CN110628661A - 一株莫海威芽孢杆菌cjx-61及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的拮抗菌是从发病的马铃薯根际土壤中分离得到一株莫海威芽孢杆菌CJX‑61，该莫海威芽孢杆菌CJX‑61命名为Bacillus mojavensis。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.17660。莫海威芽孢杆菌CJX‑61具有产几丁质酶、纤维素酶、β‑1,3‑葡聚糖酶、蛋白酶、嗜铁素、HCN的能力。CJX‑61对尖孢镰刀菌、稻梨孢菌、核盘菌、串珠镰刀菌、油菜菌核菌、灰葡萄孢菌、禾谷镰孢菌、茄链格孢菌、接骨木镰刀菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制效果。莫海威芽孢杆菌CJX‑61能对马铃薯黑痣病具有很强的防御能力，还可在大田条件下提高马铃薯产量。

Description

一株莫海威芽孢杆菌CJX-61及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株莫海威芽孢杆菌CJX-61及其应用。
背景技术
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是继玉米、水稻和小麦之后的世界第四大重要粮食作物。其营养价值丰富，含有人体所需的8种必需氨基酸以及多种维生素。随着人们对马铃薯相关种植产业的重视，马铃薯的种植面积逐年扩增，与此同时土壤中病原微生物不断增加，从而影响马铃薯的正常生长。其中，由立枯丝核菌所引起的马铃薯黑痣病，是一种对马铃薯具有破坏性的土传疾病，严重损害马铃薯的产量和品质。目前主要采用化学试剂、农药等化学方法解决这一问题，但使用化学农药对人和畜以及环境都会带来不同程度的伤害，而且会造成病原菌抗药性上升、食品安全性降低等问题。微生物防治指的是在微生物的作用下通过寄生、溶菌、激活抗性等多种方式达到抑制病原物活性的病害防治方法。微生物防治具有资源充足、投入低、无污染等多重优势，微生物制剂已经成为目前的一个研究热点。植物根际促生菌（PGPR），广泛分布于植物根际土壤中，其生防菌类能够通过定殖于宿主植物、诱导植物系统抗性、分泌抗菌物质等多种机制来帮助宿主植物抵御病害。
芽孢杆菌是生防微生物的重要类群，也是自然界分布最广的微生物之一，其繁殖快、定殖能力强、营养要求简单，具有抑制多种植物病害和促进植物生长的作用。本发明从马铃薯根际土壤中,根据生防菌产蛋白酶这一特性，筛选出一株生防菌莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）CJX-61，对其进行鉴定，分析其产几丁质酶活力、β-1,3-葡聚糖酶活力、蛋白酶活力、纤维素酶活力、产嗜铁素能力和产HCN能力等生物学特性，并评价其对植物病原菌的抑制作用及对马铃薯黑痣病的防治效果，为进一步开发应用于农业的生防制剂奠定实践基础。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中防治植物真菌性病害的化学农药会造成环境污染严重的问题，提供一种绿色的抗病的生防菌剂的制备方法与用途。本发明提供一株稳定性好，并具有广谱抑真菌作用的莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）CJX-61对马铃薯黑痣病的生物防治菌。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明提供了拮抗菌是从发病的马铃薯根际土壤中分离得到一株莫海威芽孢杆菌CJX-61，该莫海威芽孢杆菌CJX-61命名为Bacillus mojavensis。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.17660。
该菌能够产几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶、产蛋白酶、产蛋白酶活力、产HCN。本发明公开了莫海威芽孢杆菌作为植物生物防治菌剂的应用。所述的菌剂为产几丁质酶的菌剂、产纤维素酶的菌剂、产β-1,3-葡聚糖酶的菌剂、合成嗜铁素的菌剂、产蛋白酶的菌剂、产HCN的菌剂中的一种或几种。
所述的菌剂为产几丁质酶的菌剂、产纤维素酶的菌剂、产β-1,3-葡聚糖酶的菌剂、合成嗜铁素的菌剂、产蛋白酶的菌剂、产HCN的菌剂中的一种或几种。
本发明公开了莫海威芽孢杆菌CJX-61作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的应用。
所述的菌剂为防治马铃薯黑痣病的菌剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供了一株莫海威芽孢杆菌CJX-61，该莫海威芽孢杆菌CJX-61命名为Bacillus mojavensis。于2019年4月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO.17660。
本发明莫海威芽孢杆菌CJX-61可以产几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、嗜铁素、HCN，其能对马铃薯黑痣病具有很强的防御能力。同时，CJX-61对尖孢镰刀菌、稻梨孢菌、核盘菌、串珠镰刀菌、油菜菌核菌、灰葡萄孢菌、禾谷镰孢菌、茄链格孢菌、接骨木镰刀菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制效果。
同时，莫海威芽孢杆菌制剂是生物制剂，且该菌株本身就分离自马铃薯的根际，弥补了化学药剂对环境产生二次危害的不足，它的使用不会带来一系列的环境问题，也有利于马铃薯的无公害生产，适于作为农业菌剂加以开发利用。
保藏说明
本发明对所述的莫海威芽孢杆菌CJX-61进行了下述保藏：
保藏时间：2019年4月30日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏号为。CGMCC NO.17660.
