CN1863763A - 用于治疗疾病的氨基脲敏感性胺氧化酶(ssao)和vap-1介导的粘着的抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了治疗炎性疾病和免疫疾病的组合物和方法。本发明公开了为氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)和/或血管粘着蛋白1(VAP-1)抑制剂的烯丙基肼化合物、羟基胺(氨基氧基)化合物和其它化合物。这些化合物具有抑制炎症和炎症反应以及治疗几种疾病,包括多发性硬化的治疗应用。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年8月8日提交的美国临时专利申请US60/493,835、2003年9月12日提交的美国临时专利申请US60/502,401和2004年5月6日提交的美国临时专利申请US60/568,999的优先权。将这些申请的全部内容引入本文作为参考。
关于联邦政府赞助的研究或研发的声明
不适用。
技术领域
本申请涉及用于抑制氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)、也称作血管粘着蛋白1(VAP-1)的组合物和方法,它们用于治疗炎症、炎性疾病和自身免疫病。
背景技术
人血管粘着蛋白-1(VAP-1)为2型180kD的同二聚化内皮细胞粘着分子。对VAP-1的克隆和测序揭示出VAP-1cDNA序列与以前已知的蛋白质氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAO),即一种含铜的胺氧化酶的序列相同。尚未测定膜结合VAP-1粘着蛋白与可溶性SSAO酶之间的精确差异(如果有的话);一种推定表明膜结合VAP-1分子的蛋白酶剪切产生可溶性SSAO酶。膜结合VAP-1蛋白质和可溶性SSAO酶都具有胺氧化酶酶促活性。因此,膜结合VAP-1可以作为胺氧化酶和细胞粘着分子起作用。
氨基脲-敏感性胺氧化酶是一组酶的成员;该组一般称作氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAOs)。SSAOs是催化伯胺类氧化脱氨基的主要可溶性酶。该反应导致形成相应的醛并且释放H2O2和铵。这些酶在其底物、抑制剂、辅因子、亚细胞定位和功能方面不同于单胺氧化酶A和B(分别为MAO-A和MAO-B)。迄今为止,尚没有生理功能确定地与SSAOs相关,并且甚至生理底物的性质没有得到稳定地建立(Buffoni F.和Ignesti G.(2000)在《分子遗传学与代谢》(Mol.Genetics Metabl.)71:559-564中综述)。然而,它们涉及外源性和内源性胺类的代谢和调节葡萄糖运输。
SSAO分子在种类间高度保守;与人蛋白质最接近的同源物为牛血清胺氧化酶(约85%的同一性)。底物特异性和组织分布在不同物种之间变化很大。在人中,在大部分组织中检测到了SSAO特异活性,但没有显著差异(在主动脉和肺中)。人和啮齿动物血浆具有的SSAO活性与反刍动物相比极低。缺失研究提示SSAO/VAP-1占细胞和血清SSAO活性的~90%(Jaakkola K.等(1999)《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)155:1953)。
膜结合VAP-1主要在淋巴器官的高内皮细胞(ECs)、肝的窦状隙ECs和许多其它组织的小口径小静脉中表达。此外,还在生发中心的树突细胞中发现了SSAO/VAP-1并且它在脂肪细胞、周皮细胞和平滑肌细胞中大量存在。然而,它在毛细管、大血管的Ecs、上皮细胞、成纤维细胞和白细胞中不存在(Salmi M.等(2001)《免疫学趋势》(Trends Immunol.)22:211)。在临床样品中的研究揭示出SSAO/VAP-1在许多炎症,诸如滑膜炎、过敏性和其它皮肤炎症以及炎性肠病(IBD)部位处的脉管系统上得到增量调节。然而,表达看起来受到其它机制控制。动物研究表明腔SSAO/VAP-1仅在引起炎症时得到诱导。因此,在Ecs中,SSAO/VAP-1储存在胞内颗粒中并仅易位至炎症部位的腔表面上。
在健康成年人血清中,发现了浓度为80ng/ml的SSAO/VAP-1的可溶性形式。可溶性SSAO/VAP-1水平在某些肝病和糖尿病中增加,而在许多其它炎性病症中保持正常。可溶性SSAO/VAP-1具有与SSAO/VAP-1膜结合形式的邻近胞外序列相同的N-末端氨基酸序列。此外,存在良好的证据,即至少大部分可溶性分子通过窦状隙VAP-1的蛋白酶剪切在肝中产生(Kurkijarvi R.等(2000)《胃肠病学》(Gastroenterology)119:1096)。
SSAO/VAP-1调节与Ecs的白细胞-亚型-特异性粘着。研究证实SSAO/VAP-1涉及部位上的粘着级联,在所述部位中发生选择蛋白、趋化因子、免疫球蛋白超家族分子和整联蛋白的诱导/活化。尽管如此,但是在合适的背景技术中,SSAO/VAP-1功能的失活对所有外渗过程具有独立和显著的作用。近期研究表明SSAO/VAP-1的直接粘着和酶功能涉及粘着级联(Salmi M.等(2001)《免疫》(Immunity)14:265)。在该项研究中,提出VAP-1的活性直接涉及白细胞与内皮细胞粘着的途径,通过包括与存在于白细胞表面上表达的VAP-1配体的胺底物的直接相互作用来实现。在生理层切应力下,看起来当淋巴细胞开始在Ecs上滚动时,SSAO/VAP-1首先在粘连后起作用(通过选择蛋白与其配体结合进行)。因此,抗-VAP-1单克隆抗体抑制~50%的淋巴细胞滚动并且显著减少紧密结合的细胞数量。此外,SSAO抑制剂抑制VAP-1酶活性还使得滚动的和紧密结合的淋巴细胞数量减少>40%。因此,SSAO/VAP-1酶活性的抑制剂可以减少炎症区域中白细胞的粘着且由此减少白细胞输送入发炎区,并且由此减少炎症自身的过程。
已经I型和II型糖尿病患者和动物模型的血浆和胰岛以及充血性心力衰竭后和动脉粥样硬化小鼠模型中发现了增加的SSAO活性(Salmi M,.等(2002)《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)161:2255;Bono P.等(1999)《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)155:1613;Boomsma F.等(1999)《糖尿病学》(Diabetologia)42:233;Gronvall-Nordquist J.等(2001)《糖尿病并发症杂志》(J.Diabetes Complications)15:250;Ferre I.等(2002)《神经科学通讯》(Neurosci.Lett.)15;321:21;ConklinD.J.等(1998)《毒理学科学》(Toxicological Sciences)46:386;Yu P.H.和Deng Y.L.(1998)《动脉粥样硬化》(AtherosC1erosis)140:357;Vidrio H.等(2002)《普通药理学》(GeneralPharmacology)35:195;Conklin D.J.(1999)《毒理学》(Toxicology)138:137)。除AP-1在类风湿性关节炎(RA)患者的发炎关节和来自IBD患者的固有膜的小静脉和派伊尔斑中的表达得到增量调节外,还在慢性皮肤炎症和肝病中发现了VAP-1的合成增加(Lalor P.F.等(2002)《免疫学杂志》(J.Immunol.)169:983;Jaakkola K.等(2000)《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)157:463;Salmi M.和Jalkanen S.(2001)《免疫学杂志》(J.Immunol.)166:4650;Lalr P.F.等(2002)《免疫细胞生物学》(Immunol CellBiol)80:52;Salmi M等(1997)《临床研究杂志》(J.Cin.Invest.)99:2165;Kurkijarvi R.等(1998)《免疫学杂志》(J.Immunol.)1611549)。
概括地说,SSAO/VAP-1是调节白细胞-亚型-特异性粘粘着并且介导淋巴细胞与发炎血管之间的相互作用的诱导型内皮酶。SSAO/VAP-1具有酶和粘着活性及其在许多炎症病症增量调节之间的显著相关性这一事实使得它能够成为所有上述疾病情况的治疗靶。
本发明的公开内容
SSAO抑制剂可以阻断炎症和自身免疫过程以及其它与增加水平的SSAO的循环胺底物和/或产物相关的病理情况。本发明在一个实施方案中涉及抑制炎症反应的方法,通过施用化合物以便抑制SSAO酶活性(其中这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质或因它们两者所致)和/或抑制结合VAP-1蛋白质来进行。在另一个实施方案中,所述的炎症反应为急性炎症反应。本发明在另一个实施方案中,本发明涉及治疗至少部分由SSAO或VAP-1介导的疾病,正如通过SSAO和/或VAP-1的异常水平或SSAO和/或VAP-1的异常活性中的一种或多种所表现出的(其中VAP-1的异常活性可以影响其结合功能、其胺氧化酶功能或它们两者),通过施用治疗量的SSAO抑制剂或施用治疗有效量的SSAO抑制剂的组合来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫疾病的方法,通过施用治疗有效量的SSAO抑制剂或施用治疗有效量的SSAO抑制剂的组合来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗多发性硬化(包括慢性多发性硬化)的方法,通过施用治疗有效量的SSAO抑制剂或施用治疗有效量的SSAO抑制剂的组合来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗缺血性疾病(例如中风)和/或其后遗症(例如炎症反应)的方法,通过施用治疗有效量的SSAO抑制剂或施用治疗有效量的SSAO抑制剂的组合来进行。所施用的SSAO抑制剂可以抑制可溶性SSAO的SSAO活性、与膜结合VAP-1结合的膜结合VAP-1的SSAO活性或这些活性中的任意两种或这些活性中的所有三种。本发明在另一个实施方案中涉及使用本文提供的化合物在体外抑制SSAO活性或抑制结合VAP-1的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用本文提供的化合物在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制结合VAP-1的方法。
本发明在另一个实施方案中涉及用于抑制SSAO酶活性(其中这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白或因它们两者所致)和/或抑制与膜结合VAP-1蛋白质结合的不同化合物。本发明在另一个实施方案中涉及使用多种化合物抑制SSAO酶活性(其中这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质或因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。
本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用SSAO抑制剂来进行,该抑制剂具有的对SSAO抑制的特异性是对MAO-A和/或MAO-B的约10倍,约100倍或约500倍。
本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用SSAO抑制剂来进行,该抑制剂具有的对SSAO抑制的特异性是对MAO-A和/或MAO-B的约10倍,约100倍或约500倍。
本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的本文在通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B或III-C中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的本文在通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B或III-C中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在一个实施方案中涉及化合物通式I的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中:
R1独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基、C5-C14取代的杂芳基、R4-(CH2)n-和R5-Y1-CH2-组成的组;
n独立地为1或2;
Y1独立地为S或O;
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R4独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R5独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;且
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。通式I化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个优选的实施方案中,R1为未被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R1为被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R1为带有一个取代基的被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R1为带有两个取代基的被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R2为H。在另一个优选的实施方案中,R2为F。在另一个实施方案中,X为O。在另一个优选的实施方案中,X为NR6。在另一个优选的实施方案中,R3为H或C1-C4烷基。在另一个优选的实施方案中,R6为H或C1-C4烷基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO酶活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式I中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式I中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及通式I-P的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中R1p独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基、C5-C14取代的杂芳基、R4-(CH2)n-和R5-Y1-CH2-组成的组;
n独立地为1或2;
Y1独立地为S或O;
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R4独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R5独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;且
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
条件是当R1p为未被取代的苯基,R2为H且X为NH时,R3不为H。
