CN109628323B - 绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂，涉及微生物农药领域。绿色木霉发酵方法，包括如下步骤：将绿色木霉LTR‑2接种至发酵培养基，发酵前期控制温度为29‑31℃，发酵后期控制温度为24℃‑26℃、pH为5.0～5.5，得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR‑2发酵液。采用本发明方法，能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液，显著提高产品的抗逆性，延长货架期；其水分散粒剂对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ‑1。

Description

绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂
技术领域
本发明涉及微生物农药领域，更具体地说是涉及绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂。
背景技术
木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。
绿色木霉菌（Trichoderma viride）在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉菌能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。在植物病理生物防治中具有重要的作用。绿色木霉菌是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，效果非常好。
大多数绿色木霉菌可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质，并能提高农作物的抗逆性，促进植物生长和提高农产品产量，因此被广泛用于生物防治、生物肥料及土壤改良剂。由于化学农药对环境的负面影响较为严重，所以对环境较为友好的绿色木霉菌受到了广泛的关注。
厚垣孢子（chlamydospore）又称厚壁孢子。它是由菌丝中间的个别细胞膨大，原生质浓缩和细胞壁变厚而形成的变态菌丝，既不是无性孢子，也不是有性孢子。厚垣孢子呈圆形、纺锤形或长方形，它是真菌度过不良环境的一种休眠细胞，寿命较长，菌丝体死亡后，上面厚垣孢子还活着，一旦环境条件好转，又能萌发成菌丝体。
分生孢子（conidiospore）是真菌中常见的一类无性孢子，是生于细胞外的孢子，所以称为外生孢子。分生孢子着生与已分化的分生孢子梗（conidiophore）或具有一定形状的小梗上，也有些真菌的分生孢子就着生在菌丝的顶端。
跟分生孢子相比，厚垣孢子存在抗逆性强、货架期长等优点，但是现有技术发酵培养绿色木霉LTR-2，仅能得到富含分生孢子的发酵液。
发明内容
本发明的目的是提供绿色木霉发酵方法，能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液，显著提高产品的抗逆性，延长货架期。
本发明的再一目的是提供绿色木霉的水分散粒剂。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
绿色木霉发酵方法，包括如下步骤：将绿色木霉LTR-2接种至发酵培养基，发酵前期控制温度为29-31℃，发酵后期控制温度为24℃-26℃、pH为5.0～5.5；发酵结束后，得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液；所述发酵培养基含有如下成分：玉米粉18～22g/L、葡萄糖8～12g/L、磷酸二氢钾7～8g/L、碳酸钙4～6g/L、硝酸钠0.8～1.2g/L、硫酸铵1～2g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、七水硫酸亚铁0.4～0.6g/L、硫酸锰0.15～0.25g/L、硫酸锌0.15～0.25g/L，pH为6.0～7.0。
在本发明中，所述发酵前期是自发酵开始至发酵后65-72h，发酵后期是发酵后72h-发酵后178h。
在本发明中，将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基。
在本发明中，所述发酵液是将绿色木霉LTR-2接种至液体种子培养基，在25-30℃条件下培养2~3d，得到绿色木霉LTR-2种子液；所述液体种子培养基是将马铃薯切块，加蒸馏水，煮沸后取滤液，加入葡萄糖，搅拌后所得。
本发明还提供采用上述方法得到的发酵液。
本发明还提供绿色木霉分散粒剂，采用如下方法制备：
（1）将富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液浓缩；
（2）在浓缩液中添加润湿剂、分散剂、崩解剂和填料，混合均匀后，粉碎、造粒、干燥、筛分，得到所述水分散粒剂。
优选的技术方案中，所述润湿剂为十二烷基硫酸钠、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、萘磺酸盐和十八烷基丁二酸钠中的一种或两种以上；所述分散剂为木质素磺酸盐、萘磺酸钠甲醛缩合物、烷基酚乙氧基化合物、多芳基酚乙氧基化磷酸酯、EO–PO嵌段共聚物和聚羧酸盐中的一种或两种以上；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡络烷酮、交联羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上；所述填料为粘土、高岭土、膨润土、白炭黑、硅藻土、滑石粉中的一种或两种以上。
优选的技术方案中，所述绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂中润湿剂的质量百分含量为1~5%、分散剂的质量百分含量为2~10%、崩解剂的质量百分含量为2~5%。
在本发明中，所述绿色木霉分散粒剂中绿色木霉LTR-2含量至少为25×108cfu/g。
采用本发明绿色木霉发酵方法，能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液，显著提高产品的抗逆性，延长货架期。本发明绿色木霉的水分散粒剂，能够使绿色木霉LTR-2进入水中分散并防止重新再聚集，保证呈悬浮状态，对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ-1。
具体实施方式
实施例1绿色木霉LTR-2厚垣孢子发酵液的制备
本实施例介绍了绿色木霉LTR-2厚垣孢子发酵液的制备。
1、绿色木霉LTR-2的活化
从绿色木霉LTR-2的斜面中，用无菌接种针挑取部分菌苔至已预制好的含有PDA固体培养基的茄子瓶中，30℃培养2d，得到活化的绿色木霉LTR-2。
2、绿色木霉LTR-2种子液的制备
用无菌接种针挑取活化后的绿色木霉LTR-2菌苔，接种到装有100mL液体种子培养基的三角烧瓶（500mL规格）中。培养条件：在28℃、100~150r/min的摇床中，遮光震荡培养2~3d，得到绿色木霉LTR-2种子液。