附图说明
图1为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）在LB培养基上的生长状况。
图2为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）与立枯丝核菌的平板对峙图。
图3为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）羧甲基纤维素酶的水解圈图。
图4为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产嗜铁素水解圈图。
图5为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产蛋白酶水解圈图。
图6为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产HCN能力图。
图7为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对9种植物病原真菌的抑制作用，其中：a：串珠镰刀菌；b：稻梨孢菌；c：禾谷镰孢菌；d：接骨木镰刀菌；e：茄链格孢菌；f：灰葡萄孢菌；g：核盘菌；h：尖孢镰刀菌；i：油菜菌核病菌；
图8为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）的发酵液对立枯丝核菌菌丝和孢子生长的抑制作用（40×）。
图9 施加过莫海威芽孢杆菌CJX-61马铃薯盆栽防效。
图10为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对处于开花期的马铃薯黑痣病植株的防治作用。
图11为莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对马铃薯黑痣病感染薯块的生物防治作用。
具体实施方式
下面结合具体的附图和实例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
下述实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施中的定量实验，均设置三次以上重复实验，结果取平均值。
一、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）的分离和鉴定
1、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）的菌株分离
（1）土样采集
供试马铃薯根际土壤取自黑龙江省农科院民主马铃薯种植基地，将获得的马铃薯根际土壤放入提前准备的保鲜袋中带回实验室4℃保存备用。
（2）菌株的筛选和纯化
称取5 g土样，加入盛有玻璃珠和45 mL无菌水的锥形瓶中，在培养摇床上剧烈振荡30 min（37℃）然后置于80℃的水浴锅中水浴保持15 min。用无菌水进行梯度稀释后涂布于PDA平板，37℃培养1-2 d，取培养基上生长的菌落，纯化并得到纯培养的菌株。根据生防菌可产蛋白酶这一特性，将筛选的菌株点接种于脱脂牛奶培养基进行初筛，观察是否产生水解圈，其次，利用平板对峙法评价筛选出的78株可产蛋白酶的生防菌株对立枯丝核菌的生防效果进行复筛，得到的一株芽孢杆菌命名为CJX-61，其抑菌率为70.73%。（如图1）。
2、菌株CJX-61的鉴定
（1）分子鉴定
对菌株CJX-61进行基因组DNA提取，然后进行16S rDNA的PCR扩增和测序。
PCR扩增所采用的引物为：
F8：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
F1541：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'
PCR扩增条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 90 s，30个循环；72℃10 min，4℃无限循环。对PCR扩增产物进行测序，测序结果如序列表所示。
（2）形态鉴定
参见图2，菌株CJX-61在PDA培养基上菌落不透明，表面干燥多褶皱，乳白色，圆形边缘整齐，不产色素。
（3）生理生化鉴定结果如表1所示：
表1：生理生化鉴定结果
注：+，阳性；-，阴性。
二、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产几丁质酶活力的测定
将菌株接种于胶体几丁质PDA培养基中，摇床发酵培养，10000 r/min离心10 min获得上清液。利用DNS法测定可产生水解圈菌株的几丁质酶活力。实验条件下，每毫升酶液中每分钟生成1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需酶量定义为1个酶活性单位。
检测结果表明，莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）的菌落周围有水解圈产生，几丁质酶活力为0.249 U/mL，说明菌株CJX-61具有生产几丁质酶的能力。
