CN114258924A

CN114258924A - 猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用

Info

Publication number: CN114258924A
Application number: CN202111681144.4A
Authority: CN
Inventors: 黄伟; 王玮; 张丽娟; 王宁; 刘峰娟; 宋博; 罗义; 鲁志远; 马昊翔
Original assignee: Institute Of Microbial Applications Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences (china Xinjiang-Armenia Bioengineering Research And Development Center)
Current assignee: Institute Of Microbial Applications Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences (china Xinjiang-Armenia Bioengineering Research And Development Center)
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本发明公开了一种猬木霉代谢产物在制备防治香梨黑斑病药物中的应用。通过筛选猬木霉(Trichoderma erinaceum)菌株，优化培养条件，测定其挥发性物质对链格孢等5种病原真菌具有良好的抑制效果，进一步分析代谢产物组成，其产生的高效抑菌挥发性物质为6‑戊基‑2H‑吡喃‑2‑酮，3‑羟基丁酸乙酯，苯乙醇，在714.28μL/L浓度下能够显著抑制链格孢的生长，可合理开发用于植物病害防控，尤其是香梨采后果实黑斑病的熏蒸防治获得显著突出的技术效果，具有很好的应用推广价值。

Description

猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体地，涉及猬木霉(Trichoderma erinaceum) 在香梨黑斑病防治中的应用。

背景技术

由链格孢引起的黑斑病是新疆多种名特优果实采后贮藏期的主要病害之一，如库尔勒香梨、红枣、杏、甜瓜等，其中库尔勒香梨作为新疆地区贮藏量最大的水果，并且其产业化水平遥居新疆所有水果之首，是新疆尤其是南疆地区果农的主要经济支柱。香梨果实在运输、贮藏过程中发生多种病害，尤其是主要由链格孢引起的黑斑病，严重影响了香梨的食用品质和商业价值，给果农造成了巨大的经济损失，是香梨产业亟待解决的问题。

目前对香梨采后果实保鲜的使用方法有低温冷藏、气调贮藏等物理方法， 1-MCP熏蒸、壳聚糖涂膜等化学方法，然而物理方法对设备有较高的要求，化学方法中药剂的使用在食品安全性方面存在极大的隐患，因此，寻找能持续防控此病害和其他果实采后同类病害的新途径具有重要意义。

挥发性物质(volatile organic compounds，VOCs)是指能在正常条件下快速地挥发，以蒸气形式存在于空气中的小分子含碳化合物。微生物产生的VOCs是成分复杂的混合物，作为理想的“信息化学物质”，VOCs有良好的穿透性，可以在空气、土壤空隙中高效地进行扩散，从而显著地扩大了作用范围，拮抗微生物释放的VOCs具有抑制植物病原菌、促进植物生长和诱导系统抗性的能力。在果蔬储藏室内或运输用包装中，利用有益微生物产生的活性VOCs进行物熏蒸能够有效地控制病原菌的侵染及腐烂变质，因此拮抗微生物产生的活性VOCs 是香梨等果蔬储藏和保鲜过程中非常理想的控制病害的生物熏蒸剂，具有较大的开发潜力。然而有关真菌产生抑菌挥发性物质，大都属于子囊菌门炭角菌目及归属于粪壳菌纲、座囊菌纲、锤舌菌纲的子囊菌，部分酵母释放的挥发性物质能够抑制采后果蔬贮藏期腐烂病。目前，有关微生物产生的挥发性物质在香梨采后贮藏黑斑病真菌防控中的应用鲜有报道。

木霉(Trichoderma spp.)是世界上在植物病害物防治中应用最多的微生物类群之一，部分菌株其挥发物质对苹果霉心病、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢均具有抑菌活性，但是由于拮抗微生物产生VOCs的复杂性，目前未见有专利和文献报道有关猬木霉产生的VOCs及其应用。

