CN107090427A - 一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液 - Google Patents

一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液 Download PDF

Info

Publication number
CN107090427A
CN107090427A CN201710490852.7A CN201710490852A CN107090427A CN 107090427 A CN107090427 A CN 107090427A CN 201710490852 A CN201710490852 A CN 201710490852A CN 107090427 A CN107090427 A CN 107090427A
Authority
CN
China
Prior art keywords
genetic recombination
pancreatin
water
trypsase
cell dissociation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710490852.7A
Other languages
English (en)
Inventor
曲宝赤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Uniom Hengye Biological Technology (beijing) Co Ltd
Original Assignee
Uniom Hengye Biological Technology (beijing) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uniom Hengye Biological Technology (beijing) Co Ltd filed Critical Uniom Hengye Biological Technology (beijing) Co Ltd
Priority to CN201710490852.7A priority Critical patent/CN107090427A/zh
Publication of CN107090427A publication Critical patent/CN107090427A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾50～70，氯化钾350～450，碳酸氢钠300～400，氯化钠7000～9000，七水磷酸氢二钠80～100，葡萄糖1000～2000，EDTA‑4Na 200～500，基因重组胰酶1～60，余量为水。本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，对细胞的消化能力优于传统胰酶，一般细胞3分钟以内即可消化完全。细胞消化过程对细胞的损伤较少，消化完成后再接种，细胞活率高、生长状态良好。本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，无需‑20℃保存，在2～8℃中保存12个月以内使用效果不变。

