CN110839940B - 一种利用贝莱斯芽孢杆菌发酵提升烟叶品质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种利用贝莱斯芽孢杆菌发酵提升烟叶品质的方法。具体方法为将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)进行菌种活化、发酵制备成生物制剂，然后均匀喷施于烟叶表面进行发酵。经过发酵后，烟叶中淀粉的降解率可达20.2‑36.2％，烟叶中的香味物质增加。感官评吸结果表明，处理烟叶的香气质提升，香气量增加，浓度增加，口感改善，甜润感增加，杂气减少，品质显著提升。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体地，本发明涉及一种利用贝莱斯芽孢杆菌发酵提升烟叶品质的方法。
背景技术
烟叶发酵是提高烟叶可用性和卷烟感官质量的一种加工方法，经发酵后的烟叶，可以弥补烟叶本身不同程度的品质缺陷，如减轻烟叶本身的青杂气、降低刺激性，提升卷烟香气质和香气量，改善抽吸时的余味和吸味等。合适的发酵工艺可以极大改善烟叶的品质，提高卷烟质量，是卷烟加工中极为重要的步骤。
烟叶中含有上千种各种各样的化合物，包括非挥发性的大分子物质比如纤维素、淀粉、蛋白质以及果胶等；也含有大量的半挥发性和挥发性的小分子物质，比如各种酸类、醇类、醛类以及酯类等化合物。这些化合物的种类和含量比例决定了烟叶的品质。其中，淀粉是一类对烟叶品质影响比较大的多糖。烟叶淀粉含量过高，在烟支燃烧时会影响燃烧速度和燃烧的完全性，而且会产生焦糊味和杂气，降低卷烟的感官质量。而小分子的醇类、醛类、酯类、酮类、吡啶类以及吡嗪类等物质则对烟叶的香气品质有重要影响。筛选合适的微生物用于发酵烟叶，将烟叶中的淀粉转化为还原糖，可以减少卷烟的杂气，改善口感。利用微生物在烟叶发酵过程中代谢生成各种与烟气相谐调的香味物质，则可以提高烟叶的香气品质。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)属于芽孢杆菌属。作为一个独立菌种，其与近缘枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的分类相似性仅有90％。目前对该菌种的研究集中在植物抗病、抗虫以及粮食作物增产方法，研究表明其能产生多种抗菌肽和抗生素。对于该菌种在抗菌之外其他领域发酵，特别是烟草发酵方面应用的研究尚处于空白
发明内容
为进一步丰富烟叶发酵的菌株，提供更高、更丰富的烟叶发酵品质和口感。申请人尝试使用贝莱斯芽孢杆菌发酵烟叶，实现了良好的提升卷烟品质效果。
一方面，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌在提升烟叶品种中的应用。
进一步地，使用贝莱斯芽孢杆菌对烟叶进行发酵。
进一步地，所用贝莱斯芽孢杆菌为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC21094的贝莱斯芽孢杆菌。
进一步地，具体发酵步骤为：
(1)菌种活化：从保藏培养基上挑取贝莱斯芽孢杆菌，接种到PDA培养基中活化培养1-2d；
(2)制备发酵液：将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到烟末发酵培养基中，在25-30℃、150-200rpm的摇床中发酵24-48h制备发酵液；
(3)离心：将步骤(2)中的发酵液在8000-12000rpm离心5-15min，除去上清液，收集菌体；
(4)菌体重悬：将步骤(3)收集的菌体用无菌水进行重悬，使用分光光度计测定菌体浓度，将菌体浓度稀释为108cfu/mL，即为贝莱斯芽孢杆菌生物制剂；
(5)称取一定量的仓库复烤醇化烟叶；按照烟叶重量的0.05-0.2％称取上述制备好的贝莱斯芽孢杆菌生物制剂；称取烟叶重量10％的无菌水；
(6)将称好的贝莱斯芽孢杆菌生物制剂加入无菌水中混匀，均匀喷洒在烟叶上，密封好，在30-37℃、RH75％发酵24-60h；
(7)将处理好的烟叶置于40℃条件下烘干至含水量12％w/w，获得发酵烟叶。
进一步地，步骤(1)中所述PDA培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、去离子水1000ml、自然pH。
进一步地，步骤(1)中活化培养1d。
进一步地，步骤(2)中所述烟末发酵培养基配方为：烟末3.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl10g/L，pH＝7.0。
进一步地，步骤(2)中温度为25℃，摇床的转速为150rpm，发酵的时间为24h。
进一步地，步骤(3)中离心速度为8000rpm，离心时间为5min。
进一步地，步骤(5)中贝莱斯芽孢杆菌生物制剂的用量为烟叶重量的0.05％。
进一步地，步骤(6)中所述发酵温度为30℃，发酵时间为24h。