发明内容

针对现有香梨采后保鲜方法存在的问题，以及未见有专利和文献报道有关猬木霉(Trichoderma erinaceum)产生的VOCs及其在链格孢香梨黑斑病防治中的应用。本发明旨在于提供一种猬木霉产生的挥发性物质在制备防治香梨黑斑病药物中的应用。本发明采用平板对扣法测定猬木霉产生的挥发物质对5种植物病原真菌的抑菌活性、不同生长时期对链格孢的抑菌活性、采用HS-SPME法进行GC-MS/MS检测分析其挥发性物质，并对其有效成分和浓度进行优化，结果发现，猬木霉挥发性物质对香梨黑斑病菌和番茄早疫病菌的抑制率分别为 63.12±1.37％和59.67±0.30％，无显著性差异(P>0.05)，对水稻恶苗病菌、番茄灰霉病菌和棉花枯萎病菌的抑制率依次分别为50.81±3.0％、47.00±1.83％、32.65±2.56％，生长至5d对链格孢的抑制率达到最大值，为82.48±1.17％；鉴定其挥发物质包括65个组分，对主要组分进行链格孢抑制试验，结果表明，其产生的高效抑菌挥发物6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇，在714.28 μL/L浓度下能够显著抑制链格孢的生长，抑制率为21.27-50.23％，表明猬木霉挥发性物质组合对链格孢生长的抑制显著优于纯化合物，可见，利用猬木霉挥发性物质可合理开发香梨黑斑病菌拮抗菌剂和抑制香梨黑斑病菌的熏蒸剂，对于植物病害防控，尤其是香梨采后果实黑斑病防治具有重要的意义。

为了达到以上技术效果，本发明通过如下技术方案实现。

本发明提供一种猬木霉(Trichoderma erinaceum)在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，所述的猬木霉能产生挥发性物质(volatile organic compounds， VOCs)。

本发明猬木霉(Trichoderma erinaceum)在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，具体应用方案如下：

选用菌株猬木霉接种到PDA平板上，在30℃下培养7d，待菌落长满整个平板观察菌落特征，待用；挑选成熟度一致、大小均一、无病虫害的库尔勒香梨果实，使用浓度为3％的过氧化氢对香梨表面进行消毒，晾干备用；采用无菌打孔器在香梨果实赤道部位打一个直径为0.8cm，深度为0.5cm的孔；同时将生长至7d的香梨黑斑病病原菌链格孢菌饼打孔，取菌饼朝外放置于香梨预先打孔位置，然后放在干燥器(直径300mm)隔板上方，在干燥器隔板下方放置两个生长至5d的猬木霉PDA培养皿，去除皿盖后用玻璃纸封住表面，于30℃静置培养产生的挥发性物质，在香梨黑斑病防治中的应用。

进一步，本发明提供的猬木霉(Trichoderma erinaceum)M6-5从农田土壤中进行菌株的培养、分离和筛选，获得一批真菌，并从中分离筛选出一株编号为M6-5的猬木霉(Trichoderma erinaceum)，经ITS和tef1序列分析、系统发育分析和微生物学特性分析结果，M6-5菌株属于猬木霉(Trichoderma erinaceum)，通过对该菌种基因测序，所得序列在NCBI网站进行BLAST比对分析，菌株 M6-5的ITS基因序列与Trichoderma erinaceumATCCMYA-4844和Trichoderma erinaceum strain DAOM 230019的同源性最高，均为99.33％，菌株M6-5的tef1 序列与Trichoderma erinaceum culture-collection DAOM:230019序列相似性最大达99.27％。选取同源性较高的序列构建ITS和tef1系统发育树，菌株M6-5与Trichoderma erinaceum ATCC MYA-4844和Trichoderma erinaceum strain DAOM 230019亲缘关系最近，支持度为66％；菌株M6-5与Trichoderma erinaceum culture-collectionDAOM:230019亲缘关系最近，支持度bootstrap值达100％，为同一株菌。可见，本发明采用M6-5菌株属于常见的猬木霉(Trichoderma erinaceum)，公众可通过公知菌种保藏单位或其它公共渠道购买获得猬木霉 (Trichoderma erinaceum)用于实施本发明技术方案。

进一步，本发明提供的猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，并不仅限于采用提供的M6-5菌株，只要是猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用都获得抑菌率显著的技术效果。

同时，本发明提供一种香梨黑斑病菌拮抗菌剂，所述拮抗菌剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质。

本发明提供一种抑制香梨黑斑病菌的熏蒸剂，所述拮熏蒸剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质。

本发明上述的熏蒸剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质包括65个组分，其产生的高效抑菌挥发物6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇。

本发明上述的熏蒸剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质包括65个组分，其产生的高效抑菌挥发物6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇分别占挥发性物质总量的40.12％，6.49％，4.38％，4.13％，3.48％。

