KR101453058B1

KR101453058B1 - 포도 잎의 잿빛곰팡이병 방제 방법

Info

Publication number: KR101453058B1
Application number: KR1020120113516A
Authority: KR
Inventors: 최성진
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2014-10-23
Also published as: KR20140047352A

Abstract

본 발명은 포도 잎의 잿빛곰팡이병 억제를 위한 방제 방법에 관한 것으로, 자외선 조사에 의한 포도 잎의 스틸벤 화합물 함량 증대로 인해 포도의 잿빛곰팡이병 방제 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

포도 잎의 잿빛곰팡이병 방제 방법{A method for preventing gray mold in grapevine leaves}

본 발명은 포도 잎의 잿빛곰팡이병 방제 방법에 관한 것이다.

Diphenylethylene(stilbene)의 기본 골격을 가지는 폴리페놀(polyphenol) 화합물의 일종인 레스베라트롤(resveratrol, 3,5,4'-trihydroxystilbene)은 피자 식물과 나자 식물을 포함하여 지금까지 적어도 72종 이상의 종자식물에서 발견되어 왔다. 레스베라트롤(resveratrol)은 이성질체화, 수산화, 메톡시화, 배당체화, 중합 등의 과정을 거쳐 다양한 형태의 스틸벤(stilbene) 화합물로 변형되는데, 식물에서 발견되는 스틸벤 화합물은 수십 종류에 이르는 것으로 알려져 있다. 레스베라트롤은 Siemann 과 Creasy 에 의해 포도주에 함유되어 있다는 사실이 처음 알려졌고(Am. J. Enol. Vitic. (1992) 43:49-52), 암 또는 심혈관계 질환에 대한 예방 효과를 가진다는 사실이 보고되면서 최근에는 포도나 포도 가공식품에 함유되어 있는 생리활성 천연물로 주목을 받고 있다.

식물에서 스틸벤 화합물은 주로 수피의 죽은 조직에서 발견되며, 잎, 과실 또는 뿌리 등의 살아 있는 조직에서도 소량 발견된다. 이러한 조직에서는 물리적, 화학적 또는 생물학적 스트레스에 의해 레스베라트롤을 포함한 스틸벤 화합물의 축적이 촉진된다. 한편, 포도 과실의 경우 레스베라트롤은 특히 과피의 표피 조직에 축적되며 과육에서는 거의 발견되지 않는다. 이러한 보고를 포함하여, 식물에서 레스베라트롤은 phytoalexin의 일종으로서 그 주된 기능이 병원균의 침입에 대한 화학적 방어에 있음을 방증하는 다양한 관찰이 보고되어 왔는데, 레스베라트롤의 합성량과 합성의 신속성은 잿빛곰팡이병에 대한 포도의 품종별 저항성과 밀접한 상관관계가 있으며, 흰가루병 또는 탄저병에 대해 저항성을 보이는 포도 품종에서는 Plasmopora viticola 또는 Elisinoe ampelina를 접종하였을 때 잎의 레스베라트롤 함량이 증가하는 것으로 보고되어 있다. Hart 는 (1) 병원균의 침입 부위에 분포하고 (2) 병원균의 침입과 더불어 적절한 시기에 생성되어 (3) 병원균의 생장을 억제할 만큼 충분한 농도로 존재하며 (4) 그 농도의 변화가 병원균에 대한 감수성의 변화와 일치하는 것을 phytoalexin의 기준으로 하였는데(Ann. Rev. Phytopathol.(1981) 19:437-458), 레스베라트롤은 phytoalexin의 이러한 기준을 모두 충족한다.

Langcake 과 Pryce 는 포도 잎에서 자외선 조사에 의해 레스베라트롤 함량이 증대된다는 사실을 처음으로 보고하면서 자외선에 의한 DNA 손상이 이와 관련이 있을 것으로 추정하였는데(Phytochem. (1977) 16:1193-1196), 이러한 현상은 hormesis의 하나로 이해될 수 있다. 즉, 치명적이지 않은 낮은 수준의 위해 요인에 의해 식물 세포에 치유가 가능한 수준의 손상이 발생하면 이러한 손상을 복구하고 스트레스에 대한 저항성을 증진하기 위해서 세포는 다양한 생명 활동을 활성화하여 대사 경로를 재편한다. 이로 인해 페놀화합물, 폴리아민, 이소프레노이드 등의 이차대사산물의 합성 경로가 활성화되는 것으로 알려져 있다. Langcake 과 Pryce(1977)의 보고 이래, 자외선에 의한 레스베라트롤의 함량 변화에 대해 여러 연구가 이루어져 왔다.

