CN105037513A - 一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用；所述疏水蛋白，包括如下(a)或(b)所示的氨基酸序列：(a)SEQ？ID？No：1所示氨基酸序列；(b)SEQ？ID？No：1所示氨基酸序列经过1～10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(a)所述蛋白质相同的功能；本发明还涉及一种编码所述木霉菌疏水蛋白的基因的序列，所述基因命名为Thhyd2。本发明将为获得高产孢率拮抗生防菌提供了重要的科学依据和技术支撑。

Description

一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用

技术领域

本发明涉及一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用，特别涉及木霉菌分生孢子合成及其合成调控相关基因，尤其涉及调控木霉分生孢子合成的基因在调控木霉菌分生孢子产量方面的应用。

背景技术

木霉作为一种重要的生防菌，广泛分布于几乎所有的温带及热带地区。木霉是一种非常重要的生防菌，具有促进植物生长、抑制病原菌生长、产生抗生素、次级代谢产物、诱导植物抗性等多种功能。目前研究较多的主要有5种具有生防潜力：哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、绿色木霉(T.viride)、康宁木霉(T.koningii)、钩状木霉(T.hamatum)和长枝木霉(T.longibratum)。尤其哈茨木霉菌得到研究者的越来越多的关注，Bigirimana发现哈茨木霉菌株T39接种蚕豆根部后，导致蚕豆对灰霉病菌的抗性明显提高。木霉菌分泌多种酶类，抗性物质，不仅能应用于工业生产(酶类)，而且能进行生物防治农业土传病害应用于农业生产。对于能增加分生孢子的一种疏水蛋白，也就能通过基因工程的手段增加木霉菌的生物量，即具有重要的应用前景。

疏水蛋白最早是研究细菌与寄主吸附机理时发现并提出的，泛指覆盖在微生物细胞表面的一些疏水物质(hydrophobicsubstances)。学者研究裂褶菌(Schizophyllumcommune)气生菌丝缺陷型thn时，发现其与sc3基因表达受到阻止相关，同时也找到了与sc3基因同源的其它子实体特异性基因。这类基因编码的蛋白组成的疏水性氨基酸含量较高，同时与细胞壁的疏水性密切有关，因而被称之为疏水蛋白。疏水蛋白的分子量一般比较小，约100个氨基酸，大小在10kDa左右，全部氨基酸中疏水的占一半样子，在保守位置上含8个半胱氨酸残基形成4对二硫键，氨基酸亲水-疏水性特征图谱决定了其具独特而相似的水缘性图谱特征。疏水蛋白包括两种类型，I型疏水蛋白能形成膜，同时它们仅能在有机溶剂和2％SDS中溶解，Ⅱ型疏水蛋白较容易溶解在60％甲醇或者2％SDS中。

研究孢子量调控是非常有意义的一项工作。孢子对真菌具有重要的作用，不仅对增加生物量占据生态位具有作用，而且对繁衍生殖孢子就要特殊的意义。疏水蛋白与产孢率的关系虽已报导，如禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)中Ⅱ类疏水蛋白Hyd5突变株FgΔhyd5的产孢子大小和孢子数量都变小了，但属致病菌相关研究；致病菌与生防菌属于不同的生物类群，生物学特性迥异，研究方案存在显著差异，致病菌疏水蛋白的研究在现实中不能给予生防菌研究以技术启示，而作为生防菌中的一种的木霉菌，其疏水蛋白与孢子产量的关系如何还属本领域空白，需要本领域技术人员进行针对性的探究。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于寻找与木霉分生孢子量相关的功能基因，提供一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用，进而提供一种增加孢子量的方法，为提高孢子含量木霉工程菌提供技术方法；所述基因命名为Thhyd2，该基因编码的蛋白具有典型的8个Cys基序并形成4对二硫键，且受逆境诱导表达。通过构建Thhyd2基因的过表达载体并转化到木霉菌中，成功过表达了木霉菌hyd2基因，所得的转基因木霉菌转化子分生孢子数增加，气生菌丝也有所增加。体外通过原核表达的方式对改疏水蛋白进行了表达，在培养基中添加表达的疏水蛋白，能够略微增加孢子量和气生菌丝。本发明将为获得高产孢率拮抗生防菌提供了重要的科学依据和技术支撑。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种木霉菌疏水蛋白(hydrophobin)，包括如下(a)或(b)所示的氨基酸序列：

