生显色反应，底物在过氧化物酶的作用下变为蓝色，然后与酸反应最终变成黄色。颜色的深浅和样品中的IgM含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定OD值，计算样品浓度。结果见表14。
表14.发酵菌质对小鼠血浆中IgM含量的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
由表14可知，模型组与空白组免疫球蛋白含量有明显差异，说明D-半乳糖致衰老模型建模成功。随着黄粉虫发酵菌质剂量的增加，低、中、高剂量组免疫球蛋白M含量明显升高。阳性对照组与低、中剂量组比较无明显差异，与高剂量组比较差异显著，说明低、中剂量组时已经达到阳性对照组的水平，高剂量组效果超过阳性对照组水平，但低、中剂量之间无明显差异，低、中剂量组与高剂量组差异显著。实验结果说明，小鼠血清中免疫球蛋白M含量随剂量增加而升高，说明蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质有提升衰老模型小鼠血清中IgM含量的作用。
6、蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠血浆中白细胞介素4(IL-4)含量影响的测定
白细胞介素4(IL-4)是由II型辅助T细胞(Th2)分泌的主要细胞因子，在调节体液免疫及适应性免疫中起重要作用。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，往预先包被IL-4抗体的包被微孔中，依次加入样品、标准品、被标记过的检测抗体，经过37℃恒温温育，彻底洗涤。用底物TMB发生显色反应，底物在过氧化物酶的作用下变为蓝色，然后与酸反应最终变成黄色。颜色的深浅和样品中的IL-4含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定OD值，计算样品浓度。
表15.发酵菌质对小鼠血浆中白细胞介素4(IL-4)含量的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
由表15可知，与空白组比较，模型组小鼠血浆中白细胞介素4(IL-4)含量明显低，且差异显著，说明D-半乳糖致衰老模型建模成功。与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠血浆中白细胞介素4(IL-4)含量明显逐渐升高。低剂量组与阳性对照组比较无显著差异，中、高剂量组与阳性对照组差异显著，且低、中、高剂量组之间差异明显，说明随着黄粉虫发酵菌质剂量的增加，小鼠血浆中IL-4 含量明显升高，低剂量组小鼠血浆中IL-4含量恢复到对照组小鼠水平，中、高剂量组鼠血浆中IL-4含量超过阳性对照组水平。
7、蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质对小鼠血浆中γ干扰素(IFN-γ)含量影响的测定
干扰素分为α、β和γ三种类型，其中干扰素-γ主要参与免疫调节及抗病毒和抗肿瘤作用。选用小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，往预先包被IFN-γ抗体的包被微孔中，依次加入样品、标准品、被标记过的检测抗体，经过37℃恒温温育，彻底洗涤。用底物TMB发生显色反应，底物在过氧化物酶的作用下变为蓝色，然后与酸反应最终变成黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定OD值，计算样品浓度。
表16.发酵菌质对小鼠血浆中IFN-γ含量的影响
注：同列中相同上标表示数值间差异不显著，不同上标表示数值间差异显著(p＜0.05)。
由表16可知，模型组小鼠血清中干扰素-γ含量比空白组低，且差异明显，说明D-半乳糖致衰老模型建模成功。与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠血清中干扰素-γ含量明显处于升高趋势，说明衰老模型小鼠血清中干扰素-γ含量随蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质剂量的增加而升高。黄粉虫发酵菌质低、中剂量组与阳性对照组无明显差异，与高剂量组差异显著，且低、中、高剂量组之间差异显著。实验表明，黄粉虫发酵菌质可提升干扰素-γ在衰老模型小鼠血清中的含量，且与黄粉虫发酵菌质剂量增加呈正比关系。
本实施例实验结果显示：与衰老模型组比较，黄粉虫发酵菌质低、中、高剂量组均可显著提高衰老小鼠脾脏指数、胸腺指数(p＜0.05)，显著升高小鼠血清中Ig G和Ig M的含量及IL-4和IFN-γ含量(p＜0.05)，且存在剂量依赖性，低剂量组与高剂量组具有显著性差异(p＜0.05)，高剂量组小鼠脾脏指数、胸腺指数、血清中Ig G和Ig M的含量及IL-4和IFN-γ含量显著大于阳性对照组(p＜ 0.05)。因此，蛹虫草菌发酵黄粉虫发酵物能改善衰老模型小鼠的免疫功能，调节血清中细胞因子的含量，使机体保持免疫平衡状态。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质，其特征在于所述发酵菌质的制备方法包括以下步骤：
（1）、将蛹虫草菌接种到培养基中制备种子培养液；
（2）、称取黄粉虫粉和大米混匀作为发酵基质，并添加水，接入蛹虫草菌种子液进行暗培养；
（3）暗培养结束后，再将其置于光照下培养；制得的培养基即为发酵菌质。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质，其特征在于：所述步骤（2）中黄粉虫粉与大米的质量比例为5:5~9:1。
3.根据权利要求1所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质，其特征在于：所述步骤（2）中发酵基质和水的料水比为10:6~10:14。
4.根据权利要求1所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质，其特征在于：所述步骤（2）中接种量为10%~30%。
5.根据权利要求1所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质，其特征在于：所述步骤（2）中暗培养为5 天。
6.根据权利要求1所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质，其特征在于：所述步骤（3）中光照培养为6 天。
7.根据权利要求1中所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫菌质，其特征在于：最佳条件为黄粉虫脱脂蛋白粉与大米粉配比6:4，料水比10:8，接种量25%，发酵时间共11天。
8.权利要求1所述的蛹虫草菌发酵黄粉虫制得的发酵菌质在制备提高免疫力的制剂中的应用。
9.根据权利要求8的应用，其特征在于：所述发酵菌质浓度为2~10 mg/mL逐渐增大时，其对DPPH自由基的清除率、对羟自由基的清除能力和还原能力逐渐提高。
10.根据权利要求8的应用，其特征在于：所述发酵菌质在20～100 mg/mL范围内，随着浓度增加，对超氧阴离子自由基的清除率增大。
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