CN109837137A - 利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，属于微生物发酵技术领域。此制备方法通过将汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)接种至含有槐花等的发酵培养基中进行发酵，赋予发酵产物略带清甜味的槐花香气，得到了一种香味宜人的烟用香精香料；此方法工艺简单、原料来源丰富、成本低廉，可适用于工业生产；并且，利用此方法制备得到的香精香料除香味宜人外，富含槐花和酵母的活性成分，具有抗氧化、抗炎症等功效且安全可靠，可广泛应用于烟草领域。

Description

利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法

技术领域

本发明涉及利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

香精香料是一种能被嗅感嗅出气味或味感品出香味的物质，可带给人舒适、愉悦的感觉，一定程度上的缓解当代社会快节奏的生活方式给人带来的紧张感，与人类生活息息相关，因此，香精香料已被广泛应用于食品、药品、化妆品以及烟草等行业的产品的加香中，且占据不可动摇的地位。

尤其在在烟草行业，随着吸烟与健康问题争议的日益突出，烟草行业面临的一个重要挑战就是在降低烟草产品焦油含量的同时，又要使烟草产品保持足够的香味，而通过加香加料来衬托、增补烟草产品香味，增加香气质量和浓度、改变吃味，去除和掩盖不愉快的杂气，减少刺激性，消除因烟叶质量波动或、烟叶组配方调整对烟草产品香气风格产生的不利影响，保持烟草产品质量相对稳定，己成为烟草产品生产中必不可缺的工艺技术，并且随着烟草产品降焦减害工作的深入愈加显示出其重要性。

甚至可以说，香精香料是卷烟等烟草产品的灵魂，对烟草产品的品质起着关键作用。这就促使烟厂在烟草市场的竞争越加激烈的情况下，对优质烟叶以及具备增香保润功能的优质天然香精需求日益凸显。

因此，为增加市场竞争力，提升烟用香精香料的香气质量、香气强度以及留香时间等品质逐渐成为烟草行业发展的重点。

天然香料是以自然界中香料植物的花朵、叶、枝、根、皮、树胶、全草和果实为原料，经水蒸气蒸馏法、压榨法、吸收法或溶剂萃取制取的一类天然化合物。利用发酵过程等生物技术生产的香料如丁酸、丁二酮、苯甲醛等也都归属天然香料，这类香料由于品质较高，逐渐在食用香精中得到重视和发展。

目前，在整个香精香料行业，使用发酵技术制备天然香料的历史并不很长，对于利用发酵法生产天然香料的研究也并不充分，但是，由于利用发酵法制备天然香料具有以下优点：第一，反应安全，可在常温、常压下进行，对生产场地和设备要求较低；第二，环境友好，产品分离后形成的三废少；第三，安全性高，整个生产过程要求无杂菌，一定程度的减少了安全隐患；第四，可克服长期以来从动、植物作为天然香料惟一来源而存在的有效成分含量低，分离困难，受气候和动、植物病害影响等缺陷，因此，利用发酵工程制备天然香料显然更适应人们对环保、健康的要求，显现出强大的生命力和巨大的市场潜力，并且，其不仅对香料工业本身，同时，对其它与它相关的产业，如烟草产业的发展都会产生很大的影响，具有巨大的发展潜力。

汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)是一种产香酵母，由于其发酵时会产生较淡的香味且此香味为甜酯香略带酒香，因此，汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)被广泛应用于如香肠、腊肠、肉饼、卤肉等肉制品的制备中，为香肠、腊肠、肉饼、卤肉等肉制品增加特殊香气和风味。

但是，也正因为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)发酵时产生的香味较淡且此香味为甜酯香略带酒香，使得汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的应用限制在肉制品的制备中。

现在，尚无用汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)发酵生产天然香精香料的，这无疑对汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)在香精香料产业的发展以及汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)本身应用的发展造成了严重的阻碍。

发明内容

[技术问题]

提供一种以汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)为发酵原料制备得到可适用于为烟草加香的烟用香精香料的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，所述方法为将汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)接种至发酵培养基进行发酵后，将得到的发酵物进行提取，得到香精香料；所述发酵培养基的成分包含花；所述花包含槐花、菊花、白芍花、薰衣草、玫瑰花或桂花中的一种或多种；所述提取为先在发酵物中加入乙醇，于150～200rpm的条件下提取2～4h得到提取物，然后将提取物离心，取上清液，得到香精香料；所述发酵物与乙醇的体积比为1:(3～4)；所述乙醇的体积百分浓度为30～50％。