进一步地，贝莱斯芽孢杆菌用于丰富烟叶的香气，降低卷烟的刺激性，改善口感、减少杂气以及增加卷烟烟气的甜润感，提升烟叶的品质。
除了CICC21094号之外，本发明的贝莱斯芽孢杆菌也可以选用其他购买或分离的贝莱斯芽孢杆菌菌株。除增香、改善口感、提升卷烟品质之外，这些菌株还可能带来不同于CICC21094的某些特质。针对其他贝莱斯芽孢杆菌菌株，本领域技术人员能使用本领域常规技术手段对发酵过程做出调整。
除下述实施例中所用的烟叶种类，本申请中的烟叶也可以选用其他各种已知或新品种的烟叶，针对其他烟叶品种，本领域技术人员能使用本领域常规技术手段对发酵过程做出调整。
本发明将定向筛选出来的可以降解淀粉的贝莱斯芽孢杆菌菌株接种至烟叶表面，在一定的条件下进行发酵，可以显著提升烟叶的品质。其机理为贝莱斯芽孢杆菌在发酵过程中将烟叶中的淀粉转化为还原糖，减少卷烟的杂气，改善口感。其次，贝莱斯芽孢杆菌在烟叶发酵过程中，可以代谢生成各种与烟气相谐调的香味物质，比如醇类、醛类、酯类、酮类、吡啶类、吡嗪类等利于抽吸的小分子物质，增加卷烟的香气，提升卷烟的品质。本发明利用贝莱斯芽孢杆菌发酵烟叶，操作简单，容易实施，成本低廉，可以实现工业化应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实验物料：
2017年贵州兴义复烤后烟叶上桔三(B3F)，由广西中烟工业有限责任公司提供；
实验设备及检测方法：
使用AA3型连续流动分析仪(德国SEALAnalytical)对烟叶淀粉含量进行测定，方法采用：《YC/T216-2007烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》；
使用Agilent 6890GC/5973MS气质联用仪(美国Agilent公司)对烟叶中香味物质进行检测，分析时的参数设置如下：
色谱条件：HP-5MS(60m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)色谱柱；载气：高纯氦气；进样口温度：280℃；流速：3mL/min；分流比：5∶1。升温程序：起始温度50℃保持2min，以8℃/min升至200℃，再以2℃/min升至280℃，保持10min。
质谱条件：接口温度270℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，离子化方式EI，电子能量70eV，质量扫描范围35～550m/z。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌生物制剂制备
(1)从保藏培养基上挑取贝莱斯芽孢杆菌，接种到PDA培养基中活化培养1d；
(2)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到烟末发酵培养基中，在25℃、150rpm的摇床中发酵24h；
(3)将发酵液在8000rpm离心5min，除去上清液，收集菌体；
(4)将步骤(3)收集的菌体用无菌水进行重悬，使用分光光度计测定菌体浓度，将菌体浓度调整到108cfu/mL，即为贝莱斯芽孢杆菌生物制剂。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌生物制剂制备
(1)从保藏培养基上挑取贝莱斯芽孢杆菌，接种到PDA培养基中活化培养2d；
(2)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到烟末发酵培养基中，在30℃、200rpm的摇床中发酵48h；
(3)将发酵液在12000rpm离心15min，除去上清液，收集菌体；
(4)将步骤(3)收集的菌体用无菌水进行重悬，使用分光光度计测定菌体浓度，将菌体浓度调整到108cfu/mL，即为贝莱斯芽孢杆菌生物制剂。
实施例3烟叶发酵
(1)称取500g烟叶；称取0.25g实施例1中制备好的生物制剂；称取50g无菌水；
(2)将称好的贝莱斯芽孢杆菌生物制剂加入无菌水中混匀，均匀喷洒在烟叶上，密封好，在30℃、RH75％发酵24h；
(3)将处理好的烟叶置于40℃条件下烘干至含水量12％(w/w)，获得发酵烟叶；
(4)将发酵好的烟叶切丝卷成烟支，由专业评吸人员进行感官质量评价。
以未处理烟叶作为对照，测定烟叶的淀粉含量，并进行感官质量评价。结果表明，对照烟叶淀粉含量为4.75％，处理烟叶的淀粉含量为3.79％，处理烟叶的淀粉含量比对照减少了20.2％。感官质量评价结果表明，与对照烟叶相比较，处理烟叶香气质提升，香气量增加，浓度增加，口感改善，甜润感增加，杂气减少，品质显著提升。
实施例4烟叶发酵
(1)称取500g烟叶；称取0.5g实施例1中制备好的生物制剂；称取50g无菌水；
(2)将称好贝莱斯芽孢杆菌的生物制剂加入无菌水中混匀，均匀喷洒在烟叶上，密封好，在30℃、RH75％发酵36h；
(3)将处理好的烟叶置于40℃条件下烘干至含水量12％(w/w)，获得发酵烟叶；