최근 본 발명자들은 포도 잎에서 자외선 조사에 의해 스틸벤 화합물 함량이 크게 증가하는 것을 개시한 바 있다(Kor. J. Hort. Sci. Technol. (2011) 29:374-381).

그러나, 포도의 병 저항성을 증진하는 수단으로 자외선 조사의 활용 가능성이 높은데도 불구하고, 지금까지 자외선을 조사한 포도 잎에서 스틸벤 화합물의 함량 변화와 잿빛곰팡이병 발생과의 상관관계에 대하여는 보고된 바가 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 자외선을 조사한 포도 잎에서 스틸벤 화합물의 함량 증대로 인해 잿빛곰팡이병을 억제하는 방제 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 포도 잎에 자외선을 조사하는 단계와; 상기 자외선을 조사한 포도 잎에서 스틸벤 화합물을 추출 및 분석하는 단계와; 스틸벤 화합물의 항산화 활성을 조사하는 단계와; 자외선 조사에 따른 잿빛곰팡이병 발생을 조사하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 자외선 조사를 통하여 포도 잎의 잿빛곰팡이병을 억제하는 방제 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 자외선 조사에 의한 포도 잎의 스틸벤 화합물 함량 변화를 시간별로 나타낸 그래프이다.
도 2는 자외선의 반복 조사에 의한 포도 잎의 스틸벤 화합물 함량 변화를 시간별로 나타낸 그래프이다.
도 3은 스틸벤 화합물의 항산화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 스틸벤 화합물의 다양한 농도에서 B. cinerea의 균사 생장을 나타낸 그래프이다.
도 5는 스틸벤 화합물의 다양한 농도에서 B. cinerea의 포자 발아를 나타낸 그래프이다.
도 6은 자외선을 조사한 포도 잎에서 B. cinerea를 접종하여 괴사 반점을 관찰한 사진도이다.

포도 잿빛곰팡이병은 Botryris cinerea에 의해 발생하는 것으로 포도에서 주로 과실에 피해를 입히나 봄철에 신초, 꽃, 잎 등에서 발생하기도 한다. 본 발명 실험에서는 자외선을 조사한 포도 잎에서 스틸벤 화합물의 함량 변화와 잿빛곰팡이병 발생의 차이를 조사하여 방제 방법의 수단으로 자외선의 활용 가능성을 분석하였다.

본 발명 실험의 자외선 조사를 위해서 포도 잎의 수관 하부 약 30㎝ 위치에 주 파장 254㎚의 자외선 등을 설치하여 30초, 60초 또는 2분간 점등하여 자외선을 조사하였으며, 스틸벤 화합물 함량 증진을 위한 적정 자외선 조사 시간은 2분 이내가 바람직하다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 포도 잎의 자외선 조사

무가온 비닐 하우스에서 생육 중인 포도(V. labruscana cv. Campbell Early)를 자외선 조사 실험에 이용하였다. 자외선 등(germicidal UV lamp, G30T08 30W, Sankyo Denki, Japan; 주 파장 = 254nm)을 수관 하부 약 30㎝의 위치에 설치한 후, 오전 중에 30초, 60초 또는 2분간 점등하여 포도 잎에 자외선을 조사하였다. 두 차례에 걸쳐 자외선을 반복 조사한 실험에서는, 2분간 자외선을 조사하고 9일이 경과한 시점에 자외선을 2분간 추가적으로 조사하였다. 포도 가지의 특정 잎에 한정하여 자외선을 조사한 실험에서는, 자외선 조사 대상 잎을 제외한 잎을 모두 aluminium foil로 감싸 차광 처리한 후 2분간 자외선을 조사하였다. 자외선을 조사한 포도 잎은 1-2일 간격으로 수확한 후 액체 질소에 동결하여 분석에 이용할 때까지 -70℃에 보관하였다.

