CN111286523A - 一种细菌的三原色鉴别及计数方法 - Google Patents

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王秀华
杨冰
张宇哲
王枫林
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明属于细菌鉴别技术领域，一种细菌的三原色鉴别及计数方法。本领域研究过程中常常涉及不用菌株的共培养研究，需要对其中的某一菌株进行鉴别。由于菌株体积微小，直接肉眼识别较为困难。本发明提供了一种通过采集菌株三原色信息对混合菌株中的单一菌株进行快速鉴别的方法，对每种菌进行数据读取，获取各菌R、G、B的颜色数值，从而确定各菌株中不与其他菌株重叠的数值范围作为特征颜色与数值区间。经验证，该方案应用于混合菌培养液中单一菌株的鉴别，准确率能够达到100％，同时还能够对实现对菌种的计数，具有快速、准确、低成本的效果，应用于实际研究具有良好的推广意义。

Description

一种细菌的三原色鉴别及计数方法
技术领域
本发明属于细菌鉴别技术领域，具体涉及一种通过三原色信息对细菌实现快速鉴别及计数的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
自然环境中存在着多种微生物，且数量巨大，对地球上的物质循环、能量流动及人类的生产、生活具有重要影响。随着对各种微生物功能特性认知的加深，人类对微生物开发利用的速度在逐年增大。目前在食品工业中广泛应用的各种乳酸菌、酵母菌，在医药领域开发应用的各类细菌疫苗、在农业种养殖领域应用的各种芽孢菌类、在污水处理领域应用的脱氮菌等，已对社会的发展及人类健康做出了巨大的贡献。
不同种类的细菌生物学特性不同，其功能也各异。在科研或生产中，为了提高微生物产品的功能效果，往往对不同功能的细菌进行共同培养发酵或复配，为此需要建立不同细菌的快速鉴别技术，以确定不同细菌的生长特征、数量范围等。由于细菌的个体微小，其菌落的形态、颜色往往存在相似之处，肉眼难以区分，而现有的对微生物的鉴别方法中，存在着鉴别时间长、成本高等缺点。如血清识别技术需要制备抗血清，耗时30d以上、建立血清学检测方法及实验条件，耗时2d以上；分子检测技术需要进行细菌纯培养、模板制备、PCR扩增及测序，耗时3d以上；其他鉴别技术如脂肪酸鉴别技术，耗时2d以上、biolog鉴别技术，耗时2d以上。在检测时需要专业的检测设备及专业的技术人员进行操作。而在科研或生产中，有时需要对有限的细菌种类进行快速识别，且要达到节省资金的目的，因此需要研究开发快速、低成本且准确的细菌鉴别方法。
自然界中的细菌多带有不同的色素，故呈现出不同的颜色，如有些细菌为红色、有些细菌为白色，而有些细菌为绿色或其他颜色。细菌的颜色除了与其自身色素基因表达有关外，还与所采用的培养基成分有很大的关系，如弧菌在TCBS培养基中，通常为黄色或绿色，而在2216E培养基中可能为白色、半透明或其他颜色。因此对于一定种类的细菌混合液，可以通过涂布平板方法获取单菌落后，根据细菌所呈现的颜色，利用颜色识别软件可敏感识别颜色的差异，将细菌进行快速鉴别。尽管目前已有国外公司开发了利用细菌的代谢产物与不同培养基中的底物作用所显示的颜色而进行细菌分类鉴定的技术与产品，该检测方法需要细菌纯培养且需要时间长、费用也高、同样需要专业的技术人员进行操作，由于其数据库中菌株种类有限，对许多海洋中的菌株尚不能做出有效的鉴定。尤其在对多种已知菌混合培养时，研究者并不需要对其进行鉴定，而仅做鉴别即可，但现有技术尚无法对不同的细菌做出快速鉴别。
目前无论在研究还是生产中，对细菌的利用已经由使用单一菌株发展到多种细菌复合菌株，如复合菌饮料、EM菌等产品，且混合的细菌多为已知的菌株，为了掌握混合菌液中各种菌的生长动态，需要建立对已知菌种的快速鉴别技术，满足生产及科研的需求。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种从混合培养的菌液中快速鉴别出其中一种细菌的方法，以满足微生物产业领域的技术需求。本发明采用的技术构思是根据不同细菌在特定培养基中呈现的颜色不同，而每种颜色的构成均可通过红(R)、绿(G)、蓝(B)三原色进行数值化，利用颜色读取软件，读取细菌的R、G、B三原色的数值，最后通过确认该菌株特有的R、G、B三原色数值范围作为鉴别特征进行细菌种类的识别。