将通式I的包括上述条件的这一亚组化合物命名为通式I的P亚组的化合物或通式I-P的化合物。通式I化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个优选的实施方案中,R1p为未被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R1p为被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R1p为带有一个取代基的被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R1p为带有两个取代基的被取代的苯基。在另一个优选的实施方案中,R2为H。在另一个实施方案中,X为O。在另一个优选的实施方案中,X为NR6。在另一个优选的实施方案中,R3为H或C1-C4烷基。在另一个优选的实施方案中,R6为H或C1-C4烷基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-P的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO酶活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-P的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-P的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式I-P中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式I-P中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及通式I-A的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中:
R1a为取代或未被取代的苯基;
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。将通式I的这一亚组化合物命名为通式I的A亚组的化合物或通式I-A的化合物。通式I-A化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,R1a为未被取代的苯基。在另一个实施方案中,R1a为被取代的苯基。在另一个实施方案中,R1a为带有一个取代基的被取代的苯基。在另一个实施方案中,R1a为带有两个取代基的被取代的苯基。在另一个实施方案中,X为O。在另一个实施方案中,X为NR6。在另一个实施方案中,R3为H或C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R6为H或C1-C4烷基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-A的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-A的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-A的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式I-A中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式I-A中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在一个实施方案中涉及通式I-AP的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中:
R1ap为取代或未被取代的苯基;
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;条件是当R1ap为未被取代的苯基,R2为H且X为NH时,R3不为H。将通式I的包括上述条件的这一亚组化合物命名为通式I的AP亚组的化合物或通式I-AP的化合物。通式I-AP化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,R1ap为未被取代的苯基。在另一个实施方案中,R1ap为被取代的苯基。在另一个实施方案中,R1ap为带有一个取代基的被取代的苯基。在另一个实施方案中,R1ap为带有两个取代基的被取代的苯基。在另一个实施方案中,X为O。在另一个实施方案中,X为NR6。在另一个实施方案中,R3为H或C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R6为H或C1-C4烷基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-AP的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-AP的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-AP的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式I-AP中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式I-AP中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在一个实施方案中涉及通式I-B的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中:
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
R91和R92独立地选自H、F、Br、Cl、I、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。
将通式I的这一亚组化合物命名为通式I的B亚组的化合物或通式I-B的化合物。通式I-B化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,X为O。在优选的实施方案中,X为NR6。在另一个优选的实施方案中,R3为H或C1-C4烷基。在另一个优选的实施方案中,R6为H或C1-C4烷基。在另一个优选的实施方案中,R91为H。在另一个优选的实施方案中,R92为H。在另一个优选的实施方案中,R91和R92均为H。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-B的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-B的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-B的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式I-B中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式I-B中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在一个实施方案中涉及通式I-C的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中:
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
R91和R92独立地选自H、F、Br、Cl、I、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。将通式I的这一亚组化合物命名为通式I的C亚组的化合物或通式I-C的化合物。通式I-C化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,X为O。在另一优选的实施方案中,X为NR6。在另一个优选的实施方案中,R3为H或C1-C4烷基。在另一个优选的实施方案中,R6为H或C1-C4烷基。在另一个优选的实施方案中,R91为H。在另一个优选的实施方案中,R92为H。在另一个优选的实施方案中,R91和R92均为H。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-C的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-C的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I-C的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式I-C中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式I-C中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B,和/或I-C的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B,和/或I-C的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B,和/或I-C的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B,和/或I-C中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B,和/或I-C中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及通式II的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
R11和R12独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基组成的组;
R13和R14独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基组成的组。通式II化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,R11为H。在另一个实施方案中,R12为未被取代的苯基。在另一个实施方案中,R12为被取代的苯基。在另一个实施方案中,R13为H或C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R14为H或C1-C4烷基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式II的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式II的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式II的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式II中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式II中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及通式III的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中R27独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基、C5-C14取代的杂芳基、R23-(CH2)n-和R24-Y2-(CH2)-;
R22独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
n独立地为1或2;
n3独立地为0、1或2;
Y2独立地为S或O;且
R23和R24独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。通式III化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,R27为未被取代的苯基。在另一个实施方案中,R27为取代的苯基。在一个实施方案中,R22为H或C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22不为H。在另一个实施方案中,R22为C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22为甲基或乙基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式III中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式III中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及通式III-A的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中R21独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基、C5-C14取代的杂芳基、R23-(CH2)n-和R24-Y2-(CH2)-;
R22独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
n独立地为1或2;
Y2独立地为S或O;且
R23和R24独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。通式III-A化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,R21为未被取代的苯基。在另一个实施方案中,R21为取代的苯基。在另一个实施方案中,R22为H或C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22不为H。在另一个实施方案中,R22为C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22为甲基或乙基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-A的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-A的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-A的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式III-A中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式III-A中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及通式III-B的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中R25独立地选自C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;且
R22独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。通式III-B化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,R25为未被取代的苯基。在另一个实施方案中,R25为取代的苯基。在另一个实施方案中,R22为H或C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22不为H。
在另一个实施方案中,R22为C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22为甲基或乙基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-B的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-B的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-B的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式III-B中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式III-B中所述化合物中的一种或多种来进行。
本发明在另一个实施方案中涉及通式III-C的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐,特别是药学上可接受的盐:
其中R26独立地选自C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;且
R22独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。通式III-C化合物的代谢物和前体药物也包括在本发明中。在一个实施方案中,R26为未被取代的苯基。在另一个实施方案中,R26为取代的苯基。在另一个实施方案中,R22为H或C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22不为H。
在另一个实施方案中,R22为C1-C4烷基。在另一个实施方案中,R22为甲基或乙基。
