CN105624046B

CN105624046B - 一种防治真菌病的黑木耳菌及其应用

Info

Publication number: CN105624046B
Application number: CN201610050570.0A
Authority: CN
Inventors: 肖炎农; 王娜; 杨波; 孟俊峰; 袁和奇; 王云鹤; 王高峰; 肖雪琼
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: CN105624046A

Abstract

本发明公开了一种防治真菌病的黑木耳菌及其应用，所述的黑木耳菌为Auricularia auricula‑judae DK6；保藏编号：CCTCC NO：M 2016054。利用该菌的发酵液，能有效地抑制灰霉病的发生和蔓延，在离体叶片试验中，DK6菌株发酵液对灰霉病的防效可达80%，能够有效地阻止病斑的扩展；室内盆栽试验结果表显示，DK6处理组的病斑均较小，病情指数较小，防效可达57%。生菜灰霉病田间防效（病情稳定期），DK6发酵液处理组对灰霉病的防效高达73%；而该菌的发酵产物也可高效抑制灰霉菌孢子的萌发，因此该菌株是一株极具开发潜力的灰霉病生防菌。

Description

一种防治真菌病的黑木耳菌及其应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种防治真菌病的黑木耳菌及其应用。

背景技术

蔬菜是人们日常饮食中必不可少的食物之一。蔬菜可提供人体所必需的多种维生素和矿物质等营养物质。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)引起的灰霉病是一种世界性真菌病害，该病已在全国各地普遍发生，且呈上升趋势，成为当前蔬菜生产上的重要病害。灰霉病菌寄主范围十分广泛，可侵染番茄、生菜、茄子、黄瓜、辣椒、草莓、葡萄、大蒜和柑橘等400多种作物，对蔬菜、果树及花卉等多种作物产生危害，在保护地果蔬生产中尤为突出。灰霉病自20世纪80年代开始在我国发生和蔓延，其传播速度快，对我国蔬菜生产具有极大的威胁，严重时可减产40％～50％，甚至绝产。

灰霉病在生产上已成为一类重要的顽固性病害，控制该病害的发生与蔓延是确保作物产量与品质而急需解决的问题。目前灰霉病的防治主要有以下3种方法，即生态防治、化学防治和生物防治。

栽培抗灰霉病的作物品种是一种重要的控制灰霉病病害发生的农业措施，但迄今为止市面上尚未有能投入生产应用的抗灰霉病作物品种。由于目前已报告的灰霉病抗性资源稀少，且大部分为多基因控制的复杂数量性状，灰霉病的抗病育种工作一直进展缓慢。

长期以来，我国农作物的病虫害防治主要依赖化学农药，农药污染较为严重，食品中农药检出率高达90％以上，这严重危害了消费者的身体健康。同时，由于食品农药残留问题导致我国农产品出口受阻，这对我国现代农业产业的发展构成了严重影响。因此，农药残留已成为食品安全生产中急需解决的问题。相比化学农药，生物农药具有安全、环保和无残留等优点。注重低毒、高效和选择性强的生物农药开发已成为当前的研究热点之一。

目前，许多研究者提倡并在重点研究开发利用生物防治技术来控制灰霉病害。生物防治措施既对环境友好，对人畜安全，又能有效控制病害的发生与蔓延所以颇受青睐。目前已报告的灰霉病菌拮抗细菌主要集中于芽孢杆菌(Bacillus spp.)、链霉菌(Streptomyces spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)等，对灰霉病生防效果较好的生防真菌主要有木霉(Trichoderma spp.)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)和酵母菌(Yeasts)。李小龙等发现淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)的发酵产物对灰葡萄孢菌有抑菌作用，且对番茄植株存在一定的促生效果，是一种新的防治番茄灰霉病的真菌生防因子。