基于以上技术目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种细菌的三原色鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤，将待鉴别的若干种细菌分别涂布于平板培养基形成已知菌种的单菌落，读取已知菌种菌落的R、G、B数值，对比不同菌种的R、G、B数值，获取不与其他菌种数值重合的部分作为该菌种的特征数值；将待鉴别的混合菌落涂布于相同的平板培养基中，通过读取待鉴别混合平板中各菌落的R、G、B数值与特征数值进行匹配，从而确定各菌落的种类。
本发明提供的细菌鉴别方法适用于从已知菌株的混合液中对不同菌种进行快速鉴别及计数。首先通过培养已知菌种获取特征值，再扫描混合液中单菌落的颜色信息与特征值进行匹配从而实现鉴别。由于某些细菌的颜色较为相近，可通过调整培养基使颜色相近的细菌呈现出更大的色差，从而进行区分。
优选的，所述R、G、B为光的三原色R(红)、G(绿)、B(蓝)。
优选的，所述平板培养基确保待检测菌株之间具有不同的R、G或B数值区间。
若出现两种或两种以上的细菌三种颜色范围均在相同的区间内，则对该颜色重叠的细菌更换培养基，确保三种颜色中至少有一种颜色的数值范围不重叠，否则该方法对该两种细菌不能进行有效的鉴别。
优选的，所述读取已知菌种菌落的R、G、B数值，每个菌种读取单菌落数为50～100个。
优选的，所述R、G、B数值的读取通过颜色识别软件进行，具体的，为颜色拾取识别器ColorsPro。
优选的，所述若干种细菌的种数为大于1种，小于或等于10个。
经验证，本发明提供的鉴别方法用于三种到五种细菌的鉴别，都能够保持100％的鉴定正确率。应用本发明的方法，混合菌种的数量保持在1个至10个之间时都能够有效的找到鉴别特征数值，保持较高的鉴别正确率。当数量增加至10个以上时，鉴别菌株所用的时间和培养基也随之增加，考虑到应用于实际情况的时间和经济成本，当菌种数量控制在10个及以内时，有利于发挥本发明方法的卓越性。
本发明第二方面，提供一种细菌计数方法，所述方法包括第一方面所述鉴别方法的步骤，所述计数方法在确定各菌落的种类后，还包括通过颜色识别软件对该菌种的单菌落个数进行计数的步骤。
本发明中的细菌计数方法适用于混合培养若干种已知菌种时，对菌落中其中一种菌的生长状况进行研究和检测。将混合菌液涂布于平板培养基中，通过本发明提供的方法可以快速的对平板上形成的单菌落进行识别和计数，对于研究菌株的复配效果、掌握混合菌中各菌种的生长状况具有重要的意义。
本发明第三方面，提供第一方面所述细菌的三原色鉴别方法和/或第二方面所述细菌计数方法在微生物研究与生产领域的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
利用本发明提供的方法能够从不同菌种混养培养物中对不同的菌种进行大批量、快速的鉴别、计数，满足对不同细菌在混合培养液中生长特性研究的需要。具有快速、高效、精准、节约成本和便于操作的特点，该技术可广泛应用于微生物研究与生产领域。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌三种细菌的R、G、B颜色数值范围图。
图2为实施例1中所识别三种细菌的PCR电泳图。
图3为实施例2中解淀粉芽孢杆、腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、盐单胞菌四种细菌的R、G、B颜色值范围图。
图4为实施例2中所识别四种细菌的PCR电泳图。
图5为实施例3中哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌五种细菌的R、G、B颜色数值范围图。
图6为实施例3中所识别五种细菌的TCBS培养基上的R、G、B值范围。
图7为实施例3中所识别五种细菌的PCR电泳图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种细菌的三原色鉴别方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
应用本发明对腐败西瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三种细菌混合液中对不同的细菌进行鉴别及计数。