本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-C的化合物抑制SSAO酶活性(无论这种酶活性因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质结合的方法。这些化合物可以用于在体外抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过在体外环境中提供足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。这些化合物还可以用于在体内,即活的生物,诸如脊椎动物、哺乳动物或人体内抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的方法,通过对生物体施用足以抑制SSAO活性或抑制与VAP-1结合的用量的所述化合物来实现。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-C的化合物治疗炎症或免疫疾病的方法。本发明在另一个实施方案中涉及使用通式III-C的化合物抑制或减轻炎症或抑制或减轻炎症反应的方法。本发明在另一个实施方案中涉及治疗炎症的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗炎症用量的通式III-C中所述化合物中的一种或多种来进行。本发明在另一个实施方案中涉及治疗免疫或自身免疫病的方法,通过施用治疗有效量的或足以治疗免疫或自身免疫病用量的通式III-C中所述化合物中的一种或多种来进行。
在另一个实施方案中,由本发明通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B和/或III-C化合物中的一种或多种治疗的炎性疾病或免疫疾病选自下列疾病组成的组:多发性硬化(包括慢性多发性硬化);滑膜炎;全身炎性脓毒症;炎性肠病;克罗恩病;溃疡性结肠炎;阿尔茨海默氏病;血管性痴呆;动脉粥样硬化;类风湿性关节炎;青少年类风湿性关节炎;肺部炎性病症;哮喘;皮肤炎性病症和疾病;接触性皮炎;肝炎性和自身免疫病;自身免疫性肝炎;原发性胆汁性肝硬变;硬化性胆管炎;自身免疫性胆管炎;酒精性肝病;I型糖尿病和/或其并发症;II型糖尿病和/或其并发症;动脉粥样硬化;慢性心力衰竭;充血性心力衰竭;缺血性疾病,诸如中风和/或其并发症;和心肌梗死和/或其并发症。在另一个实施方案中,由本发明治疗的炎性疾病或免疫疾病为多发性硬化(包括慢性多发性硬化)。在另一个实施方案中,由本发明治疗的炎性疾病或免疫疾病为因中风导致的炎性并发症。
可以以治疗有效量单独施用如上所述的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B或III-C的化合物。可以将如上所述的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B或III-C的化合物与通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B或III-C的一种或多种其它化合物以治疗有效量施用。当以组合方式施用时,可以以治疗有效量施用这些化合物,所述量为单独施用所述化合物时的量。或者,当以组合方式施用时,可以以单独施用所述化合物时并非治疗有效,而在组合时治疗有效的用量施用任意或所有的化合物。还可以将通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B或III-C的一种或多种化合物与其它未包括在通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B或III-C中的化合物一起施用;这些化合物的施用量在作为单一药物使用时是治疗上有效的,或该用量在作为单一药物时并非治疗上有效,而在组合时是治疗上有效的。还提供了药学上可接受的组合物及其人体用的单位剂量,所述组合物包含治疗有效量的本文公开的化合物中的一种或多种或本文公开的化合物中的两种或多种的治疗有效组合,包括上述通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B和/或III-C的化合物及其药学上可接受的载体。
可以将如上所述的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B和/或III-C的化合物制成分离的药物组合物,并且以分离的药物组合物与载体或其它分离的化合物一起施用。即可以从其它化合物中分离如上所述的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B和/或III-C的化合物(例如,可以将在文库筛选试验中发现的化合物从该库中纯化出来或作为单一化合物重新合成)。纯化程度可以为90%、95%、99%,或无论如何的纯度百分比为该化合物的药物应用所需的。然后可以将分离的化合物与药学上可接受的载体组合,或可以将其与通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B和/或III-C中一种或多种分离的化合物组合,或与另一种治疗性物质组合。可以将如上所述的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B和/或III-C的化合物以人用药物单位剂量制剂经口施用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式I的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式I-P的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-P的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-P的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-P的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-P的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式I-A的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-A的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-A的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-A的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-A的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式I-AP的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-AP的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-AP的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-AP的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-AP的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式I-B的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-B的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-B的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-B的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-B的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式I-C的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-C的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-C的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-C的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式I-C的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式II的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式II的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式II的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式II的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式II的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式III的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式III-A的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-A的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-A的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-A的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-A的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式III-B的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-B的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-B的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-B的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-B的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
在另一个实施方案中,本发明包括通式III-C的化合物在疗法中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-C的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-C的化合物在制备用于治疗免疫或自身免疫病的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-C的化合物在制备用于治疗多发性硬化或慢性多发性硬化的药物中的应用。在另一个实施方案中,本发明包括通式III-C的化合物在制备用于治疗缺血性疾病(诸如中风)或缺血性疾病后遗症的药物中的应用。
附图简述
附图1A描绘了实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼)与磷酸缓冲盐水(PBS)对照品和甲氨蝶呤相比较对如通过关节炎评分评价的单克隆抗体诱导的关节炎疾病发展的作用。
附图1B描绘了实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼)与PBS对照品和甲氨蝶呤相比较对如通过爪测量结果评价的单克隆抗体诱导的关节炎疾病发展的作用。
附图1C描绘了实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼)与PBS对照品和甲氨蝶呤相比较对如通过发病率百分比评价的单克隆抗体诱导的关节炎疾病发展的作用。
附图2A描绘了实施例18的烯丙胺(AA)化合物(莫非吉兰(mofegiline))与载体对照品和甲氨蝶呤相比较对如通过临床严重程度评价的实验性自身免疫性脑炎(EAE)发展的作用。
附图2B描绘了实施例18的烯丙胺(AA)化合物(莫非吉兰)与载体对照品和甲氨蝶呤相比较对如通过发病率百分比评价的EAE发展的作用。
附图2C描绘了实施例18的烯丙胺(AA)化合物(莫非吉兰)与载体对照品和甲氨蝶呤相比较对如通过体重评价的EAE发展的作用。
附图3A描绘了实施例2((2-苯基烯丙基)肼)与载体对照品相比较对如通过发病率百分比评价的EAE发展的作用。
附图3B描绘了实施例2((2-苯基烯丙基)肼)与载体对照品相比较对如通过临床严重程度评价的EAE发展的作用。
附图4A描绘了实施例2和8的化合物与PBS相比较对诱导的爪炎症的作用。该附图中的各种三角形、正方形和菱形符号表示各测试动物。
附图4B描绘了实施例2和8的化合物与磷酸缓冲盐水相比较对诱导的爪炎症的作用。该附图中的符号代表各小鼠。
附图5A和5B描绘了小鼠和大鼠中的口服有效性研究。附图5A描绘了在小鼠中的口服有效性研究;附图5B描绘了在大鼠中的口服有效性研究。通过经口管饲法将磷酸缓冲盐水(PBS)中的浓度为50mg/kg的化合物施用于小鼠和大鼠。在附图中所示的时间处采集血浆,并且使用实施例14中所述的SSAO比色测定法测定抑制剂浓度。
附图6描绘了SSAO活性的体内抑制。单一经口剂量施用实施例8化合物在治疗后4小时对大鼠主动脉和肺中SSAO活性的剂量反应作用(平均值S.E.M.)。Ed50值:主动脉-5mg/kg;肺-0.72mg/kg;n=5。
附图7描绘了阻断SSAO/VAP-1对外周血单核细胞(PBMCs)和肥厚内皮细胞(HEC)之间结合的影响。附图7A是对照实验,显示了用于处理的多种化合物对PBMCs与VAP-1转染的肥厚内皮细胞粘着的影响;包括未处理的对照用于比较(MNT)。附图7B为表示用于处理的不同化合物对PBMCs与用VAP-1转染的肥厚内皮细胞粘着的作用的对照实验;包括未处理的对照组用于比较(VNT)。MNT:模拟转染的细胞,未处理;VNT:VAP-1-转染的细胞,未处理;VAP-1:用抗-VAP1抗体处理的细胞;Ex2:用实施例2的化合物处理的细胞;Ex8:用实施例8化合物处理的细胞;Semic:用氨基脲处理的细胞;Clog:用氯吉灵处理的细胞;Parg:用帕吉林处理的细胞。IC100值:氨基脲(SSAO)-500μM;氯吉灵(MAO-A)-250μM;帕吉林(MAO-B)-200μM;实施例2的化合物-150nM;实施例8的化合物-250nM;n=6。
附图8表示来自小鼠爪样品的18SrRNA和TNFα的RT-PCR扩增。附图8A:来自有代表性的动物的爪和趾的cDNA的RT-PCR扩增。附图8B:从来自三个不同组的所有动物取下右后爪并分离总RNA且用于如实施例17所述的定性RT-PCR研究。对每一样品测定来自TNF和18S带的光密度单位(DU)并且将它们的比值平均(±SD)。″化合物2″表示实施例2的化合物。
附图9表示在慢性多发性硬化模型中施用(2-苯基烯丙基)肼的改善作用。附图9A描绘了用PBS(磷酸缓冲盐水)治疗的小鼠与用(2-苯基烯丙基)肼治疗的小鼠的平均临床评分比较。附图9B描绘了用PBS(磷酸缓冲盐水)治疗与用(2-苯基烯丙基)肼治疗的小鼠的疾病发病率的百分比比较。附图9C描绘了用PBS(磷酸缓冲盐水)治疗的小鼠与用(2-苯基烯丙基)肼治疗的小鼠的小鼠中患慢性疾病百分比的比较。附图9D描绘了用PBS(磷酸缓冲盐水)治疗的小鼠与用(2-苯基烯丙基)肼治疗的小鼠中复发总数的比较。
附图10表示治疗施用后SSAO抑制对爪水肿减轻的作用。动物在角叉菜胶注射(箭头)后1小时接受实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼,30mg/kg,口服)、吲哚美辛(3mg/kg,口服)或PBS。在所示的时间处记录爪体积并且将其表示为注射前体积的百分比。N=8只动物/组;*p<0.05。
附图11表示指出SSAO抑制剂减小爪体积(附图11A)和爪渗出物中PGE2的水平(附图11B)的数据。8只动物/组在右侧后足垫中注射0.5%角叉菜胶前1小时接受(通过经口施用)PBS、吲哚美辛(3mg/kg)或实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼,50mg/kg)。还在注射角叉菜胶前1小时经腹膜内施用地塞米松(3mg/kg)。在注射角叉菜胶后3小时,处死动物,采集其爪的渗出物并通过ELISA测定PGE2水平。星号表示下列p值:*p<0.05;**p<0.01。