三、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产β-1,3-葡聚糖酶的能力测定
将菌株接种于β-1,3-葡聚糖酶产酶培养基中，摇床发酵培养，4000 r/min离心15min，获得上清液。利用DNS法测定可产生水解圈菌株的β-1,3-葡聚糖酶活力。实验条件下，每毫升酶液中每分钟生成1 μmol葡萄糖所需酶量定义为1个酶活性单位。
检测结果表明，莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）的菌落周围有水解圈产生，β-1,3-葡聚糖酶活力分别为0.203 U/mL，说明菌株CJX-61具有生产β-1,3-葡聚糖酶的能力。
四、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产羧甲基纤维素酶活力的测定
将菌株点接种到羧甲基纤维素酶鉴别培养基中，28℃培养2-4天，用刚果红溶液染色，氯化钠溶液脱色，观察菌落周围是否产生水解圈，若产生水解圈说明菌株可产羧甲基纤维素酶。
如图3所示，莫海威芽孢杆菌CJX-61可在羧甲基纤维素酶鉴别的培养基中产生水解圈，说明该菌株能产羧甲基纤维素酶。并对该菌株进行羧甲基纤维素酶活力定量测定，菌株CJX-61酶活力为0.178 U/mL。
五、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产生嗜铁素能力的测定
将菌株点接种到CAS固体培养基中，28℃培养48-72 h，观察菌落周围是否产生橘黄色透明晕圈，若产生橘黄色的透明晕圈说明菌株具有合成嗜铁素的能力。如图4所示，在菌株嗜铁素合成能力的定性实验中，莫海威芽孢杆菌CJX-61在CAS检测培养基中能产生橘黄色透明晕圈，即CJX-61菌株具有产嗜铁素的能力。并对该菌株进行嗜铁素合成能力定量测定，CJX-61可合成嗜铁素的相对含量为0.919。
六、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产蛋白酶的测定
将菌株点接种到脱脂牛奶培养基中，37℃培养24 h，观察菌落周围是否产生水解圈，若产生水解圈说明菌株可产蛋白酶。如图5所示，在产蛋白酶能力测定的定性实验中，莫海威芽孢杆菌CJX-61在脱脂牛奶培养基中能形成水解圈，即为CJX-61菌株可以产蛋白酶。该菌株进行蛋白酶活力定量测定结果为14.69 U/Ml。
七、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）产HCN能力的测定
菌株接种于含4.4 g/L甘氨酸的PDA固体培养基中，皿盖内部有浸有苦味酸溶液的无菌滤纸条，封口膜密封，37℃恒温培养2 d，观察滤纸条颜色变化。如图6所示，菌株CJX-61培养皿盖上浸有苦味酸溶液的滤纸条变为棕色，即CJX-61菌株具有产HCN的能力。
八、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对马铃薯黑治病的抑制作用
1、分离菌株拮抗植物病原真菌的平板对峙实验
莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）在PDA培养基上37℃活化后，将植物病原真菌（尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、稻梨孢菌（Pyricularia oryzae）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、茄链格孢菌（Alternaria solani）、油菜菌核病菌（Sclertinia sclerotiorum）、接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）用8mm打孔器打出菌柄置于PDA培养基中央，在距平皿边缘2 cm处接种菌株CJX-61，培养皿置28℃下培养3-5 d，观察菌落周围是否产生抑菌圈。
由图7可见，莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对9种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。
抑菌率计算公式如下：
表2 CJX-61对10种植物病原真菌生长的抑制作用
2、莫海威芽孢杆菌CJX-61发酵液对病原菌丝及孢子生长的抑制作用
PDA板活化立枯丝核菌，刮取培养基表面菌丝，接种于50 mL PDA液体培养基中。同时，取200 μL过夜培养的细菌发酵液也接入PDA液体培养基中。对照组不接种细菌发酵液，28℃震荡培养2 d。显微镜下观察，不同处理立枯丝核菌菌丝及孢子的生长情况。
如图8所示，液菌株CJX-61的发酵液对立枯丝核菌菌丝和孢子生长均有明显的抑制作用。在电子显微镜下观察，上图为对照组（CK），下图为接有CJX-61的发酵，对照组（CK）菌丝大量生长，边缘光滑，可见清晰的分支结构，并伴有大量孢子生成。与对照组（CK）相比，菌株CJX-61处理后的病原菌菌丝明显减少，菌丝体扭曲、折叠、菌丝量和孢子量也明显减少。