실시예 2 : 스틸벤 화합물의 추출 및 분석

상기 실시예 1에서 획득한 동결 포도 잎 1g에 4mL의 80% (v/v) 메탄올을 가하여 레스베라트롤을 포함한 스틸벤 화합물을 추출하였다. 즉, 포도 잎에 용매를 가하고 약간의 해사와 함께 막자 사발에서 마쇄하여 얻은 추출액을 4℃에서 20분간 25,000x g로 원심분리하였다. 원심분리 후 상징액을 취하여 즉시 HPLC에 주입하여 스틸벤 화합물을 분석하였으며, 이 때 HPLC-mass spectrometry (LC-MS)의 분석 조건은 다음과 같았다. LC 조건: HPLC system = Water model 2696 (USA); column = XTerra MS C18 (3.5μ, 150 x 2.1㎜, Waters, USA); solvent A = 0.1% formic acid, solvent B = acetonitrile; solvent program = 80:20 (A/B) to 55:45 (A/B) in 10 min; flow rate = 0.2 mL/min; MS 조건: MS system = Waters model 3100 (USA); desolvation gas flow rate = 500 L/h; cone gas flow rate = 50 L/h; desolvation temperature = 400℃; source temperature = 120℃; capillary voltage = 4 KV; ionization mode = electrospray negative, cone voltage = 35V; data acquisition mode = single ion reaction (SIR); m/z = 227 for resveratrol; m/z = 243 for piceatannol; m/z = 389 for piceid.

주요 스틸벤 화합물의 함량은 0.5-2분간 자외선을 조사하였을 때 조사 시간의 증가와 더불어 증가하는 경향을 보였다. 그러나 자외선의 과도한 조사는 포도 잎에 장해를 유발하여 갈변 또는 흑색 반점의 형성을 유발하므로, 스틸벤 화합물 함량 증진을 위한 적정 자외선 조사 시간은 2분 이내로 판단되었다.

실험 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사에 따른 스틸벤 화합물 함량의 변화는 trans/cis-레스베라트롤과 피세아타놀(piceatannol)의 함량은 자외선 조사 3일 이내에 자외선 조사 이전에 비해 각각 80배, 22배, 51배 증가하여 정점을 이루었으며 그 이후에는 점차 감소하여 약 9일 후에는 거의 본래의 수준으로 낮아졌다. 반면, trans/cis-피세이드(piceid)의 경우에는 자외선 조사 3-5일 후 자외선 조사 이전에 비해 약 30배 까지 증가한 상태에서 높은 수준의 함량을 상당 기간 동안 지속적으로 유지하였다.

한편, 자외선 조사 후 9일이 경과하여 레스베라트롤 또는 피세아타놀의 함량이 자외선 조사 이전의 수준으로 감소한 시점에 2차로 자외선을 반복 조사한 결과(도 2), 자외선 조사에 의해 레스베라트롤과 피세아타놀의 함량은 일시적으로 다시 증가하였으나 그 증가 정도는 1차 조사의 경우에 비해 약 절반 수준으로 낮았으며 1일 이후에는 빠르게 재차 감소하는 경향을 나타내었다. 그러나 레스베라트롤 또는 피세아타놀과 달리 피세이드는 반복된 자외선 조사의 영향을 크게 받지 않았으며 이후 약 한달 가까이 지속적으로 높은 수준의 함량이 유지되었다.

레스베라트롤(resveratrol)과 피세아타놀(piceatannol)의 합성에 관련된 주된 효소는 phenylalanin ammonia-lyase(PAL)과 stilbene synthase(STS)이다. Phenylpropanoid pathway에서 PAL에 의해 합성된 cinnamic acid는 STS의 기질인 cinnamoyl-CoA 또는 p-coumaroyl-CoA로 전환되며, STS는 이들 기질로부터 다양한 종류의 스틸벤 화합물을 합성한다. PAL과 STS는 생물적 스트레스 또는 자외선 조사를 포함한 비생물적 스트레스에 반응하여 활성화되는 것으로 잘 알려져 있다. 한편 피세이드(piceid)는 레스베라트롤의 배당체로서 glucosyltransferase에 의해 합성되는데, glucosyltransferase는 기질의 폭이 넓어서 레스베라트롤을 포함하여 다양한 종류의 phenol 화합물에 작용하여 glucose ester를 생성한다. 본 발명의 상기 실험 결과에서 피세이드는 자외선 처리 후 포도 잎에 지속적으로 축적되는 양상을 보였는데, 특히 cis-피세이드의 경우 매우 높은 수준의 축적량을 나타내었다(도 2). 따라서 자외선 조사에 의해 포도 잎의 스틸벤 화합물 생합성 관련 효소의 합성이 유도되어 레스베라트롤과 피세아타놀의 생성이 증가하며, 생성된 레스베라트롤과 피세아타놀은 glucosyltransferase에 의해 피세이드로 배당체화한 후 궁극적으로 cis 형으로 전환되어 포도 잎에 축적되는 것으로 판단되었다.