(a)SEQIDNo：1所示氨基酸序列；

(b)SEQIDNo：1所示氨基酸序列经过1～10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(a)所述蛋白质相同的功能。

SEQIDNo：1所示由99个氨基酸残基组成，其中第80位至第99位氨基酸残基是hydrophobin2结构域；

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非所述结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加，以及对相关功能的检测可以通过本领域的常规技术来实现。

第二方面，本发明提供一种编码所述木霉菌疏水蛋白(hydrophobin)的基因的序列。

优选地，所述基因的cDNA序列如SEQIDNo：2所示。

本发明的木霉菌hydrophobin蛋白基因Thhyd2可以是其cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQIDNO：2所示的DNA序列。

第三方面，本发明提供一种所述基因在木霉菌工程菌株构建中的应用。

优选地，所述应用具体包括用于提高木霉工程菌株的分生孢子产量。

第四方面，本发明提供一种用所述基因提高木霉菌菌株分生孢子产量的方法，所述方法为：

通过重叠PCR的方法，将TrpC启动子序列、TrpC终止子序列和所述基因融合成过表达框；

将通过农杆菌介导的方法，将所述过表达框转化到木霉菌株中，即可获得分生孢子产量提高的木霉菌转化子、提高分生孢子产量。

优选地，所述过表达框的构建具体如下：

以SEQIDNo：11、SEQIDNo：12为引物扩增TrpC启动子序列，得片段1；

以SEQIDNo：13、SEQIDNo：14为引物扩增所述基因序列，得片段2；

以SEQIDNo：11、SEQIDNo：14为引物，以所述片段1、片段2为模板，融合扩增得所述片段1、片段2的融合片段1；

以SEQIDNo：15、SEQIDNo：16为引物，扩增TrpC终止子序列，得片段3；

以SEQIDNo：11、SEQIDNo：16为引物，融合扩增得所述融合片段1和片段3得所述基因的表达框。

第五个方面，本发明提供一种通过所述方法构建的木霉菌转化子。

优选地，所述木霉菌包括茨木霉菌为T.harzianumT28。

本发明的研究发现，木霉菌的Thhyds是受逆境的诱导而表达。通过融合PCR技术在木霉菌中过表达Thhyd2基因，获得转基因木霉转化子，检测发现这些转基因转化子中分生孢子的含量相对野生型要高很多。由此推测，利用转基因技术，过表达某些Thhyds，可为获得高分生孢子含量木霉工程菌种提供重要的科学依据。鉴于该类基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。

通过木霉菌转录组测序结果进行denovo拼接，利用所获得的木霉转录组数据以及NCBI公布的木霉基因组序列片段和EST片段进行曲霉同源hydrophobin的Blast分析，本发明的相关研究获得了一些木霉菌hydrophobin蛋白(Thhyds)成员。其中，设计引物克隆了Thhyd2的ORF全长序列(SEQIDNO：2)，其编码的蛋白序列如序列表中的SEQIDNo：1所示。序列分析结果表明，该蛋白含有保守的hydrophobin2结构域。其次，利用通过RT-PCR及Real-timePCR发现该基因是-C(缺碳源)和H₂O₂诱导而表达的(图1)。

基于上述研究，本发明通过过表达技术构建了Thhyd2基因的Overexpression转基因载体，成功获得了过表达在木霉菌细胞中表达的转基因转化子，所获得的转基因木霉转化子拥有分生孢子含量相对对照明显升高的表型。可见，利用转基因技术，过表达Thhyd2基因能够获得高分生孢子的转基因木霉菌，这使得高分生孢子的工程菌成为可能，为提高木霉发酵产物的产量提供了一种有效的技术手段。在本发明的一个具体实例中，首先，为构建Thhyd2的Overexpression表达载体，选择此基因cDNA读码框片段(序列表SEQIDNO：2)为Overexpression的表达序列，曲霉菌TrpC启动子序列(SEQIDNO：3)和TrpC终止序列(SEQIDNO：4)分别作为目的表达基因的引导序列和终止序列，设计引物分别获得上述三段序列，然后通过融合PCR技术使其形成一个完整表达框。如图2所示，该载体中的除了TrpC启动子引导表达Thhyd2表达盒之外，还有由TrpC启动子引导表达Hygromycin表达框的抗性筛选标记。之后，将此质粒转入农杆菌EHA105，并经由农杆菌将此质粒转入木霉菌T28中。进而，通过Real-timePCR方法对Thhyd2表达量进行了检测。结果显示，所获得的转基因转化子中Thhyd2的表达量明显增高(图3)。