3、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对马铃薯黑痣病防治的盆栽试验
将在PDA固体培养基上培养的立枯丝核菌菌丝以0.2 g/kg的接菌量与灭好的土壤混合，装入花盆中，每个花盆装2.5 Kg混菌土，马铃薯提前催芽，处理组为0.5%的次氯酸钠溶液消毒并多次无菌水冲洗浸种在1×109 cfu/mL的CJX-61中（将细菌接种于LB液体培养基中，180 rpm 28℃摇床培养，离心获得菌体，用无菌水制成菌悬液，浓度为1×109 cfu/mL）。对照组用无菌水浸种，晾干，种植在盆中，苗期30d后调查病情。
苗期马铃薯黑痣病病情指数计算：
根据溃疡斑沿茎横向长度总和与地下茎周长的比例衡量发病程度。
计算公式为：
（1为溃疡斑横向平均长度，N为溃疡斑的个数，L为茎的周长）
分级标准如下：
0级：芽或地中茎没有溃疡斑，植株生长正常；1级：F为19%以下；2级：F为20～39%；3级：F为40～59%；4级：F为60～79%；5级：F为80～99%；6级：F为100%以上或植株枯萎死亡。
根据病情指数分级标准计算各处理组的病情指数和相对防效。
如图 9 所示，对照组用无菌水浸种，种植于混菌土中的植株染病程度较为严重，其地中茎形成大面积褐色病斑，病情指数高达63.89%。而生防菌CJX-61菌悬液防治马铃薯黑痣病效果最明显，相对防效高达52.17%。
4、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对马铃薯黑痣病防治的大田实验
利用生防细菌CJX-61的菌悬液浸种防治马铃薯黑痣病，对马铃薯植株黑痣病的防治效果明显。对照组用无菌水浸种，种植于混菌土中的植株染病程度较为严重，其地中茎形成大面积褐色病斑。
马铃薯黑痣病块茎分级标准：
0级：薯块没有溃疡斑；1级：病部面积占整个薯块面积的5%以下（含5%）；2级：病部面积占整个薯块面积的6%～10%；3级：病部面积占整个薯块面积的11%～25%；4级：病部面积占整个薯块面积的26%～50%；5级：病部面积占整个薯块面积的51%～75%；6级：病部相连，占整个薯块面积的76%以上。
根据病情指数分级标准计各处理组的病情指数和相对防效。
如图 10 所示，在马铃薯苗期，无菌悬液处理的对照组植株地中茎出现大面积褐色病斑，病害程度比较严重，接种分离的生防细菌菌悬液CJX-61的处理组则病害程度较轻。CJX-61相对防效为20.08%。
如图 11 所示，在马铃薯薯块收获期，用无菌悬液处理的对照组薯块上出现大面积不易被冲洗掉的、黑褐色或暗褐色的大小形状不均匀的土壤颗粒状的真菌休眠体，病害程度较为严重，病情指数达68.52%。而接种生防菌CJX-61的处理组病情指数轻，其相对防效为33.33%。
4、莫海威芽孢杆菌CJX-61（Bacillus mojavensis）对马铃薯田间有促生效果
为了评估生防细菌对田间马铃薯植株的促生效果，经分离的生防菌株CJX-61菌悬液接种后的处理组马铃薯产量与对照组相比，其增产率较对照组增加了14%。由此可见，利用分离菌株的菌悬液浸种具有一定的增产作用。
所以，该菌应用包括：
所述莫海威芽孢杆菌CJX-61具有合成羧甲基纤维素酶、嗜铁素、蛋白酶、HNC的能力。
所述莫海威芽孢杆菌CJX-61在防治马铃薯黑痣病的应用。
所述莫海威芽孢杆菌CJX-61在抑制多种植物病原真菌生长的应用。
所述莫海威芽孢杆菌CJX-61对田间马铃薯植株有促生增产效果。

Claims (8)

1.一株莫海威芽孢杆菌CJX-61，其特征在于，该莫海威芽孢杆菌CJX-61命名为Bacillus mojavensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17660。
2.权利要求1所述的莫海威芽孢杆菌CJX-61作为抑制植物病原真菌生长的菌剂的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为促蛋白酶合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂、促几丁质酶合成的菌剂、促β-1,3-葡聚糖酶合成、促HCN产生的菌剂中的一种或几种。
4.权利要求1所述的莫海威芽孢杆菌CJX-61作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的制备。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为促蛋白酶合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂、促几丁质酶合成的菌剂、促β-1,3-葡聚糖酶合成、促HCN产生的菌剂中的一种或几种。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为防治马铃薯黑痣病的菌剂。
7.权利要求1所述的莫海威芽孢杆菌CJX-61作为促进植物生长菌剂的应用。
8.权利要求1所述的莫海威芽孢杆菌CJX-61在制备用于促进植物生长菌剂中的应用。
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