CN106635872A - 一株莫海威芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株莫海威芽孢杆菌及其应用，属于环境微生物应用领域。本发明的莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）B1811，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.12805，保藏时间为2016年7月21日；能够用于降解邻苯二甲酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯的降解率可高达99.7%。本发明采用莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）B1811降解邻苯二甲酸二丁酯的方法，是在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与邻苯二甲酸二丁酯接触。与本发明之前细菌、真菌降解邻苯二甲酸二丁酯的方法相比，本发明降解邻苯二甲酸二丁酯的方法，在菌种来源上具有新意，其对邻苯二甲酸二丁酯的降解率较高，降解周期短，操作简单。

Description

一株莫海威芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株莫海威芽孢杆菌及其应用，属于环境微生物应用领域。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate），简称，DBP，属于邻苯二甲酸酯(Phhtalic Aicd Easters, PAEs)的一种，是一类重要的环境激素类有机合成化合物，具有色泽浅、挥发性低、气味小和耐低温等特点，是近年来产量最大、用量最多的增塑剂，广泛用于橡胶、塑料、香料等行业。

DBP与载体连接不稳定，极易扩散到环境中，可通过食物、空气、饮用水、化妆品等多种途径进入人体并富集。DBP对水生植物具有毒性效应，对动物雌激素具有显著干扰作用，能降低细胞膜表面蛋白的表达从而抑制巨噬细胞的吞噬能力，甚至诱导神经细胞凋亡，是一种重要的环境内分泌干扰物及致癌、致畸、致突变物质，引起了各国环保部门的高度重视。美国环保局（EPA）、欧盟以及中国国家环境监测中心均已将其列入优先控制污染物黑名单。我国也相应地规定了生活饮用水中DBP的最大检出浓度。

环境中DBP的分解、转化方法及技术探索已成为环境污染治理的重要研究方向。但是DBP在自然环境中的水解、光解速度非常缓慢，属于难降解物质。有研究表明，BBP的水相中光解半衰期长于100天^[1,2]。与水解及光解等物理降解相比，基于微生物代谢的生物降解过程具有功能微生物多样性、过程简单、成本低、环境友好等特点，使得微生物降解被认为是自然环境中DBP完全矿化的最有效途径^[1-3]。因此筛选高效分解以DBP为代表的PAEs类物质的微生物并阐明其分解代谢途径，对于深化有关消除DBP环境危害的研究及应用具有现实意义。

近年来，DBP的微生物降解已经得到广泛的研究，大量能高效降解DBP的菌株已经从各类环境中分离得到，包括红树林、土壤、海洋、河流与废水处理厂的活性污泥等，微生物类别包括大量细菌以及部分真菌。研究表明，不同来源以及不同类型的微生物在DBP降解途径方面具有较大差异性，所呈现的降解机制也不尽相同。所述降解机制包括发挥降解作用的关键酶及酶系、降解途径中的关键节点及关键影响因素、微生物自身代谢与降解效果之间的关系、微生物降解广谱性与特异性及其与DBP结构的关系等。

莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）主要应用在脂肪酶的发酵，目前未见有关利用莫海威芽孢杆菌降解DBP的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够降解邻苯二甲酸二丁酯的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株降解邻苯二甲酸二丁酯的方法。

技术方案

本发明从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；是杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；经鉴定，该菌株是一种莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）；命名为莫海威芽孢杆菌B1811；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号为CGMCCNo.12805；保藏时间为2016年7月21日。

本发明的莫海威芽孢杆菌B1811能够降解邻苯二甲酸二丁酯；莫海威芽孢杆菌B1811对邻苯二甲酸二丁酯的降解率可高达99.7%。

采用本发明的莫海威芽孢杆菌B1811降解邻苯二甲酸二丁酯的其中一种方法为：在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与DBP接触。其中，酵母提取物的量会影响降解率。所以，上述方法，优选的，在改良BSM 基础盐液体培养基存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与DBP接触；所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物1-8g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。

具体的，是将DBP加入改良BSM 基础盐液体培养基；将莫海威芽孢杆菌B1811种子液接种于改良BSM 基础盐液体培养基，在150-200 rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。