在本发明的一种实施方式中，所述提取为先在发酵物中加入乙醇，于200rpm的条件下提取2h得到提取物，然后将提取物离心，取上清液，得到香精香料；所述发酵物与乙醇的体积比为1:4；所述乙醇的体积百分浓度为50％。

在本发明的一种实施方式中，所述花为槐花。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含槐花、葡萄糖以及水。

在本发明的一种实施方式中，所述槐花、葡萄糖以及水的质量比为(45～65)：(3～5)：(30～50)。

在本发明的一种实施方式中，所述槐花、葡萄糖以及水的质量比为50:4:46。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为25～30℃、时间为7～10d。

在本发明的一种实施方式中，所述汉逊德巴利酵母以种子液的形式接种至发酵培养基中进行发酵；所述汉逊德巴利酵母种子液的体积占发酵液总体积的2～10％，所述发酵液由种子液及发酵培养基组成；所述汉逊德巴利酵母种子液的菌浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL；所述汉逊德巴利酵母种子液是通过将汉逊德巴利酵母接种至种子培养基中培养获得的。

在本发明的一种实施方式中，所述香精香料还可以进一步浓缩。

在本发明的一种实施方式中，所述浓缩可通过旋蒸进行。

在本发明的一种实施方式中，所述旋蒸的的压强为40mbar、温度为40℃。

本发明还提供了一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备得到的烟用香精香料，所述烟用香精香料是应用上述方法制备得到的。

本发明还提供了一种烟草产品，所述烟草产品含有上述烟用香精香料。

在本发明的一种实施方式中，所述烟草产品包含卷烟、自卷烟、斗烟、水烟、雪茄、小雪茄、嚼烟或鼻烟等。

[有益效果]：

(1)本发明的方法通过将汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)接种至含有槐花等的发酵培养基中进行发酵，赋予发酵产物略带清甜味的槐花香气，得到了一种香味宜人的烟用香精香料；

(2)利用汉逊德巴利酵母发酵槐花得到的烟用香精香料的香味宜人具体表现为：与汉逊德巴利酵母单独发酵得到的发酵物相比，利用汉逊德巴利酵母发酵槐花得到的提取液中，苯酚、à-松油醇含量显著增加；新增加一些含量较高物质，比如：蘑菇醇、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、反-α反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇、芳樟醇；

(3)本发明的方法工艺简单、原料来源丰富、成本低廉，适用于工业生产；

(4)槐花富含维生素和多种矿物质，具有清热解毒、凉血润肺、降血压、预防中风的功效；酵母可产生物活性物质，具备一定的抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、调节免疫等生理功效，因此，利用本发明的方法制备得到的香精香料除香味宜人外，还可同时具有槐花和酵母的有益功效，能够一定程度上的缓解烟草对人体造成的伤害；

(5)本发明的方法不仅拓展了烟用香精香料资源，且获得的烟用香精香料安全性较高，可以广泛应用于烟草领域，赋予烟草产品特征香气、香韵和特征功能；

(6)将利用本发明的方法制备得到的烟用香精香料用于烟草产品的加香加料，能够满足人们对绿色、健康卷烟产品的需求，因此具有显著的工业应用价值和广阔的推广应用前景。

附图说明

图1为实施例1中香精香料A₀的总离子流图谱；

图2为实施例1中香精香料A₁的总离子流图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中的汉逊德巴利酵母购自中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC2.1335；下述实施例中涉及的槐花购自无锡农贸市场；下述实施例中涉及的烟丝购自四川中烟工业有限责任公司(上述菌株汉逊德巴利酵母CGMCC 2.1335可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

YPD种子培养基(m/v)：蛋白胨2％、酵母粉1％、葡萄糖2％(115℃灭菌20min)。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

香精香料固相微萃取-气质分析方法：

采用TSQ8000三重四级杆气质联用仪进行分析。

样品预处理：取制备好的发酵物按照1:3～4体积比加入30～95％乙醇，于150～200rpm的条件下提取2～4h，得到提取物；将提取物于10000rpm的条件下离心10min，得到上清液；将上清液于40mbar、40℃的条件下旋蒸，得到提取液；将提取液稀释至合适浓度后加入到20mL顶空瓶，加入内标2-辛醇(终浓度8.2ppb)，总体积3mL，加入NaCl至其饱和，然后测定；