至今关于丝状担子菌作为生防菌的报道较少，刘标等发现采绒革盖菌能够降解菊粉；李国红首次发现担子菌YL 14具杀线虫活性；肖逸等角担子菌B6的活菌丝能够改善土壤环境，提高西瓜植株的抵抗力，进而增加产量。有关丝状担子菌作为生防菌的报道更少，用其防治灰霉病暂未出现任何报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种黑木耳菌DK6(本发明或称为DK6菌株)，该菌株对灰霉菌有较强的防治效果。该菌株已于2016年1月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Auricularia auricula-judae DK6；保藏编号：CCTCC NO：M 2016054；地址：中国武汉武汉大学。

本发明的第二个目的是在于提供了一种黑木耳菌DK6在制备治疗或预防真菌病生物制剂药物中的应用，特别适合于植物灰霉病的防治。

本发明最后一个目的在于提供了一种黑木耳菌DK6在促进番茄生长中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种黑木耳菌DK6，通过以下方式获得：

申请人从中国湖北省十堰市玉米叶片上分离、筛选得到一株对灰霉病具有较强防治效果的菌株，将其命名为DK6。通过形态学及分子生物学的鉴定，鉴定为担子菌木耳属(Auricularia spp.)。该菌株已于2016年1月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Auricularia auricula-judae DK6；保藏编号：CCTCC NO：M 2016054；地址：中国武汉武汉大学。

DK6菌株菌落特征：菌落整体呈现白色。随着培养时间的增长，正反颜色出现不同，正面菌丝颜色逐渐变黄，且密布菌丝，菌丝与培养基结合不牢固，而背面出现淡黄色。随着时间的延长，淡黄色慢慢加深。菌丝无色,有隔膜，呈树枝状，分支菌丝互生，分支处有溢缩但不明显，与主枝菌丝角度小于90℃，菌丝末端钝圆；目前尚未观察到其孢子。

平板培养DK6使用的是PDA培养基，该培养基组分及配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；25℃，暗培养。

一种黑木耳菌DK6在制备治疗或预防真菌病生物制剂药物中的应用，包括利用该菌株作为有效成分之一制备成防治植物灰霉病的药物，所述的黑木耳菌DK6特别适用于防治番茄灰霉病和生菜灰霉病。

以上所述的应用，本发明的保护内容还包括，黑木耳菌DK6的发酵产物在制备灰霉菌孢子萌发抑制剂中的应用。

本发明的保护内容还包括黑木耳菌DK6在制备灰霉菌抑制剂中的应用。

一种黑木耳菌DK6在促进番茄生长中的应用，包括所述的黑木耳菌DK6发酵液用于制备番茄促生长制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明筛选出一株防治灰霉病的新菌株DK6，该菌株是担子菌木耳属，目前没有关于该菌株防治灰霉病的相关报道。

2.用该真菌的发酵液，能有效地抑制灰霉病的发生和蔓延。本发明筛选出的DK6菌株对灰霉菌在平板拮抗试验中，DK6能够覆盖到灰霉菌上继续生长，初步判定其与灰霉菌是竞争作用，为一株较好拮抗活性的菌株；在离体叶片试验中，DK6菌株发酵液对灰霉病的防效可达80％，能够有效地阻止病斑的扩展；室内盆栽试验结果表显示，DK6处理组的病斑均较小，病情指数较小，防效可达57％。生菜灰霉病田间防效(病情稳定期)结果表明，DK6发酵液处理组对灰霉病的防效高达73％，防效较高。

3.DK6发酵液对番茄种子的萌发试验中，DK6发酵液和DK6发酵产物对番茄种子的萌发没有促进作用；DK6发酵液对番茄生长的试验中，DK6菌株对番茄有较好的促生作用，在茎粗、株高、根长、鲜重、干重方面均与对照组有差异显著(5％水平上)。