通过以上技术方案，本发明得到以下技术效果：

(1)本发明采用猬木霉(Trichoderma erinaceum)在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，采用的菌种猬木霉可在常见的PDA培养基上生长，具有较高的抑制链格孢病原菌生长的特性，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点。

(2)本发明提供的猬木霉(Trichoderma erinaceum)在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，利用分离出的菌种培养产生的挥发物质能够对5种植物病原真菌的抑菌活性，对香梨黑斑病菌和番茄早疫病菌的抑制率分别为63.12±1.37％和59.67±0.30％，无显著性差异(P>0.05)，对水稻恶苗病菌、番茄灰霉病菌和棉花枯萎病菌的抑制率依次分别为50.81±3.0％、47.00±1.83％、32.65±2.56％，其中，猬木霉生长至5d对链格孢的抑制率达到最大值，为82.48±1.17％，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

(3)本发明提供的猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，采用 HS-SPME法进行GC-MS/MS检测分析其挥发性物质，其挥发物质包括65个组分，其产生的高效抑菌挥发物6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇，在714.28μL/L浓度下能够显著抑制链格孢的生长，抑制率为21.27-50.23％，表明猬木霉挥发性物质组合对链格孢生长的抑制显著优于纯化合物，可见，利用猬木霉挥发性物质可合理开发香梨黑斑病菌拮抗菌剂和抑制香梨黑斑病菌的熏蒸剂，对于植物病害防控，尤其是香梨采后果实黑斑病防治具有重要的意义。

附图说明

图1所示为基于ITS序列的菌株M6-5的系统发育进化树。

图2所示为基于tef1序列的菌株M6-5的系统发育进化树。

图3所示为菌株M6-5形态特征图；A为菌株的菌落图；B为分生孢子形态图，C为厚垣孢子形态图，D为分生孢子梗形态图。

图4所示为菌株M6-5对不同病原真菌的抑制效果，图中上：处理组；下：对照组；A为香梨黑斑病菌，B为番茄早疫病菌，C为水稻恶苗病菌，D为番茄灰霉病菌，E为棉花枯萎病菌。

图5所示为不同生长时期的菌株M6-5对香梨黑斑病菌链格孢的抑制效果。图中上：处理组；下：对照组；A～F分别为0d、5d、10d、15d、20d、25d效果图。

图6所示为浓度为714.28μL/L的3-羟基丁酸乙酯与苯乙醇对香梨黑斑病菌链格孢的抑制效果，A为对照组，B为处理组。

图7所示为菌株M6-5挥发物质对接种香梨黑斑病菌链格孢香梨的影响图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明中，选用的，猬木霉(Trichoderma erinaceum)、香梨黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)、番茄早疫病菌茄链格孢菌(Alternaria dauci(Kuhn) Groveset Skolkof.sp.solani)、对水稻恶苗病菌串珠镰孢(Fusarium moniliforme Sheld.)、番茄灰霉病菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.Fr.)和棉花枯萎病菌尖孢镰刀菌(F.oxysporum)都为常见的公众熟知菌株，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得，培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。

本发明实施例中采用如下基础培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，加蒸馏水至1.0L。

DNA抽提试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

固相微萃取：上海安谱实验科技股份有限公司DVB/CAR/PDMS

气质联用仪：日本SHIMADZU公司TQ8040NX三重四极杆型

实施例1：猬木霉(Trichoderma erinaceum)M6-5的鉴定

(一)猬木霉M6-5 ITS的序列测定与分析：

1.PCR模板DNA的提取

将卷猬木霉(Trichoderma erinaceum)M6-5接种于PDA液体培养基中，30℃ 培养7d，获得菌体细胞，采用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组 DNA提取。

2.PCR扩增

ITS序列引物：

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

Tef1序列引物：

tef1-EF1：5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3'；

tef1-EF2：5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3'。

ITS序列PCR扩增条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火52.6℃ 30s，延伸72℃45s，35个循环；延伸72℃5min。

tef1序列PCR扩增条件为：预变性95℃3min；变性94℃15s，退火53℃ 30s，延伸72℃45s，35个循环；延伸72℃5min。

3.序列测定

PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列长度为609bp，测序结果见SEQ IDNo:1。所得序列在NCBI网站进行比对分析，经比对分析发现，菌株 M6-5的ITS基因序列与Trichoderma erinaceumATCC MYA-4844和Trichoderma erinaceum strain DAOM 230019的同源性最高，为99.33％，选取同源性较高的序列构建ITS系统发育树，菌株M6-5与Trichoderma erinaceum ATCC MYA-4844 和Trichoderma erinaceum strain DAOM230019亲缘关系最近，归属于猬木霉(Trichoderma erinaceum)，证实了该菌株卷猬木霉(Trichoderma erinaceum) M6-5属于常见的猬木霉(Trichoderma erinaceum)。

PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列长度为912bp，测序结果见SEQ IDNo:2。所得序列在NCBI网站进行比对分析，经比对分析发现，菌株 M6-5的tef1基因序列Trichoderma erinaceum culture-collection DAOM:230019的同源性最高，为99.27％，选取同源性较高的序列构建tef1系统发育树，菌株 M6-5与Trichoderma erinaceumculture-collection DAOM:230019亲缘关系最近，支持度bootstrap值达100％，归属于猬木霉(Trichoderma erinaceum)，证实了该菌株M6-5属于常见的猬木霉(Trichodermaerinaceum)。

可见，菌株M6-5的ITS序列与tef1序列系统发育树结果一致，均为常见的猬木霉(Trichoderma erinaceum)。本发明采用M6-5菌株属于常见的猬木霉 (Trichodermaerinaceum)，公众可通过公知菌种保藏单位或其它公共渠道购买。

(二)猬木霉(Trichoderma erinaceum)M6-5的菌落形态

将待观察的菌株M6-5接种到PDA平板上，在30℃下培养7d，待菌落长满整个平板观察菌落特征记录并拍照保存。此外，使用插片法在光学显微镜下观察分生孢子梗和分生孢子的特征，记录结果参见附图3所示。

由图3结果可知，菌株M6-5在PDA平板生长较快，3d即可长满全皿，初期在培养基表面形成白色致密的菌丝，生长7d后，菌落表面逐渐产生白色点状物，呈绒毛状，带有明显的椰子香气，背面为明显的黄色；分生孢子梗大小为 10.1-22.3μm×2.2-4.3μm，多为2个一组，由菌丝不规则伸出，分枝简单，互生呈树枝状排列，其基部缢缩，中间膨大，顶部变细；分生孢子为卵圆形，3.5～5.9 μm×3.0～4.0μm；厚垣孢子为圆形或椭圆形，大小为7.0～12.1μm×5.2～12.2μm。

基于以上生物学特征，将菌株M6-5属于常见的猬木霉(Trichoderma erinaceum)，公众可通过公知菌种保藏单位或其它公共渠道购买。

实施例2：猬木霉M6-5挥发物质的应用试验

1.猬木霉M6-5挥发物质对不同病原菌的影响试验

(1)试验方案

试验菌株：菌株M6-5为实验室前期分离纯化所得菌株，香梨黑斑病菌由新疆农业科学院植保所分离保存，水稻恶苗病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌由中国农业大学李健强教授赠予。

采用平板对扣法测定菌株M6-5挥发性物质的抑菌活性。用无菌打孔器分别取培养了7d的M6-5和供试菌株菌饼(直径0.8cm)，接于两块PDA平板正中央，去除培养皿的盖，将供试菌株培养皿置于下方，M6-5的培养皿扣在其上，对照组下方为无M6-5的PDA培养皿，用两层封口膜密封，防止挥发性物质外泄。30℃恒温培养，7d培养结束后观察记录结果，每组处理3个重复，抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％，具体结果参见附图4所示。

(2)数据结果与分析

由附图4数据可知，通过平板对扣试验发现，处理组中5种病原真菌的病斑直径都显著低于对照组，说明M6-5挥发性物质中产生了能够抑制它们生长的成份。菌株M6-5产生的挥发性物质对香梨黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata) 和番茄早疫病菌茄链格孢菌(Alternaria dauci(Kuhn)Groves et Skolkof.sp. solani)的抑制率分别为63.12±1.37％和59.67±0.30％，无显著性差异(p>0.05)，对水稻恶苗病菌串珠镰孢(Fusariummoniliforme Sheld.)、番茄灰霉病菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.Fr.)和棉花枯萎病菌尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑制率依次分别为50.81±3.00％、47.00±1.83％、32.65±2.56％。