顶空固相微萃取条件：萃取头在GC进样口老化至无杂峰，然后在60℃下萃取30min；被吸附的挥发性化合物在GC进样口260℃下解吸1min，冲入GC色谱柱；同时启动仪器采集数据；萃取头：DVB/CAR/PMDS；

气相色谱条件：色谱柱HP-5；载气：氦气，1.0mL·min^-1；程序升温条件：40℃维持1min，3℃·min^-1升温至180℃，15℃·min^-1升温至230℃，维持3min；

质谱条件：接口温度250℃；电离源温度：300℃；四级杆温度150℃；电离电70eV；离子化模式：EI⁺；质量扫描范围m/z 35～350amu。

数据处理：样品按上述条件进行顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)分析，依据NIST标准质谱检索库进行检索比对鉴定，由内标法计算各组分的相对含量。

烟草感官评价：

参照国标法对烟草感官质量影响进行评价(YC/T 138-1998)。

菌体浓度检测方法：

取酵母种子液1mL于比色皿，测定OD₆₀₀，然后用生理盐水稀释种子液，用规格为25×16的血球计数板计数酵母细胞数，计算菌体浓度；

其中，每mL中的细胞数＝(血球计数板内计得的的细胞个数/80)×400×10000×稀释倍数。

实施例1：汉逊德巴利酵母+槐花

具体步骤如下：

(1)将4℃下保存的酵母菌株取一环接到YPD种子培养基(115℃灭菌20min)，30℃、转速200r·min^-1的条件下培养2d，得到活化液；

(2)取80mL YPD种子培养基置于250mL三角瓶中(115℃灭菌20min)，取200μL(1)得到的活化液接种至YPD种子培养基中，于温度30℃、转速200r·min^-1的条件下培养2d，得到种子液；此时，种子液中的菌体浓度约为9×10⁹CFU/mL；

(3)取100g发酵培养基(105℃灭菌20min)置于250mL摇瓶中，将种子液按照表2的参数接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵物A₀、A₁、A₂、A₃；其中，A₀组为空白对照组。

以2-辛醇为内标(终浓度8.2ppb)，将发酵物A₀、A₁、A₂、A₃按照香精香料固相微萃取-气质分析方法中记载的分析方法进行分析，其中，发酵物A₀、A₁的分析结果见表3-4与图1-2。

对发酵物A₀、A₁、A₂、A₃进行嗅香，结果见表5。

由表3-4与图1-2可知，发酵物A₁较空白对照组发酵物A₀的物质种类明显丰富，含量变化较大，其中苯酚、à-松油醇含量显著增加，3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇等物质含量显著下降；新增加一些含量较高物质，比如：蘑菇醇、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、反-α反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇、芳樟醇。可见，经过槐花发酵汉逊德巴利酵母所得发酵物中挥发性物质种类、含量都有较大提升，香气品质变化明显。

由表5可知，发酵物A₁、A₂、A₃均具有很好的香味，可以广泛应用于食品、烟草、化妆品、医疗等领域，赋予产品特征香气和香韵。

表2发酵物A₀、A₁、A₂、A₃的发酵参数

表3发酵物A₀的物质基础分析结果

表4发酵物A₁的物质基础分析结果

表5发酵物A₀、A₁、A₂、A₃的嗅香结果

组别	香气
		发酵物A<sub>0</sub>	酯香味，略带酒香甜味
发酵物A<sub>1</sub>	槐花特有香气
		发酵物A<sub>2</sub>	槐花特有香气，略带清香
发酵物A<sub>3</sub>	槐花清柔甜香

