CN114015508B - 一种高氨基酸含量香料、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高氨基酸含量香料，其中氨基酸总量大于35.00g/kg；所述高氨基酸含量香料由类诺卡氏菌ST46发酵木蝴蝶植物得到。本发明还公开了所述高氨基酸含量香料的制备方法和应用。本发明的高氨基酸含量香料应用于卷烟中，可以使烟气具有特殊药草香及甜香，提升了卷烟抽吸品质。

Description

一种高氨基酸含量香料、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于卷烟用香精香料技术领域，具体涉及一种高氨基酸含量木蝴蝶烟用香料的制备方法和应用。

背景技术

烟用香精香料是卷烟生产中不可缺少的添加剂，其应用更是与卷烟品牌的树立及卷烟风格的形成发展休戚相关。天然香原料是烟用香精香料极为重要的组成部分，但现有天然香原料的种类、品质、制备工艺等尚不能满足调香技术人员的需求，所以持续开发利用更多的香料植物资源，通过改进制备方法等获取品质更为优秀的天然香原料，已成为卷烟调香和卷烟产品研发人员越加重视的研究方向。

木蝴蝶(Oroxylum indicum(Linn.)Kurz)，是唇形目紫葳科木蝴蝶属直立小乔木，是一种观果和观花园林绿化植物，种子和树皮可供药用，味苦、甘、性凉，入肺肝、胃经，有清肺利咽止咳、舒肝和胃之功效，主治肺热咳嗽、喉痹、音哑、肝胃气痛、疮口不敛。道地产区包括云南、广西、贵州等省，福建、广东、四川也有分布。其种子亦可泡茶，种子中富含烃类、苯类、甾醇类、酸类、酯类、酮类等多种物质，从中提取制备有效成分，添加到卷烟中，可使烟味柔和，并降低烟气的喉部刺激性，是一种具有开发潜力的园林绿化植物和中药植物资源。

利用具特殊功能的微生物对植物进行发酵，再结合特定化学成分的定向提取制备技术，可以实现天然香原料中意向组分的含量控制，是提升天然香原料品质的一种重要手段。目前，还没有利用微生物发酵技术结合化合物定向制备技术制备木蝴蝶烟用香料的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有烟用香精香料种类不够丰富及制备方法不足等问题，提供一种具有特殊药草香和甜香香韵的木蝴蝶烟用香料的制备方法及在卷烟中的应用；其是利用类诺卡氏菌ST46发酵工艺对木蝴蝶种子进行处理得到木蝴蝶发酵提取液，再针对木蝴蝶发酵提取液中氨基酸组分进行定向富集得到的一种高氨基酸含量木蝴蝶烟用香料；将该香料应用于卷烟烟丝中，使得烟气中具有特殊药草香及甜香，且香气丰满，香味醇和，喉部刺激性降低，在增强卷烟赋香效果，提升卷烟抽吸品质的同时，丰富了烟用香精香料来源和种类。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明第一方面涉及一种类诺卡氏菌ST46，其是从云南昆明烟草种植基地烟草土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明其属于类诺卡氏菌，微生物学分类命名为类诺卡氏菌ST46，拉丁文学名：Nocardioidessp.ST46。申请人已于2020年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为 CGMCC 4.7686，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所；于2020年10月15日给出存活证明。

本发明分离得到的类诺卡氏菌ST46菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈白色。明胶液化、L-精氨酸双水解酶、V-P反应、过氧化氢酶呈阳性，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、色安酸脱氨酶呈阴性，不产生硫化氢。能利用D-纤维二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘油、L-组氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇，细胞的呼吸醌为甲基萘醌-8(H4)(MK-8(H4))。

本发明所分离得到的类诺卡氏菌ST46的16S rDNA序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MT559270。

本发明第一方面公开了一种高氨基酸含量香料，其中氨基酸总量大于35.00 g/kg；所述高氨基酸含量香料由类诺卡氏菌ST46发酵木蝴蝶植物得到。

优选地，所述香料中氨基酸总量为35.87g/kg；其中天门冬氨酸的含量为3.43 g/kg、苯丙氨酸的含量为3.46g/kg、组氨酸的含量为2.98g/kg、赖氨酸的含量为 3.24g/kg、精氨酸的含量为2.36g/kg、脯氨酸的含量为3.85g/kg。