4.本发明使用的菌株对番茄灰霉病防效较高，对人畜无毒；成本低；另外也适合对生菜灰霉病的防治。

5.本发明利用黑木耳菌DK6菌株的发酵液直接防治番茄灰霉病和生菜灰霉病，生产和使用均十分简单，生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，也不会产生溶剂中毒，具有生物农药对人畜安全的优点。

附图说明

图1为本发明分离筛选的DK6菌株的菌落形态。

图2为本发明分离筛选的DK6菌株的显微图片，100倍镜下的图片。

图3为本发明分离筛选的DK6菌株的rDNA-ITS区扩增序列电泳图。

方框内是DK6菌株的扩增序列。

图4为本发明分离筛选的DK6菌株对灰霉病菌株的拮抗作用和对照。

其中：4A是对照(未接种DK6菌株)，4B显示了DK6在PDA培养基上对灰霉病菌株的拮抗作用。

图5为本发明分离筛选的DK6菌株发酵产物对灰霉菌生长速率的影响(3d)示意图。

其中：5A是对照，5B是发酵产物浓度为1％的抑制结果，5C是发酵产物浓度为5％的抑制结果，5D是发酵产物浓度为10％的抑制结果。

图6为本发明分离筛选的DK6菌株发酵产物对灰霉菌生长速率的影响(7d)示意图。

其中：6A是对照，6B是发酵产物浓度为1％的抑制结果，6C是发酵产物浓度为5％的抑制结果，6D是发酵产物浓度为10％的抑制结果。

图7为本发明分离筛选的DK6菌株发酵产物对灰霉菌菌丝的影响，100倍镜下的结果图。

其中：7A是对照(不含DK6发酵产物的PDA培养基上灰霉菌菌丝的形态)；7B显示了含有DK6发酵产物的PDA培养基上灰霉菌菌丝的形态；7C显示了含有DK6发酵产物的PDA培养基上灰霉菌菌丝的形态。

图8为本发明分离筛选的DK6菌株发酵产物对灰霉菌孢子的影响示意图。

其中：8A是对照(未经DK6发酵产物处理，无菌水处理)；8B显示了经DK6发酵产物处理的灰霉菌孢子萌发情况。

图9为本发明分离筛选的DK6菌株发酵产物对灰霉菌孢子萌发和芽管长度影响的柱状图。

图10为离体叶片条件下DK6菌株对番茄灰霉病的抑制作用示意图。

其中：10A是对照(未经DK6发酵液处理，无菌水处理)，10B显示了DK6发酵液对番茄灰霉病的抑制作用。

图11为盆栽试验中DK6菌株对番茄灰霉病的防效示意图。

其中：11A是对照(未经DK6发酵液处理，无菌水处理)；11B显示了DK6发酵液对番茄灰霉病的抑制作用。

图12是生菜灰霉病田间防效，病情稳定期的生菜生长情况示意图。

12A是对照(未经DK6发酵液处理，无菌水处理)；12B显示了经DK6发酵液处理的生菜生长情况。

图13为DK6菌株对番茄种子萌发的影响。

其中：13A是对照(未经DK6发酵液处理，无菌水处理)；13B显示了DK6发酵液对番茄种子萌发的影响；13C显示了DK6发酵产物对番茄种子萌发的影响。

图14为DK6菌株发酵液对番茄生长的影响示意图。

其中：14A是对照(未经DK6发酵液处理，无菌水处理，左起三株)；14B显示了DK6发酵液对番茄生长的影响。

图15为DK6菌株发酵液对番茄生长的影响示意图。

其中：15A显示了DK6发酵液对番茄生长的影响；15B是对照(未经DK6发酵液处理，无菌水处理)。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

DK6菌株的分离及鉴定

1、分离地点、分离方法(传统微生物学的形态鉴定)