1材料与方法
1.1菌株
腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌三种细菌，来源于发明人实验室。
1.2培养基
2216E培养基:蛋白胨5g、酵母膏1g、FePO4 0.01g、琼脂20g。(液体培基中不添加)、陈海水1L，pH7.8，121℃高压灭菌20min。
1.3菌落颜色读取软件
颜色拾取识别器ColorsPro。
1.4菌落颜色读取方法及不同菌株R、G、B三种颜色特征范围的确定
1.4.1细菌菌落制备及图像采集
将腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌三种菌分别于2216E平板活化后，取各菌单菌落用无菌PBS稀释成浓度1×103CFU/mL菌悬液。分别取100μL菌悬液涂布2216E平板(设3个平行)，28℃恒温培养24h，之后使用ProtoCOL 2自动菌落计数仪对各平板照相并编号(每次选定的曝光时间均为300ms)，存储于电脑中。
1.4.2R、G、B判别数值范围确定
电脑下载颜色拾取识别器ColorsPro，安装后，打开该软件，分别对腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌菌株平板的单菌落进行R、G、B三种颜色的数据读取，每种菌读取菌落数50个，记录每种菌的各菌落R、G、B三种颜色值，统计比较，并确定出各菌的R、G、B三种颜色中每种颜色的数值范围。比较3个菌株每种颜色的数值大小，找出各菌株的R、G、B三种颜色中，某种颜色与其他菌株在该颜色条件下不重叠的数值区间，将该颜色及其数值范围作为该菌鉴别的特征颜色与数值区间。
1.5混合菌培养液中各种菌的鉴别与计数
混合接种腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌于2216E液体培养基中，培养24h，获得三种菌的混合发酵液。之后将混合菌用灭菌PBS稀释至总菌密度在1×103CFU/mL，分别取100μL菌悬液涂布2216E平板3个(平行样)，28℃恒温培养24h后对各平板照相并编号，存储于电脑中；之后采用颜色拾取识别器软件ColorsPro，对各平板上的菌落进行识别，记录不同菌落R、G、B三种颜色的数据；最后将各菌株的R、G、B三种颜色值范围与1.4.2中各菌株特征颜色及其数值段进行比较，确定各菌株的种类，并统计各种菌的数量。
1.6细菌鉴别方法的可靠性验证
分别从1.5中的3个平板上随机取所鉴别的不同菌落各4个，再采用细菌鉴定通用引物PCR扩增各个细菌的16SrDNA，测序比对，对所鉴别出的细菌的正确性进行验证。
2实验结果
2.1腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌的R、G、B三种颜色范围确定及各菌的鉴别特征颜色与数值范围。
应用软件软件ColorsPro，对单独培养的腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌，分别对其单菌落进行R、G、B的数值读取，每种菌读取菌落数50个，统计各菌种的R、G、B数值，确定各个菌落R、G、B的数值范围。结果见附图1，可知3个菌株的R、G、B值存在差异，其区别是：腐败西瓦氏菌的红光(R)数值范围是[68，83]，其他2种菌的红光值均≥103；地衣芽孢杆菌的绿光(G)数值范围是[94，110]，其他菌的绿光值均≤91；假交替单胞菌的蓝光(B)数值范围是[46,55]，其他细菌的蓝光值均大于61。因此可以认为红光值≤83的菌落均为腐败西瓦氏菌，绿光值≥94的均为地衣芽孢杆菌，而蓝光值≤55的菌落均为假交替单胞菌。
2.2腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌混合菌液中，各种菌的识别结果
从腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌混合培养液中，取发酵液适量，涂布2216E平板，培养24h后，采用软件ColorsPro对其各单菌落进行R、G、B数值测量，根据2.1确定R、G、B数值范围，对三个平板中的3种细菌进行鉴别及计数，结果如下表1.