其中液体种子培养基采用如下方法制备：将300g去皮马铃薯切块，加800mL蒸馏水，煮沸10～20min，用纱布过滤，在滤液中加入20g葡萄糖，搅拌至葡萄糖溶解后，补加蒸馏水至1000mL，分装后121℃高压灭菌20min。
3、制备绿色木霉LTR-2发酵液
发酵培养基含有如下成分：玉米粉20g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾7.5g/L、碳酸钙5g/L、硝酸钠1g/L、硫酸铵1.5g/L、氯化钠1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸锌0.2g/L，pH为6.5。
按照2%的接种量将绿色木霉LTR-2种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中。发酵前期（自发酵开始至发酵后72h），控制发酵温度为30℃、转速150r/min、通气量为1VVM；发酵后期（发酵后72h至发酵后168h），控制发酵温度为25℃、转速150r/min、通气量为1VVM，通过流加稀酸控制发酵液pH为5.0～5.5。发酵结束后，得到厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液。
去掉上述发酵培养基中的七水硫酸镁和七水硫酸亚铁，其他培养基成分和含量不变，作为对照发酵培养基。按照2%的接种量将绿色木霉LTR-2种子液接入装有对照发酵培养基的发酵罐中。整个发酵过程，发酵温度一直控制在30℃、转速150r/min、通气量为1:1；一直持续到发酵结束，得到分生孢子含量为5×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2菌液，几乎无厚垣孢子产生。
实施例2 绿色木霉LTR-2水分散粒剂的制备
在厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液（实施例1制备）中，加入助滤剂后通过过滤或加入絮凝剂后离心得到厚垣孢子浓缩物。例如：向1200kg厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液中加入絮凝剂聚丙烯酰胺（按照2g/kg的比例添加），混合均匀后，在蝶式离心机中，5000rpm转速下离心浓缩，取沉淀，得到210kg厚垣孢子浓缩物。
在210kg厚垣孢子浓缩物中，添加1000目的高岭土（填料）290kg，再添加十二烷基硫酸钠（润湿剂）10kg、木质素磺酸钠（分散剂）25kg和羧甲基淀粉钠（崩解剂）15kg，在混合罐中混合60min以上，搅拌均匀。将得到的混合物通过气流粉碎，挤压造粒，通过流化床干燥（进风温度80~90℃，出风口温度40~50℃），过筛除去过大和过小的颗粒，得到直径为0.5～1mm、长1～5mm的绿色木霉LTR-2水分散粒剂。该水分散粒剂中，绿色木霉LTR-2厚垣孢子含量为25×108cfu/g，水含量为4.5%，润湿时间54s，分散性92%，悬浮率85%。
本实施例中涉及到的润湿剂，也可以为脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、萘磺酸盐和十八烷基丁二酸钠中的一种或两种以上。
本实施例中涉及到的分散剂，也可以萘磺酸钠甲醛缩合物、烷基酚乙氧基化合物、多芳基酚乙氧基化磷酸酯、EO–PO嵌段共聚物和聚羧酸盐中的一种或两种以上。
本实施例中涉及到的崩解剂，也可以为低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡络烷酮、交联羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上。
本实施例中涉及到的填料，也可以为粘土、膨润土、白炭黑、硅藻土、滑石粉中的一种或两种以上。
在保证水分散粒剂中绿色木霉菌LTR-2厚垣孢子含量不低于2×108cfu/g的情况下，可以对发酵液浓缩工艺、添加剂及填料的种类及含量、后处理工艺进行适当的调整。
设对照样品1：液体种子培养基含有玉米粉2％、葡萄糖0.5％、豆饼粉1%，磷酸氢二钾0.2%、磷酸二氢钾0.3%、碳酸钙1%，pH6.0。灭菌后将2个茄子瓶的种子接种至150立升的种子罐中，30℃培养，通气量1:0.7，搅拌转速200rpm，培养时间为40h，得到液体菌种。将该液体菌种与固体培养基（麸皮：稻壳：玉米粉=7:1:2，含水量为70%，pH6.0，灭菌后冷却）混合均匀，接种量为8%，接种完毕转移到固体培养室内培养。培养基厚度5cm，料温控制在30±2℃，室温控制在25～30±2℃，空气的相对含水量控制在95～100%，培养时间7天。培养完毕，将固体培养物自然风干，成品含水量控制在5～10%，得绿色木霉菌LTR-2固体培养物，过100目筛收集孢子粉，记为农用制剂DZ-1，该分生孢子含量为1×108cfu/g。
实施例3 绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂在田间对病害的防治效果
采用实施例2制备的绿色木霉LTR-2水分散粒剂，在云南省开展了大量的试验。
施用作物及防治病害：番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病。
选取如下用药方案进行试验：
番茄灰霉病：空白对照CK（清水）、绿色木霉LTR-2水分散粒剂（1500倍液喷雾）、农用制剂DZ-1（60倍液喷雾）、对照药剂（10%井•蜡芽悬浮剂，500~625倍液喷雾）。第一次用药在定植前，第二次在发病初期，之后每隔7天喷1次，共施用4次。
马铃薯晚疫病：空白对照CK（清水）、绿色木霉LTR-2水分散粒剂（1500倍液喷雾）、农用制剂DZ-1（60倍液喷雾）、对照药剂（80%代森锰锌，600~800倍液喷雾）。田间发现病株时，第一次用药，之后间隔7天喷1次，连续施用3次。
烟草白粉病：空白对照CK（清水）、绿色木霉LTR-2水分散粒剂（1500倍液喷雾）、农用制剂DZ-1（60倍液喷雾）、对照药剂（70%甲基托布津，1000倍液喷雾）。田间发现病株时第一次用药，之后间隔7天喷1次，连续施用3次。
试验小区设置：对于每种作物及病害，单个小区面积在30-40平方米左右，设置12个小区，每个实验3个小区，在田块面积大的地方可以设隔离带。
每种作物的各小区仅施药不一样，其他管理及育苗等完全一样。分别统计发病指数，每个处理3次重复取平均值后，计算各药剂的使用效果。其试验数据分别见下表1。
表1 绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂对植物病害的防治效果
由上述表1的数据可知，绿色木霉LTR-2水分散粒剂对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ-1。
绿色木霉菌是一种安全、无毒、无残留的新型生物农药，通过人工培养获得绿色木霉菌厚垣孢子后又施用在作物中，使之在土壤中继续繁殖，形成有益微生物在土壤中的良性循环，有利于保持根际土壤微生态平衡，达到对病害的持续控制，而且不易产生抗药性，因此可以在农业生产中推广应用，前景广阔。