微生物特征

DK6菌株的分离：申请人从中国湖北省十堰市玉米叶片上分离、筛选得到一株对灰霉病具有较强防治效果的担子菌菌株，申请人将其命名为DK6。本发明的DK6菌株的分离和筛选采用组织分离法、稀释平板方法、平板拮抗、离体试验等方法，菌种鉴定工作参照《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，《真菌的形态和分类》(戴芳澜，1987)等专著中的试验方法。将DK6菌株于25℃培养10d，采用CTAB法(Taylor et al,1993)提取基因组DNA，采用真菌核糖体DNA通用引物ITS4和ITS5对其rDNA-ITS区进行扩增(章初龙和徐同，2003)。

DK6菌株形态鉴定结果：

DK6菌株菌落特征如图1显示：培养7d后,菌落直径约7cm，菌落整体呈现白色。随着培养时间的增长，正反颜色出现不同，正面菌丝颜色逐渐变黄，且密布菌丝，菌丝与培养基结合不牢固，而背面出现淡黄色。随着时间的延长，淡黄色慢慢加深。

显微镜检特征图2显示，菌丝无色,有隔膜，呈树枝状，分支菌丝互生，分支处有溢缩但不明显，与主枝菌丝角度小于90℃，菌丝末端钝圆；目前尚未观察到其孢子。

ITS的引物序列

正向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

反向引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′

序列分析表明，目的片段大小为675bp(图3)。扩增序列BLAST分析，可知其与黑木耳(Auricularia auricula-judae)高度同源。

该菌株已于2016年1月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Auricularia auricula-judae DK6；保藏编号：CCTCC NO：M 2016054；地址：中国武汉武汉大学。

培养DK6菌株使用的是PDB培养液，其组分及配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

摇瓶发酵参数条件：用内径为9mm打孔器打取DK6菌块接种，25℃，160rpm，摇培5d。摇培后成其发酵液。

实施例2：

DK6菌株与灰霉菌平板对峙试验：

用内径为9mm的打孔器打已活化好的灰霉菌接在PDA平板的一侧，另一侧接DK6菌株(内径9mm)，DK6菌株与灰霉菌之间间隔约5cm，在PDA平板一侧接种灰霉菌另一侧不接作为对照，重复3次。3～4d后观察对峙结果。试验结果见图4。

对峙试验结果显示：DK6菌株能够覆盖到灰霉菌上面继续生长，且在灰霉菌上生长的较为浓密，初步估计DK6菌株能够与灰霉菌竞争营养或者能够利用灰霉菌自身营养或其代谢产物继续生长，作用方式为营养竞争，为一株具有灰霉菌强抑制作用的菌株。

实施例3：

菌株DK6拮抗机理的初步分析

(1)DK6发酵产物对灰霉菌生长速率的影响

用内径为9mm打孔器打取DK6菌块，转入100mL PDB中，25℃，160rpm，摇菌5d。将制备好的发酵液经8，000r/min离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜抽滤，得到无菌发酵液即发酵上清液。将发酵上清液按1％(体积比)、5％、10％加入PDA中倒平板，每个平板上接直径为9mm的灰霉菌菌丝块，每个处理3次重复，3次平行试验，20℃培养，分别于3d、5d、7d测量灰霉菌的菌落直径并记录相关数据。试验结果为图5、图6。

图5结果显示，3d时，DK6菌株的发酵产物对灰霉菌的抑制作用较明显，处理组菌丝较对照组稀疏。与对照相比，1％、5％浓度的处理组，灰霉菌菌丝中央和边缘相对较密且不规则，10％浓度的处理组，灰霉菌菌丝中央较密，边缘较为稀疏。

图6结果显示，7d时，DK6菌株的发酵产物对灰霉菌的抑制作用不明显，但随着浓度的增加，抑制率相对增加。

表1 DK6发酵产物对灰霉菌生长速率的影响(20℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0 LSD法，P≤0.05)