本发明第二方面涉及所述高氨基酸含量香料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)类诺卡氏菌ST46菌剂的制备；

(2)木蝴蝶粉的发酵：利用步骤(1)得到的类诺卡氏菌ST46菌剂对木蝴蝶粉进行发酵，得到发酵木蝴蝶粉；

(3)发酵木蝴蝶粉的粗提：将步骤(2)得到的发酵木蝴蝶粉利用蒸馏水加热提取，经过滤浓缩得到木蝴蝶发酵提取液；

(4)木蝴蝶发酵提取液的精制：将步骤(3)的木蝴蝶发酵提取液利用硅胶柱层析进行分段式精提，即得到所述的高氨基酸含量香料。

优选地，步骤(1)类诺卡氏菌ST46菌剂的制备步骤具体包括：将类诺卡氏菌ST46液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中，30℃震荡培养7天，得到培养液；培养液离心分离，用无菌水洗涤沉淀，最后用无菌水震荡均匀，稀释10倍，即得到所述类诺卡氏菌ST46菌剂。

优选地，步骤(2)木蝴蝶粉的发酵具体步骤包括：将干燥的木蝴蝶种子粉碎成粒径为30～100目的粉末，平衡水分至10％～13％，每100g木蝴蝶粉中喷施类诺卡氏菌ST46菌剂20mL，混匀，将处理好的木蝴蝶粉置于22℃、60％的恒温恒湿箱中发酵48～72h，即得到发酵木蝴蝶粉。

优选地，步骤(3)发酵木蝴蝶粉的粗提具体步骤包括：

①加热提取：将得到的发酵木蝴蝶粉置于121℃灭菌锅中灭菌30min后，加入发酵木蝴蝶粉质量10～20倍的蒸馏水，50℃～70℃加热提取4～8h，趁热过滤；滤渣继续加入发酵木蝴蝶粉质量10～20倍的蒸馏水，50℃～70℃加热提取2～4h，再次趁热过滤；

②浓缩：合并步骤①两次提取所得滤液，在45～65℃、80～100kPa条件下浓缩至体积不再变化，得到所述木蝴蝶发酵提取液。

优选地，步骤(4)木蝴蝶发酵提取液的精制步骤具体包括：

(a)装柱与平衡：取4～8倍木蝴蝶发酵提取液质量的100～300目的柱色谱硅胶，用90％乙醇浸泡搅拌后进行湿法装柱；

(b)加样与洗脱：取木蝴蝶发酵提取液加入到层析柱中，依次用3倍硅胶柱体积的90％乙醇、60％～80％乙醇、10％～30％乙醇、蒸馏水将硅胶色谱柱进行分段式梯度洗脱，收集60％～80％乙醇、10％～30％段乙醇洗脱剂；

(c)浓缩：将收集的60％～80％乙醇和10％～30％段乙醇的洗脱剂合并，在 45～65℃、80～100kPa条件下浓缩得到密度为1.0～1.5g/cm³的精提液，即为所述的高氨基酸含量香料。

本发明第三方面涉及高氨基酸含量香料用于卷烟加香的用途。

优选地，上述卷烟中高氨基酸含量香料的用量为烟丝质量的0.2～0.5％，其通过40％～60％乙醇稀释3～5倍质量后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上制得。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明充分利用当地的地道药材，将木蝴蝶制备成烟用香料应用于卷烟加工，拓宽了木蝴蝶的开发应用领域，同时以木蝴蝶为原料制备的烟用香料应用于卷烟后还能具备清咽利喉，降低喉部刺激性的功效。

2、烟草中氨基酸的含量与卷烟抽吸品质有重要相关性，其可以提高烟气劲头，增加烟气的丰满度，同时氨基酸在卷烟中燃烧还能形成多种致香成分，丰富卷烟烟香。本发明利用新的菌种类诺卡氏菌ST46对木蝴蝶进行发酵，可显著增加木蝴蝶中氨基酸含量，制成的烟用香料可以实现提升烟气劲头、增加烟气丰满度、丰富卷烟烟香的作用。