한편, 스틸벤 화합물의 체내 전류 여부를 확인하기 위해서 특정 잎에 한정하여 자외선을 조사한 후 가지에 착생된 모든 잎에서 스틸벤 화합물의 함량을 분석하여 하기 [표 1]에 나타내었다.

실험 결과 자외선을 조사한 잎에서만 스틸벤 화합물이 증가할 뿐 차광 처리한 다른 잎에서는 스틸벤 화합물이 거의 검출되지 않았다. 이는 스틸벤 화합물이 체내 이동성이 없으며, 자외선에 직접적으로 노출된 잎에서만 스틸벤 화합물의 합성이 증가됨을 나타내었다.

실험예 1 : 스틸벤 화합물의 항산화 활성 검정

레스베라트롤을 포함한 스틸벤 화합물의 생리적 활성은 항산화 작용성과 관련이 있는 것으로 알려져 있고, 스틸벤 화합물의 라디칼 소거능은 수산기(-OH)의 개수와 상관성이 있다.

본 발명 항산화 활성의 검정은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용한 radical 소거능 검정법을 사용하였다. 레스베라트롤, 피세이드, 피세아타놀 등 검정 대상 스틸벤 화합물을 0.1mM의 농도로 methanol에 용해한 후 500μL (50nmol)를 취하여 동량의 0.4mM DPPH와 혼합하고 25℃에서 30분간 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각 화합물의 항산화 활성은 0-50nmol 범위의 tocopherol를 사용하여 작성한 standard curve로부터 산출하여 레스베라트롤 대비 백분율로 표시하였다.

실험 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 레스베라트롤의 수산화 유도체인 피세아타놀은 레스베라트롤 보다 강한 항산화 활성을 나타내었다. 반면, 레스베라트롤의 배당 유도체인 피세이드는 레스베라트롤에 비하여 낮은 활성을, 또한 cis 형의 스틸벤 화합물은 trans 형의 isomer에 비하여 항산화 활성이 현저히 낮은 경향을 나타내었다.

실험예 2 : Botrytis cinerea 의 균사 생장 조사

B. cinerea의 균사 생장에 대한 스틸벤 화합물의 영향을 조사하기 위해서, 포자를 potato dextrose agar (PDA) 배지에 접종하여 생장 중인 B. cinerea의 균사를 멸균 cork borer를 사용하여 균사 가장자리에서 5㎜ 직경으로 절취한 후, 이를 스틸벤 화합물을 포함하는 PDA 배지에 접종하여 25℃ 암소에서 배양하면서 균사의 생장 직경(radial growth)을 관찰하였다. 상기 스틸벤 화합물 함유 PDA 배지는 멸균한 PDA 용액을 약 50℃로 식힌 후 methanol에 용해한 검정 대상 스틸벤 화합물(0-160ppm)을 혼합하고 8㎝ 직경의 petri dish에 분주하여 조제하였다.

실험 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, B. cinerea의 균사 생장은 레스베라트롤에 의해 가장 크게 억제된 반면 피세아타놀은 거의 억제 효과를 나타내지 않았으며, cis-레스베라트롤은 trans 형에 비하여 억제 효과가 비교적 낮기는 하나 피세이드에서는 두 종류의 isomer 간에 큰 차이는 나타나지 않았다.