DK6发酵产物对灰霉菌生长速率的影响表明：DK6菌株的发酵产物不能有效的抑制灰霉菌生长，但随着浓度的增加，抑制率有所增加，最高只能达到18.6％。同一时间段内，10％与5％浓度的抑制效果较好，两者的抑制率差异不显著，但10％浓度处理组与1％的处理组差异较为显著。同一浓度水平上，3d时，发酵产物对灰霉菌的抑制率均达到最高(表1)。

(2)DK6发酵产物对灰霉菌菌丝的影响

具体试验方法同(1)。3d时，显微镜下观察灰霉菌菌丝的形态变化。试验结果为图7。图7结果显示，DK6发酵产物对灰霉菌的菌丝形态均有一定的影响，与正常的灰霉菌菌丝相比，灰霉菌菌丝较粗，分支较短且较多，菌丝内部多呈现液泡，且颗粒相对较多。

(3)DK6发酵产物对灰霉菌孢子萌发的影响

用内经为9mm打孔器打取DK6菌块，转入100mL PDB中，25℃，160rpm，摇菌5d。将制备好的孢子悬浮液经8，000r/min离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜抽滤，得到无菌发酵液即发酵上清液。灰霉菌孢子液的制备同上。按照以下配比体系：发酵液：孢子液：水：PDB＝100：100：100：50(体积比)加入双凹载玻片中，20℃培养，4h后观察孢子萌发情况，每隔4h观察1次。

试验结果见图8、9。图8结果显示，DK6发酵产物对灰霉菌的孢子的影响较大，正常的灰霉菌孢子均已萌发且芽管很长，而DK6发酵产物处理的孢子几乎没有萌发，即使萌发，芽管相对对照组短。图9结果显示，DK6发酵产物对灰霉菌的孢子的影响很大，8h时，正常的灰霉菌孢子萌发率高达92.9％，芽管长度有34.8μm，而DK6发酵产物处理的孢子萌发率仅有3.7％，萌发的孢子芽管只有9.2μm(表2)。在5％水平上，8h萌发率和芽管长度两方面，对照组与DK6处理组均有显著差异。

表2 DK6发酵产物对灰霉菌孢子影响(3d，20℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0 t检验，P≤0.05)

以上结果表明：DK6发酵产物对灰霉菌的孢子萌发和芽管伸长的影响很大，8h时，在萌发率方面，正常的灰霉菌孢子萌发率高达92.9％，而DK6发酵产物处理的孢子萌发率仅有3.7％，；在芽管长度方面，正常的灰霉菌孢子芽管长度有34.8μm，DK6处理后萌发的孢子芽管只有9.2μm。在5％水平上，8h萌发率和芽管长度两方面，对照组与DK6处理组差异均较显著。

实施例4：

离体叶片测定：

用内径为9mm打孔器打取DK6菌块接种于已灭好菌的PDB中(每瓶100mL)，25℃，160rpm培养5d后备用。将田间采集的新鲜番茄叶片在流动的自来水中冲洗干净，自然晾干后将其浸入发酵液(8层纱布过滤后)浸泡30min，以无菌水浸泡作为对照，每个处理设10个叶片，3次重复。处理后，在每个叶片的相同位置接种培养2～3d后的灰霉菌尖端菌丝块，菌块直径为6mm。瓷盘内保持一定的湿度，盖上胶纸膜后置于20℃恒温光照培养室中，每天观察发病情况，并测量其病斑大小。试验结果如图10所示，离体叶片条件下抑制作用同样表现出较强的抑制作用。

表3 离体下DK6菌株对番茄灰霉病抑制率(3d，20℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0 t检验，P≤0.05)

离体叶片试验中，对照组在接种灰霉菌菌丝块，2d后便开始发病，3d时发病严重，病斑大小为5.5～4cm不等，而且发病叶片也已腐烂，未发病部分呈现萎蔫的现象。DK6发酵液处理组病斑平均大小为0.77cm，抑制率达到79.6％(表3)，进一步验证了DK6对灰霉病具有较强抑制作用。DK6发酵液浸泡的番茄叶片病斑较小，能够抑制番茄灰霉病。病斑大小方面，在5％水平上，与对照组病斑大小差异显著；抑制率方面，DK6发酵液对灰霉病的抑制率高达80％，抑制作用显著。