实施例2：汉逊德巴利酵母+白芍花

具体步骤如下：

将实施例1中的槐花替换成白芍花，重复实施例1中A₁组的实验，得到发酵物A₄。

对得到的发酵物A₄进行嗅香，结果见表6。

实施例3：汉逊德巴利酵母+薰衣草

具体步骤如下：

将实施例1中的槐花替换成薰衣草，重复实施例1中A₁组的实验，得到发酵物A₅。

对得到的发酵物A₅进行嗅香，结果见表6。

实施例4：汉逊德巴利酵母+桂花

具体步骤如下：

将实施例1中的槐花替换成桂花，重复实施例1中A₁组的实验，得到发酵物A₆。

对得到的发酵物A₆进行嗅香，结果见表6。

实施例5：汉逊德巴利酵母+玫瑰花

具体步骤如下：

将实施例1中的槐花替换成玫瑰花，重复实施例1中A₁组的实验，得到发酵物A₇。

对得到的发酵物A₇进行嗅香，结果见表6。

实施例6：汉逊德巴利酵母+菊花

具体步骤如下：

将实施例1中的槐花替换成菊花，重复实施例1中A₁组的实验，得到发酵物A₈。

对得到的发酵物A₈进行嗅香，结果见表6。

由表6可知，发酵物A₄、A₅、A₆、A₇、A₈香气品质较差，不适宜作为香精香料。

表6发酵物A₄、A₅、A₆、A₇、A₈的嗅香结果

组别	香气
		发酵物A<sub>4</sub>	弱白芍特征花香，带刺激性烟甜味
发酵物A<sub>5</sub>	薰衣草特有的木香香韵,略带腥膻味
		发酵物A<sub>6</sub>	桂花特征香气较弱，略带甜味
发酵物A<sub>7</sub>	淡玫瑰特有的花香和甜香，略带生鲜气
		发酵物A<sub>8</sub>	较淡菊花特有香气，带有较浓郁酱甜香

实施例4：烟草的制备

具体步骤如下：

1、提取

将实施例1得到的发酵物A₁按照方案一、方案二、方案三、方案四的参数条件进行提取，得到香精香料A、B、C、D；其中，各方案的提取条件如下：

方案一：在发酵物中按1:3体积比加入30％乙醇(v/v)，150rpm提取2h，提取物10000rpm离心10min获取上清液，此上清液即为烟用香精香料；

方案二：在发酵物中按1:4体积比加入50％乙醇(v/v)，200rpm提取2h，提取物10000rpm离心10min获取上清液，此上清液即为烟用香精香料；

方案三：在发酵物中按1:3体积比加入40％乙醇(v/v)，150rpm提取3h，提取物10000rpm离心10min获取上清液，此上清液即为烟用香精香料；

方案四：在发酵物中按1:3体积比加入95％乙醇(v/v)，150rpm提取3h，提取物10000rpm离心10min获取上清液，此上清液即为烟用香精香料；

2、检测

将制备得到的香精香料A、B、C、D按照烟丝表7的添加量比例加入烟丝，进行感官评定，评定结果见表7。

由表7可知，香精香料A、B、C均可适用于烟草加香，具有很好的效果；香精香料D效果不好，不适合烟草加香。

表7烟草感官评价结果

注：“+”为正效应；“-”为负效应；“±”为效果不明显。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，所述方法为将汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)接种至发酵培养基进行发酵后，将得到的发酵物进行提取，得到香精香料；所述发酵培养基的成分包含花；所述花包含槐花、菊花、白芍花、薰衣草、玫瑰花或桂花中的一种或多种；所述提取为先在发酵物中加入乙醇，于150～200rpm的条件下提取2～4h得到提取物，然后将提取物离心，取上清液，得到香精香料；所述发酵物与乙醇的体积比为1:(3～4)；所述乙醇的体积百分浓度为30～50％。

2.如权利要求1所述的一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，所述提取为先在发酵物中加入乙醇，于200rpm的条件下提取2h得到提取物，然后将提取物离心，取上清液，得到香精香料；所述发酵物与乙醇的体积比为1:4；所述乙醇的体积百分浓度为50％。

3.如权利要求1或2所述的一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，所述花为槐花。

4.如权利要求1-3任一所述的一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含槐花、葡萄糖以及水。

5.如权利要求4所述的一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，所述槐花、葡萄糖以及水的质量比为(45～65)：(3～5)：(30～50)。

6.如权利要求4或5所述的一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，所述槐花、葡萄糖以及水的质量比为50:4:46。

7.如权利要求1-6任一所述的一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25～30℃、时间为7～10d。

8.如权利要求1-7任一所述的一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备烟用香精香料的方法，其特征在于，汉逊德巴利酵母以种子液的形式接种至发酵培养基中进行发酵；所述汉逊德巴利酵母种子液的体积占发酵液总体积的2～10％，所述发酵液由种子液及发酵培养基组成；所述汉逊德巴利酵母种子液的菌浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL；所述汉逊德巴利酵母种子液是通过将汉逊德巴利酵母接种至种子培养基中培养获得的。

9.一种利用汉逊德巴利酵母及花发酵制备得到的烟用香精香料，其特征在于，所述烟用香精香料是应用权利要求1-7任一所述的方法制备得到的。

10.一种烟草产品，其特征在于，含有权利要求9所述烟用香精香料。