表1各平板不同细菌个数
Figure BDA0002388113690000071
2.3细菌鉴别方法的可靠性验证
取从2.2中鉴别出的腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、地衣芽孢杆菌各4株，采用PCR方法扩增其16SrDNA，经过测序比对，鉴定各细菌的种类。细菌鉴定结果见表2，12株细菌的PCR扩增结果电泳图见附图2。证实各种菌的鉴别正确性均为100％。
表2细菌RGB鉴别结果及PCR产物测序结果比较
Figure BDA0002388113690000072
实施例2
应用本发明对假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp)、解淀粉芽孢杆(B.amyloliquefaciens)、盐单胞菌(Halomonas anticariensis)、腐败西瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)4种细菌混合培养液中不同的细菌进行鉴别及计数的实例。
1材料与方法
1.1菌株
假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌4种细菌，来源于本发明者实验室。
1.2培养基
2216E培养基:蛋白胨5g、酵母膏1g、FePO4 0.01g、琼脂20g。(液体培基中不添加)、陈海水1L，pH7.8，121℃高压灭菌20min。
1.3菌落颜色读取软件
颜色拾取识别器ColorsPro
1.4菌落颜色读取方法及不同菌株R、G、B三种颜色特征范围的确定
1.4.1 4种细菌菌落制备及图像采集
将假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌4种菌分别于2216E平板活化后，取各菌单菌落用无菌PBS稀释成浓度1×103CFU/mL菌悬液。分别取100μL菌悬液涂布2216E平板3个(平行样)，28℃恒温培养24h。之后使用ProtoCOL 2自动菌落计数仪对各平板照相并编号(注每次选定的曝光时间均为300ms)，存储于电脑中。
1.4.2 R、G、B判别数值范围确定
电脑下载颜色拾取识别器ColorsPro，安装后，打开该软件，分别对假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌2216E平板的单菌落进行R、G、B三种颜色的数据读取，每种菌读取菌落数100个，记录每种菌的各菌落R、G、B三种颜色值，统计比较，并确定各菌的R、G、B三种颜色中每种颜色的数值范围。比较4种菌每种颜色的数值大小，找出各菌株的R、G、B三种颜色中，某种颜色与其他菌株在该颜色条件下不重叠的数值区间，将该颜色及其数值范围作为该菌的鉴别特征颜色与数值区间。
1.5混合菌培养液中各种菌的鉴别与计数
混合接种假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌4种菌于2216E液体培养基中，28℃培养24h，获得4种菌的混合发酵液。之后将混合菌用灭菌PBS稀释至总菌密度在1×103CFU/mL，分别取100μL菌悬液涂布2216E平板(设3个平行)，28℃恒温培养24h后对各平板照相并编号，存储于电脑中；之后采用颜色拾取识别器软件ColorsPro，对各平板上的菌落进行识别，记录各菌株不同菌落R、G、B三种颜色的数据；最后将各菌株的R、G、B三种颜色值与1.4.2中各菌株特征颜色及其数值段进行比较，确定各菌株的种类，并统计各种菌的数量。
1.6细菌鉴别方法的可靠性验证
对1.5中鉴别的细菌，分别从3个平板上随机取出所鉴别的不同细菌的菌落各5个，采用细菌通用引物再PCR扩增各个细菌的16SrDNA，测序比对，对所鉴别出的细菌的正确性进行验证。
2实验结果
2.1假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌R、G、B数值范围确定。
应用软件软件ColorsPro，对采用2216E培养基单独培养的假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌，分别对其单菌落进行R、G、B的数值读取，读取菌落数100个，统计各菌落的R、G、B数值，确定各个菌落R、G、B的数值范围。结果见附图3，可知4种菌株的R、G、B值存在差异，其区别范围是：假交替单胞菌的蓝光(B)值范围[46,55]，其他菌的B值均大于61；解淀粉芽孢杆菌的红光值(R)范围为[99,121]，该菌的红光值与假交替单胞菌的红光值[108,131]部分重叠，而高于腐败西瓦氏菌红光值[68,83]，低于盐单胞菌的红光值[162,181]；盐单胞菌的红光(R)值范围为[162,181]，而其他菌的红光值均小于162；腐败西瓦氏菌的红光(R)值范围[68,83]，其他菌的R值均大于99。由此可知，上述菌悬液中，B值≤55的菌均为假交替单胞菌；混合菌株中，排除假交替单胞菌后，剩余的3中细菌中，R范围为[99,121]的菌株为解淀粉芽孢杆菌，R值≤83的菌均为腐败希瓦氏菌，R值≥162的菌均为盐单胞菌。
2.2假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌4中细菌混合发酵菌液中，各种菌的识别结果
从假交替单胞菌、解淀粉芽孢杆、盐单胞菌、腐败西瓦氏菌混合培养液中，取发酵液适量，涂布2216E平板，培养24h后，采用软件ColorsPro对其单菌落进行RGB数值测量，根据2.1确定R、G、B数值范围，对三个平板中的4种细菌进行鉴别及计数，结果如下表3.