2.菌株M6-5挥发性物质对香梨黑斑病菌链格孢的抑菌活性影响试验

(1)试验方案

采用平板对扣法测定不同生长时期的菌株M6-5挥发性物质对香梨黑斑病菌的抑菌活性。使用无菌打孔器取培养了7d的链格孢菌饼(直径0.8cm)，接于PDA平板正中央，去除培养皿的盖，将其与含链格孢菌饼的培养皿对扣在一起，用两层封口膜密封，此记为0d。待同一时间接于PDA的菌株M6-5培养至 5d、10d、15d、20d、25d时，对扣后置于30℃恒温培养，7d培养结束后观察记录结果，每组处理3个重复，抑制率＝(对照组菌落直径—处理组菌落直径) /对照组菌落直径×100％，具体结果参见表1和附图5所示。

(2)数据结果与分析

表2：不同生长时期的M6-5对香梨黑斑病菌链格孢的抑制率

不同生长时期的M6-5(d)	抑制率(单位：％)
		0	52.75±3.88c
5	82.48±1.17a
		10	76.86±2.54b
15	38.81±3.06d
		20	16.97±1.79e
25	－

注：不同英文小写字母表示0.05水平的显著性差异(P<0.05)；“－”表示无抑制效果。

由表2和附图5数据可知，随着生长时期的延长，M6-5挥发性物质对香梨黑斑病菌链格孢的抑菌活性呈现先上升后下降的趋势。在培养至5d时，M6-5 产生的挥发性物质对链格孢的抑菌率达最高，为82.48±1.17％。而培养至25d时， M6-5产生的挥发性物质对链格孢已无抑制效果。

3.菌株M6-5挥发性物质组成测定

(1)试验方案

萃取：将菌株M6-5接种到PDA平板上，在30℃下培养5d，将M6-5和 PDA培养基一同置于纯甲醇中提取(质量：体积比＝1：1)，超声提取30min，提取2-3次，合并萃取液，使用布氏漏斗抽滤出去菌体，收集滤液。旋转浓缩至初始体积的1/3，置于三角瓶中，加入无水硫酸钠(比例为10：1)，4℃过夜干燥脱水。再次过滤，收集滤液。

挥发性物质的提取：采用HS-SPME法，称取20g发酵液样品，放入100mL 带有硅胶垫帽的顶空萃取瓶中，于60℃水浴中预平衡15min后，推出老化过的萃取头，顶空吸附40min。取出萃取针头后进样，250℃解析5min。

挥发性物质的分析：GC-MS/MS分析条件；GC条件：SHIMADZU InertCap WAX色谱柱(30m*0.25mm*0.25μm)；程序升温：进样口温度为250℃，初始温度为35℃保持5min，以3℃/min升至100℃，再以4℃/min升至240℃，保持4min；进样模式：不分流进样；色谱柱流速：1mL/min。MS条件：电离方式EI；载气为He；离子源温度230℃；数据采集方式Q3 Scan；扫描范围 45-500m/z，测试结果见表2所示。

(2)数据结果与分析

由表2数据可知，采用顶空吸附法收集菌株M6-5在PDA生长至5d产生的挥发性物质，使用GC-MS/MS测定分析其组成成份，结果表明菌株M6-5共产生了65种挥发性物质，其中主要组分为6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇，2-烯丙基呋喃，棕榈酸甲酯等，分别占挥发性物质总量的40.12％，6.49％， 4.38％，4.13％，3.48％。

