CN113564053A - 一种猬木霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猬木霉，该猬木霉的拉丁学名为Trichoderma erinaceum，菌株号TR1169B，保藏号为CGMCC No.21429。本发明还公开了一种氨基酸水溶肥，含有本发明猬木霉发酵产生的猬木霉发酵上清液。本发明通过发酵工艺，既解决了猬木霉工业废水的环境污染问题，又使废物得到再利用，产生了环境与经济的双重效益。本发明制备的氨基酸水溶肥不仅可以明显提高农作物的产量，改善农作物的品质，长期使用可以改良土壤环境以及增强植物的抗逆性和抗病性。

Description

一种猬木霉及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种猬木霉及其应用。

背景技术

木霉菌(包括“猬”木霉)是自然界中对多种植物病原菌有抑制和灭杀功能的微生物。人类利用木霉菌的优良特性，通过特定的工艺加工技术，将其制成不同剂型的生物农药和生物肥料。木霉菌分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的厚垣孢子、具有易贮藏和使用方便等特点，并且具有以下功效：防治多种植物病害，促进植物生长。

水溶肥是一种经水溶解或稀释，用于滴灌施肥、喷灌施肥、叶面施肥、无土栽培和浸种蘸根等用途的液体或固体肥料。因其具有速溶、施肥均匀、吸收率高、见效快、施用方便等显著优点，得到了迅猛的发展，随着国家对水肥一体化的大力推广，水溶肥市场规模和销量在逐年增加。截止到2015年6月1日，在农业部登记的水溶肥料品种有6545个，其中大量元素水溶肥料1383个，微量元素水溶肥料1668个，氨基酸的水溶肥料1630个，含腐植酸水溶肥料1527个，中量元素水溶肥料240个，有机水溶肥料97个。国内各种水溶肥料的产量相差较大，其中大量元素水溶肥料占68％，中量元素的占10％，腐植酸水溶肥料占12％，其他类型的占10％。

近年来，随着我国生物农药行业的迅猛发展，木霉菌相关产品增长势头强劲。目前生物农药企业多采用液体发酵技术，批量生产木霉菌制剂。在木霉菌类活体微生物制剂的生产过程中会产生大量发酵上清液，每生产1kg的木霉菌产品就有1.5kg的发酵上清液产生，这些上清液中含有多种微量元素，以及发酵过程中产生的小分子活性物质如多种氨基酸、发酵过程产生多种大分子活性物质如活性蛋白酶等。这些活性物质配以有机质能促进作物根系生长，增强作物抗逆能力，促进土壤中有益微生物代谢和生长，缓冲土壤酸碱度，提高土壤保水、保肥和通气能力，提高作物对土壤水肥的吸收，使植株生长健壮，根深叶茂，增加植株干重；促进叶片光合作用，使得果实光亮，促进中微量元素吸收，增加果实重量。然而目前木霉菌制剂生产工厂处理发酵上清液的正常流程是其经过三废处理排放进入环境，这样“简单粗暴”的处理方式，不仅造成一定程度的资源浪费，而且存在污染环境的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种猬木霉及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供猬木霉，所述猬木霉的拉丁学名为Trichodermaerinaceum，菌株号TR1169B，保藏号为CGMCC No.21429。

本发明的猬木霉(Trichoderma erinaceum)菌保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2021年01月13日。

本发明的第二方面是提供一种猬木霉发酵上清液，采用上述猬木霉(Trichodermaerinaceum)菌发酵，猬木霉发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将所述猬木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养；

步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24-36h，得到一级种子液；

步骤三，将中级发酵罐中的培养液高温高压灭菌，然后向所述中级发酵罐中倒入步骤二所得的所述一级种子液，加压通入无菌空气进行发酵6-10天，得到猬木霉发酵液；

步骤四，使用离心机将所述猬木霉发酵液进行离心，即得所述猬木霉发酵上清液。

进一步地，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

进一步优选地，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

进一步地，步骤三中，所述发酵的条件为：28～30℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/H空气流量和120～150rpm转速。