3、本发明利用硅胶柱层析对木蝴蝶发酵提取液进行分段式精提，利用洗脱剂极性的梯度差异变化，既保证了木蝴蝶发酵提取液中氨基酸成分被定向充分富集，又确保了木蝴蝶发酵提取液中多数致香性物质被充分保留，同时还能去除杂质。本发明的方法利用类诺卡氏菌ST46发酵，结合硅胶柱层析精提得到的高氨基酸含量香料；将其应用于卷烟中，可以使烟气具有特殊药草香及甜香，且香味醇和，显著增强了卷烟赋香效果，提升了卷烟抽吸品质。

4、本发明的高氨基酸含量香料的制备过程不涉及有毒有害试剂的引入，所得香料及加工工艺安全环保；且木蝴蝶来源广泛，原料易得，成本低廉，符合企业绿色环保经济的生产制造要求，有良好的应用价值。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

(1)类诺卡氏菌ST46菌剂的制备

采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖 0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2；将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种类诺卡氏菌ST46菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种；

采用种子培养基，种子培养基为R2A液体培养基，配方为：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000mL，pH7.2；将培养基在121℃下灭菌25分钟，从上述的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，30℃震荡培养 48h，获得液体菌种；

将类诺卡氏菌ST46液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中，30℃震荡培养7天，得到培养液；每1000mL培养液以3500r/min离心10min，用无菌水洗涤沉淀，最后用20mL无菌水震荡均匀，稀释10倍即得类诺卡氏菌ST46菌剂；其中发酵培养基配方为：黄豆饼浸出汁10mL，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL，PH7.2；将培养基在121℃下灭菌30min，既得发酵培养基。

(2)木蝴蝶粉的发酵

将干燥的木蝴蝶种子粉碎成粒径50目的粉末，平衡水分至12％，每100g木蝴蝶种子粉中喷施类诺卡氏菌ST46菌剂20mL，混匀，将处理好的木蝴蝶种子粉置于22℃，60％的恒温恒湿箱中发酵48h，得到发酵木蝴蝶粉；

(3)发酵木蝴蝶粉的粗提

A、加热提取：将所得发酵木蝴蝶粉置于121℃灭菌锅中灭菌30min后，加入发酵木蝴蝶粉质量20倍的蒸馏水，60℃加热提取6h，趁热过滤；滤渣继续加入发酵木蝴蝶粉质量10倍的蒸馏水，60℃加热提取4h，再次趁热过滤；

B、浓缩：合并步骤A两次提取所得滤液，在65℃、90kPa条件下浓缩至体积不再变化，得到木蝴蝶发酵提取液；

(4)木蝴蝶发酵提取液的精制

(a)装柱与平衡：取5倍木蝴蝶发酵提取液质量的100目的柱色谱硅胶，用90％乙醇搅拌浸泡后进行湿法装柱，继续用90％乙醇洗柱，使硅胶压实至硅胶层不再下降。

(b)加样与洗脱：当90％乙醇下降到略高于吸附剂硅胶层时，取木蝴蝶发酵提取液加入到层析柱中，依次用3倍硅胶柱体积的90％乙醇、70％乙醇、25％乙醇、蒸馏水将硅胶色谱柱进行分段式梯度洗脱，收集70％乙醇、25％乙醇洗脱剂。

(c)浓缩：将收集的70％乙醇、25％乙醇洗脱剂合并，在50℃、80kPa条件下浓缩得到1.2g/cm³精提液，即为高氨基酸含量香料。

实施例2

(1)高氨基酸含量香料的应用

以实施例1所制高氨基酸含量香料为试验样品，取占卷烟烟丝质量0.3％的该香料，用4倍量的60％乙醇溶解后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡48h，卷制成卷烟烟支，即为高氨基酸含量木蝴蝶烟用香料的试验卷烟。