针对Thhyd2-Overexpression木霉菌转基因转化子，利用血球板计数板测定了在28℃在SM和SM(缺碳源)培养基中培养6天，测定分生孢子的量。相比对照野生型孢子量，过表达转化子分生孢子量有提高明显(图4)。通过原核表达Hyd2蛋白，添加到5μMHyd2蛋白到SM培养基中，野生型木霉菌的分生孢子书有所增加(图5)。因此，本发明为获得提高分生孢子含量木霉工程菌提供重要的科学依据和技术支撑。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1、Real-timePCR检测低糖(A)和H₂O₂逆境下(B)Thhyd2的表达变化，其中：低糖、5mMH₂O₂条件下Thhyd2诱导表达明显，以Actin为内参；

图2、Thhyd2-Overexpression木霉表达载体构建示意图，该载体中，Thhyd2过表达引导和终止序列分别为TrpC启动子和终止序列，图中，RB、LB示序列的左右边界，Hyg示潮霉素抗性基因；

图3、木霉菌转化子的分子鉴定：所示为转化Thhyd2转化子转录水平的Real-timePCR鉴定结果，其中T28为本研究木霉菌野生型；

图4、木霉菌转化子分生孢子量检测：利用过表达技术在木霉菌细胞中表达，将野生型和过表达转化子分别在SM活化，然后将菌饼接到SM和-C(基本培养基SM中缺碳)平板于28℃培养了6天计分生孢子的量，Thhyd2-Overexpression转化子孢子数量增加显著，WT为木霉菌野生型T28对照；

图5、将hyd2构建到pET-28a上，转化到BL21(DE3)中，进行原核表达(A)，然后将表达的蛋白5μM添加到SM培养基中28℃培养野生型木霉菌，6天后计分生孢子的量，相对于对照添加了Hyd2蛋白的分生孢子数有所增加(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实验材料：哈茨木霉。木霉菌(Trichodermaspp.)是对多种病原菌具有拮抗作用的一类生防菌，其分布的生态系统非常广泛，是由许多的根际丝状真菌组成，按照经典分类系统其属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丝孢科(Hyphomycetaceae)本实施例涉及的哈茨木霉菌为T.harzianumT28(CCTCCAF2013026)(Yu.,etal..BiologicalRoleofTrichodermaharzianum-DerivedPlatelet-ActivatingFactorAcetylhydrolase(PAF-AH)onStressResponseandAntagonism.《PLOSONE》_。2014，第9卷(第6期)，e100367)，该菌株也保存于上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业(南方)重点开放实验。在PDA(Difco,BectonDickinson&Co.,USA)活化后，转接到SM培养基(0.68g/LKH₂PO₄，0.87g/LK₂HPO₄，1.7g/L(NH₄₎₂SO₄，0.2g/LCaCl₂，0.2g/LKCl，0.2g/LMgSO₄·7H₂O，2mg/LZnSO₄，2mg/LMnSO₄，2mg/LFeSO₄·7H₂O，20g/LGlucose，pH＝6.0)中培养收集菌丝用于提取RAN、DNA或者其它相关实验。

实施例1、不同处理材料RNA的提取

1、不同诱导处理木霉菌条件

木霉菌1×10⁶孢悬液在SM液体培养基中28℃培样，180rpm摇床中悬浮培养养4天，过滤无菌水冲洗3次，然后将菌丝转入到-C(SM缺碳源)和10mMH₂O₂中诱导0h、2h、12h和24h。过滤收集菌丝，液氮速冻转移到-80℃低温冰箱中保存，以用于Real-timePCR分析。

孢子含量检测实验材料：木霉菌首先在SM平板上活化，然后用打孔器打同样大小的菌饼，分别转入到SM、-C(SM缺碳源)和含10mMH₂O₂的SM平板上28℃倒置培样6天，用于孢子测定。