进一步地，步骤三中，所述高温高压灭菌的具体为：121℃、15磅压力下灭菌20min。

进一步地，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至28～30℃。

进一步优选地，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至30℃。

进一步地，所述中级发酵罐指的是大于1L而小于1吨规格的发酵罐，所述规格为本技术领域公知常识。

进一步地，在所述高温高压灭菌之前，向所述中级发酵罐内投入消泡剂；在100L规格发酵罐中消泡剂加入体积优选为50ml。

本发明的第三方面是提供一种氨基酸水溶肥，含有上述的猬木霉发酵上清液，包括如下重量百分比的组分：

上述氨基酸水溶肥采用如下方法制备：按照配比，按照配比，将所述猬木霉发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置，待搅拌彻底溶解后；再加入所述硝酸钾、EDTA-Mn、磷酸氢二钾、糖蜜粉、EDTA-Te、四水八硼酸二钠、氨基酸螯合锌，搅拌完全溶解后，过滤即得所述氨基酸水溶肥。。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明通过发酵工艺，既解决了猬木霉工业废水的环境污染问题，又使废物得到再利用，产生了环境与经济的双重效益。

本发明制备的氨基酸水溶肥不仅可以明显提高农作物的产量，改善农作物的品质，长期使用可以改良土壤环境以及增强植物的抗逆性和抗病性。

附图说明

图1为本发明猬木霉的分生孢子梗形态的电镜照片；

图2为本发明猬木霉的孢子形态的电镜照片；

图3为本发明猬木霉的PDA平板照片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供了一种猬木霉，从云南省西双版纳豆角根围土壤中分离得到，上述猬木霉的拉丁学名为Trichoderma erinaceum，菌株号TR1169B，保藏号为CGMCC No.21429。

本发明的猬木霉(Trichoderma erinaceum)菌保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2021年01月13日。

猬木霉的分类鉴定：

上述猬木霉菌株在PDA培养基上黑暗条件下25℃～35℃培养96小时菌落半径为65mm；在SNA上为35mm；在PDA和SNA上35℃为17～25mm。在PDA上黑暗条件下培养72小时能形成大量致密的分生孢子堆，菌苔平坦，具有同心轮纹，有形成平坦分生孢子簇的倾向；没有扩散性色素，有椰子气味。在CMD上，分生孢子苏平坦，发展不完全。菌落在SNA上与黑暗条件下培养96小时，产生平坦的直径为2～3mm的分生孢子簇，环绕在最初的接种点周围呈现同心轮纹状排列。

参照图1～图3，上述猬木霉菌株的分生孢子梗分枝与主轴的夹角近似90°，成对或者不成对产生，很少产生再次分枝，直接产生瓶梗，有时在顶端产生短的次级分枝。主轴的宽度为(1.8～)2.2～3.0(～3.5)μm。瓶梗产生于分枝的近基部，单生或者2～3个呈旋涡状排列，直，近似圆柱形，中间膨大，长度为(4.5～)6.0～8.0(～11.0)μm，最宽处为(2.3～)2.7～3.5(～4.3)μm，长宽比例为(1.4～)1.7～3.1(～4.2)μm。基部宽度为(1.0～)1.5～2.0(～2.5)μm，母细胞宽度为(1.8～)2.2～3.0(～3.5)μm。不产生间生瓶梗。在CMD上分生孢子为绿色，椭圆形至宽的椭圆形，(3.5～)4.0～4.7(～5.1)×(2.7～)3.0～3.5μm，长宽比例为(1.2～)1.3～1.5(～1.8)，光滑。有时候在分生孢子堆里面有黄色孢子。厚垣孢子为端生或者间生，球形至亚球形，(8.5～)10.0～13.0(～15.0)μm。在CMD上于气生菌丝上产生大量共无形性阶段。

猬木霉的分子生物学菌种鉴定：

将引物ITS4和ITS5扩增到ITS1-5.8S-ITS2区序列得到的序列段，通过NCBI GenBank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，该序列段与猬木霉的相似度达到99％。