表3：菌株M6-5挥发性物质组成成份的GC-MS/MS测定结果

注：CAS#为0-0-0，说明该物质未被收录到NIST数据库中。此外，部分化合物没有通用的中文名称，化合物名称以CAS#和英文名称为准。

4.菌株M6-5产生的挥发性物质纯品对香梨黑斑病菌链格孢的抑菌活性影响试验

(1)试验方案

用无菌打孔器取培养了7d的链格孢菌饼(直径0.8cm)，接于PDA平板正中央，在另一个培养皿中加入一个灭过菌的2mL离心管盖子，用移液枪移取液体挥发物纯品(6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羟基丁酸乙酯、苯乙醇)，体积分别为 100.0、50.0、25.0、12.5、6.25、3.125μL，培养皿体积为80mL，扣除PDA培养基占用体积20mL，对扣后培养皿的体积为140mL，对应剂量分别为714.28、 357.14、178.57、89.28、44.64、22.32μL/L，于离心管盖子中，液体纯品组以离心管盖中不添加挥发物纯品为对照、固体纯品组以离心管盖中添加100μL无水乙醇为空白对照，去除皿盖后，迅速对扣好，用两层封口膜封住培养皿边缘。置于30℃下培养10d后，采用十字交叉法测量处理组和空白对照组菌落直径。每个处理3个平板。抑制率＝(对照菌落直径—处理菌落直径)/对照菌落直径 ×100％，准备购买到的6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羟基丁酸乙酯、苯乙醇、棕榈酸甲酯四种挥发性物质纯品，通过平板对扣检测其不同浓度对香梨黑斑病菌链格孢的抑制率，具体结果参见表3和附图6所示。

(2)数据结果与分析

由表4结果可知，6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羟基丁酸乙酯、苯乙醇均对链格孢具有一定的抑制作用，且表现出浓度效应，即随着浓度的升高，抑制率也呈现升高的趋势，在浓度为714.28μL/L时，抑制率分别为21.27±0.60％、41.43±2.36％、50.23±1.07％，三者之间存在显著性差异(P<0.05)。

表4：不同浓度挥发性物质纯品对香梨黑斑病菌链格孢的抑制率

注：不同英文小写字母表示0.05水平的显著性差异(P<0.05)。

由附图6结果可知，将浓度为714.28μL/L的3-羟基丁酸乙酯与苯乙醇组合，检测其对香梨黑斑病菌链格孢的抑制率，结果表明组合后效果优于单独使用3- 羟基丁酸乙酯和苯乙醇，通过测量，处理组病斑直径为2.38±0.14cm，对照组病斑直径为7.80±0.19cm，因此抑制率为69.38±2.42％。

5.菌株M6-5产生的挥发性物质对香梨黑斑病菌链格孢的抑菌效果试验

(1)试验方案

挑选成熟度一致(八成熟)、大小均一、无病虫害的库尔勒香梨果实，使用 3％的过氧化氢对香梨表面进行消毒，晾干备用。干燥器隔板下方放置两个生长至5d的菌株M6-5培养皿，去除皿盖后用玻璃纸封住表面，以排除菌株M6-5 孢子和菌丝的影响，对照组为生长至5d的PDA培养皿；采用打孔器在香梨果实赤道部位打孔一个，直径为0.8cm，深度为0.5cm；同时将生长至7d的链格孢打孔，取菌饼朝外放置于香梨预先打孔位置，然后放在干燥器(直径300mm) 隔板上方，每个处理组30个果实，每组处理3个重复，具体结果参见附图7所示。

(2)数据结果与分析

由图7数据可知，使用干燥器检测菌株M6-5产生的挥发性物质对接种链格孢后香梨果实的抑菌效果试验，熏蒸7d后，通过测量得到处理组的病斑直径为 1.45±0.06cm，对照组的病斑直径为2.53±0.08cm，处理组较对照组的病斑直径降低了42.46±4.44％，说明体内条件下，菌株M6-5产生的挥发性物质对香梨黑斑病具有一定的抑制效果。

综合以上数据，本发明基于猬木霉挥发性物质对生长至5d对链格孢的抑制率达到最大值，为82.48±1.17％；鉴定其挥发物质包括65个组分，对主要组分进行链格孢抑制试验，结果表明，其产生的高效抑菌挥发物6-戊基-2H-吡喃-2- 酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇，在714.28μL/L浓度下能够显著抑制链格孢的生长，抑制率为21.27-50.23％，表明猬木霉挥发性物质组合对链格孢生长的抑制显著优于纯化合物，可见，猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用具有显著的技术效果，利用猬木霉产生挥发物质可合理开发香梨黑斑病菌接抗菌剂和抑制香梨黑斑病菌的熏蒸剂，对于植物病害防控，尤其是香梨采后果实黑斑病防治具有重要的意义。

如上所述，即可较好地实现本试验，上述的实施例仅仅是对本试验的优选实施方式进行描述，并非对本试验的范围进行限定，在不脱离本试验设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本试验的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本试验确定的保护范围内。

序列表

<110> 新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆—亚美尼亚生物工程研究开发中心）

<120> 猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用

<141> 2021-12-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 609

<212> DNA

<213> 猬木霉(猬木霉（Trichoderma erinaceum）M6-5)

