CN114480165A - 一种高效解钾固氮菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效解钾固氮菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的高效解钾固氮菌的分类学命名为特基拉芽孢杆菌，菌株号为FTB‑K2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23347。本发明从土壤中分离出的特基拉芽孢杆菌FTB‑K2，具有较高的解钾能力，同时也具有很好的固氮能力，可以增加土壤中有效钾、可利用氮的含量，提高土壤中难溶性钾的利用效率；能够分解钾长石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，能作为微生物肥料，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。在土壤中具有较高的存活率，能应用于实际农业生产中。

Description

一种高效解钾固氮菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种高效解钾固氮菌及其应用。
背景技术
氮和钾是植物生长所必需的元素，缺一不可。氮对作物生长起着非常重要的作用，它是植物体内氨基酸的组成部分、是构成蛋白质的成分，也是植物进行光合作用起决定作用的叶绿素的组成部分。氮还能帮助作物繁殖。所以氮元素不仅能提高农产品的产量，还能提高农产品的质量。植物体内含钾一般占干物质重的0.2％-4.1％，仅次于氮。钾在植物生长发育过程中，参与60种以上酶系统的活化，光合作用，同化产物的运输，碳水化合物的代谢和蛋白质的合成等过程。
然而，我国大部分耕地的土壤全氮含量都在0.2％以下，为缺氮土壤，土壤中可直接利用钾的含量只占全钾的2％-10％，其余90％以上的钾是以矿物钾的形式存在，如存在于长石和云母等硅酸盐矿物中，这些矿物化学性质稳定，只有从矿物中释放出来才能被植物吸收利用。鉴于此，本领域大多采用施用富含氮、钾化肥的方式以满足作物对营养元素的需求，但是大量施用化肥会造成环境污染、土壤板结、地力衰退、农产品品质降低、土壤微生物数量减少、生态恶化、耕地土壤生态系统失衡等环境问题。因此，如何提高耕作田土壤中营养元素钾、氮的利用率，是本领域亟需解决的技术问题。从已有的文献报道来看，虽然已有相关固氮菌种和解钾菌种的报道，但是菌种的功效却差强人意，而且同时具备解钾、固氮功能的菌种较少，在土壤中的存活率也不高，不能应用于实际农业生产中。所以，筛选具有高效解钾固氮功能且可应用于实际农业生产中的野生菌株，对于我国农业的发展具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能为植物提供可以直接吸收利用的优质钾且可固氮的高效解钾固氮菌，可应用于实际农业生产中。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种高效解钾固氮菌，所述高效解钾固氮菌的分类学命名为特基拉芽孢杆菌，菌株号为FTB-K2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23347。
本发明还提供了一种上述高效解钾固氮菌在制备解钾固氮微生物肥料中的应用。
本发明还提供了一种上述高效解钾固氮菌在土壤解钾和/或固氮中的应用。
优选的，使用上述高效解钾固氮菌的发酵液用于土壤解钾和/或固氮。
优选的，所述发酵液的施用量为0.5-0.9L/m2。
优选的，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：将上述高效解钾固氮菌活化后，接种于发酵培养基中，28-32℃，培养20-28h。
优选的，所述活化的时间为22-26h。
优选的，所述活化用的活化培养基包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨8-12份，牛肉膏粉3-7份，氯化钠3-7份，琼脂10-14份，水800-1200份，pH 7.2-7.4。
优选的，所述发酵培养基包括按照重量份数计的如下组分：玉米浆干粉2-6份、牛肉浸粉4-10份、胰蛋白胨3-8份、复合无机盐0.5-0.9份、水1000-2000份，pH值6.8-7.3。
优选的，所述复合无机盐中KH2PO4：K2HPO4：MnSO4·H2O的重量比为2-4：1-3：1-5。
本发明的有益效果：
本发明从土壤中分离出的特基拉芽孢杆菌FTB-K2，具有较高的解钾能力，同时也具有很好的固氮能力，可以增加土壤中有效钾、可利用氮的含量，提高土壤中难溶性钾的利用效率；能够分解钾长石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，能作为微生物肥料，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。
本发明特基拉芽孢杆菌FTB-K2在土壤中具有较高的存活率，能应用于实际农业生产中，使用后有益微生物能够迅速定殖，分解活化难溶矿质元素，能将土壤中被固定的钾养分转化为可溶性的钾肥，供作物再次吸收利用，能大幅度提高肥料养分利用率。另外，本发明特基拉芽孢杆菌FTB-K2还能将土壤中被固定的氮转化为可供农作物直接吸收利用的氮，增加氮素来源，减少氮肥的融淋损失和挥发，刺激根系发育，增根养根。