2、不同逆境处理木霉菌总RNA的提取

Trizol法提取细胞总RNA，首先加入1mLTrizol液到1.5mLRNAasefree离心管中，将木霉菌丝放入盛液氮研钵中研碎，加入150mg磨碎组织，上下颠倒混匀，加入预冷的氯仿，混匀后冰上静置5分钟，4℃离心13000g，11min，取新离心管加入等体积预冷的氯仿，轻柔混匀，4℃下13000g离心11min，吸取上清液后再用氯仿抽提一次，小心吸取上清到一新RNAasefree离心管中，加入2体积无水乙醇，-20℃放置1h，4℃，13000g离心13min，小心去掉上清，用600μL75％乙醇洗涤一次，离心去上清，室温干燥4min。加30μLDEPC水溶解RNA。

3、RNA质量检测

用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(ThermoScientificNANODROP2000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。

4、RNA样品中基因组DNA去除

用RNasefree的DNaseI消化RNA中的DNA，反应体系包括：10xRNase-freeDNaseBuffer10μL、RNaseinhibitor40unit、RNase-freeDNaseI2μL、RNA样品100μg，用RNasefreeH₂O补足体系至100μL。上述体系于37℃温育20min。DNA酶解反应结束后，加入100μLRNasefreeH₂O，加入200μL用水饱和酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，75％乙醇洗涤一次，室温晾干用20μLRNasefreeH₂O溶解消化完的RNA样品。

实施例2、hyd2全长cDNA的克隆

以在SM培养3天的木霉菌为T.harzianumT28的总RNA，反转录为cDNA，将此cDNA为模板PCR扩增hyd2全长序列。具体流程如下：

利用Takara公司的PrimeScript^TM1stStrandcDNASynthesisKit进行反转录，获得cDNA，配制反应体系I如下：1μLOligodTprimer、1μg总RNA、加RNasefreeH₂O到10μL，65℃孵育5min快速置冰上冷却。向上述变性液中加入4μL5×PrimeScriptBuffer、0.5μLRNaseinhibiior(40U/μL)、PrimeScriptRTase1μL最后加RNasefreeH₂O至20μL。混匀42℃反转录60min，95℃处理5min，置于冰上几分钟，用于PCR反应或保存于-20℃备用。

PCR扩增hyd2编码基因，根据Blast分析序列，设计全长引物，使用高保真DNA聚合酶扩增hyd2编码基因。反应体系如下：2×MaxDNAPolymerase20μL、上、下游引物各1μL(10μM)、cDNA1μL，用ddH₂O补充反应体系至40μL。

PCR反应条件：99℃预变性20sec；98℃变性10sec，57℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环，最后72℃延伸1min。

其中引物序列如下：

SEQIDNO：5(上游hyd2-F)：5’-ATGAAGTTCTCTGCCATCGCTCTCT-3’；

SEQIDNO：6(下游hyd2-R)：5’-TTACTGGGGGAGGGCATCCTGGCAC-3’

PCR产物采用捷瑞胶回收试剂盒进行纯化，用31μLddH₂O溶解，向溶解后的产物中加入4μL10×PCRbuffer、4μLdNTP、1μLTagpolymerase产物于72℃30min进行加A尾反应。取加A尾的产物4.5μL、0.5μLpMD19-Simplevector和5μLsolutionI在4℃连接过夜转化DH5α，得到质粒pMD19-hyd2。

质粒pMD19-hyd2的小量提取：使用北京天根生化公司质粒小提试剂盒(该试剂盒由溶液I、Ⅱ、Ⅲ组成)，挑取单克隆到5mLLB(含50μg/Kan)中37℃培养14h，12000rpm30sec收集3mL菌体。倒掉上清用250μL溶液I重悬菌体，再加入等体积溶液Ⅱ，轻柔地上下颠倒30sec使菌体裂解充分，最后加入350μL溶液Ⅲ，立即小心地上下颠倒5-6次，充分混匀，管中会产生白色絮状沉淀。13000rpm离心10min，用移液器将上清转移吸附柱中，室温放置1分钟，12000rpm离心30sec，去掉收集管中的收集液，加入500μL去蛋白液12000rpm离心30sec，再用漂洗液于12000rpm离心30sec漂洗2次，最后12000rpm空管90sec。37℃干燥8min，向吸附膜中加40μL预热的ddH₂O，12000rpm离心90sec，收集管中即为质粒DNA。