<400> 1

ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 60

atttcagaag ttgggtgttt tacggacgtg gacgcgccgc gctcccggtg cgagttgtgc 120

aaactactgc gcaggagagg ctgcggcgag accgccactg tatttcgggg ccgggatccc 180

gtctgagggg ttcccgatcc ccaacgccga ccccccggag gggttcgagg gttgaaatga 240

cgctcggaca ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc aaagattcga 300

tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt tcgctgcgtt cttcatcgat 360

gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgattcat tttgaatttt tgctcagagc 420

tgtaagaaat aacgtccgcg aggggactac agtaaagagt ttggttggtc cctccggcgg 480

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ctacggaag 609

<210> 2

<211> 912

<212> DNA

<213> 猬木霉(猬木霉（Trichoderma erinaceum）M6-5)

<400> 2

gttcttgatg aaatcacggt ggccgggagc gtctgtagag agtggcacgt taggataatg 60

attttcgaga tgtcaatgag gaaaccaaaa acataccaat gacggtgaca tagtacttgg 120

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cgacagagtc gatggcgata gggctcgagg aattggaggt tactcacggt ggtagacttg 720

ccggagtcga cgtggctgtt gtagcaagtc agtattggag tcgatcgaaa gctatatgga 780

gaaatacgaa cccctagacg actatggtca gcaaaatgtt atgcgcatca gtgtcaacgg 840

cagagagagt gccgctgacg agaggaatga gaaatgcaaa cttacgatga cgacgacgtt 900

gatgtgagtc tt 912

Claims

1.猬木霉(Trichoderma erinaceum)在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，其特征在于，所述的猬木霉能产生抑菌挥发性物质(volatile organic compounds，VOCs)。

2.如权利要求1所述的猬木霉在制备防治香梨黑斑病药物中的应用，其特征在于，具体应用方案如下：

首先分别准备供试拮抗菌株和病原菌，选用菌株猬木霉接种到PDA平板上，在30℃下培养7d，待菌落长满整个平板观察菌落特征，转接到新的PDA平板上，生长至5d时从培养箱中取出备用；将链格孢转接至PDA中，生长至7d时从培养箱中取出并打出菌饼备用；其次准备库尔勒香梨果实，挑选成熟度一致、大小均一、无病虫害的库尔勒香梨果实，使用浓度为3％的过氧化氢对香梨表面进行消毒，晾干备用；采用无菌打孔器在香梨果实赤道部位打一个直径为0.8cm，深度为0.5cm的孔；同时将链格孢菌饼朝外放置于香梨预先打孔位置，放置在干燥器(直径300mm)隔板上方，下方为2个含猬木霉的培养皿，去除皿盖后用玻璃纸封住表面，于21±1℃静置，M6-5产生的挥发性物质对制备防治香梨黑斑病药物应用具有较好的防治效果。

3.一种香梨黑斑病菌拮抗菌剂，其特征在于，香梨黑斑病菌拮抗菌剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质。

4.如权利要求3所述的香梨黑斑病菌拮抗菌剂，其特征在于，香梨黑斑病菌拮抗菌剂的挥发性物质包括65个组分，其产生的高效抑菌挥发物6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇。

5.如权利要求4所述的香梨黑斑病菌拮抗菌剂，其特征在于，香梨黑斑病菌拮抗菌剂的挥发性物质主要组分为6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇，2-烯丙基呋喃，棕榈酸甲酯分别占挥发性物质总量的40.12％，6.49％，4.38％，4.13％，3.48％。

6.一种抑制香梨黑斑病菌的熏蒸剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的熏蒸剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质。

7.如权利要求6所述的一种抑制香梨黑斑病菌的熏蒸剂，其特征在于，所述的熏蒸剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质包括65个组分，其产生的高效抑菌挥发性物质6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇。

8.如权利要求7所述的一种抑制香梨黑斑病菌的熏蒸剂，其特征在于，所述的熏蒸剂的活性成分为猬木霉产生的挥发性物质包括65个组分，其产生的高效抑菌挥发性物质6-戊基-2H-吡喃-2-酮，3-羟基丁酸乙酯，苯乙醇分别占挥发性物质总量的40.12％，6.49％，4.38％，4.13％，3.48％。