保藏说明
本发明特基拉芽孢杆菌FTB-K2(Bacillus tequilensis FTB-K2)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年9月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23347。
附图说明
图1为FTB-K2的菌落形态图；
图2为显微镜下FTB-K2菌体图。
具体实施方式
本发明提供了一种高效解钾固氮菌，所述高效解钾固氮菌的分类学命名为特基拉芽孢杆菌，菌株号为FTB-K2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23347。
本发明特基拉芽孢杆菌FTB-K2是从河北省唐山市玉田县玉田镇纪家庄村玉米地土壤中筛选获得的。对筛选获得的FTB-K2菌株经形态鉴定和16S rRNA测序分析，确定为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)FTB-K2。在营养琼脂培养基上30℃有氧培养18h，菌体可以大量生长，菌落形态结果如图1所示，菌落呈不规则形态，边缘光滑湿润，不透明，微黄色，中间颜色较深、边缘较浅。显微镜观察发现菌体呈杆状，大小为0.6-1.0μm×2.0-4.0μm，芽孢呈椭圆倒柱状，长0.5-1.0μm，如图2所示。采用细菌16s RNA通用引物序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示：
27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)
1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，其中M代表简并碱基，M＝A/C，即表明M为A或C，对菌株FTB-K2进行扩增和正向测序，得到的序列长度为1380bp，具体序列如SEQ IDNO.1所示。
将测序结果在NCBI数据库中进行比对，最终鉴定筛选获得的样品为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)FTB-K2。
本发明还提供了一种上述高效解钾固氮菌在制备解钾固氮微生物肥料中的应用。
本发明还提供了一种上述高效解钾固氮菌在土壤解钾和/或固氮中的应用。
用本发明高效解钾固氮菌进行土壤解钾和/或固氮时，优选的是使用本发明特基拉芽孢杆菌FTB-K2的发酵液，所述发酵液的施用量优选为0.5-0.9L/m2，更优选为0.6-0.8L/m2。
在本发明中，特基拉芽孢杆菌FTB-K2发酵液的制备方法优选的包括如下步骤：将本发明高效解钾固氮菌活化后，接种于发酵培养基中，28-32℃，培养20-28h。
在本发明中，对特基拉芽孢杆菌FTB-K2进行活化的时间优选为22-26h，更优选为23-25h。特基拉芽孢杆菌FTB-K2菌种活化所用的活化培养基优选的包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨8-12份，牛肉膏粉3-7份，氯化钠3-7份，琼脂10-14份，水800-1200份，pH7.2-7.4，更优选的包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨9-11份，牛肉膏粉4-6份，氯化钠4-6份，琼脂11-13份，水900-1100份，pH 7.3。本发明对于上述各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
在本发明中，所述发酵培养基优选的包括按照重量份数计的如下组分：玉米浆干粉2-6份、牛肉浸粉4-10份、胰蛋白胨3-8份、复合无机盐0.5-0.9份、水1000-2000份，pH值6.8-7.3，更优选的包括按照重量份数计的如下组分：玉米浆干粉3-5份、牛肉浸粉6-8份、胰蛋白胨5-6份、复合无机盐0.7-0.8份、水1400-1600份，pH值7.1-7.2。本发明所述复合无机盐优选的由KH2PO4、K2HPO4和MnSO4·H2O组成，且三者的重量比优选为2-4：1-3：1-5，更优选为3：2：3-4。本发明对于上述各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
在本发明中，所述发酵培养的温度优选为29-31℃，所述发酵培养的时间优选为22-26h，更优选为24-25h。本发明所述发酵培养优选的采用摇床培养，所述摇床的转速优选为90-110r/min，更优选为100-105r/min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
特基拉芽孢杆菌FTB-K2的解钾能力测定
将特基拉芽孢杆菌FTB-K2接种于蛋白胨8g，牛肉膏粉3g，氯化钠3g，琼脂10g，水800g，pH 7.2的活化培养基中，活化22h，然后接种于玉米浆干粉2g、牛肉浸粉4g、胰蛋白胨3g、复合无机盐(KH2PO4：K2HPO4：MnSO4·H2O为2：1：1)0.5g、水1000g，pH值6.8的发酵培养基中，28℃，90r/min培养20h，得菌悬液。