附图12表示显示SSAO/VAP-1抑制在鼠结肠炎模型中延长存活、减轻疾病症状和提高的组织学评分的数据。唑酮诱导的结肠炎为模拟人溃疡性结肠炎的小鼠模型。用3%唑酮使小鼠预先致敏(presensitize)(第0天),并且在5天后经直肠内用1%唑酮攻击(第5天)。用实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼,10mg/kg,每天两次,腹膜内)或PBS(每天两次,腹膜内)在第0天开始治疗。对EtOH组中的动物用3%唑酮预先致敏,随后在第5天时直肠内施用50%EtOH(载体)。附图12A表示对存活率的影响,而附图12B表示对体重的影响。在附图12A中,n=10,p<0.05;正方形表示EtOH组,三角形表示PBS组,圆形表示接受实施例2化合物的组。在附图12B中,n=10,星号*表示p<0.05的p值;正方形表示EtOH组,正三角形表示PBS组,倒三角形表示接受实施例2化合物的组。
附图13表示直肠内施用1%唑酮后2天患有唑酮诱导的结肠炎的小鼠中结肠炎的组织学评价(第7天)。将结肠固定并用H/E染色。在第0天用实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼,20mg/kg/天)或PBS开始处理。N=10只动物/治疗组。数据针对的是来自切片2的评分。使用GraphPadPrism软件(San Diego,CA)计算不配对t检验。双星号**表示p<0.01。
附图14表示治疗施用后SSAO抑制剂延长存活。用3%唑酮使小鼠预先致敏(第0天),并且在5天后经直肠内用1%唑酮攻击(第5天)。用实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼,10mg/kg,每天两次,腹膜内)或PBS(每天两次,腹膜内)在第6天开始治疗。N=10,p<0.05;正方形表示接受PBS的动物的数据点;菱形表示接受实施例2化合物的动物的数据点。
附图15表示用SSAO抑制剂口服施用减少了LPS-诱导的细胞因子产生和致死率。8只雌性小鼠/组腹膜内接受5mg/kg LPS注射。在LPS施用前1小时经口服施用载体(PBS)和实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼,50mg/kg)。同时经腹膜内施用地塞米松(3mg/kg)。在LPS注射后1、2、4和8小时采血并通过ELISA(R & D Systems)测定循环TNF-α和IL-6水平。星号*表示p<0.01。PBS数据如空框中所示,实施例2化合物的数据如灰色阴影框中所示,地塞米松的数据如黑色填充框中所示。
附图16表示实验结果,其中雌性小鼠接受腹膜内施用的LPS(2mg/kg)与300mg/kg D-半乳糖胺。在攻击时通过口腔管饲法递送实施例2的化合物((2-苯基烯丙基)肼)(1X)或在LPS注射后0和8小时时施用两次(2X)。列出了前14小时的存活率数据。用PBS治疗的小鼠的存活率为40%,而用实施例2化合物治疗一次或两次的小鼠的存活率分别为60和80%。
本发明的实施方式
本发明涉及用于抑制SSAO活性(其中酶活性是因可溶性SSAO酶或膜结合的VAP-1蛋白质或它们两者所致)和/或抑制与膜结合VAP-1蛋白质结合的多种化合物。本发明还涉及使用多种化合物抑制SSAO活性(其中酶活性是因可溶性SSAO酶或膜结合VAP-1蛋白质或它们两者所致)和/或抑制与膜结合VAP-1蛋白质结合的方法。本发明还涉及使用多种化合物治疗炎症或免疫疾病和减轻或抑制炎症和/或炎症反应的方法。
可以通过下文实施例14中的方案检测用于本发明的化合物的SSAO抑制活性。SSAO与单胺氧化酶的底物特异性相比部分重叠。因此,优选使用对SSAO的特异性抑制超过单胺氧化酶的化合物。可以通过下文实施例15中的方案检测所述化合物对SSAO的抑制活性与对MAO-A和MAO-B抑制活性相比较的特异性。用于本发明的具有的对SSAO的抑制活性(IC50)约<1μM,更优选为约100nM,并且更优选约10nM。优选用于本发明的化合物对SSAO具有的特异性与对MAO-A具有的特异性相比约为10,更优选约为100,更优选约为500(其中将对SSAO具有的特异性与对MAO-A具有的特异性相比定义为化合物对MAO-A的IC50与相同化合物对SSAO的IC50的比值;即具有对MAO-A的IC50为10μM和对SSAO具有IC50为20nM的化合物对SSAO具有的特异性与对MAO-A具有的特异性之比为500)。用于本发明的化合物对SSAO具有的特异性与对MAO-B具有的特异性相比为约10,更优选为约100,更优选为约500(其中将对SSAO具有的特异性与对MAO-B具有的特异性相比定义为化合物对MAO-B的IC50与相同化合物对SSAO的IC50的比值)。下表1中提供了用于本发明的几种化合物的实验值。
术语″抑制与VAP-1蛋白质的结合″意在指出抑制(可以包括部分到完全抑制)例如在表面上表达SSAO/VAP-1蛋白质的细胞与SSAO/VAP-1蛋白质结合配偶体之间的结合。例如,当在表面上表达SSAO/VAP-1蛋白质的细胞与表达SSAO/VAP-1蛋白质的结合配偶体的另一种细胞,诸如肥厚内皮细胞(HEC)发生相互作用时发生这类结合。因此,″抑制与VAP-1蛋白质的结合″包括抑制在表面上表达SSAO/VAP-1蛋白质的细胞与表达SSAO/VAP-1蛋白质的结合配偶体的另一种细胞之间的粘着。这类粘着包括:例如细胞滚动。如本说明书公开内容(包括实施例)中清楚地表明的,这类抑制可以在体外或体内发生。
本发明包括本文所述化合物的所有盐以及使用这类化合物的盐的方法。本发明还包括本文命名的化合物的任意盐的所有纯(非盐)化合物以及本文命名的化合物的任意盐的其它盐。在一个实施方案中,化合物的盐包括药学上可接受的盐。药学上可接受的盐为保留游离化合物的生物活性并且不是生物或者不希望的那些盐。可以通过本领域技术人员公知的方法,通过用酸处理化合物来制备所希望的碱性化合物的盐。无机酸的实例包括,但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。有机酸的实例包括,但不限于甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、磺酸和水杨酸。还可以制备碱性化合物与氨基酸形成的盐,诸如天冬氨酸盐和谷氨酸盐。可以通过本领域技术人员公知的方法,通过用碱处理化合物来制备所希望的酸性化合物的盐。酸性化合物的无机盐的实例包括,但不限于:碱金属和碱土金属盐,诸如钠盐、钾盐、镁盐和钙盐;铵盐;和铝盐。酸性化合物的有机盐的实例包括,但不限于普鲁卡因、二苄胺、N-乙基哌啶、N,N′-二苄基乙二胺和三乙胺。还可以制备酸性化合物与氨基酸形成的盐,诸如赖氨酸盐。
本发明还包括:所述化合物的所有立体异构体,包括非对映体和对映体;以及立体异构体的混合物,包括,但不限于外消旋混合物。除非化学结构或化学名中明确表示了立体化学,否则化学结构或化学名用以包括所示化合物的所有可能的立体异构体。此外,尽管画出的通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B和I-C仅带有所绘制的顺反异构体之一(其中将R1和R2描绘为彼此为顺式),但是该图用以包括具有顺式位置的R1和R2和反式位置的R1和R2的化合物(即单个图用于代表E和Z异构体,尽管仅画出了一种异构体)。
术语″烷基″指的是饱和脂族基团,包括直链、支链、环状基团及其组合,它们带有指定的碳原子数,或如果未指定碳原子数,那么带有至多12个碳原子。″直链烷基(straight-chain alkyl)″或″线性烷基(linear alkyl)″指的是既非环状又非支链的烷基,通常命名为″正-烷基″。烷基的实例包括,但不限于这类基团,诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、正戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、新戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基和金刚烷基。环烷基可以由一个环组成,包括,但不限于这类基团,诸如环庚基;或由多稠合环组成,包括,但不限于这类基团,诸如金刚烷基或降冰片基。
″取代的烷基″指的是被一个或多个取代基取代的烷基,所述取代基包括,但不限于:诸如卤素(氟、氯、溴和碘)、烷氧基、酰氧基、氨基、羟基、巯基、羧基、苄氧基、苯基、苄基、氰基、硝基、硫代烷氧基、醛(carboxaldehyde)、烷氧羰基和酰胺的基团;或如果对本发明的目的必要,可以适当被保护基封闭的官能团。取代的烷基的实例包括,但不限于-CF3、-CF2-CF3和其它全氟和全卤代基团;-CH2-OH;-CH2CH2CH(NH2)CH3等。
术语″链烯基″指的是不饱和的脂族基团,包括直链(线性)、支链、环状基团及其组合,它们带有指定的碳原子数,或如果未指定碳原子数,那么带有至多12个碳原子,它们含有至少一个双键(-C=C-)。链烯基的实例包括,但不限于:-CH2-CH=CH-CH3;和-CH2-CH2-环己烯基,其中乙基可以以任意可利用的碳原子价连接环己烯基部分。术语″炔基″指的是不饱和的脂族基团,包括直链(线性)、支链、环状基团及其组合,它们带有指定的碳原子数,或如果未指定碳原子数,那么带有至多12个碳原子,它们含有至少一个三键(-C≡-C-)。″烃链″或″烃基″指的是直链、支链或环状烷基、烯基或炔基的任意组合及其任意的组合。″取代的链烯基″、″取代的炔基″和″取代的烃链″或″取代的烃基″指的是被一个或多个取代基取代的各自基团,所述的取代基包括,但不限于诸如卤素、烷氧基、酰氧基、氨基、羟基、巯基、羧基、苄氧基、苯基、苄基、氰基、硝基、硫代烷氧基、醛、烷氧羰基和酰胺的基团;或如果对本发明的目的必要,可以适当被保护基封闭的官能团。
″芳基″或″Ar″指的是带有单环(包括,但不限于诸如苯基的基团)或二或多稠合环(包括,但不限于诸如萘基或蒽基的基团)的芳族碳环基,并且包括未被取代和取代的芳基。除非另有说明,芳基在环部分中含有6-12个碳原子。芳基的优选范围为在环部分中有6-10个碳原子。″取代的芳基″指的是被一个或多个取代基取代的芳基,所述的取代基包括,但不限于诸如烷基、链烯基、炔基、烃链、卤素、烷氧基、酰氧基、氨基、羟基、巯基、羧基、苄氧基、苯基、苄基、氰基、硝基、硫代烷氧基、醛、烷氧羰基和酰胺的基团;或如果对本发明的目的必要,可以适当被保护基封闭的官能团。″芳烷基″表示烷基-取代的芳基,其中任意的芳基可以与烷基连接;烷基部分为1-6个碳原子的直链或支链,优选烷基链含有1-3个碳原子。当将芳烷基表示为取代基时,该芳烷基可以以任意可利用的化合价连接到分子的剩余部分的烷基部分或芳基部分上;例如甲苯基芳烷基可以通过用分子剩余部分取代芳环部分上5个氢中任意一个或通过用分子的剩余部分取代甲基部分上的α-氢之一而与分子的剩余部分连接。优选芳烷基通过烷基部分与分子的剩余部分连接。
优选的芳基为苯基,它可以被取代或未被取代。被取代的苯基的优选取代基为:低级烷基(-C1-C4烷基)或卤素(氯(-Cl)、溴(-Br)、碘(-I)或氟(-F);苯基的优选卤素取代基为氯和氟)、羟基(-OH)或低级烷氧基(-C1-C4烷氧基),诸如甲氧基、乙氧基、丙氧基(propyloxy)(丙氧基(propoxy))(正-丙氧基或异-丙氧基)和丁氧基(正丁氧基、异-丁氧基、仲-丁氧基或叔-丁氧基);优选的烷氧基取代基为甲氧基。被取代的苯基优选带有一个或两个取代基;更优选一个取代基。
″杂烷基″、″杂烯基″和″杂炔基″指的是分别含有指定碳原子数(或如果不指定碳原子数,那么带有至多12个碳原子)、在基团的主链、支链或环状链上含有一个或多个杂原子的烷基、烯基和炔基。杂原子包括,但不限于N、S、O和P;优选N和O。杂烷基、杂烯基和杂炔基可以在杂原子(如果化合价可利用)或碳原子上与分子的剩余部分连接。杂烷基的实例包括,但不限于诸如-O-CH3、-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH3、-S-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH(CH3)-S-CH3、-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-、1-乙基-6-丙基哌啶子基和吗啉基的基团。杂烯基的实例包括,但不限于诸如-CH=CH-NH-CH(CH3)-CH2-的基团。″杂芳基″或″HetAr″指的是带有单环(包括,但不限于诸如吡啶基、咪唑基、噻吩或呋喃基这类实例)或两个或多个稠合环(包括,但不限于诸如中氮茚基或苯并噻吩基的实例)和在环上带有至少一个杂原子的芳族碳环基,所述的杂原子为诸如N、O、P或S。除非另有说明,杂烷基、杂烯基、杂炔基和杂芳基带有1-5个杂原子和1-12个碳原子。″取代的杂烷基″、″取代的杂烯基″、″取代的杂炔基″和″取代的杂芳基″指的是被一个或多个取代基取代的杂烷基、杂烯基、杂炔基和杂芳基,所述的取代基包括,但不限于这类基团:诸如烷基、链烯基、炔基、苄基、烃链、卤素、烷氧基、酰氧基、氨基、羟基、巯基、羧基、苄氧基、苯基、苄基、氰基、硝基、硫代烷氧基、醛、烷氧羰基和酰胺;或如果对本发明的目的必要,可以适当被保护基封闭的官能团。这类取代的杂烷基的实例包括,但不限于在氮或碳上被苯基或苄基取代并且通过碳或氮上的任意可利用的化合价与分子剩余部分连接的哌嗪、-NH-SO2-苯基、-NH-(C=O)O-烷基、-NH-(C=O)O-烷基-芳基和-NH-(C=O)-烷基。如果在化学上可能,那么基团的杂原子和/或碳原子可以被取代。如果在化学上可能,那么杂原子可以为氧化形式。
本文所用的术语″烷氧基″指的是与氧原子连接并且带有指定碳原子数或如果未指定碳原子数,那么带有至多12个碳原子的烷基、链烯基、炔基或者烃链。烷氧基的实例包括,但不限于这类基团,诸如甲氧基、乙氧基、丙氧基(propyloxy)(丙氧基(propoxy))(正-丙氧基或异-丙氧基)和丁氧基(正丁氧基、异-丁氧基、仲-丁氧基或叔-丁氧基)。上句中所列的基团为优选的烷氧基;特别优选的烷氧基取代基为甲氧基。
本文所用的术语″卤″和″卤素″指的是VIIa族元素(在1990 IUPAC周期表中的第17族元素,IUPAC Nomenclature of Inorganic Chemistry,Recommendations 1990)并且包括Cl、Br、F和I取代基。优选的卤素取代基为Cl和F。
″保护基″指的是表现出如下特性的化学基团:1)以良好产率与所希望的官能团选择性反应而得到被保护的对希望保护的计划反应稳定的底物;2)选择性地从被保护底物中除去以产生所希望的官能团;和3)可用与存在于这类计划反应或在其中产生的其它官能团相容的试剂以良好产率除去。合适的保护基的实例可以在Greene等(1991)《有机合成中的保护基》(Protective Groups in Organic Synthesis),3rd Ed.(John Wiley & Sons,Inc.,New York)中找到。氨基保护基包括,但不限于均三甲苯磺酰基(Mts)、苄氧羰基(CBz或Z)、叔丁氧羰基(Boc)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS或TBDMS)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、甲苯磺酰基、苯磺酰基、2-吡啶基磺酰基或合适的对光不安的保护基,诸如6-硝基藜芦基氧基羰基(Nvoc)、硝基胡椒基、芘基甲氧羰基、硝基苄基、二甲基二甲氧基偶苯酰、5-溴-7-硝基二氢吲哚基等。羟基保护基包括,但不限于Fmoc、TBS、对光不安的保护基(诸如硝基藜芦基氧基甲基醚(Nvom))、Mom(甲氧基甲基醚)和Mem(甲氧基乙氧基甲基醚)、NPEOC(4-硝基苯乙基氧基羰基)和NPEOM(4-硝基苯乙基氧基甲氧羰基)。
一般合成方法
可以通过多种方法制备本文所述通式的化合物。便利的是使用1,2-取代的丙烯作为原料制备通式I的化合物(参见下文的实施例1-10)。使用良好的离去基团(LG),例如通过溴化将丙烯的甲基衍生成3-溴-1,2-取代的丙烯。
与N-保护的羟基胺化合物HON(R3)(PG)反应,其中PG为保护基(例如N-Boc羟基胺(N-羟基氨基甲酸叔丁酯)),或与单-保护的肼化合物H(R6)N-N(R3)(PG)(例如N-Boc肼(肼基甲酸叔丁酯))反应,得到通式I的化合物,其中X分别=O或NR6。
便利的是通过下列合成途径,以商购苯乙酸(苯基乙酸、α-甲基苯甲酸;Aldrich;相当于如下反应方案中n=0)或3-苯基丙酸(氢化肉桂酸;Aldrich;相当于如下反应方案中n=1)为原料制备通式I的某些化合物(例如通式I-B或通式I-C的化合物)。可以使用苯基取代的苯乙酸或苯基取代的3-苯基丙酸合成通式I-B和通式I-C的其它化合物。