(2)高氨基酸含量木蝴蝶烟用香料的感官评价

(A)对照卷烟的制备：

将木蝴蝶粉碎成粒径为50目的粉末，将该木蝴蝶粉代替发酵木蝴蝶粉，按照实施例1中的步骤(3)，制得未经发酵只进行粗提的1号对照样。

将木蝴蝶粉碎成粒径为50目的粉末，将该木蝴蝶粉按照实施例1中的步骤 (1)-(3)，制得经发酵后只进行粗提的2号对照样。

将木蝴蝶粉碎成粒径为50目的粉末，将该木蝴蝶粉按照实施例1中的步骤 (3)-(4)，制得未经发酵只进行精制的3号对照样。

取占卷烟烟丝质量0.3％的上述1号、2号、3号对照样，分别用对照样四倍量的60％乙醇溶解后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡48h，卷制成对应的1号、2号、3号对照卷烟烟支。

(B)试验卷烟和对照卷烟的感官评价

将含有高氨基酸含量香料的试验卷烟、不含任何木蝴蝶提取物的空白卷烟以及1号、2号、3号对照卷烟烟支，由感官评吸专业人员进行感官对比评吸，结果如表1所示。由评吸结果可知，未经发酵只进行粗提的1号对照样与空白卷烟相比，烟香丰富性有所增加，但同时杂气明显增加，刺激稍有下降；经发酵后只进行粗提的2号对照样，与空白卷烟相比，除特殊药草香外，还具有明显甜润香气，烟香丰富性进一步增加，但杂气也明显增加，刺激性稍有改善；未经发酵只进行精制的3号对照样，与空白卷烟相比，烟气中有明显药草香香韵但无甜香，精制后烟气香味醇和，杂气改善明显，刺激性有所下降；而由本发明所制含有高氨基酸含量香料的试验卷烟，烟气中既有特殊药草香，又有明显甜香，同时香气丰满，香味醇和，杂气和喉部刺激性明显改善，余味舒适干净。因此，本发明所制高氨基酸含量香料，可显著增强卷烟赋香效果，提升卷烟抽吸品质，适宜卷烟加香使用。

表1高氨基酸含量木蝴蝶烟用香料的感官评价

(3)高氨基酸含量香料的氨基酸含量分析

将实施例1所制高氨基酸含量香料的试验样品、实施例2所制未经发酵只进行粗提的1号对照样、经发酵后只进行粗提的2号对照样、未经发酵只进行精制的3号对照样利用全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量，具体测定方法参照国标 GB/T 5009.124-2016，结果如表2所示。由表2可知，只进行粗提，但经类诺卡氏菌ST46发酵的2号样相对未经发酵的1号样，氨基酸总量明显提升，说明利用类诺卡氏菌ST46对木蝴蝶进行发酵，可显著增加木蝴蝶中氨基酸含量；都未利用类诺卡氏菌ST46发酵，但经精制的3号样相对未经精制的1号样，氨基酸总量也有显著提升，说明利用硅胶柱层析对木蝴蝶提取液进行分段精制，可以保证木蝴蝶发酵提取液中氨基酸成分被充分富集；而既利用类诺卡氏菌ST46进行发酵，又通过硅胶柱层析进行分段精制的试验样品，相较3个对照样，氨基酸总量有极显著的增加，说明利用类诺卡氏菌ST46发酵，结合硅胶柱层析精提可以得到高氨基酸含量的香料。其中天门冬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸等含量有显著提升。这可能与烟气甜润的致香成分形成有较大关系。

表2高氨基酸含量木蝴蝶烟用香料及对照样氨基酸含量分析

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种高氨基酸含量香料、其制备方法和应用

<130> RIB210613

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1490

<212> DNA

<213> 类诺卡氏菌ST46(Nocardioides sp. )