ITS序列如下：

CTGGGCTTCTACTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGGATCCCGTCTGAGGGGTTCCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATAACGTCCGCGAGGGGACTACAGTAAAGAGTTTGGTTGGTCCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTATGGTTCACATTGGGTTTGGGAAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCGTACCTAGG

提供采用引物Ef728和Tef1αR扩增Tef1α序列得到的序列段，通过NCBI Gen Bank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，Tef1α序列与猬木霉的相似度达到98％。

Tef1α序列如下：

CATTTCCGCTTTTCTCTATGCATTCATAGCACAATCGTGTCGACAATTCTTGTCCTCAGACTTGTCGATTTTTCCTCACGGCGTCACACCCCGCTTTACCTGCCCTACCCCTCCTTTGGCTCAGCAAAAAAATTTTCTGGTTGCCTTGTTTGGTTTTTAGTGGGGTGCCAACTTTTTGGCAGCAACCCCGCTATCGCCACTGTCCTTCATCCATCATCCCAATGCCTTGTTCTCGCTCAATCGCATCGTCTTTTGCCTCAATTTATGATTCATTGTGCTAATCATGTTTCAACCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGAAAGGGTTCTTTCAAGTATGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTTGGTTTCCTCATTGACATCTCGAAAATCATTATCCTAACGTGCCACTCTCTACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTCATATCGCTGCCGTACGTGG

通过分子生物学菌种鉴定并结合形态特征，可确定本发明分离的菌株为猬木霉株。

上述猬木霉菌株的分生孢子阶段为半知菌门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属，其有性态是属于子囊菌门子囊菌纲。

实施例2

本实施例提供一种猬木霉发酵上清液，上述猬木霉发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将实施例1分离得到的猬木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养3天；

步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24h，得到一级种子液；

步骤三，将中级发酵罐中的培养液121℃、15磅压力下灭菌20min后，保持正压，冷却至30℃，然后向中级发酵罐中倒入步骤二所得的一级种子液，加压通入无菌空气，在28～30℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/H空气流量和120～150rpm转速条下进行发酵6天，得到猬木霉发酵液；

步骤四，使用离心机将猬木霉发酵液进行离心，即得猬木霉发酵上清液。

步骤二和步骤三中，上述培养液包括如下重量比的组分：

优选地，上述培养液包括如下重量比的组分：

实施例3

本实施例提供一种氨基酸水溶肥，分别对应含有上述实施例2中采用组别1-3培养液所得的猬木霉发酵上清液，分别包括如下(表1)重量百分比的组分：

表1

	实施例3-1	实施例3-2	实施例3-3
				猬木霉发酵上清液	50％	48.5％	39.5％
复合氨基酸粉	25％	18.5％	20％
				硝酸钾	5％	7％	9.5％
EDTA-Mn	2％	2.5％	4％
				磷酸氢二钾	4％	4％	6％
糖蜜粉	5.5％	8％	12％
				EDTA-Te	3％	2.5％	4％
四水八硼酸二钠	2％	5％	3％
				氨基酸螯合锌	3.5％	4％	2％

上述氨基酸水溶肥采用如下方法制备：按照配比，将猬木霉发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置，待搅拌彻底溶解后；再加入硝酸钾、EDTA-Mn、磷酸氢二钾、糖蜜粉、EDTA-Te、四水八硼酸二钠、氨基酸螯合锌，搅拌完全溶解后，过滤即得氨基酸水溶肥。

应用例

田间肥效试验：使用上述实施例3-1制备的氨基酸水溶肥开展对红雪梨的肥效试验。试验地点在云南省巍山县马鞍山乡进行，品种为巍山红雪梨，示范面积160亩，示范时间：2020年7月，试验方法：9升/亩/季。共设3种处理，分别是：无施肥对照、氨基酸水溶肥(本发明制备的氨基酸水溶肥)、氨基酸叶面肥(郑州树活力农业科技有限公司)，施肥后对梨树的叶片、树势、产量、品质、口感等方面进行检测。