上述方法，优选的，改良BSM 基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为6g/L。

上述方法，优选的，培养条件为转速175rpm，温度30℃，其他条件相同情况下，此条件下菌B1811的降解率最高。

上述方法，莫海威芽孢杆菌 B1811种子液相对于改良BSM 基础盐液体培养基的接种量的变化，对单位时间内的DBP降解率有明显影响；通常情况下，接种量越多，单位时间内降解率越高；但是对最终降解率（发酵液中DBP含量达到稳定时的降解率）没有明显影响。

上述方法，所述莫海威芽孢杆菌B1811种子液是由莫海威芽孢杆菌B1811培养获得的。在获得莫海威芽孢杆菌B1811的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得莫海威芽孢杆菌 B1811种子液。

本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。

本发明所用专业术语说明：rpm是转速单位，1 rpm是指每分钟旋转一转。

有益效果：

（1）首次分离培养出能够降解邻苯二甲酸二丁酯的莫海威芽孢杆菌B1811；

（2）莫海威芽孢杆菌B1811对邻苯二甲酸二丁酯的降解率高达99.7%；

（3）本发明降解邻苯二甲酸二丁酯的方法，与本发明之前细菌、真菌降解邻苯二甲酸二丁酯的方法相比，在菌种来源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作简单。

保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中国科学院微生物研究所

保藏日期：2016年7月21日

保藏编号：CGMCCNo.12805

分类命名：莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。

附图说明

图1为本发明中所述莫海威芽孢杆菌B1811的显微镜下形态特征；图1中，莫海威芽孢杆菌B1811为杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；

图2为高效液相色谱法测得的DBP降解效果；图2中：a图是DBP空白对照的高效液相图谱，b图是DBP经过降解后的高效液相图谱；DBP基本在第7.825min出峰，降解后，DBP峰消失，说明基本降解完毕；

图3为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的16S rDNA序列系统发育分析；

图4为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的recA序列系统发育分析。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1菌株B1811的鉴定

菌株B1811分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16s rDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对。

(1)16S rDNA 序列分析：

16s rDNA正向引物27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,如SEQ ID NO.1所示；

16s rDNA反向引物1541R：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′，如SEQ ID NO.2所示；

扩增所得16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示，序列全长为1461bp。将该扩增所得16SrDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株Bacillus mojavensis RO-H-1T/JH600280同源性达99.8％。

(2)gyrB基因序列分析

gyrB-34F基因正向引物：5'-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3'，如SEQ ID NO.4所示；

gyrB-977R基因反向引物：5'-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3'，如SEQ ID NO.5所示；

扩增所得gyrB基因序列如SEQ ID NO：6所示，序列全长为887bp。将该扩增所得gyrB基因序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图4。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株B.malacitensis CECT 5687(DQ903179)同源性达99.5％。

因此可以判定B1811为一种全新的莫海威芽孢杆菌。经过鉴定确认其所属菌种后，莫海威芽孢杆菌B1811于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12805；此生物材料已经存活试验测试并通过该试验。

实施例2 莫海威芽孢杆菌B1811液体摇瓶培养液制备

（1）斜面培养：莫海威芽孢杆菌B1811接种于斜面培养基上，在40℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、琼脂 1.8g、蒸馏水余量，pH为中性，115℃灭菌20 min。

（2）取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175 rpm、30℃的条件下恒温震荡培养24h，得到种子培养液。所述种子培养基，每1L中含有的成分为：硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、琼脂粉15g、酵母提取物5g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌25min。

（3）将10μL的DBP（工业纯）以无菌操作加入含有50mL的改良BSM 基础盐液体培养基的摇瓶中，将莫海威芽孢杆菌B1811的种子培养液以1mL 的接种量接种到摇瓶中，在175r/min、30℃的条件下恒温震荡培养72h；得发酵液。所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有的成分为：酵母提取物5.0g、硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌15min。