表3各平板不同细菌个数
Figure BDA0002388113690000091
Figure BDA0002388113690000101
2.3细菌鉴别方法的可靠性验证
取从2.2中鉴别出的解淀粉芽孢杆、腐败西瓦氏菌、假交替单胞菌、盐单胞菌各5株，采用PCR扩增其16SrDNA，经过测序比对，鉴定各细菌的种类。细菌的PCR扩增结果见附图4，细菌鉴定结果见表4，证实各种菌鉴别的正确性均为100％。
表4细菌RGB鉴别结果及PCR产物测序结果比较
Figure BDA0002388113690000102
实施例3
应用本发明对同属5种弧菌：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、灿烂弧菌(V.splendidus)、副溶血弧菌(V.Parahemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、费氏弧菌(V.fischeri)混合培养液中不同的细菌进行鉴别及计数的实例。
1材料与方法
1.1菌株
哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌等5种弧菌，来源于本发明者实验室。
1.2培养基
2216E培养基:蛋白胨5g、酵母膏1g、FePO4 0.01g、琼脂20g。(液体培基中不添加)、陈海水1L，pH7.8，121℃高压灭菌20min。
TCBS培养基：购于青岛海博生物技术有限公司
1.3菌落颜色读取软件
颜色拾取识别器ColorsPro
1.4菌落颜色读取方法及不同菌株R、G、B三种颜色特征范围的确定
1.4.1 5种弧菌菌落制备及图像采集
将哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌5种弧菌分别于2216E平板活化后，取各菌单菌落用无菌PBS稀释成浓度1×103CFU/mL菌悬液。分别取100μL菌悬液涂布2216E平板及TCBS平板(均设3个平行)，28℃恒温培养24h。之后使用ProtoCOL 2自动菌落计数仪对各平板照相并编号(注每次选定的曝光时间均为300ms)，存储于电脑中。
1.4.2 R、G、B判别数值范围确定
电脑下载颜色拾取识别器ColorsPro，安装后，打开该软件，分别对哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌2216E平板的单菌落及TCBS平板的单菌落进行RGB三种颜色的数据读取，每种菌读取菌落数70个，记录每种菌的各菌落R、G、B三种颜色值，统计比较，并确定各种菌在2216E及TCBS平板上的R、G、B三种颜色中每种颜色的数值范围。比较5种分别在2216E及TCBS平板上的颜色数值，找出各菌株的R、G、B三种颜色中，某种颜色与其他菌株在该颜色条件下不重叠的数值区间，将该颜色及其数值范围作为该菌的鉴别特征颜色与数值区间。
1.5混合菌培养液中各种菌的鉴别与计数
混合接种哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌5种菌于2216E液体培养基中，28℃培养24h，获得5种菌的混合发酵液。之后将混合菌用无菌PBS稀释至总菌密度在1×103CFU/mL，分别取100μL菌悬液涂布2216E平板及TCBS平板(每种平板设3个平行)，28℃恒温培养24h后对各平板照相并编号，存储于电脑中；之后采用颜色拾取识别器软件ColorsPro，对各平板上的菌落进行识别，记录各菌株不同菌落R、G、B三种颜色的数据；最后将各菌株在2216E及TCBS平板上的R、G、B三种颜色值与1.4.2中相对应平板上的各菌株特征颜色及其数值段进行比较，确定各菌株的种类，并统计各种菌的数量。
1.6细菌鉴别方法的可靠性验证
对1.5中鉴别的细菌，分别从3个平板上随机取出所鉴别的不同细菌的菌落各5个，提取各个菌落的DNA，采用细菌通用引物PCR扩增各个细菌的16SrDNA，测序比对，对所鉴别出的细菌的正确性进行验证。
2实验结果
2.1哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌单独培养平板上R、G、B数值范围确定。