(4)将发酵好的烟叶切丝卷成烟支，由专业评吸人员进行感官质量评价。
以未处理烟叶作为对照，测定烟叶的淀粉含量，并进行感官质量评价。结果表明，对照烟叶淀粉含量为4.75％，处理烟叶的淀粉含量为3.36％，处理烟叶的淀粉含量比对照减少了29.3％。感官质量评价结果表明，与对照烟叶相比较，处理烟叶香气质提升，香气量增加，浓度增加，口感改善，甜润感增加，杂气减少，品质显著提升。
实施例5烟叶发酵
(1)称取500g烟叶；称取1g实施例1中制备好的生物制剂；称取50g无菌水；
(2)将称好的生物制剂加入无菌水中混匀，均匀喷洒在烟叶上，密封好，在37℃、RH75％发酵48h；
(3)将处理好的烟叶置于40℃条件下烘干至含水量12％(w/w)，获得发酵烟叶；
(4)将发酵好的烟叶切丝卷成烟支，由专业评吸人员进行感官质量评价。
以未处理烟叶作为对照，测定烟叶的淀粉含量和挥发性/半挥发性物质含量(表一)，并进行感官质量评价。结果表明，对照烟叶淀粉含量为4.75％，处理烟叶的淀粉含量为3.03％，处理烟叶的淀粉含量比对照减少了36.2％。感官质量评价结果表明，与对照烟叶相比较，处理烟叶香气质提升，香气量增加，浓度增加，口感改善，甜润感增加，杂气减少，品质显著提升。从表一可以看出，试验组中香味物质种类和含量均有所上升，包括其中包括苯甲醇、苯乙醇、香叶基香叶醇、螺岩兰草酮、苯乙醛、α-大马酮、巨豆三烯酮、橙花基丙酮、3-羟基-β-二氢大马酮、茄酮、苯甲醛、二氢猕猴桃内酯、亚麻酸甲酯、2-乙酰基吡咯等重要致香物质。
表一实施例5中烟叶样品处理前后挥发性/半挥发性物质含量变化：
Claims (9)
1.一种利用贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)发酵提升烟叶品质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：从保藏培养基上挑取贝莱斯芽孢杆菌，接种到PDA培养基中活化培养1-2d；
(2)制备发酵液：将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到烟末发酵培养基中，在25-30℃、150-200rpm的摇床中发酵24-48h，制备发酵液；
(3)离心：将步骤(2)中获制备的发酵液在8000-12000rpm离心5-15min，除去上清液，收集菌体；
(4)菌体重悬：将步骤(3)收集的菌体用无菌水进行重悬，使用分光光度计测定菌体浓度，将菌体浓度稀释为108cfu/mL，即为贝莱斯芽孢杆菌生物制剂；
(5)称取一定量的仓库复烤醇化烟叶；按照烟叶重量的0.05-0.2％称取上述制备好的贝莱斯芽孢杆菌生物制剂；称取烟叶重量10％的无菌水；
(6)将称好的生物制剂加入无菌水中混匀，均匀喷洒在烟叶上，密封好，在30-37℃、RH75％发酵24-60h；
(7)将处理好的烟叶置于40℃条件下烘干至含水量12％w/w，获得发酵烟叶；
所述贝莱斯芽孢杆菌为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC21094的贝莱斯芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述PDA培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、去离子水1000ml、自然pH。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中活化培养1d。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述烟末发酵培养基配方为：烟末3.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl 10g/L，pH＝7.0。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中发酵温度为25℃，摇床的转速为150rpm，发酵的时间为24h。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中离心速度为8000rpm，离心时间为5min。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(5)中贝莱斯芽孢杆菌生物制剂的用量为烟叶重量的0.05％。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中所述发酵温度为30℃，发酵时间为24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提升烟叶品质包括丰富烟叶的香气、降低卷烟的刺激性、改善口感、减少杂气以及增加卷烟烟气的甜润感。
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