实施例5：

番茄灰霉病防效盆栽试验

将内径为9mm的DK6菌株接种于PDB中(每瓶100mL)，25℃，160rpm，摇床培养5d后成其发酵液，8层纱布滤出菌丝球后备用。用洗孢子的方法获得灰霉菌的分生孢子液，血球计数板计数后调整其浓度为10⁵个/mL备用。准备好长势一致的番茄幼苗(约20d)，喷洒DK6发酵液，每个处理喷20mL，24h后喷洒等量的灰霉菌孢子液，重复试验3次。试验处理2d后分别观察番茄幼苗的发病情况，按分级标准分级。试验结果如图11和表4。

叶片病害分级方法(以叶片为单位)

0级：无病斑

1级：病斑叶面积<叶面积的1/4；

2级：>1/4,<1/2；

3级：>1/2,<3/4；

4级：>3/4。

表4 番茄灰霉病防效盆栽试验结果(3d，20℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0 t检验，P≤0.05)

盆栽试验中，接种灰霉菌孢子液24h后，对照组番茄叶片上出现少量病斑且病斑较小，然后病斑慢慢扩展。而DK6处理组的生菜叶片2d后才有少量病斑出现，然后病斑才慢慢扩展。3d后，对照组出现较多的病斑，而提前喷了DK6发酵液处理的番茄叶片，其病斑较少，病斑面积相对较小，说明提前喷了DK6发酵液后，能够抑制灰霉病在番茄叶片上的生长和扩大，即DK6能够有效预防番茄灰霉病的发生。

实施例6：

生菜灰霉病大田防效试验

将内径为9mm的DK6菌株接种于PDB中(每瓶100mL)，25℃，160rpm，摇床培养5d后成其发酵液备用。用洗孢子的方法获得灰霉菌的分生孢子液，8000rpm离心5min，取上清液，血球计数板计数并将分生孢子液调至10⁶个/mL备用。处理组为DK6发酵液处理组(3个小区，每平方喷洒100mL发酵液)，另外设置3个空白对照。

提前浇水，用手动喷雾器将DK6发酵液均匀喷雾于生菜植株各部位，空白对照组只喷洒等量的清水。24h后，用手动喷雾器喷洒与DK6发酵液等体积的灰霉菌孢子液，均匀喷雾于生菜植株各部位，用塑料布将菜地盖上，保证湿度。于病情稳定期调查生菜的病情指数，并作相关的数据分析。

生菜灰霉病病叶严重度分级标准：

0级：叶片无病斑；

1级：病斑占全叶面积的5％以下；

3级：病斑占全叶面积的5％以上至10％以下；

5级：病斑占全叶面积的11％以上至25％以下；

7级：病斑占全叶面积的26％以上至50％以下；

9级：病斑占全叶面积的50％以上或叶片枯死。

病情指数＝(各级病叶数×相应的发病级数/总叶数×最高发病级数)×100

防治效果(％)＝(对照组平均病情指数－处理组平均病情指数/对照组平均病情指数)×100％

病情稳定期试验结果见图12。

表5 生菜灰霉病大田防效(病情稳定期)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0 t检验，P≤0.05)

生菜灰霉病田间防效(病情稳定期)结果见表5，经DK6发酵液处理小区的生菜病株率仅有72.5％，与对照组差异较大；病情指数明显低于对照组。DK6发酵液处理组生菜生长整齐健壮，病叶少，长势旺盛，病害相对较轻，DK6发酵液对生菜灰霉病的防效可达72.9％。结果表明DK6具备很好的生防价值，后期可以对其进行拮抗机制的研究，开发相关的菌剂并推广应用。