Claims (7)

1.绿色木霉发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基进行培养，发酵前期控制温度为29-31℃，发酵后期控制温度为24℃-26℃、pH为5.0～5.5；发酵结束后，得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液；所述发酵培养基由如下组分组成：玉米粉18～22g/L、葡萄糖8～12g/L、磷酸二氢钾7～8g/L、碳酸钙4～6g/L、硝酸钠0.8～1.2g/L、硫酸铵1～2g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、七水硫酸亚铁0.4～0.6g/L、硫酸锰0.15～0.25g/L、硫酸锌0.15～0.25g/L，pH为6.0～7.0，余量为水；所述发酵前期是自发酵开始至发酵后72h，发酵后期是发酵后72h至发酵后168h；将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基，接种量为2%，转速为150r/min、通气量为1VVM。
2.根据权利要求1所述绿色木霉发酵方法，其特征在于将绿色木霉LTR-2接种至液体种子培养基，在25-30℃条件下培养2~3d，得到绿色木霉LTR-2种子液；所述液体种子培养基是将马铃薯切块，加蒸馏水，煮沸后过滤，取滤液，加入葡萄糖后所得。
3.权利要求1所述方法得到的发酵液。
4.绿色木霉分散粒剂，其特征在于采用如下方法制备：
（1）将权利要求1所得富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液浓缩；
（2）在浓缩液中添加润湿剂、分散剂、崩解剂和填料，混合均匀后，粉碎、造粒、干燥、筛分，得到所述水分散粒剂。
5.根据权利要求4所述绿色木霉分散粒剂，其特征在于所述润湿剂为十二烷基硫酸钠、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、萘磺酸盐和十八烷基丁二酸钠中的一种或多种；所述分散剂为木质素磺酸盐、萘磺酸钠甲醛缩合物、烷基酚乙氧基化合物、多芳基酚乙氧基化磷酸酯、EO–PO嵌段共聚物和聚羧酸盐中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡络烷酮、交联羧甲基纤维素钠中的一种或多种；所述填料为粘土、高岭土、膨润土、白炭黑、硅藻土、滑石粉中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述绿色木霉分散粒剂，其特征在于所述绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂中润湿剂的质量百分含量为1~5%、分散剂的质量百分含量为2~10%、崩解剂的质量百分含量为2~5%。
7.根据权利要求6所述绿色木霉分散粒剂，其特征在于所述绿色木霉分散粒剂中绿色木霉LTR-2含量为25×108cfu/g。
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长柄木霉ACCC30150 与哈茨木霉ACCC30371产厚垣孢子的液体培养条件;顾金刚等;《中国生物防治》;20080831;第24卷(第3期);第253-256页 *

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