实验结果表明：

(1)本发明的氨基酸水溶肥在红雪梨膨果转色期进行灌根7天左右，梨树的叶片明显转色，呈现出黑亮厚的特点，15-20天后，树势更加旺盛，叶片厚绿，有效的提高红雪梨的产量和产值(结果如表2所示)：

表2

处理	用量(kg/季/亩)	平均单果重(克)	平均单棵树产量(公斤)	亩产(公斤)
					含氨基酸水溶肥	9	268	159.6	3012
氨基酸叶面肥	9	259	153.2	2988
					无施肥对照	/	251	150.0	2676

(2)从表3上可以看出，使用过本发明氨基酸水溶肥的红雪梨，其糖分、维生素C、有机酸都要高于市售氨基酸叶面肥和无施肥对照，说明本发明的氨基酸水溶肥对红雪梨品质的提升有非常好的作用且果肉更细腻。

表3

检测项目	氨基酸水溶肥	氨基酸叶面肥	无施肥对照
				维生素C(mg/100g)	3.71	3.51	2.92
有机酸(mg/kg)	9.8×10<sup>3</sup>	8.9×10<sup>3</sup>	8.4×10<sup>3</sup>
				糖度(％)	15.6	15.2	13.5

(3)从土壤的检测数据(表4)可以看出，使用了本发明氨基酸水溶肥，土壤内的有机质含量、有效磷、速效钾、水解氮、阳离子交换量等都明显的增加，同时土壤容重降低，说明土壤疏松度、透气性更好。使用本发明的氨基酸水溶肥后能够有效的改善土壤环境，增加土壤养分，提高作物吸收养分能力。

表4

检测项目	氨基酸水溶肥	氨基酸叶面肥	无施肥对照
				PH	6.1	5.8	5.8
有机质(g/Kg)	78.1	63.1	52.0
				水解性氮(mg/kg)	351	288	224
有效磷(mg/kg)	32.5	27.1	26.8
				速效钾(mg/kg)	754	641	402
阳离子交换量(cmol/kg(+))	12.98	12.22	11.9
				容重(g/cm<sup>3</sup>)	0.74	1.0	1.23

(4)本发明氨基酸水溶肥在红雪梨生长过程中进行叶面喷施，对红雪梨叶部病害褐斑病具有一定的防治效果(如表5所示)。

表5

处理	用量	病情指数	防效
				氨基酸水溶肥	300-600倍	3.45	58.98
氨基酸叶面肥	300-600倍	5.06	13.89
				无施肥对照	/	5.29	/

上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种猬木霉，其特征在于，所述猬木霉的拉丁学名为Trichoderma erinaceum，菌株号TR1169B，保藏号为CGMCC No.21429。

2.一种猬木霉发酵上清液，其特征在于，所述猬木霉发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将所述猬木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养；

步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24-36h，得到一级种子液；

步骤三，将中级发酵罐中的培养液高温高压灭菌，然后向所述中级发酵罐中倒入步骤二所得的所述一级种子液，加压通入无菌空气进行发酵6-10天，得到猬木霉发酵液；

步骤四，使用离心机将所述猬木霉发酵液进行离心，即得所述猬木霉发酵上清液。

3.根据权利要求2所述的猬木霉发酵上清液，其特征在于，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

4.根据权利要求3所述的猬木霉发酵上清液，其特征在于，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

5.根据权利要求2所述的猬木霉发酵上清液，其特征在于，步骤三中，所述高温高压灭菌的具体为：121℃、15磅压力下灭菌20min。

6.根据权利要求2所述的猬木霉发酵上清液，其特征在于，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至28～30℃。

7.一种氨基酸水溶肥，含有如权利要求2-6任一项所述的猬木霉发酵上清液，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：

8.根据权利要求7所述的氨基酸水溶肥，其特征在于，采用如下方法制备：按照配比，将所述猬木霉发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置，待搅拌彻底溶解后；再加入所述硝酸钾、EDTA-Mn、磷酸氢二钾、糖蜜粉、EDTA-Te、四水八硼酸二钠、氨基酸螯合锌，搅拌完全溶解后，过滤即得所述氨基酸水溶肥。

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