按照Hin,B.等在《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)67:7365-7368(2002)中所示的操作步骤将酸转化成(2-苄基)丙烯酸甲酯或(2-苯乙基)丙烯酸甲酯(参见由6b制备8b的操作步骤,在7367-7368页上的苯乙酸)。简单的说,将在二氯甲烷中的二环己基碳二亚胺(DCC)加入到苯乙酸或3-苯基丙酸、梅钟酸(Meldrum’s acid)(2,2-二甲基-1,3-二烷-4,6-二酮)和二甲基氨基吡啶的溶液中并且在0℃下反应过夜。过滤该溶液,洗涤并干燥,酸化,且然后加入NaBH4并且使反应在0℃下过夜进行。洗涤该溶液,干燥并浓缩,并且通过重结晶或硅胶层析纯化产物,从而得到5-取代的梅钟酸中间产物。然后在65℃下将梅钟酸中间产物与二甲基甲叉碘化铵(dimethylmethyleneimmonium iodide)在无水甲醇中一起搅拌过夜。浓缩该反应混合物,溶于二乙醚,洗涤,干燥并浓缩至得到(2-苄基)丙烯酸甲酯或(2-苯乙基)丙烯酸甲酯。
然后使上述产物(2-苄基)丙烯酸甲酯(n=0)或(2-苯乙基)丙烯酸甲酯(n=1)化合物进行DIBAL还原,使得所述酯类还原成醇类(2-苯乙基-2-丙烯-1-醇(n=0)或2-(3-苯基丙基)-2-丙烯-1-醇(n=1)):
然后使用N-(Boc-氨基)苯邻二甲酰亚胺(N′-Boc-N,N-邻苯二甲酰肼;购自Fluka,Switzerland)使所述醇类进行Mitsunobu反应(参见Brosse等,《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)41,205(2000);Brosse等,《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)66,2869(2001);Brosse等,《有机化学杂志》(Journalof Organic Chemistry),65(14),4370-4374(2000);另外参见下文的实施例10;还参见Hughes,D.L.《有机反应》(Org.Reac.)42:335-656(1992)和Mitsunobu,O.等,《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)94:679(1972)),得到如下产物:
随后除去保护基而得到:
(2-苯乙基烯丙基)肼(n=0)[2-(3-苯基丙基)烯丙基]肼(n=1)。
便利的是通过几种方法制备通式II的化合物。一种这类方法使用1,1-二取代的环氧乙烷作为原料,它与通式HON(R14)PG的化合物反应,其中PG为保护基且R10如通式II中所示(参见下文的实施例11和12)。
然后使羟基氧进行进一步衍生并且在合成结束时除去保护基。
便利的是通过多种方法制备通式III的化合物。一种这类方法(参见下文的实施例13)使用苄基氰(苯基乙腈)原料。苯环可以任选地被取代。可以使用其它基团,诸如烷基、环烷基、芳基(取代的或未被取代的)或杂芳基(取代的或未被取代的),例如2-吡啶基乙腈。用强位阻碱,诸如双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾处理苄基氰,随后添加在1和2位上被良好离去基取代的乙基化合物,诸如1,2-二溴乙烷。该步骤产生1-苯基,1-氰基环丙烷化合物。
然后可以通过本领域中公知的方法还原氰基(诸如通过添加氢化铝锂)而得到相应的胺化合物。
可以使由此产生的氨基与多种试剂,例如烷基溴、醛类或酮类反应,随后还原酰基化合物,随后还原等,从而将R22基团引入氮上。
用于合成用于制备通式III-B和通式III-C化合物的通式III化合物的另一种途径特别描述在如下方案中(其中Ar表示芳基,诸如C6-C10取代或未被取代的芳基)。使环丙烷腈(环丙基氰;Aldrich)与碱(诸如二异丙基酰胺锂,LDA)反应,随后与取代的烷基溴反应;然后将腈基还原成氨基:
例如使(2-溴乙基)苯与碱反应,随后与环丙烷腈反应,从而得到中间产物(1-苯乙基)环丙烷腈,将其还原成(1-苯乙基环丙基)甲胺;使苄基溴(α-溴甲苯)与碱反应,随后与环丙烷腈反应,从而得到中间产物1-苄基环丙烷腈,将其还原成(1-苄基环丙基)甲胺。
使用方法
可以以多种方式使用本文所述的化合物。一种这类用途为治疗炎症、炎性疾病、炎症反应和某些其它疾病,如下文″疾病的治疗″中更具体地描述。其它用途包括在体内还是在体外抑制SSAO活性和/或VAP-1结合活性或VAP-1胺氧化酶活性。化合物体外应用的实例为试验,诸如常规试验或高效筛选试验中的用途。
疾病的治疗
本文所述的化合物用于治疗炎症和炎性疾病并且用于治疗免疫和自身免疫疾病。这些化合物还用于治疗由炎症或免疫疾病导致或特征在于炎症或免疫疾病的多种疾病中的一种或多种。因此,这些化合物可以用于治疗由炎症导致的疾病并且还可以用于治疗引起炎症的疾病。这些化合物用于治疗哺乳动物,优选人。将用本文所述的化合物″治疗″疾病定义为将本文所述化合物中的一种或多种与或不与其它治疗剂一起施用,以便预防、减轻或消除疾病或疾病的一种或多种症状,或延缓疾病或疾病的一种或多种症状的发展,或减轻疾病或疾病的一种或多种症状的严重程度。将用本文所述的化合物的″治疗用途″定义为使用本文所述化合物中的一种或多种治疗如上定义的疾病。化合物的″治疗有效量″为该化合物的用量,在对受试者施用时,该用量足以预防、减轻或消除疾病或疾病的一种或多种症状,或延缓疾病或疾病的一种或多种症状的发展,或减轻疾病或疾病的一种或多种症状的严重程度。可以将″治疗有效量″分一次或多次施用给予。
可以用本发明化合物和方法治疗的受试者包括脊椎动物,优选哺乳动物,更优选人。
可以用本发明化合物和方法治疗的疾病包括炎症、炎症反应、炎性疾病和免疫疾病。应注意炎性疾病可以由免疫疾病导致并且免疫疾病通常伴有炎症,且由此可以用本发明的化合物和方法同时治疗炎症和免疫疾病。可以用本发明化合物和方法治疗的疾病包括,但不限于:多发性硬化(包括慢性多发性硬化);滑膜炎;全身炎性脓毒症;炎性肠病;克罗恩病;溃疡性结肠炎;阿尔茨海默氏病;动脉粥样硬化;类风湿性关节炎;青少年类风湿性关节炎;肺部炎性病症;哮喘;皮肤炎性病症和疾病;接触性皮炎;肝炎和自身免疫病;自身免疫性肝炎;原发性胆汁性肝硬变;硬化性胆管炎;自身免疫性胆管炎;酒精性肝病;I型糖尿病和/或其并发症;II型糖尿病和/或其并发症;动脉粥样硬化;缺血性疾病,诸如中风和/或其并发症;和心肌梗死。在另一个实施方案中,通过本发明治疗的炎性疾病或免疫疾病为多发性硬化。在另一个实施方案中,通过本发明治疗的炎性疾病或免疫疾病为慢性多发性硬化。在另一个实施方案中,用本发明治疗的炎性疾病或免疫病症为因中风导致的炎症并发症。
施用方式
可以通过本领域中公知的任意途径将用于本发明的化合物对哺乳动物,优选对人施用,包括,但不限于本文公开的那些途径。施用方法包括,但不限于静脉内、口服、动脉内、肌内、局部、通过吸入(例如作为雾或喷雾剂)、通过鼻粘膜、皮下、经皮、腹膜内、胃肠和直接针对具体或受侵袭的器官。口服施用是优选的施用途径。可以以片剂、丸剂、粉末混合物、胶囊剂、粒剂、注射剂、霜剂、溶液剂、栓剂、乳剂、分散体、食品预混合物的形式和其它合适的形式施用为本文用途所述的化合物。还可以以脂质体制剂的形式施用所述化合物。还可以将所述化合物作为前体药物施用,其中前体药物在所治疗的受试者体内转化成治疗有效的形式。其它施用方法是本领域中公知的。
可以在约0.1μg/kg-约300mg/kg剂量范围内或约1.0μg/kg-约40mg/kg体重剂量范围内或约1.0μg/kg-约20mg/kg体重剂量范围内,优选约1.0μg/kg-约10mg/kg体重剂量范围内的有效量施用本发明的化合物。可以将本发明的化合物以单次日剂量施用,或可以将总日剂量分成每天2、3或4次分剂量施用。
便利的是将含有本文所述化合物的药物剂型与无毒性药物有机载体或无毒性药物无机载体混合。典型的药学上可接受的载体包括:例如甘露糖醇、脲、葡聚糖、乳糖、马铃薯和玉米淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇类、乙基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、碳酸钙、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、苯甲酸苄酯、碳酸钠、明胶、碳酸钾、硅酸和其它常用的可接受的载体。药物剂型还可以含有无毒性的辅助物质,诸如乳化剂、防腐剂或湿润剂等。合适的载体为不会导致不能忍受的副作用,但允许化合物在体内保持其药理活性的载体。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的制剂是本领域中公知的并且描述在《Remington:制药科学与实践》(Remington:The Science和Practice of Pharmacy)20th Edition,Lippincott,Williams & Wilkins(2000)中。可以使用本领域众所周知的常用压片机和胶囊填充机配制固体剂型,诸如片剂、胶囊剂和粉剂。固体剂型,包括用于口服施用的单位剂型呈递形式的片剂和胶囊可以含有任意数目的本领域中公知的其它非活性组分,包括常用添加剂,如:赋形剂;干燥剂;着色剂;粘合剂,例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、西黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮;填充剂,例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘油;压片润滑剂,例如硬脂酸镁。滑石、聚乙二醇或二氧化硅;崩解剂,例如马铃薯淀粉;或可接受的润滑剂,诸如十二烷基硫酸钠。可以按照标准制药实践众所周知的方法给片剂包衣。使用公知的液体载体,包括水性和非水性载体配制用于摄取的液体形式,所述载体为诸如无菌水、无菌盐水、混悬液、水包油和/或油包水型乳剂等。液体制剂也可以含有任意数目的其它非活性组分,包括着色剂、芳香剂、调味剂、粘度调节剂、防腐剂、稳定剂等。为了进行肠胃外施用,可以将用于本发明的化合物作为该化合物在生理上可接受的稀释剂或无菌液体载体,诸如水、盐水或油中的含有或不含其它表面活性剂或佐剂的溶液剂或混悬剂的可注射剂量施用。载体油的解释性实例包括动物油和植物油(例如花生油、大豆油)、石油来源的油(例如矿物油)和合成的油。一般来说,就可注射的单位剂量而言,无菌液体,诸如水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液和乙醇和二元醇溶液,诸如丙二醇或聚乙二醇为优选的液体载体。
优选配制所选药物单位剂量并将其施用以便提供药物在血液、组织、器官或其它体内靶向区域中的确定的终浓度。可以根据经验确定本发明化合物的最佳有效浓度且其取决于疾病的类型和严重程度、施用途径、疾病的发展和健康、患者体重和身体面积。这类测定属于本领域技术人员的范围内。可以将用于本发明的化合物作为单一活性组分施用,或可以将它们与另一种活性组分联合施用。
药盒
本发明还提供了含有用于治疗疾病的材料的制品和药盒,所述的疾病为诸如:炎性疾病;自身免疫病;多发性硬化(包括慢性多发性硬化);滑膜炎;全身炎性脓毒症;炎性肠病;克罗恩病;溃疡性结肠炎;阿尔茨海默氏病;动脉粥样硬化;类风湿性关节炎;青少年类风湿性关节炎;肺部炎性病症;哮喘;皮肤炎性病症和疾病;接触性皮炎;肝炎和自身免疫病;自身免疫性肝炎;原发性胆汁性肝硬变;硬化性胆管炎;自身免疫性胆管炎;酒精性肝病;I型糖尿病和/或其并发症;II型糖尿病和/或其并发症;动脉粥样硬化;缺血性疾病,诸如中风和/或其并发症;和心肌梗死;或所述的制品或药盒用于抑制SSAO酶活性(无论是该酶活性是因可溶性SSAO酶或膜结合的VAP-1蛋白质还是因它们两者所致)和/或抑制与VAP-1蛋白质的结合。所述的制品包括带有标签的容器。合适的容器包括:例如瓶、小瓶和试管。容器可以由多种材料制成,诸如玻璃或塑料。容器可以容纳含有活性剂的组合物,所述的活性剂可有效治疗疾病或用于抑制SSAO或VAP-1酶活性或与VAP-1蛋白质的结合。组合物中的活性剂为通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B,和/或III-C化合物中的一种或多种。容器上的标签表示组合物用于治疗疾病,诸如炎性或自身免疫病或用于抑制SSAO或VAP-1酶活性或与VAP-1蛋白质的结合,并且还可以表示体内或体外使用,诸如如上所述的那些用途的说明书。
本发明还提供了药盒,它包含通式I、I-P、I-A、I-AP、I-B、I-C、II、III、III-A、III-B,和/或III-C化合物中的任意一种或多种。在某些实施方案中,本发明的药盒包含上述容器。在其它实施方案中,本发明的药盒包含上述容器和包含缓冲剂的第二种容器。它可以进一步包括依据商业和使用者观点所希望的物质,包括其它缓冲剂、稀释剂、填充剂、注射针头、注射器和带有实施本文所述的任意方法(诸如用于治疗自身免疫或炎性疾病的方法和用于抑制SSAO或VAP-1酶活性或与VAP-1蛋白质的结合的方法)的技术说明的包装说明书。
在其它方面中,所述的药盒可以用于本文所述的任意方法,包括,例如用于治疗患有自身免疫或炎性疾病的个体,诸如多发性硬化或缺血性疾病(诸如中风)及其后遗症。
将由鉴定的引证内容披露的所有公开文献、专利、专利申请和公布的专利申请的全部内容引入本文作为参考。
通过下列非限制性实施例进一步理解本发明。术语″实施例X的化合物″在本文中使用时指的是实施例标题中的化合物;例如实施例8的化合物指的是N-[2-(4′-氟苯基)-烯丙基]-肼盐酸盐,而实施例10的化合物指的是(E)-1-氟-2-苯基-3-肼基丙烯盐酸盐。应注意,尽管一般将化合物描述为盐,但是本说明书特别包括化合物的非盐形式以及该化合物的任意其它盐;例如N-[2-(4′-氟苯基)-烯丙基]-肼盐酸盐作为N-[2-(4′-氟苯基)-烯丙基]-肼的非盐化合物披露。
实施例
实施例1
O-(2-苯基-烯丙基)-羟基胺盐酸盐
将α-甲基苯乙烯(17.73g,150mmol)和N-溴琥珀酰亚胺(17.80g,100mmol)的混合物在安装了回流冷凝器和磁性搅拌器的烧瓶内溶于CCl4(20ml)。将该体系加热至混合物回流。使反应缓和以维持缓慢回流3小时,然后冷却至室温。通过过滤分离沉淀的琥珀酰亚胺。在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,100%己烷)。得到产物α-溴甲基苯乙烯,其为油状物(13.0g,66%)。
将HONHBoc(5.99g,45.0mmol)和NaOH(1.8g,45.0mmol)在MeOH(20ml)中的溶液在室温下搅拌1小时。向该混合物中滴加α-溴甲基苯乙烯(5.91g,30.0mmol)在MeOH(5ml)中的溶液。将所得反应混合物在N2环境中保持缓慢回流过夜。在真空中浓缩该混合物。用H2O稀释残余物且然后用EtOAc(3×20ml)萃取。干燥合并的有机层(MgSO4)并过滤。在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,10% EtOAc/己烷)。得到N-叔丁氧羰基-O-(2-苯基烯丙基)羟基胺(4.0g),其为白色固体。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.25-7.58(m,5H),7.65(s,1H),5.42(s,1H),4.79(s,2H),1.52(s,9H)。
向N-叔丁氧羰基-O-(2-苯基烯丙基)羟基胺(2.0g,8.0mmol)在乙醚(5ml)中的溶液中加入1M HCl在乙醚中的溶液(20ml,20mmol)。将所得混合物在室温下N2中搅拌3小时。通过过滤收集沉淀,用乙醚(3×20ml)洗涤且然后在真空中干燥。得到O-(2-苯基-烯丙基)-羟基胺盐酸盐(0.80g,67%)。mp 101-102℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.25-7.52(m,5H),5.75(s,1H),5.45(s,1H),4.89(s,2H)。
实施例2
2-(苯基-烯丙基)-肼盐酸盐