质粒pMD19-hyd2的PCR鉴定：通过PCR对hyd2的全长进行电泳鉴定，将得到有全长插入片段的阳性克隆，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(Genebank)，比对的结果此蛋白为微生物疏水蛋白(hydrophobin)，最终鉴定得到hyd2基因ORF的全长序列。

实施例3、胁迫下诱导hyd2基因的表达

1、Realtime-PCR引物设计

因同一家族基因序列类似性比较高，所以根据hyd2与其它hydrophobins的序列比对情况，该基因的C端同源性较高，用hyd2N端特异序列片段进行RealtimePCR引物设计，具体引物序列如下：

SEQIDNO：7(hyd2-F)：5′-GTTCTCTGCCATCGCTCTCT-3′；

SEQIDNO：8(hyd2-R)：5′-AGCGCCACAGCACTTGGGGA-3′

木霉菌内参为Actin，其引物为

SEQIDNO：9(Actin-F)：5′-GTATCATGATCGGTATGGGTCAGA-3′；

SEQIDNO：10(Actin-R)：5′-TAGAAGGTGTGGTGCCAGATCTT-3′

2、取材：木霉菌T28培养菌丝

诱导条件和时间：检测缺碳源(无葡萄糖)、和5mMH₂O₂条件下诱导0h、2h、12h和24hThhyd2的表达变化。

Trizol(Invitrogen)提取木霉总RNA，去DNA后，反转录为cDNA，将cDNA稀释-20℃待用，用EASYDilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-timePCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-timePCR反应在Roche96实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，95℃变性30s，接着40个循环：95℃20s；55℃20s；72℃20s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

采用法作相对定量分析。结果如图1所示，在不同诱导条件下处理木霉菌，分别在2h、12h和24h收集木霉菌丝，提取RNA，通过Real-time分析hyd2基因缺碳源条件下诱导表达，并随着作用时间的延长，基因的表达量逐渐增加，在24h达到最大值。

实施例4、hyd2过表达转基因木霉菌转化子的获得

为构建Thhyd2的Overexpression表达载体，选择此基因cDNA读码框片段(SEQIDNO：2)为Overexpression的表达序列，曲霉菌TrpC启动子序列(SEQIDNO：3)和TrpC终止序列(SEQIDNO：4)分别作为目的表达基因的引导序列和终止序列，设计引物序列如下，用引物A1(SEQIDNO：11)、A2(SEQIDNO：12)扩增TrpC片段，B1(SEQIDNO：13)、B2(SEQIDNO：14)扩增hyd2片段，以上面两片段为模板用引物A1、B2将上面两片段进行融合，将融合的片段在和用C1(SEQIDNO：15)、C2(SEQIDNO：16)扩增的TrpCterminato片段用引物A1、C2将三片段融合在一起成为一个完整过表达框，如图2所示。导入大肠杆菌DH5α挑取单菌落提取质粒，然后质粒转入农杆菌EHA105，并经由农杆菌ATMT方法将此表达框转入木霉菌T28中。进而，通过Real-timePCR方法对Thhyd2表达量进行了检测。结果显示，所获得的转基因转化子中Thhyd2的表达量明显增高。

SEQIDNO：11(A1TrpC-F)：5′-GTTGGATCCGAATTCATGCCAGTTGTTCC-3′

SEQIDNO：12(A2Trpc+hyd2-R)：

5′-GATGGCAGAGAACTTCATATCGATGCTTGGGTAGAA-3′

SEQIDNO：13(B1Trpc+hyd2-F)：

5′-TTCTACCCAAGCATCGATATGAAGTTCTCTGCCATC-3′

SEQIDNO：14(B2hyd2+terminator-R)：

5′-ATGATTTCAGTAACGTTAAGTTTACTGGGGGAGGGCATCCT-3′

SEQIDNO：15(C1hyd2+terminator-F)：

5′-AGGATGCCCTCCCCCAGTAAACTTAACGTTACTGAAATCAT-3′

SEQIDNO：16(C2Terminator-R)：

5′-GCTGGTACCAACCCAGGGGCTGGTGACG-3′

实施例5、hyd2过表达转基因木霉菌转化子分生孢子测定

木霉菌转化子分生孢子量检测：将过表达hyd2木霉菌转化子和WT为木霉菌野生型T28对照菌都接到SM平板上活化一次，然后分别打菌饼到新的SM平板和-C(基本培养基中缺碳)平板上，每个处理5个重复，然后将平板于28℃培养了6天计分生孢子的量，Thhyd2-Overexpression转化子孢子数量增加显著(图4)，WT为木霉菌野生型T28对照。