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc 60

ggaaaggcca cttcggtggt actcgagcgg cgaacgggtg agtaacacgt gagtaatctg 120

cccctggctt tgggatagcc accggaaacg gtgattaata ccggatatgc actgcttctc 180

gcatgggttg tggtggaaag tttttcggcc agggatgtgc tcgcggccta tcagcttgat 240

ggtgaggtaa tggctcacca tggcttcgac gggtagccgg cctgagaggg tgaccggtca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360

atgggcggaa gcctgatcca gcaacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac 420

ctctttcagc agggacgaag cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcac cggccaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcgagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540

agggctcgta ggcggtttgt cgcgtcggga gtgaaaacgc cgtgcttaac acggcgcttg 600

ctttcgatac gggcagacta gaggtattca ggggagaacg gaattcctgg tgtagcggtg 660

aaatgcgcag atatcacgag gaacaccggt ggcgaaggcg ggtctctggg aatgacctga 720

cgctgaggag cgaaagtgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacaccgt 780

aaacgtgggc gctaggtgtg gggkycattc acggatccgt gcgcagctac gcattagcgc 840

cccgctgggg agtacgcgca gctaaactca ggatgacggg gcccgcacaa gcggcggagc 900

atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gtttgacata caccctgccg 960

ctccagagat ggggcttctt ttgggggtgt acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 1020

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgttctat gttgccagca 1080

cgtaatggtg gggactcata ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac 1140

gtcaagtcat catgcccctt atgtccaggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa 1200

gggctgcgat cccgtaaggg tgagcgaatc ccaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg 1260

tctgcaactc gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg 1320

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt cacgaaagtc ggcaacaccc 1380

ggagccggtg gcccaaccct tgtggaggga gccgtcgaag gtggggctgg cgattgggac 1440

gaagtcgtaa caaggtagcc gtaccggaag gtgcggctgg atcacctcct 1490

Claims (3)

1. 一种高氨基酸含量香料，其特征在于，其中氨基酸总量大于35.00 g/kg；所述高氨基酸含量香料由保藏编号为 CGMCC 4.7686的类诺卡氏菌ST46发酵木蝴蝶种子得到；所述高氨基酸含量香料的制备方法包括如下步骤：

（1）类诺卡氏菌ST46菌剂的制备：将类诺卡氏菌ST46液体菌种按10%的接种量接种到发酵培养基中，30℃震荡培养7天，得到培养液；培养液离心分离，用无菌水洗涤沉淀，最后用无菌水震荡均匀，稀释10倍，即得到所述类诺卡氏菌ST46菌剂；

（2）木蝴蝶粉的发酵：将干燥的木蝴蝶种子粉碎成粒径为30~100目的粉末，平衡水分至10%～13%，每100g木蝴蝶粉中喷施步骤（1）得到的类诺卡氏菌ST46菌剂20 mL，混匀，将处理好的木蝴蝶粉置于22℃、60%的恒温恒湿箱中发酵48～72h，即得到发酵木蝴蝶粉；

（3）发酵木蝴蝶粉的粗提：①加热提取：将步骤（2）得到的发酵木蝴蝶粉置于121℃灭菌锅中灭菌30 min后，加入发酵木蝴蝶粉质量10～20倍的蒸馏水，50℃~70℃加热提取4~8h，趁热过滤；滤渣继续加入发酵木蝴蝶粉质量10～20倍的蒸馏水，50℃~70℃加热提取2~4h，再次趁热过滤；②浓缩：合并步骤①两次提取所得滤液，在45～65℃、80～100 kPa条件下浓缩至体积不再变化，得到木蝴蝶发酵提取液；

（4）木蝴蝶发酵提取液的精制：（a）装柱与平衡：取4~8倍步骤（3）得到的木蝴蝶发酵提取液质量的100~300目色谱硅胶柱，用90%乙醇浸泡搅拌后进行湿法装柱；（b）加样与洗脱：取木蝴蝶发酵提取液加入到层析柱中，依次用3倍硅胶柱体积的90%乙醇、60%~80%乙醇、10%~30%乙醇、蒸馏水将硅胶色谱柱进行分段式梯度洗脱，收集60%~80%乙醇、10%~30%段乙醇洗脱剂；（c）浓缩：将收集的60%~80%乙醇和10%~30%段乙醇的洗脱剂合并，在45～65℃、80～100 kPa条件下浓缩得到密度为1.0~1.5g/cm³的精提液，即为所述的高氨基酸含量香料。

2.一种根据权利要求1所述高氨基酸含量香料用于卷烟加香的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，卷烟中所述的高氨基含量香料的用量为卷烟质量的0.2~0.5%。