配制解钾培养基(无水溶性钾离子)：葡萄糖5g、硫酸铵0.5g、酵母粉0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸氢二钠2g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、钾长石2g(含钾量11％-13％)、蒸馏水1L，搅拌均匀，调pH值至7.2，121℃高温灭菌15min。
500mL三角瓶，每瓶分装100mL解钾培养基，加入5mL菌悬液，以未接种菌悬液的为对照，每个处理重复5次。28℃、100r/min摇床培养10d后结束培养，培养液经4500r/min离心20min，收集上清液，加2mL 6％H2O2消煮1h，再离心，取上清液。用电感耦合等离子体光谱法测定上清液中水溶性钾含量，与对照处理进行比较，计算解钾菌的解钾量。
解钾量(mg/L)＝菌悬液中K+含量-对照液中K+含量。
得出菌悬液中水溶性钾离子含量为140-160mg/L，对照液中水溶性钾离子含量基本趋近于0，解钾率达60％以上，具有较强的解钾能力。
实施例2
特基拉芽孢杆菌FTB-K2的固氮能力测定
无氮培养基的配制：按重量份数计，培养基由下述成分：葡萄糖10g、磷酸氢钾0.2g、七水合硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、碳酸钙5g、硫酸钙0.1g、蒸馏水1000ml；调节培养基pH为72，121℃灭菌30min后备用；
将特基拉芽孢杆菌FTB-K2接种于蛋白胨8g，牛肉膏粉3g，氯化钠3g，水800g，pH7.2的活化培养基中，活化22h。实验组：取5ml活化后的特基拉芽孢杆菌FTB-K2菌悬液到含有100ml无氮液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃、80r/min振荡培养30d，重复15瓶。以未接种菌悬液的为对照组。在接种后2、4、6、8、10d取整瓶发酵液加入浓硫酸和30％H2O2在电炉上进行高温消解测定含氮量。结果如表1所示。
表1特基拉芽孢杆菌FTB-K2固氮量
Figure BDA0003426010960000061
由表1可以看出，特基拉芽孢杆菌FTB-K2能够用于固氮且固氮效果好。
实施例3
将特基拉芽孢杆菌FTB-K2接种于蛋白胨12g，牛肉膏粉7g，氯化钠7g，琼脂14g，水1200g，pH 7.4的活化培养基中，活化26h，然后接种于玉米浆干粉6g、牛肉浸粉10g、胰蛋白胨8g、复合无机盐(KH2PO4：K2HPO4：MnSO4·H2O为4：3：5)0.9g、水2000g，pH值7.3的发酵培养基中，32℃，110r/min培养28h，得实验组发酵液。
对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加特基拉芽孢杆菌FTB-K2。
在唐山市玉田县选取100m2小麦种植田，平均分成四块试验田，其中2块设定为实验组(按照0.5L/m2的施用量施用实验组发酵液)，2块设定为对照组(按照0.5L/m2的施用量施用对照组发酵液)，实验组和对照组均在小麦分蘖期进行施肥，实验组与对照组除了施用的发酵液不同外，其余田间管理等条件均相同。在小麦成熟期检测小麦产量等各指标，结果如表2所示。
表2特基拉芽孢杆菌FTB-K2对小麦产量的影响
Figure BDA0003426010960000062
由表2可以看出，本发明发酵液可以提高农作物产量。
实施例4
将特基拉芽孢杆菌FTB-K2接种于蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂12g，水1000g，pH 7.3的活化培养基中，活化23h，然后接种于玉米浆干粉4g、牛肉浸粉7g、胰蛋白胨6g、复合无机盐(KH2PO4：K2HPO4：MnSO4·H2O为3：2：3)0.8g、水1500g，pH值7.2的发酵培养基中，30℃，100r/min培养24h，得实验组发酵液。
对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加特基拉芽孢杆菌FTB-K2。
在唐山市玉田县选取50m2甜瓜种植田，平均分成5块试验田，其中3块设定为实验组(按照0.9L/m2的施用量施用实验组发酵液)，2块设定为对照组(按照0.9L/m2的施用量施用对照组发酵液)，实验组和对照组均在甜瓜坐果3天后施肥，实验组与对照组除了施用的发酵液不同外，其余田间管理等条件均相同。在甜瓜成熟期检测甜瓜维生素C和硝酸盐含量，结果如表3所示。
表3特基拉芽孢杆菌FTB-K2对甜瓜产量和品质的影响
处理 维生素C含量(mg/100g) 硝酸盐含量(mg/100g) 产量(kg/亩)
实验组 7.6±0.5 12.8±0.5 3333.5±15
对照组 3.8±0.2 18.5±0.3 1600.1±12
由表3可以看出，本发明发酵液在在提高农作物产量的同时还能提高农作物的品质，与未使用本发明菌剂的对照组相比，本发明的特基拉芽孢杆菌FTB-K2可使甜瓜的维生素C含量提高一倍，可使硝酸盐含量降低30.8％。
实施例5
实验组发酵液的制备过程同实施例4，对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加特基拉芽孢杆菌FTB-K2。