“实施例2的化合物”指的是(2-苯基-2-丙烯基)肼(CAS注册号65814-30-4),也称作(2-苯基烯丙基)肼,它是本实施例的产物(参见本实施例中最后的结构)。将NH2NHBoc(3.96g,30mmol)和Et3N(3.04g,30mmol)在MeOH(15ml)中的混合物在室温下搅拌20分钟。向该混合物中加入α-溴甲基苯乙烯(2.96g,15mmol)。将所得混合物缓慢回流并通过TLC监测。在回流约3小时后,TLC显示反应完成。在真空中浓缩该反应混合物。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,10% EtOAc/己烷)而得到3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-苯基丙烯(1.34g,39%),其为白色固体。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.26-7.55(m,5H),5.50(s,1H),5.30(s,1H),3.90(s,2H),1.52(s,9H)。
向3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-苯基丙烯(1.0g,4mmol)在乙醚(5ml)中的溶液中加入1M HCl在乙醚中的溶液(20ml,20mmol)。将该溶液在室温下N2中搅拌5小时。TLC显示反应未完成。因此,在真空中浓缩该混合物。将残余物溶于无水MeOH(3ml)。向该溶液中加入1M HCl在乙醚中的溶液(20ml,20mmol)。将所得混合物在室温下N2中搅拌3小时。TLC显示反应完成。通过过滤收集形成的固体,用乙醚洗涤且然后在真空中干燥。得到白色结晶固体(0.36g,48%)。mp:153-154.5℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.25-7.42(m,5),5.60(s,1H),5.40(s,1H),4.05(s,2H)。将该化合物命名为实施例2的化合物(2-苯基-2-丙烯基)肼(也称作(2-苯基烯丙基)肼),结构如下所示。
实施例3
N-[2-(4′-氯苯基)-烯丙基]-肼盐酸盐
将肼基甲酸叔丁酯(6.61g,50mmole)和Et3N(5.06g,50mmole)在MeOH(40ml)中的混合物在室温下搅拌20分钟。向该搅拌的混合物中加入4-氯-α-溴甲基苯乙烯(按照Yamanaka,M.等在《四面体通讯》(TetrahedronLett.)2002,43,2403-2406中所述的步骤制备)(6.95g,30mmol)。将所得混合物加热至回流并通过TLC监测。TLC显示在回流3小时后反应完成。在真空中浓缩该混合物。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,5% EtOAc/己烷)。得到3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯,其为白色固体(2.70g,20%)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.42(d,J=8.4Hz,2H),7.29(d,J=8.4Hz,2H),5.45(s,1H),5.28(s,1H),3.85(s,2H),1.45(s,9H)。
向3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯(0.78g,2.76mmol)在MeOH(4ml)中的溶液中加入HCl在乙醚中的溶液(2M,5.0ml,10mmol)。将该溶液在室温下搅拌过夜。在真空中浓缩该反应混合物。用乙醚洗涤所得固体,得到2-(4′-氯苯基)-烯丙基肼盐酸盐,其为白色固体(0.61g,100%)。Mp:124-126℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.40(d,J=9Hz,2H),7.35(d,J=9Hz,2H),5.65(s,1H),5.43(s,1H),4.06(s,2H)。
实施例4
N-[2-(4′-氯-苯基)-烯丙基]-N-甲基-肼盐酸盐
将3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯(参见实施例3)(1.00g,3.54mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.91g,7.08mmol)在DMF(10ml)中的混合物在室温下和N2中搅拌20分钟,此后滴加MeI(1.00g,7.08mmol)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌过夜。然后在真空中浓缩该体系。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,5% EtOAc/己烷)。得到3-(N-甲基-N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯,其为白色固体(0.82g,78%)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.48(d,J=9Hz,2H),7.26(d,J=9Hz,2H),5.45(s,1H),5.23(s,1H),3.73(br s,2H),2.60(s,3H),1.40(s,9H)。
向3-(N-甲基-N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯(0.82g,2.76mmol)在MeOH(5ml)中的混合物中加入HCl在乙醚中的溶液(2M,5ml,10mmol)。将该反应混合物在室温下和N2中搅拌过夜。然后在真空中浓缩该体系。用乙醚洗涤残余物。通过过滤收集形成的固体。得到N-[2-(4′-氯苯基)-烯丙基]-N-甲基-肼盐酸盐,其为白色固体(0.6g,94%)。Mp:132-134℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.27-7.52(m,4H),5.70(s,1H),5.50(s,1H),4.09(s,2H),2.76(s,3H)。
实施例5
N-[2-(4′-氯苯基)-烯丙基]-N-乙基-肼盐酸盐
将3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯(参见实施例3)(0.42g,1.49mmole)和N,N-二异丙基乙胺(0.38g,2.97mmol)在DMF(10ml)中的混合物在室温下和N2中搅拌20分钟。向该搅拌的混合物中加入EtI(0.46g,2.97mmol)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌4天。然后在真空中浓缩该体系。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,5% EtOAc/己烷)。得到3-(N-乙基-N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯,其为油状物(0.38g,83%)。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.26-7.52(m,4H),5.45(s,1H),5.25(s,1H),3.77(br s,2H),2.80(br s,2H),1.38(s,9H),1.04(t,J=6.3Hz,3H)。
向3-(N-乙基-N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯(0.38,1.221)在MeOH(3ml)中的混合物中加入HCl在乙醚中的溶液(2M,4ml,8mmol)。将该反应混合物在室温下和N2中搅拌过夜。然后在真空中浓缩该体系。用乙醚洗涤残余物。通过过滤收集形成的固体。得到N-[2-(4′-氯苯基)-烯丙基]-N-乙基-肼盐酸盐,其为白色固体(0.27,90%)。Mp:150-151℃。1HNMR(D2O,300MHz)δ7.25-7.46(m,4H),5.68(s,1H),5.50(s,1H),4.11(s,2H),3.07(q,J=7.2Hz,2H),1.12(t,J=7.2Hz,3H)。
实施例6
N-[2-(4′-氯苯基)-烯丙基]-N,N′-二甲基肼盐酸盐
向3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯(参见实施例3)(0.42g,1.49mmol)在DMF(10ml)中的溶液中加入氢化钠(0.11g,4.47mmol)。将该混合物在室温下和N2中搅拌20分钟。然后一次加入MeI(0.63g,4.47mmol)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌过夜。在真空中浓缩该体系。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,5% EtOAc/己烷)。得到3-(N,N′-二甲基-N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯,其为无色油状物(0.29g,63%)1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.46(d,J=8.7,2H),7.26(d,J=8.7Hz,2H),5.43(s,1H),5.22(s,1H),3.75(br s,2H),2.73(s,3H),2.59(br s,3H),1.43(s,9H)。
向3-(N,N′-二甲基-N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氯苯基)丙烯(0.29g,0.93mmol)在MeOH(3ml)中的混合物中加入HCl在乙醚中的溶液(2M,4ml,8mmol)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌过夜。然后在真空中浓缩该体系。用乙醚洗涤残余物。通过过滤收集形成的固体。得到N-[2-(4′-氯苯基)-烯丙基]-N,N′-二甲基肼盐酸盐,其为白色固体(0.17g,74%)。Mp:108-110℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.27-7.56(m,4H),5.60(s,1H),5.42(s,1H),3.93(s,2H),2.70(s,3H),2.58(s,3H)。
实施例7
N-[2-(4′-氟苯基)-烯丙基]-N′-甲基肼盐酸盐
向4-氟-α-甲基苯乙烯(13.62g,100mmol)和NBS(21.36g,120mmol)在CH2Cl2/THF(4∶1,50ml)中的混合物中加入Yb(OTf)3(3.1g,5mmol)和5mol% TMSCl(0.54g)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌2小时。TLC显示原料消失。在真空中浓缩该反应混合物。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,100%己烷)得到4-氟-α-溴甲基苯乙烯,其为油状物(13.54g,63%)。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ,7.47(br s,2H),7.37(br s,2H),5.50(s,1H),5.47(s,1H),4.36(s,2H)。
向二叔丁基肼基二甲酸盐(9.29g,40mmol)和NaH(0.96g,40mmol)在DMF(40ml)中的混合物中加入4-氟-α-溴甲基苯乙烯(6.45g,30mmol)。在室温下和N2中搅拌所得反应混合物并通过TLC监测。当TLC显示反应完成时,在真空中浓缩该体系。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,0-5% EtOAc/己烷)。得到3-(N,N′-二-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氟苯基)丙烯,其为油状物(8.33g,83%)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.42(br s,2H),7.01(br s,2H),5.42(br s,1H),5.17(s,1H),4.50(s,2H),1.43(s,18H)。
将3-(N,N′-二-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氟苯基)丙烯(1.0g,2.73mmol)和NaH(0.11g,4.55mmol)在DMF(30ml)中的混合物在室温下和N2中搅拌20分钟。向该混合物中滴加MeI(0.65g,4.55mmol)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌过夜。在真空中浓缩该体系。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,0-5% EtOAc/己烷),得到油状物(1.12g)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.48(br s,2H),7.03(br s,2H),5.49(s,1H),5.20(s,1H),4.10(br s,2H),2.75(s,3H),1.45(s,18H)。
向3-(N,N′-二-叔丁氧羰基-N′-甲基肼基)-2-(4′-氟苯基)丙烯(1.12g,2.94mmol)在MeOH(4.0ml)中的混合物中加入HCl在乙醚中的溶液(2M,6.0ml,12mmol)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌过夜。在真空中除去溶剂和过量的HCl。用乙醚将残余物洗涤几次,然后干燥得到N-[2-(4′-氟苯基)-烯丙基]-N′-甲基肼盐酸盐,其为白色固体(0.56g,88%)。Mp:128-129℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.41(br s,2H),7.03(br s,2H),5.50(s,1H),5.29(s,1H),3.95(s,2H),2.67(s,3H)。
实施例8
N-[2-(4′-氟苯基)-烯丙基]-肼盐酸盐
将肼基甲酸叔丁酯(6.61g,50mmole)和Et3N(5.06g,50mmole)在MeOH(40ml)中的混合物在室温下搅拌20分钟。向该搅拌的混合物中加入4-氟-α-溴甲基苯乙烯(参见实施例7)(6.45g,30mmol)。将所得混合物加热至回流并通过TLC监测。TLC显示在回流3小时后反应完成。在真空中浓缩该混合物。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,5-10% EtOAc/己烷)。得到3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氟苯基)丙烯,其为白色固体(1.9g,24%)。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.42-7.52(m,2H),7.02(t,J=8.4Hz,2H),5.43(s,1H),5.27(s,1H),3.87(s,2H),1.47(s,9H)。
将3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-(4′-氟苯基)丙烯(0.8g,3.0mmol)和HCl在乙醚中的溶液(2.0M,5.0ml,10mmol)在MeOH(4.0ml)中的混合物在室温下和N2中搅拌过夜。在真空中浓缩该体系。用乙醚将白色固体残余物洗涤几次,通过过滤收集,然后干燥。得到N-[2-(4′-氟苯基)-烯丙基]-肼盐酸盐,其为白色固体(0.55g,83%)。Mp:149-150℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.35-7.46(m,2H),7.05(t,J=8.4Hz,2H),5.58(s,1H),5.38(s,1H),4.04(s,2H)。
实施例9
(2-甲基-烯丙基)肼盐酸盐
将肼基甲酸叔丁酯(1.72g,13mmol)和Et3N(1.81ml,13mmol)在MeOH(25ml)中的混合物在室温下搅拌20分钟。向该搅拌的混合物中加入3-溴-2-甲基丙烯(1.26ml,12.5mmol)。将所得混合物加热至回流并通过TLC监测。TLC显示在回流3小时后反应完成。在真空中浓缩该混合物。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,20% EtOAc/己烷)得到3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-甲基-丙烯,其为油状物(0.7g,30%)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ4.92(br s,2H),3.43(s,2H),1.78(s,3H),1.46(s,9H)。