Description

一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液
技术领域
本发明涉及一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，用于贴壁细胞的消化，属于生物制药、生物治疗等相关领域。
背景技术
胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶，由动物胰腺分泌的胰蛋白酶原激活产生，能专一性的水解精氨酸和赖氨酸竣基端的肽键，被广泛应用于生物技术领域和医疗领域。
目前获取胰蛋白酶的途径主要有两种，传统的方式是从动物身上进行获取，通过宰杀牛、羊、猪等，从其胰脏提取出胰蛋白酶。另外，利用微生物发酵的方式来获取胰蛋白酶，因高效和专一性强而逐渐受到人们的青睐。
随着生物制药的不断发展,胰蛋白酶成为一些生物制药的主要原辅材料。因其最终产品将被用于人体疾病治疗，其质量的好坏可能会直接影响人类的生命健康。由于胰蛋白酶来源于生物体，其成分复杂，供体容易受到病原体污染，一旦这种污染没有被彻底清除而被带入到胰酶的生产中，就可能会导致严重的后果。
目前，酵母和大肠杆菌是合成胰蛋白酶常用的微生物宿主。重组胰蛋白酶是利用重组DNA技术在重组大肠杆菌表达出的胰蛋白酶，无任何动物源性组分，且背景清楚，纯度较高，因而适用于无血清培养，可应用于抗体和药物的生产。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，本发明的目的在于对贴壁细胞无血清培养或者无动物源培养过程中进行消化操作，避免传统动物源胰蛋白酶的介入，以保证整个细胞培养过程没有动物源组分的参入。同时，本产品可在2～8℃环境中长期保存，随取随用，旨在为实验操作者带来更大的方便。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾50～70，氯化钾350～450，碳酸氢钠300～400，氯化钠7000～9000，七水磷酸氢二钠80～100，葡萄糖1000～2000，EDTA-4Na 200～500，基因重组胰酶1～60，余量为水。
所述基因重组胰酶，购自KERRY，产品名称：rTrypsin，产品货号：30624799.5GR。
所述基因重组胰酶，由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的阳离子型胰蛋白酶完全一致，酶切特异性相同；不含任何动物来源组分，没有传统天然胰酶中不可避免的糜蛋白酶等组分。
本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，对细胞的消化能力优于传统胰酶，一般细胞3分钟以内即可消化完全。细胞消化过程对细胞的损伤较少，消化完成后再接种，细胞活率高、生长状态良好。本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，无需-20℃保存，在2～8℃中保存12个月以内使用效果不变。本发明的制备工艺全部采用在线清洗及在线灭菌设备，保证批间差的稳定，同时生产中采用惰性体氮气保护，避免不稳定性成分被氧化，该工艺生产的免疫细胞无血清培养基质量稳定，解决了大多数厂家生产质量不易控制的问题。
附图说明
图1：传统胰酶液相色谱图。
图2：基因重组胰酶液相色谱图。
图3：A549(肺癌)消化前。
图4：A549(肺癌)消化后。
图5：MK2(恒河猴肾细胞)消化前。
图6：MK2(恒河猴肾细胞)消化后。
图7：3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)消化前。
图8：3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)消化后。
图9：hepG2(肝癌细胞)消化前。
图10：hepG2(肝癌细胞)消化后。
图11：MDCK(犬肾细胞)消化前。
图12：MDCK(犬肾细胞)消化后。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
本发明所用基因重组胰酶，购自KERRY，产品名称：rTrypsin，产品货号：30624799.5GR。
实施例1 制备基因重组胰蛋白酶细胞消化液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾60，氯化钾400，碳酸氢钠350，氯化钠8000，七水磷酸氢二钠90，葡萄糖1500，EDTA-4Na350，基因重组胰酶30，余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实施例2 制备基因重组胰蛋白酶细胞消化液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾50，氯化钾450，碳酸氢钠300，氯化钠9000，七水磷酸氢二钠80，葡萄糖2000，EDTA-4Na500，基因重组胰酶10，余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实施例3 制备基因重组胰蛋白酶细胞消化液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾70，氯化钾350，碳酸氢钠400，氯化钠7000，七水磷酸氢二钠100，葡萄糖2000，EDTA-4Na200，基因重组胰酶50，余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.2～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实验 基因重组胰蛋白酶细胞消化液消化细胞
采用本发明的基因重组胰蛋白酶细胞消化液消化细胞，同时，以传统胰酶(传统胰酶，是指直接从猪体内提取得到的胰酶)作为对照。
(1)稳定性对比：对比本发明所用的基因重组胰酶与传统胰酶的稳定性，如表1所示。
表1
(2)纯度对比：如图1、图2所示。由图1可见，传统胰酶杂质多(峰越多，杂质越多)，传统胰酶可见四种含量较高的成分，同时由于其中一种杂质含量较高，无法分开，出现降解，稳定性差。由图2可见，重组胰酶几乎无杂质，纯度高，峰型好，稳定性好，无降解峰。
(3)使用方法对比：如表2所示。
表2
(4)消化时间对比：对比本发明的重组胰酶、传统胰酶，以及Gibco(重组胰酶)(商品化产品，市场购买)对细胞的消化时间，如表2所示。
表3
细胞系名称 本发明重组胰酶 Gibco(重组胰酶) 传统胰酶
A549(肺癌) 3min 5min 3min
MDCK(犬肾细胞) 10min 15min 13min
3T3(小鼠胚胎成纤维细胞) 2min 3min 3min
hepG2(肝癌细胞) 3min 5min 3min
MK2(恒河猴肾细胞) 1min 2min 2min
MSC(间充质干细胞) 1min 2min 1min
由表3可见，本发明所用的重组胰酶，缩短了细胞消化时间，对所列细胞消化时间均有显著提高，大大缩短了工作的繁琐性；在缩短了细胞消化时间的同时，还可保证消化后的细胞活率仍大于90％以上。
对比本发明的重组胰酶(不同用量)对细胞的消化时间，如表4所示。
表4
细胞系名称 胰酶10mg/L 胰酶30mg/L 胰酶60mg/L
A549(肺癌) 6min 3min 过度消化
MDCK(犬肾细胞) 20min 10min 过度消化
3T3(小鼠胚胎成纤维细胞) 5min 2min 过度消化
hepG2(肝癌细胞) 7min 3min 过度消化
MK2(恒河猴肾细胞) 3min 1min 过度消化
MSC(间充质干细胞) 3min 1min 过度消化
由表4可见，不同配比的胰酶对细胞影响较大，经筛选30mg/L的使用量最优。
(5)消化效果：采用本发明的重组胰酶消化细胞，对比消化前、后，如图3～12所示，由图可知，经重组胰酶处理后，细胞均可正常消化，胰酶活性明显。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (6)

1.一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾50～70，氯化钾350～450，碳酸氢钠300～400，氯化钠7000～9000，七水磷酸氢二钠80～100，葡萄糖1000～2000，EDTA-4Na 200～500，基因重组胰酶1～60，余量为水。
2.根据权利要求1所述的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾60，氯化钾400，碳酸氢钠350，氯化钠8000，七水磷酸氢二钠90，葡萄糖1500，EDTA-4Na 350，基因重组胰酶30，余量为水。
3.根据权利要求1所述的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾50，氯化钾450，碳酸氢钠300，氯化钠9000，七水磷酸氢二钠80，葡萄糖2000，EDTA-4Na 500，基因重组胰酶10，余量为水。
4.根据权利要求1所述的基因重组胰蛋白酶细胞消化液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：磷酸氢二钾70，氯化钾350，碳酸氢钠400，氯化钠7000，七水磷酸氢二钠100，葡萄糖2000，EDTA-4Na 200，基因重组胰酶50，余量为水。
5.权利要求1～4中任一项所述的基因重组胰蛋白酶细胞消化液的制备方法，其特征在于：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如权利要求1～4中任一项所述，调节pH值至7.2～7.4，即得。
6.权利要求1～4中任一项所述的基因重组胰蛋白酶细胞消化液在消化细胞中的应用。
CN201710490852.7A 2017-06-23 2017-06-23 一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液 Pending CN107090427A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710490852.7A CN107090427A (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710490852.7A CN107090427A (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107090427A true CN107090427A (zh) 2017-08-25