实施例7：

DK6发酵液及发酵产物对番茄种子萌发的影响

将DK6菌株接种于PDB中(每瓶100mL)，接内径为9mm的菌块。摇培5d后成其发酵液。8层纱布过滤后获得DK6发酵液，0.2μm细菌过滤器过滤发酵液获得发酵产物。发酵液、发酵产物获得后，调节其pH在7.0备用。挑选大小一致的番茄种子(中蔬四号)，先用无菌水浸泡20h后，分别放入发酵液(DK6)、发酵产物(DK6-f)中再浸泡20min，放入铺有湿润滤纸的培养皿中，28℃暗培养，定时加水，保持湿润每个处理50粒种子，重复3次。3d后观察种子的萌发情况，并记录相关数据。试验结果如图13，结果显示经DK6发酵液和发酵产物处理的番茄种子，5d后，萌发的番茄根长与对照组没有差异。番茄株高方面也没有差异。

表6 不同处理对番茄种子萌发的影响(5d，28℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0 LSD法，P≤0.05)

经DK6发酵液和发酵产物DK6-f处理的番茄种子，5d后，萌发的番茄根长与对照组在5％水平上没有显著性差异。鲜重方面(30颗番茄苗子总重)，DK6-f处理组最重，DK6组次之，对照组最低，且在5％水平上，三者之间差异显著。萌发率方面，DK6-f组萌发率达到56％，DK6组有51.5％左右(表6)，两者在5％水平上，差异不显著，而与对照组差异显著。

实施例8：

DK6菌株发酵液对番茄生长的影响

DK6发酵液的获得同实施例7。挑选大小一致的番茄种子(中蔬四号)，用DK6发酵液浸泡20min，将其播种在装有湿润营养土的穴盘中，每个处理15粒种子，重复3次。将其放在25℃、12h光照的温室内培养。分别于播种7d、14d后，每株番茄孔中注入2mL发酵液。40d后观察番茄生长情况，测量相关数据。

试验结果如图14、15，结果显示40d大小的番茄苗，相对于对照组来说，DK6发酵液处理的一组番茄长势更好，株高远大于对照组，两组在株高方面的显著差异

表7 DK6对番茄苗期的促生作用(40d，25℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0 t检验，P≤0.05)

将40d大小的番茄苗，拍照之后从土里拔出洗净晾干后测定的结果如表7，结果显示DK6菌株发酵液对番茄有较好的促生作用。茎粗方面，DK6处理组番茄茎粗有3.52mm，对照组番茄茎粗有3.07mm，两者在5％水平上差异显著。株高方面，DK6处理组番茄株高有18.12cm，对照组番茄株高有12.86cm，两者在5％水平上差异显著。根长方面，DK6处理组番茄根长有6.95cm,对照组番茄根长有4.97cm，两者在5％水平上差异显著。鲜重方面(15颗番茄苗子总重)，DK6处理组番茄鲜重有54.83g，对照组番茄鲜重有34.47g，两者在5％水平上差异显著。干重方面(15颗番茄苗子总重)，DK6处理组番茄干重有3.18g，对照组番茄干重有2.17g，两者在5％水平上差异显著。试验重复3次，3次试验结果比较一致，能够说明DK 6菌株对番茄的生长有很好的促生作用。

Claims

1.一种分离的黑木耳菌，其特征在于：所述的菌株为黑木耳菌(Auriculariaauricula-judae)DK6；保藏编号：CCTCC NO：M 2016054。

2.权利要求1所述的黑木耳菌在制备治疗或预防植物灰霉病制剂中的应用。

3.权利要求1所述的黑木耳菌的发酵产物在制备灰霉菌孢子萌发抑制剂中的应用。

4.权利要求1所述的黑木耳菌在制备灰霉菌抑制剂中的应用。

5.权利要求1所述的黑木耳菌在制备番茄生长促进剂中的应用。

6.根据权利要求2所述的应用，所述的植物为生菜或番茄。