向3-(N′-叔丁氧羰基肼基)-2-甲基-丙烯(0.7g,3.76mmol)在MeOH(5.0ml)中的溶液中加入HCl在1,4-二烷中的溶液(4M,3.8ml,15.2mmol)。将所得混合物在室温下和N2中搅拌过夜。然后在真空中浓缩该体系而得到固体。用乙醚和EtOAc洗涤该固体,然后干燥。得到白色固体(0.4g,87%)。1H NMR(D2O,300MHz)δ5.05(s,1H),4.95(s,1H),3.53(s,2H),1.65(s,3H)。
实施例10
(E)-1-氟-2-苯基-3-肼基丙烯盐酸盐
向冷却的(E)-2-苯基-3-氟烯丙基醇(通过使用McDonald;I.A.等在《药物化学杂志》(J.Med.Chem.)(1985),28,186-193中所述的操作步骤合成)(1.1g,7.47mmol)、N-叔丁氧羰基氨基苯邻二甲酰亚胺(按照Brosse;N.等在《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)(2000),65,4370-4374中所述的操作步骤制备)(1.95g,7.47mmol)和PPh3(2.94g,11.22mmol)在THF(120ml)中的溶液中一次加入DEAD(1.8ml,11.09mmol)。将所得混合物在室温下和N2气环境中搅拌过夜。然后将该体系在真空中浓缩。将残余物在EtOAc中研磨并过滤。在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,10% EtOAc/己烷)而得到油状物(1.3g,44%)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.71-7.95(m,5H),7.15-7.55(m,4H),6.81(2d,J=81.3Hz,1H),4.64,4.55(2s,2H),1.44,1.30(2s,9H)。
将N-[(E)-2-苯基-3-氟烯丙基]-N-叔丁氧羰基氨基-苯邻二甲酰亚胺(1.3g,3.28mmol)、H2NNHMe(0.26ml,4.72mmol)在THF(50ml)中的混合物在室温下和N2环境中搅拌24小时,然后在真空中浓缩。用EtOAc洗涤残余物。形成白色固体。将其过滤并用EtOAc洗涤。浓缩滤液至得到半固体(0.90g)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.21-7.53(m,5H),6.78(d,J=83.1Hz,1H),4.26(s,2H),1.40(s,9H)。将其不经进一步纯化而直接用于下一步。
将1-[(E)-2-苯基-3-氟烯丙基]-1-叔丁氧羰基肼(0.98g,3.27mmol)和在1,4-二烷(4.0ml,16mmol)中的4M HCl在MeOH(5ml)中的混合物在室温下和N2气环境中搅拌过夜。在真空中浓缩该混合物。用乙醚将残余物洗涤几次。通过过滤收集形成的固体并干燥至得到(E)-1-氟-2-苯基-3-肼基丙烯盐酸盐,其为白色固体(0.35g,53%)。Mp:139-141℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.22-7.47(m,5H),6.96(d,J=81.0Hz,1H),3.89(s,2H)。
实施例11
2-氨基氧基-1-苯基-乙醇盐酸盐
将HONHBoc(5.59g,42mmol)和NaOH(1.7g,42mmol)在MeOH(15ml)中的混合物在室温下搅拌1小时。然后向该搅拌的溶液中滴加氧化苯乙烯(2.52g,21mmol)在MeOH(3ml)中的溶液。将所得混合物加热至保持缓慢回流并通过TLC监测。在回流3小时后,TLC显示反应完成。在真空中浓缩该反应混合物。用H2O稀释残余物,用EtOAc(3×20ml)萃取。干燥合并的有机层(MgSO4)且然后过滤。在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,15% EtOAc/己烷),得到2-(N-叔丁氧羰基氨基氧基)-1-苯基乙醇(0.95g,18%)。mp 97-99℃。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.25-7.35(m,5H),4.99(dd,J=9.9,2.4Hz,1H),3.95(dd,J=11.7,9.0Hz,1H),3.77(dd,J=11.7,9.9Hz,1H),1.52(s,9H)。
向2-(N-叔丁氧羰基氨基氧基)-1-苯基乙醇(100mg,0.395mmol)在乙醚(5ml)中的溶液中加入1M HCl在乙醚(2.0ml,2mmol)中的溶液。将该反应混合物在室温下和N2环境中搅拌3小时。形成固体并沉淀。通过过滤收集该固体,用乙醚洗涤且然后在真空中干燥而得到2-氨基氧基-1-苯基-乙醇,其为白色结晶固体(40mg,53%)。Mp 131-132℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ7.30(m,5H),4.99(t,J=5.7Hz,1H),4.10(d,J=5.4Hz,2H)。
实施例12
2-氨基氧基-1-(3′,4′-二甲氧基苯基)-乙醇盐酸盐
向冷却的NaH(0.25g,10.42mmol)在THF(20ml)中的溶液中滴加碘化三甲基锍(2.08g,10mmol)在DMSO(20ml)中的溶液。将所得混合物在0℃下和N2气环境中搅拌10分钟,此后加入3,4-二甲氧基苯甲醛(1.66g,10.00mmol)在THF(5ml)中的溶液。将所得反应混合物在0℃下和N2气环境中搅拌30分钟,然后将该体系逐步升温至室温并在室温下搅拌1小时。将该反应混合物倾入冰水。用己烷(3×30ml)萃取该混合物。用H2O,盐水洗涤合并的有机层,然后干燥(MgSO4)并过滤。在真空中浓缩滤液而得到2-(3′,4′-二甲氧基苯基)-环氧乙烷,其为油状物(1.56g,87%)。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ2.75-2.83(m,1H),3.08-3.17(m,1H),3.76-3.85(m,1H),3.87(br s,6H),6.51(s,1H),6.75-6.91(m,2H)。
将HONHBoc(2.31g,17.35mmol)和NaOH(0.69g,17.25mmol)在MeOH(20ml)中的混合物在室温下搅拌1小时。然后向该搅拌的溶液中滴加2-(3,4-二甲氧基-苯基)-环氧乙烷(1.56g,8.67mmol)在MeOH(3ml)中的溶液。将所得混合物缓慢回流并通过TLC监测。在回流3小时后,TLC显示反应完成。在真空中浓缩该反应混合物。用H2O(50ml)稀释残余物,用EtOAc(3×20ml)萃取。干燥合并的有机层(MgSO4)且然后过滤。在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶,20-40% EtOAc/己烷),得到2-(N-叔丁氧羰基氨基氧基)-1-(3′,4′-二甲氧基苯基)乙醇(0.4g,15%)。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.51(s,1H),7.01(s,1H),6.81-6.95(m,2H),4.99(d,J=3.0Hz,1H),3.97(s,3H),3.75(s,3H),3.70-3.95(m,2H),1.52(s,9H)。
向2-(N-叔丁氧羰基氨基氧基)-1-(3′,4′-二甲氧基苯基)乙醇(80mg,0.26mmol)在CH2C12(2ml)中的溶液中加入在1,4-二烷中的4M HCl(1.5ml,6.0mmol)中的溶液。将该反应混合物在室温下和N2气环境中搅拌过夜。形成固体并沉淀。通过过滤收集该固体,用乙醚洗涤且然后在真空中干燥而得到2-氨基氧基-1-(3′,4′-二甲氧基苯基)-乙醇,其为白色结晶固体(50mg,55%)。mp 100-101℃。1H NMR(D2O,300MHz)δ6.93(s,1H),6.85-6.91(m,2H),4.87(t,J=5.7Hz,1H),4.05(d,J=5.4Hz,2H),3.70(s,3H),3.68(s,3H)。
实施例13
2-苯基-2-环丙基乙胺
向2-苯基乙腈(5.85g,50mmol)在THF(200ml)中的冷却溶液中加入双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(29.92g,150mmol)。将所得混合物在0℃下和N2气环境中搅拌30分钟。向所得混合物中滴加1,2-二溴乙烷(10.33g,55mmol)在THF(30ml)中的溶液。在0℃下和N2气环境中搅拌该反应混合物并将其逐步升温至室温。然后将该体系在室温下搅拌过夜。在真空中浓缩该反应体系。通过蒸馏获得1-苯基-1-环丙烷腈(3.6g,50%)。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.27-7.38(m,5H),1.69-1.76(m,2H),1.37-1.44(m,2H)。
将1-苯基-1-环丙烷腈(1.0g,6.98mmol)加入到搅拌的氢化铝锂(0.27g,6.98mmol)在乙醚(25ml)中的混悬液中。将所得混悬液回流小时,然后通过在外部施加冰浴将其冷却至0℃。通过谨慎加入H2O骤冷过量的氢化物。过滤所得混合物。用乙醚洗涤固体并过滤。干燥滤液(MgSO4)并过滤。在真空中浓缩滤液而得到2-环丙基-2-苯基乙胺。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ7.28(m,4H),7.17(m,1H),2.70(s,2H),1.45(br s,2H),0.78(dd,J=6.2,3.8H,2H),0.67(dd,J=6.2,3.8Hz,2H)。
实施例14
SSAO活性的体外抑制
使用主要如对单胺氧化酶和相关酶所述的偶联比色法测定SSAO活性(Holt A.等(1997)《生物化学年鉴》(Anal.Biochem.)244:384)。牛血浆胺氧化酶(PAO)购自Worthington Biochemical(Lakewood,NJ)并用作用于活性测定的SSAO来源。如下在96孔微量滴定板中进行SSAO试验。如果需要,将预定量的在0.2M pH 7.6的磷酸钾缓冲液中稀释的抑制剂加入到各孔中。抑制剂的量在每次试验中可变,但一般终浓度在10nM-10μM。对照不含抑制剂。为了研究可能的抑制剂的作用,将50μl的抑制剂溶液在37℃下与0.4mU PAO一起在总体积为130μl的0.2M pH 7.6的磷酸钾缓冲液中预保温30分钟。然后通过添加20μl 10mM苄胺底物开始试验并在37℃下保温20分钟。然后加入下列试剂至最终反应体积为200μl,50μl新制的含有750nM香草酸(Sigma#V-2250)、400nM 4-氨基安替比林(Sigma#A-4328)和12U/ml辣根过氧化物酶(Sigma#P-8250)的显色溶液以便使得每小时有0.5OD A490的改变。它属于本试验的线性响应范围内。将平板在37℃下保温1小时,并且在490nm处使用微量培养板分光光度计(Power Wave 40,Bio-Tek Inst.)测定反映出SSAO活性的吸光度增加。将抑制表示为与对背景吸光度校准后的对照品相比的抑制百分比并且使用GraphPad Prism软件计算IC50值。
还如所述测定SSAO活性(Lizcano JM.等(1998)《生物化学杂志》(Biochem J.)331:69)。简单的说,通过将新取出的组织切成小块并将它们在PBS中充分洗涤制备大鼠匀浆物。然后按照1∶10(w/v)在10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中匀浆组织并在4℃下以1000g离心10分钟;将上清液保持冷冻至备用。使用20μM 14C-苄胺作为底物以放射化学方法测定100μl肺匀浆中的SSAO活性。使反应在37℃下和300μl终体积的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中进行并使用100μl 2M柠檬酸使反应终止。将放射性标记的产物萃取入含有0.6%(w/v)2,5-二苯基唑(PPO)的甲苯/乙酸乙酯(1∶1,v/v),此后进行液体闪烁计数。使用这种方法还在高达50%人血清存在下测试了实施例2和8化合物的抑制活性。在有血清存在下对两种化合物的SSAO IC50值没有改变。
实施例15
SSAO/VAP-1的SSAO活性与MAO-A和MAO-B活性的抑制比较
通过测定体外抑制MAO-A和MAO-B活性的能力测试不同SSAO抑制剂的特异性。重组人MAO-A和人MAO-B酶获自BD Biosciences(MA,USA)。按照与SSAO类似的方式测定MAO活性,但不进行用抑制剂或底物的预保温。如果需要,向每个孔中加入预定量的在0.2M pH 7.6的磷酸钾缓冲液中稀释的抑制剂。抑制剂的量在每次试验中可变,但一般终浓度在50nM-1mM。对照不含抑制剂。然后将下列试剂加入到在0.2M pH 7.6磷酸钾缓冲液中的200μl最终反应体积中,所述的0.2M pH 7.6磷酸钾缓冲液含有:0.04mg/ml MAO-A或0.07mg/ml MAO-B酶、15μl 10mM酪胺底物(用于MAO-A)或15μl 100mM苄胺底物(用于MAO-B)和50μl新制的显色溶液(如上所述)。将平板在37℃下保温60分钟。使用微量培养板分光光度计(Power Wave 40,Bio-Tek Inst.)在490nm处测定反映出MAO活性的吸光度增加。将抑制表示为与对背景吸光度校准后的对照品相比的抑制百分比并且使用GraphPad Prism软件计算IC50值。分别将0.5和10μM的氯吉灵和帕吉林(分别为MAO-A和-B抑制剂)加入到一些孔中作为用于MAO抑制的阳性对照。前面实施例的化合物抑制SSAO活性与MAO活性的能力比较如表1中所示。结果表明本发明中所述的化合物为SSAO活性的特异性抑制剂。由此预计本发明中所述的化合物在治疗其中SSAO/VAP-1的SSAO活性起作用的疾病和病症,即在SSAO/VAP-1介导的疾病和病情中具有治疗应用。
表1
实施例1-12的功效和特异性
实施例化合物 | SSAO抑制活性IC50(μM) | MAO-A抑制活性IC50(μM) | MAO-B抑制活性IC50(μM) | SSAO相对于MAO-A的特异性 | SSAO相对于MAO-B的特异性比较 |
1 | 0.029 | 900 | 125 | 31,000 | 4,300 |
2 | 0.035 | 225 | 100 | 6,400 | 2,900 |
3 | 0.050 | 1 | 24.5 | 20 | 490 |
4 | 0.65 | 260 | 175 | 400 | 269 |
5 | 0.95 | 690 | 155 | 726 | 163 |
6 | 4.7 | 300 | 2.8 | 64 | 0.60 |
7 | 2.61 | 620 | 210 | 230 | 80 |
8 | 0.032 | 2.2 | 81 | 69 | 2,500 |
9 | 0.055 | 350 | 20 | 6,300 | 360 |
10 | 0.065 | 2.8 | 0.65 | 43 | 10 |
11 | 0.050 | 250 | 450 | 5000 | 9000 |
12 | 0.090 | 3,6000 | 8,200 | 400,000 | 90,000 |
实施例16
急性毒性研究
在小鼠中测定实施例8和10的化合物以及莫非吉兰(实施例18中所述的烯丙胺化合物)的腹膜内(i.p.)和静脉内(i.v.)LD50值。将6周龄C57B1/6雌性小鼠分成5只一组的组并施用溶于PBS中的化合物的单次i.p或i.v.注射(在100μl中10-100mg/kg i.v.;在200μl中30-500mg/kg i.p.)。对对照组施用相同体积的PBS i.p.或i.v.。每日注意外观和外表行为并测定体重,此后施用化合物(第1天)并在第3、5和7天施用。7天后,对动物实施安乐死并对肝、脾和肾称重。将急性毒性研究结果概括在表2中。
表2.莫非吉兰和实施例8和10化合物的腹膜内和静脉内LD50(mg/kg)*值
施用方式 | 莫非吉兰 | 实施例8 | 实施例10 |
腹膜内 | 200 | 350 | 250 |
静脉内 | >70 | >100 | >100 |
*数字表示第7天的LD50值。