实施例6、在BL21(DE3)中原核表达Hyd2

接经测序正确阳性菌液到100mLLB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中，37℃，200rpm，培养至OD约为0.6，IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导4h。用50mL大离心管，6000rpm，离心5min，弃上清。沉淀用20mL冰冷的LysisBuffer(50mmol/LNa₃PO₄，300mmol/LNaCl)(pH8.0)溶液吹散，进行冰上超声：超5s，停10s，超100次，功率200W。电泳确定表达形式：取100μL超声后的菌悬液，4℃，10000rpm，离心10min。取40μL上清至另一EP管，同时将沉淀用40μLLysisBuffer(pH8.0)溶液吹散，两管分别加入10μL5×SDS-LoadingBuffer，100℃煮3min，12％SDS-PAGE检测为在沉淀包涵体中。

沉淀重悬于冰冷的pH7.4的PBS中，冰上超声200W3min，12000rpm离心20min，弃上清，重复一次。将沉淀重悬于含8M尿素、2mMGSH5mMGSSG的PBS中溶解包涵体，12000rpm离心20min，用恒流泵缓慢等体积加入含2mMGSH(谷胱甘肽)、5mMGSSG(氧化型谷胱甘肽)的PBS，约1mL/min，在冷凝柜中搅拌过夜，吸上清于PBS中透析，隔4h换一次液。取透析液12000rpm离心20min，收集上清过his柱，用2mL含有500mM咪唑的PBS洗脱2次。取透析液12000rpm离心20min，取上清浓缩，用milipore浓缩管测定浓度。然后将表达的蛋白Hyd2(5μM)添加到SM培养基中，28℃倒置培养木霉菌T28，6天后计算分生孢子数量，添加了Hyd2蛋白的分生孢子数有所增加(图5)。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种木霉菌疏水蛋白，其特征在于，包括如下(a)或(b)所示的氨基酸序列：

(a)SEQIDNo：1所示氨基酸序列；

(b)SEQIDNo：1所示氨基酸序列经过1～10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(a)所述蛋白质相同的功能。

2.一种编码所述木霉菌疏水蛋白的基因的序列，所述基因命名为Thhyd2。

3.根据权利要求2所述的基因的序列，其特征在于，所述基因的cDNA序列如SEQIDNo：2所示。

4.一种根据权利要求2所述基因在木霉菌工程菌株构建中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括用于提高木霉工程菌株的分生孢子产量。

6.一种用权利要求2所述基因提高木霉菌菌株分生孢子产量的方法，其特征在于，所述方法为：

通过重叠PCR的方法，将TrpC启动子序列、TrpC终止子序列和所述基因融合成过表达框；

将通过农杆菌介导的方法，将所述过表达框转化到木霉菌株中，即可获得分生孢子产量提高的木霉菌转化子、提高分生孢子产量。

7.根据权利要求6所述的提高木霉菌菌株分生孢子产量的方法，其特征在于，所述过表达框的构建具体如下：

以SEQIDNo：11、SEQIDNo：12为引物扩增TrpC启动子序列，得片段1；

以SEQIDNo：13、SEQIDNo：14为引物扩增所述基因序列，得片段2；

以SEQIDNo：11、SEQIDNo：14为引物，以所述片段1、片段2为模板，融合扩增得所述片段1、片段2的融合片段1；

以SEQIDNo：15、SEQIDNo：16为引物，扩增TrpC终止子序列，得片段3；

以SEQIDNo：11、SEQIDNo：16为引物，融合扩增得所述融合片段1和片段3得所述基因的表达框。

8.一种通过权利要求6～7任一项所述方法构建的木霉菌转化子。