应用软件ColorsPro，对采用2216E培养基单独培养的哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌，分别对其单菌落进行R、G、B的数值读取，读取菌落数70个，统计个菌落的R、G、B数值，确定各个菌落在2216E培养基上R、G、B的数值范围。结果见附图5，可知；副溶血弧菌的R值均≥140，而其他4种菌的R值均小于133；灿烂弧菌的G值≥86，且≤102，而其他4种菌的G值不在此范围；费氏弧菌的G值≥53，且≤62，其他4种菌的G值不在该数值段内。因此可以容易的将副溶血弧菌、灿烂弧菌及费氏弧菌从5种弧菌的混合液中鉴别出。但剩余的哈维氏弧菌及鳗弧菌，其三种颜色的数值相互接近，无法判别。
采用培养基TCBS方法，对其进行比较区别，从附图6可知，在TCBS培养基上，费氏弧菌的R值≤42，其他4种菌的R值均>42；灿烂弧菌的R值≤70，且≥55，其他菌的R值均不在该范围段内；鳗弧菌G值≤51，且≥44，其他菌的G值不在该范围内；副溶血弧菌G值≤91，且大于等于≥74的，其他菌的G值不在该为范围内；鉴别出上述4种菌后，剩余1种为哈维氏弧菌(也即其蓝光值≤7，且其红光值≥92，其他四种菌不能满足该条件)。
由上可知，5种弧菌采用2216E培养基不能完全鉴别出，但采用TCBS培养基即可将5种弧菌进行有效鉴别。
2.2哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌5种菌混合发培养菌液中，各种菌识别结果的分子生物学方法验证结果
从哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌混合培养液中，取发酵液，经稀释后，分别涂布TCBS平板，培养24h后，采用软件ColorsPro对其单菌落进行R、G、B数值测量，根据2.1确定的5种弧菌在TCBS培养基上的R、G、B数值范围，对5种细菌进行鉴别及计数，结果如下表5。
表5各TCBS平板不同细菌个数
Figure BDA0002388113690000121
Figure BDA0002388113690000131
2.3识别菌株正确性验证
取从2.2中鉴别出的哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、费氏弧菌各5株，采用PCR扩增其16SrDNA，经过测序比对，鉴定各细菌的种类。部分细菌的PCR扩增结果电泳图见附图7，细菌鉴定结果见表6，证实各种菌鉴别的正确性均为100％。
表6细菌R、G、B鉴别结果及PCR产物测序结果比较
Figure BDA0002388113690000132
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细菌的三原色鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括如下步骤，将待鉴别的若干种细菌分别涂布于平板培养基形成已知菌种的单菌落，读取已知菌种菌落的R、G、B数值，对比不同菌种的R、G、B数值，获取不与其他菌种数值重合的部分作为该菌种的特征数值；将待鉴别的混合菌落涂布于相同的平板培养基中，通过读取待鉴别混合平板中各菌落的R、G、B数值与特征数值进行匹配，从而确定各菌落的种类。
2.如权利要求1所述细菌的三原色鉴别方法，其特征在于，所述R、G、B为光的三原色R(红)、G(绿)、B(蓝)。
3.如权利要求1所述细菌的三原色鉴别方法，其特征在于，所述平板培养基确保待检测菌株之间具有不同的R、G或B数值区间。
4.如权利要求1所述细菌的三原色鉴别方法，其特征在于，所述读取已知菌种菌落的R、G、B数值，每个菌种读取单菌落数为50～100个。
5.如权利要求1所述细菌的三原色鉴别方法，其特征在于，所述R、G、B数值的读取通过颜色识别软件进行。
6.如权利要求5所述细菌的三原色鉴别方法，其特征在于，所述颜色识别软件为颜色拾取识别器ColorsPro。
7.如权利要求1所述细菌的三原色鉴别方法，其特征在于，所述若干种细菌的种数为大于1种，小于或等于10个。
8.一种细菌计数方法，其特征在于，所述方法包括第一方面所述鉴别方法的步骤。
9.如权利要求8所述细菌计数方法，其特征在于，所述计数方法在确定各菌落的种类后，还包括通过颜色识别软件对该菌种的单菌落个数进行计数的步骤。
10.权利要求1-7任一项所述所述细菌的三原色鉴别方法和/或权利要求8或9所述细菌计数方法在微生物研究与生产领域的应用。
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