实施例3 DBP 标准曲线制定与含量测定

（1）高效液相色谱法（HPLC）制作标准曲线：取600μL DBP以甲醇为溶剂，制备成1mg/mL的DBP溶液，稀释十倍后分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL 定容至2mL离心管中，即浓度梯度（μg/mL）为10、20、30、40、50、60、70 分别用0.45μm 有机滤膜过滤后置于液相小瓶中待测。本实施例3中的高效液相检测条件为：色谱柱为Sepax Gp-C18 柱（150mm*4.6mm，5.0μm）；流动相为乙腈-水（83：17，V/V）；进样量10μL；流速1.0mL/min；柱温25C°；紫外检测器波长210nm。以DBP的峰面积为横坐标，以DBP的浓度为纵坐标，制作标准曲线；进而获得峰面积-浓度方程。

实施例4高效液相法检测DBP的降解率

（1）向实施例2获得的发酵液中加入与发酵液等量的乙腈对DBP 进行提取，超声（40KHZ，300W）辅助提取30min后取其中2mL用乙腈定容至10mL，混合均匀后离心（12000rpm,10min），将离心后的上清液用有机滤膜（0.45μm）进行过滤，弃去初滤液，取续滤液置于液相小瓶中，以实施例3步骤（1）的检测条件，采用高效液相色谱仪（HPLC）进行分析。运行时间为20 分钟，读取保留时间在7 min左右的峰面积值。根据实施例3的峰面积-浓度方程，得续滤液中DBP的浓度，进而计算出发酵液中DBP的残留浓度。

（2）降解率的计算公式：降解率%= (C0-C)/C0*100%，C0 为用莫海威芽孢杆菌B1811降解之前DBP的总质量浓度（μg/mL）（即实施例2步骤（3）发酵之前摇瓶中混合液的DBP质量浓度：0.1713μg/mL），C 为发酵液中的DBP 的残留浓度（μg/mL）。经计算，实施例2的降解率为98.9%。

实施例5 莫海威芽孢杆菌B1811降解DBP的优化

将实施例2步骤（3）中的种子液接种量依次改为2、3、4、5、6mL，其他操作同实施例2。按照实施例4的步骤测定发酵液的DBP浓度，进而计算DBP的降解率。在不同接种量条件下，DBP降解率如表1所示。

实施例6

将实施例2步骤（3）中所用改良BSM 基础盐液体培养基的酵母提取物的含量依次修改为1、2、3、4、5、6、7、8g/L；其他操作同实施例2。按照实施例4的步骤测定发酵液的DBP浓度，进而计算DBP的降解率。在不同酵母提取物的含量条件下，DBP降解率如表2所示。

表1

种子液接种量（mL）	DBP降解率（%）
		0	0
1	98.9
		2	98.9
3	99.2
		4	99.3
5	99.2
		6	99.3

表2

酵母提取物添加量（g/L）	DBP降解率（%）
		0	0
1	97.5
		2	97.8
3	98.2
		4	98.7
5	98.9
		6	99.7
7	99.3
		8	99.4

<110>北京工商大学

<120>一株莫海威芽孢杆菌及其应用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

AAGGAGGTGA TCCAGCC 17

<210>3

<211>1461

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ATACATGCAG TCGAGCGGAC AGATGGGAGC TTGCTCCCTG ATGTTAGCGG CGGACGGGTG 60

AGTAACACGT GGGTAACCTG CCTGTAAGAC TGGGATAACT CCGGGAAACC GGGGCTAATA 120

CCGGATGCTT GTTTGAACCG CATGGTTCAA ACATAAAAGG TGGCTTCGGC TACCACTTAC 180

AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAATG GCTCACCAAG GCAACGATGC 240

GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC 300

GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC AACGCCGCGT 360

GAGTGATGAA GGTTTTCGGA TCGTAAAGCT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA GTACCGTTCG 420

AATAGGGCGG TACCTTGACG GTACCTAACC AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG 480

CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GGGCTCGCAG 540

GCGGTTCCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCC CGGCTCAACC GGGGAGGGTC ATTGGAAACT 600

GGGGAACTTG AGTGCAGAAG AGGAGAGTGG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA 660

GATGTGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGAGC 720

GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAGT 780

GCTAAGTGTT AGGGGGTTTC CGCCCCTTAG TGCTGCAGCT AACGCATTAA GCACTCCGCC 840

TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT 900

GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCTCTG 960

ACAATCCTAG AGATAGGACG TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC 1020

GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGATCTTA 1080

GTTGCCAGCA TTCAGTTGGG CACTCTAAGG TGACTGCCGG TGACAAACCG GAGGAAGGTG 1140

GGGATGACGT CAAATCATCA TGCCCCTTAT GACCTGGGCT ACACACGTGC TACAATGGAC 1200

AGAACAAAGG GCAGCGAAAC CGCGAGGTTA AGCCAATCCC ACAAATCTGT TCTCAGTTCG 1260

GATCGCAGTC TGCAACTCGA CTGCGTGAAG CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT 1320

GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAC GAGAGTTTGT 1380

AACACCCGAA GTCGGTGAGG TAACCTTTAT GGAGCCAGCC GCCGAAGGTG GGACAGATGA 1440

TTGGGGTGAA GTCGTAACAA G 1461

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ggTgTWRgKg CNgTCgTAAA Cg 22

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CCSgCAgART CACCCTCTAC g 21

<210>6

<211>887

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

AACGCGTTAT CAACAGAGCT TGATGTGACT GTTCACCGTG ACGGAAAAAT CCATCGCCAA 60

GTCTATAACC GCGGTGTCCC GGTTTCTGAT CTTGAGGTTA TTGGCGAAAC GGATCATACA 120

GGAACGACTA CACACTTTGT TCCAGATCCT GAAATCTTCA CGGAAACAAC TGAGTATGAA 180

TATGATTTGC TTGCTAACCG TGTTCGCGAA CTAGCCTTTT TGACAAAAGG CGTAAACATC 240

ACGATTGAAG ATAAACGTGA AGGCCAAGAG CGCAAAAATG AGTATCATTA CGAAGGCGGA 300

ATTAAAAGCT ATGTAGAGTA TTTAAACCGC TCCAAAGAAG TTGTCCATGA AGAGCCGATT 360

TATATTGAAG GCGAAAAGGA CGGCATTACG GTTGAAGTCG CTCTGCAATA CAATGACAGC 420

TACACAAGCA ATATTTACTC ATTTACAAAC AATATCAACA CGTACGAAGG CGGTACCCAC 480

GAAGCCGGTT TTAAAACGGG GCTGACTCGT GTCATCAATG ATTACGCCAG AAAAAAAGGA 540

CTCATAAAAG AAAATGATCC AAACTTAAGC GGAGATGATG TGAGAGAAGG GCTTACCGCG 600

ATTATCTCGA TCAAACACCC GGATCCGCAG TTCGAAGGCC AAACGAAAAC AAAACTAGGC 660

AACTCAGAGG CGCGGACGAT CACAGATACG TTATTTTCTG CTGCGTTGGA AACCTTTATG 720

CTGGAAAATC CAGATGCGGC CAAAAAAATC GTTGACAAAG GCTTAATGGC AGCAAGAGCA 780

AGAATGGCTG CGAAAAAAGC GCGTGAATTA ACGCGCCGCA AAAGTGCTTT GGAGATTTCA 840

AACCTTCCTG GTAAATTAGC GGACTGCTCT TCGAAAGACC CGAGCAT 887

Claims (9)

1.一株莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）B1811，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.12805，保藏时间为2016年7月21日。

2.根据权利要求1所述的莫海威芽孢杆菌B1811，其特征在于，属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢。

3.一种权利要求1或2所述莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）B1811的用途，用于降解邻苯二甲酸二丁酯。

4.一种采用权利要求1或2所述莫海威芽孢杆菌B1811降解邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于：在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与邻苯二甲酸二丁酯接触。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在改良BSM 基础盐液体培养基存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与邻苯二甲酸二丁酯接触；所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物1-8g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，改良BSM 基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为6g/L。

7.根据权利要求4、5或6所述的方法，其特征在于，将邻苯二甲酸二丁酯 加入改良BSM基础盐液体培养基；将莫海威芽孢杆菌B1811种子液接种于改良BSM 基础盐液体培养基，在在150-200 rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养条件为转速175rpm，温度30℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述莫海威芽孢杆菌B1811种子液是由莫海威芽孢杆菌B1811培养获得的。