Family

ID=59641496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710490852.7A Pending CN107090427A (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107090427A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439621A (zh) * 2018-11-12 2019-03-08 王晓柯 一种干细胞温和酶细胞消化液
CN110736732A (zh) * 2019-12-09 2020-01-31 南阳理工学院 基于拉曼光谱的体液药物浓度的测量方法及检测装置
CN112680412A (zh) * 2021-01-14 2021-04-20 辽宁省肿瘤医院 一种用于传代干细胞的无动物源传代方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1694953A (zh) * 2002-08-30 2005-11-09 诺维信生物技术公司 制备哺乳动物胰蛋白酶的方法
CN102533704A (zh) * 2010-12-30 2012-07-04 上海雅心生物技术有限公司 即配即用型的胰蛋白酶制剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1694953A (zh) * 2002-08-30 2005-11-09 诺维信生物技术公司 制备哺乳动物胰蛋白酶的方法
CN102533704A (zh) * 2010-12-30 2012-07-04 上海雅心生物技术有限公司 即配即用型的胰蛋白酶制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
中国生物器材网: "疫苗生产降血清细胞培养工艺优化方案", 《中国生物器材网》 *
周竹青主编: "《细胞生物学实验教程》", 31 January 2014, 中国农业出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439621A (zh) * 2018-11-12 2019-03-08 王晓柯 一种干细胞温和酶细胞消化液
CN110736732A (zh) * 2019-12-09 2020-01-31 南阳理工学院 基于拉曼光谱的体液药物浓度的测量方法及检测装置
CN112680412A (zh) * 2021-01-14 2021-04-20 辽宁省肿瘤医院 一种用于传代干细胞的无动物源传代方法
CN112680412B (zh) * 2021-01-14 2024-02-23 辽宁省肿瘤医院 一种用于传代干细胞的无动物源传代方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI810163B (zh) 芽孢桿菌屬細菌之培養方法及有用物質之製造方法
Jiang et al. Ectodomain shedding and autocleavage of the cardiac membrane protease corin
CN107090427A (zh) 一种基因重组胰蛋白酶细胞消化液
US9803185B2 (en) Method for cancer targeting treatment and detection of arginine using albumin-binding arginine deiminase fusion protein
Matsumura et al. Is aspartate 52 essential for catalysis by chicken egg white lysozyme? The role of natural substrate-assisted hydrolysis
HK1082761A1 (en) Circular dna molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
CN109439621A (zh) 一种干细胞温和酶细胞消化液
RU2495926C2 (ru) Питательная добавка для среды спиртового брожения
CN108034645A (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及其应用
CN101218338B (zh) 生产液体曲的方法
Lv et al. Cloning, expression, and characterization of β-mannanase from Bacillus subtilis MAFIC-S11 in Pichia pastoris
Zhang et al. Production of surfactant-stable keratinase from Bacillus cereus YQ15 and its application as detergent additive
Su et al. Enhancement of chitosanase secretion by Bacillus subtilis for production of chitosan oligosaccharides
CN106257988A (zh) 新颖方法、多肽以及其用途
CN105247036B (zh) 蛋白纯化的新颖方法
HIRAMATSU et al. On the proteolytic enzymes from the commercial protease preparation of Streptomyces griseus (Pronase P)
Ilian et al. Effect of preslaughter feed withdrawal period on longissimus tenderness and the expression of calpains in the ovine
ATE346914T1 (de) Udp-n-acetylglucosamin: galaktose-beta 1,3-n- acetylgalaktosamin-alpha-r/(glcnac -galnac) beta 1,6-n-acetylglucosaminyltransferase, c2gnt3
WO2020133314A1 (zh) 一种磷脂酶d突变体、其应用及其制备磷酯酰丝氨酸的方法
Adamczyk et al. Degradation of proteins by enzymes exuded by Allium porrum roots–a potentially important strategy for acquiring organic nitrogen by plants
CN108048367A (zh) 白葡萄球菌粉及其应用
CN104664062A (zh) 多肽微生物水产饲料的制备方法
KR20120011261A (ko) 바실러스속 균주의 유가식 배양 방법에 의한 나토키나아제 대량 생산 방법
Geng et al. Purification, Characterization, and Immobilization of a Novel Protease-Resistant α-Galactosidase from Oudemansiella radicata and Its Application in Degradation of Raffinose Family Oligosaccharides from Soymilk
Abi et al. Improved laminaribiose phosphorylase production by Euglena gracilis in a bioreactor: a comparative study of different cultivation methods

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170825

RJ01 Rejection of invention patent application after publication