在唐山市玉田县选取100m2玉米种植田，平均分成5块试验田，试验设5个处理，其中处理1未施肥料即为空白对照，处理2按照0.9L/m2的施用量施用对照组发酵液，处理3施用本领域普通玉米专用肥0.05kg/m2，处理4施用本领域普通玉米专用肥0.05kg/m2和按照0.9L/m2的施用量施用实验组发酵液，处理5施用本领域玉米专用肥0.025kg/m2和按照0.9L/m2的施用量施用实验组发酵液。上述玉米专用肥由尿素70kg，磷酸二氢钾30kg，硝酸钾60kg，2,4-D1kg，4-碘苯氧乙酸1kg、硼砂1kg，钼酸铵1kg，硫酸锌1kg，硫酸铜1kg，硫酸锰1kg，硫酸亚铁1kg组成。5个处理组均在春播时进行一次性施肥，5个处理组除了施肥不同外，其余田间管理等条件均相同。在玉米成熟期检测玉米产量，结果如表4所示。
表4特基拉芽孢杆菌FTB-K2对玉米产量的影响
组别 产量(kg/亩)
处理1 600.1
处理2 666.7
处理3 1133.3
处理4 1933.4
处理5 1266.7
由表4可知，本发明特基拉芽孢杆菌FTB-K2菌剂与肥料混施，能够提高玉米的产量，当减施50％质量的普通玉米专用肥时，依然能够提高玉米的产量，说明本发明菌剂可以有效减少化肥的施用量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 沣田宝农业科技有限公司
<120> 一种高效解钾固氮菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcacgca 120
gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc 180
ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 240
atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt 300
gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 360
catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg 420
acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct 480
tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc tcaatccttg agttcagtct 540
tgcgaccgta ctccccaggc ggagggctta atgcgttagc tgcagcacta agggcggaac 600
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<211> 18
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<220>
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种高效解钾固氮菌，其特征在于，所述高效解钾固氮菌的分类学命名为特基拉芽孢杆菌，菌株号为FTB-K2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23347。
2.权利要求1所述高效解钾固氮菌在制备解钾固氮微生物肥料中的应用。
3.权利要求1所述高效解钾固氮菌在土壤解钾和/或固氮中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，使用所述高效解钾固氮菌的发酵液用于土壤解钾和/或固氮。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液的施用量为0.5-0.9L/m2。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：将所述高效解钾固氮菌活化后，接种于发酵培养基中，28-32℃，培养20-28h。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述活化的时间为22-26h。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述活化用的活化培养基包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨8-12份，牛肉膏粉3-7份，氯化钠3-7份，琼脂10-14份，水800-1200份，pH 7.2-7.4。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括按照重量份数计的如下组分：玉米浆干粉2-6份、牛肉浸粉4-10份、胰蛋白胨3-8份、复合无机盐0.5-0.9份、水1000-2000份，pH值6.8-7.3。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复合无机盐中KH2PO4：K2HPO4：MnSO4·H2O的重量比为2-4：1-3：1-5。
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