실험예 3 : Botrytis cinerea 의 포자 발아율 조사

잿빛곰팡이병에 감염되어 다량의 포자를 방출하는 포도 과실을 실온에서 3일간 건조한 후 B. cinerea의 분생 포자를 채집하였다. 포자의 발아에 대한 스틸벤 화합물의 영향을 조사하기 위해서, 40ppm 또는 160ppm의 스틸벤 화합물을 포함하는 0.24% potato dextrose broth(0.8% NaCl 함유)에 포자를 풀어 포자 현탁액(1.5x10⁴spores·mL^-1)을 조제한 후, dichlorodimethyl silane으로 발수 처리한 slide glass에 5μL의 상기 포자 현탁액을 치상하여 25℃ 습실에서 24시간 배양한 후 현미경으로 검경하여 포자 발아율을 5 반복으로 조사하였다.

실험 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 스틸벤 화합물의 B. cinerea 포자 발아에 대한 억제 효과는 40ppm의 trans/cis-레스베라트롤의 농도 조건에서 각 52.3%(±5.2)와 58.6%(±4.8), 160ppm의 trans/cis-피세이드에서 각 65.7%(±7.2)와 70.6%(±6.1)의 포자가 발아하는 것으로 조사되었다.

상기 결과로부터 비록 스틸벤 화합물의 종류에 따라 B. cinerea의 생장에 미치는 영향에서 약간의 차이는 있으나, 스틸벤 화합물은 종류를 막론하고 전반적으로 B. cinerea의 포자 발아 및 균사 생장을 억제하는 작용이 있음을 보였다. 즉, 스틸벤 화합물은 trans-레스베라트롤, cis-레스베라트롤, trans-피세이드, cis-피세이드 순으로 B. cinerea의 생장을 억제하는데, 피세이드는 레스베라트롤과 동일한 수준의 생장 억제 효과를 보이기 위해서는 4배 이상의 농도가 요구될 것으로 판단되었다. 그러나 포도 잎에 자외선을 조사할 경우 피세이드 함량이 수십 배 증가한 점에 비추어 볼 때(도 1), 레스베라트롤 뿐만 아니라 피세이드 역시 자외선 조사 잎에서 B. cinerea의 생장 억제에 기여할 수 있을 것으로 판단되었다.

실험예 4 : 자외선에 의한 포도 잎의 잿빛곰팡이병 발생 조사

자외선 조사에 따른 포도 잎의 잿빛곰팡이병 발생을 조사하기 위해서, 0.24% potato dextrose broth(0.8% NaCl 함유)에 10^6·mL^-1의 농도로 B. cinerea 포자 현탁액을 조제한 후, 20μL의 포자 현탁액을 Ependorf repeater(pipette)를 사용하여 포도 잎 뒷면의 4곳에 가압 주입하였다. 접종한 포도 잎은 형광등 조명의 25℃ 습실에서 5일간 방치한 후 괴사 반점의 크기 변화를 측정하였으며, 무처리 잎과 UV 처리 잎 각각 10장에 대하여 조사하였다.

실험 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 자외선 무처리 잎에서는 접종 부위의 90%에서 괴사 반점이 형성되었고 괴사 반점의 직경은 21mm(±9.2)인 반면, 자외선을 조사한 잎에서는 괴사 반점 형성 비율이 60%로 낮았으며 괴사 반점의 크기 또한 7mm(±4.6)로 축소되었다. 상기 결과는 포도 잎에 자외선을 조사할 경우 B. cinerea 의 포자 발아가 억제될 뿐만 아니라 발아한 포자의 균사 생장 또한 억제되기 때문인 것으로 판단되었다. 그러나, 스틸벤 화합물은 체내 이동성이 거의 없고 자외선에 직접 노출된 잎에서만 함량이 증가하므로 병 발생 경감의 수단으로 자외선을 활용하기 위해서는 수관 전체에 자외선을 균일하게 조사하는 방법의 도움이 필요하다고 판단되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 자외선 조사에 의한 포도 잎의 스틸벤 화합물 함량 증대로 인해 포도의 잿빛곰팡이병 발생을 억제하는 뛰어난 효과가 있으므로 원예산업 및 생물농약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

삭제
자외선 등을 수관하부 30 cm 위치에 설치하고 주 파장 254㎚의 자외선을 2분 이내 조사하여 포도잎의 스틸벤 화합물을 증대시키는 것을 특징으로 하는 포도 잎의 잿빛곰팡이병 방제 방법.
삭제
삭제
삭제
레스베라트롤, 피세아타놀, 피세이드 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징인 포도 잎 잿빛곰팡이병 방제용 미생물제제 조성물.