莫非吉兰的急性毒性作用包括震颤(40mg/kg i.v.;100mg/kg i.p.)和阵挛性惊厥和呼吸吃力(100mg/kg i.v.;200mg/kg i.p.)。接受100mg/kg实施例8和10的化合物的小鼠仅表现震颤,而对两种化合物仅在大于约300mg/kg剂量下观察到了惊厥和呼吸吃力(参见表2;对实施例10的化合物而言,大于约250mg/kg剂量,对于实施例8的化合物,大于约350mg/kg的剂量)。在药物施用后24小时内发生所有动物死亡。尸体解剖检验未显示出任何肉眼损害(gross lesion)。对任意化合物而言,体重以及绝对和体重标准化器官重量与对照组相比没有显著差异(方差分析后通过邓奈特检验(Dunnett’s test),p>0.05)。因此,对测试的任意化合物而言,没有死亡原因的指征。然而,正如诱发震颤、阵挛性惊厥和呼吸吃力所需实施例8和10化合物的高得多的水平所指示的,本发明的化合物的毒性显著低于莫非吉兰。
实施例17
小鼠中胶原蛋白诱发的关节炎的抑制
在小鼠中胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)广泛用作在人中的类风湿性关节炎(RA)的实验模型。CIA由针对II型胶原蛋白的特定区的自身抗体和补体介导。在本研究中使用的鼠CIA模型称作抗体-介导的CIA,并且可以通过i.v.注射不同抗-II型胶原蛋白单克隆抗体的组合诱发(Terato K.,等(1995)《自身免疫性》(Autoimmunity.)22:137)。几种化合物已经用于成功地阻断这一模型中的炎症,包括抗-α1β1和抗-α2β2整联蛋白单克隆抗体(deFougerolles A.R.(2000)《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)105:721)。
在本实施例中,arthrogen-胶原蛋白-诱导的关节炎抗体试剂盒购自Chemicon International(Temecula,CA)并且使用制造商的方案诱发关节炎。在第0天给小鼠i.v.注射4种抗-II型胶原蛋白单克隆抗体的混合物(各0.5mg),随后在第2天i.p.注射25μg脂多糖(LPS)。在LPS注射后3-4天小鼠发生腕、踝和趾肿胀,在第7天时的发病率为90%。将各肢中关节炎的严重程度进行如下的12天评分:0=正常;1=轻度发红、踝或腕轻度肿胀;2=中度发红和踝或腕肿胀;3=重度发红和某些趾、踝和爪肿胀;4=最大程度的肢体发炎。将动物分成各6只的3组:载体、甲氨蝶呤(MTX)-治疗和化合物-治疗的组。给载体组中的动物i.p.注射磷酸缓冲盐水(PBS),每天两次,持续12天(从第0天开始)。在第0天开始经i.p.施用MTX(3mg/kg)并且在实验期间持续每隔一天(周一、周三、周五)施用。在第0天开始施用实施例2的化合物(20mg/kg/剂量,i.p.,每天两次剂量)并且持续至第11天。结果如附图1A、附图1B和附图1C中所示。每天两次施用20mg/kg实施例2的化合物明显降低了该模型中最终的关节炎评分和爪肿胀。
对两组数据中的每一组(关节炎评分和爪肿胀)进行重复测定分析以便评价治疗效果。就关节炎评分而言,存在显著的总体治疗效果(p=0.0165)。实施例2的化合物与MTX之间在治疗效果方面没有显著性差异(p=0.3348)。然而,实施例2的化合物在与PBS载体相比时表现出显著的治疗效果(p=0.0046)。对肿胀存在显著的总体治疗效果(p=0.0294)。实施例2的化合物与MTX之间在治疗效果方面没有显著性差异(p=0.8772)。然而,实施例2的化合物在与PBS相比时表现出显著的治疗效果(p=0.0060)。
随访研究包括观察血清和受侵害组织中的细胞因子水平。而易于通过ELISA测定循环细胞因子,在爪、结肠和脊髓中测定的细胞因子水平并非呈直线的。使用相对RT-PCR方法。为了进行本实验,使用来自Ambion(USA)的试剂盒,它使用18S核糖体RNA(rRNA)作为内部对照。除rRNA引物外,该试剂盒还提供了用于扩增所分析的不同细胞因子的特异性引物。使用18SrRNA作为标准品的优点在于,与用于特异性基因的mRNA相反,它在整个宽范围组织和治疗条件中以静态水平得到表达。而对所分析的各组织而言,必须使扩增步骤最优化,使得目的基因和rRNA处于线性范围。在本研究结束时,对动物实施安乐死并取出右后爪并且冷冻。按照制造商的说明,每50-100mg组织使用1ml Trizol试剂(Invitrogen,USA)分离总RNA。按照配备了Ambion TNF-α(小鼠)基因特异性相对(GeneSpecific Relative)RT-PCR试剂盒(目录#5439)的方案将5微克总RNA用于第一链cDNA合成并且将2μl用作定性RT-PCR反应的模板。PCR循环条件如下:在94℃下热启动2分钟,随后为94℃下变性45秒、50℃下退火45秒和72℃下延伸45秒的27个循环和在72℃下7分钟的最终一次延伸。使来自每次PCR反应的10μl等分试样在6%丙烯酰胺/TBE凝胶(Invitrogen,USA)中电泳并用溴化乙锭染色。附图8A显示了这些实验之一的结果,其中使用rRNA和小鼠TNFα的引物扩增来自1只动物的趾、足垫和踝的RNA(该动物的爪具有不同水平的关节炎评分)。对不同带进行的定量光密度分析(Gel Doc 2000凝胶记录系统和Quantity One 4.3.1软件,BioRad,USA)允许对样品之间的相对TNFα:rRNA比进行比较。附图8B表示从来自附图1中所示实验的所有动物右后爪中分离总RNA并且其用于测定18S与TNFα水平之间的相对比例时获得的结果。
使用GraphPad Prism软件(San Diego,CA),通过方差分析后的邓奈特检验来分析数据。这些结果表明实施例2的化合物(用于附图1中的实验)能够降低患有CIA的小鼠爪中TNFαmRNA水平。
实施例18A
SSAO抑制剂-莫非吉兰(烯丙胺化合物)对小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓
炎的抑制
SSAO/VAP-1在发炎组织/器官,包括脑和脊髓的内皮上得到表达。它的支持淋巴细胞跨内皮迁移的能力可能是SSAO/VAP-1在炎性疾病,诸如多发性硬化和阿尔茨海默氏病的重要系统功能。通过使用在C57BL/6小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)对使用SSAO抑制剂治疗中枢神经系统(CNS)的炎性疾病进行分析。啮齿动物中的EAE得到充分表征并且是人中多发性硬化的可再现的动物模型(Benson J.M.等(2000)《临床研究杂志》(J.C1in.Invest.)106:1031)。多发性硬化是慢性免疫-介导的CNS疾病,其特征在于脱髓鞘区域中的肥厚性小静脉周围炎性浸润和轴突丧失。作为动物模型,可以通过用由佐剂存在下的致脑炎髓磷脂抗原进行免疫接种在小鼠中诱发EAE。EAE的发病机理包括将髓磷脂抗原呈递给T细胞、活化的T细胞迁移至CNS和在识别相同抗原时发生炎症和/或脱髓鞘。
为了检验SSAO/VAP-1作为对CNS的淋巴细胞募集的主要调节剂的作用,在EAE模型中评价莫非吉兰(一种烯丙胺)和SSAO抑制剂。
在第0天时给30只雌性C57BL/6小鼠经皮下(s.c)免疫接种在弗氏完全佐剂(CFA)中的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG肽35-55),随后经i.p.注射百日咳毒素(在第0天注射一次百日咳毒素,在第2天进行第二次百日咳毒素注射)。10只小鼠的组接受烯丙胺化合物莫非吉兰(AA,10mg/kg/剂量,每天两次,连续18天)、甲氨蝶呤(2.5mg/kg/天,隔天一次(周一、周三、周五),直到第18天)或载体对照(两次/天,连续18天),所有施用均从免疫接种后1天开始并且均经i.p.施用。然后按照如下的0-5级评分系统对动物监测体重、麻痹病征和死亡:1=跛行尾或带有尾部紧张性的蹒跚步态;2=带有跛行尾的蹒跚步态(共济失调);2.5=带有部分肢体麻痹的共济失调;3=一条肢完全麻痹;3.5=一条肢体完全麻痹与第二条肢部分麻痹;4=两条肢完全麻痹;4.5=濒临死亡;5=死亡。结果如附图2A、附图2B和附图2C中所示。与在给药期间(至第18天)表现出80%疾病发病率和中度临床严重程度的载体治疗组相比,莫非吉兰-治疗的小鼠中,50%受侵害小鼠的疾病严重程度具有统计学上的显著减轻。(通过评价治疗效果的重复测定分析p=0.04。将具有选择天数的间隔的适当的多项式转换用于测试时间效应)。在AA与载体治疗组之间在疾病严重程度上具有统计学意义的显著性差异,甚至在终止化合物施用后仍然持续,并且直到研究结束时仍然观察到(d25)。
正如预计的,载体对照小鼠中体重减轻与临床严重程度相关;并且莫非吉兰治疗还在施用期间防止了体重减轻(p=0.04)。此外,在最后一次治疗后将莫非吉兰对EAE发展生的抑制作用连续观察至少一周以上(d19-25)。MTX-治疗的小鼠在治疗期间表现出类似的抑制作用(d0-18)。然而,在MTX治疗停止后就观察到疾病发病率和严重程度升高(附图2A)。在施用期间或之后用MTX和莫非吉兰治疗的组之间没有统计学显著性差异(p=0.8和p=0.38,分别对临床严重程度和体重而言)。
在独立的实验中使用实施例2的化合物遵循完全相同的方案,但这次不使用MTX组。附图3中所示的结果表明该化合物对疾病的发展和严重程度显然具有治疗效果。这些数据表明本发明的化合物为治疗人多发性硬化的候选物。
实施例18B
VAP-1/SSAO抑制剂对小鼠中复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制
(慢性多发性硬化的模型)
通过使用在SJL/J小鼠中的复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)对使用VAP-1/SSAO抑制剂治疗CNS炎性疾病进行分析。小鼠中的复发性EAE得到充分表征并且是人中多发性硬化的可再现的动物模型(Brown & McFarlin 1981《实验室研究》(Lab.Invest.)45:278-284;McRae等1992《神经免疫学杂志》(J.Neuroimmunol.)38:229-240)。多发性硬化是慢性免疫-介导的CNS疾病,其特征在于脱髓鞘区域中的肥厚性小静脉周围炎性浸润和轴突丧失。作为动物模型,可以通过佐剂存在下用致脑炎髓磷脂抗原进行免疫接种在小鼠中诱发慢性复发性EAE。EAE的发病机理包括将髓磷脂抗原呈递给T细胞、活化的T细胞迁移至CNS和在识别相同抗原时发生炎症和/或脱髓鞘。
血管粘着蛋白-1(VAP-1)是胺氧化酶和在发炎组织/器官,包括脑和脊髓内皮上表达的粘着受体。它的支持淋巴细胞跨内皮迁移的能力可能是VAP-1在炎性疾病,诸如多发性硬化和阿尔茨海默氏病的重要系统功能。
为了检验VAP-1作为对CNS的淋巴细胞募集的主要调节剂的作用,在慢性复发性EAE模型中评价VAP-1/SSAO抑制剂。给7-8周龄雌性SJL/J小鼠经s.c.免疫接种在弗氏完全佐剂(CFA)中的50μg小鼠PLP肽139-151,随后经i.p.注射两次200ng百日咳毒素。10只小鼠的组接受10mg/kg的载体对照(PBS,0.1ml)或(2-苯基烯丙基)肼,每天两次,连续53天,所有的施用均从免疫接种后1天开始。(2-苯基烯丙基)肼为如下化合物:
然后按照如下的0-5级评分系统对动物监测麻痹病征:
0.5 部分尾部无力;
1 跛行尾或带有尾部紧张性的蹒跚步态;
1.5 带有部分尾无力的蹒跚步态;
2 带有跛行尾的蹒跚步态(共济失调);
2.5 带有部分肢体麻痹的共济失调;
3 一条肢完全麻痹;
3.5 一条肢体完全麻痹与第二条肢部分麻痹;
4 两条肢完全麻痹;
4.5 濒临死亡;
5 死亡。
将结果表示为平均临床评分(附图9A)、发病率%(带有任何麻痹的小鼠数量/10只小鼠)(附图9B)、患有慢性疾病的小鼠%(具有至少一次复发的小鼠)(附图9C)和复发的累积总数(附图9D)。通过重复测定方法分析临床评分的p值并且通过广义线性模型,以治疗组((2-苯基烯丙基)肼与缓冲剂)的主要效应和选择的当天来计算累积复发次数和患有慢性疾病的小鼠百分比的p值。
正如附图9A、附图9B、附图9C和附图9D中所示,尽管两组中90-100%的小鼠在免疫接种后2周发生中度至重度麻痹,但是慢性疾病的发病率在用(2-苯基烯丙基)肼治疗的组中显著低于(p<0.0001)接受缓冲液的对照小鼠。还观察到(2-苯基烯丙基)肼-治疗的小鼠与接受缓冲液的对照组相比,总体临床严重程度(p<0.005)和累积的复发次数(p<0.0001)均具有类似的统计学上的显著降低。这些结果共同表明SSAO/VAP-1抑制剂对慢性EAE发展具有减轻作用。
实施例19
角叉菜聚糖诱发的大鼠爪水肿的抑制
角叉菜聚糖诱发的爪水肿已经广泛应用于评价多种治疗剂的抗炎作用并且是用于评价化合物在缓解急性炎症中功效的有用的实验系统(Whiteley PE和Dalrymple SA,1998.“炎症模型:角叉菜聚糖在大鼠中诱发的爪水肿”-《最新药理学方案》(Current Protocols inPharmacology.)Enna SJ,Williams M,Ferkany JW,Kenaki T,Porsolt RE和Sullivan JP,eds.,pp 5.4.1-5.4.3,John Wiley & Sons,New York)。水肿的完全发展是嗜中性粒细胞依赖性的(Salvemini D.等(1996)《英国药理学杂志》(Br.J.Pharmacol.)118:829)。
使用雌性Sprague Dawley大鼠并在接触角叉菜聚糖前15分钟经i.p.注射100mg/kg的本发明化合物。给对照组注射等体积的载体(PBS)。如上所述通过用27-G针头经s.c.在右足垫(pat)上注射50μl角叉菜聚糖(IV型λ,Sigma)在盐水中的0.5%溶液诱发爪中的水肿(参见Whiteley P.E.和Dalrymple S.A.(1998)“炎症模型:角叉菜聚糖在大鼠中诱发的爪水肿”-《最新药理学方案》(Current Protocols in Pharmacology.)Enna SJ,Williams M,Ferkany JW,Kenaki T,Porsolt RE和Sullivan JP,eds.,pp 5.4.1-5.4.3,JohnWiley & Sons,New York)。在诱发水肿前和在角叉菜聚糖诱发后60、120和180分钟按照体积测量每只动物的测试足的大小。
使用实施例2和8的化合物的实验结果如附图4中所示。在两种情况中,100mg/kg剂量在所有测试时间点均显然和显著地减轻了爪水肿。使用GraphPad Prism软件(San Diego,Ca),通过方差分析后的邓奈特检验来分析数据(p<0.05)。
使用该模型进行其它实验以便确定SSAO抑制剂在以治疗方式使用时是否表现出显著功效(即注射角叉菜聚糖后)。简单的说,在注射角叉菜聚糖后1小时经口服施用SSAO抑制剂(30mg/kg)、吲哚美辛(3mg/kg)和PBS。一个有代表性的实验结果如附图10中所示。数据表明测试的SSAO抑制剂以治疗方式应用时能够减轻爪水肿到与使用吲哚美辛观察到的相当的水平。
为了进一步研究SSAO抑制在炎症反应中的作用,进行研究以便评价SSAO抑制对前列腺素E2(PGE2)水平的作用。将动物分成各8只大鼠的4个治疗组。3个组在注射角叉菜聚糖前1小时分别接受口服施用的50mg/kg实施例2的化合物、3mg/kg吲哚美辛或PBS。第4组在爪发炎前1小时经i.p.接受3mg/kg地塞米松。在注射角叉菜聚糖后3小时,用CO2使大鼠窒息并取下其后爪。用解剖刀撕开爪,将其悬浮于带有微量加样器吸头的1.5ml聚丙烯管脱离底部的位置上并且离心以便挤压出炎性流体。测定从每只爪中采集的体积并通过使用商购试剂盒(R & D Systems,Minneapolis,MN),按照制造商的说明进行ELISA来分析流体中PGE2的产量。将角叉菜聚糖注入足垫通常诱发5-10-倍的PGs增加。正如预计的,地塞米松更有效地预防肿胀,而吲哚美辛对PGE2水平具有更大的影响(参见附图11)。实施例2的化合物能够显著将PGE2产量降至与在地塞米松治疗的动物中观察到的相当的水平。使用GraphPad Prism软件(San Diego,Ca),通过方差分析后的邓奈特检验来分析数据。
实施例20
化学方法诱发的结肠炎的抑制
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)-诱发的结肠炎和葡聚糖硫酸钠(DSS)-诱发的结肠炎为TH1-介导的涉及克罗恩病的结肠炎小鼠模型。已经证实通过不同机制起作用的化合物在这些模型中有效,包括泼尼松龙、抗IL-16、抗ICAM和抗-整联蛋白等(Strober W.等(2002)《免疫学综述年鉴》(Annu.Rev.Immunol.)20:495)。唑酮-诱发的结肠炎为TH2-介导的过程,它与溃疡性结肠炎极为相似并且响应抗-IL4疗法(Boirivant M.等(1998)《实验药物杂志》(J.Ex.Me)188:1929)。
如所述的诱发TNBS结肠炎(Fuss I.J.等(2002)《免疫学杂志》(J.Immunol.)168:900)。简单的说,通过将接近肛门边缘4cm插入的3.5F导管在麻醉的SJL/J雄性小鼠中经直肠内对每只小鼠施用2.5mg在50%ETOH中的TNBS(pH 1.5-2,Sigma)。将TNBS-注射的小鼠分成3个治疗组并且每天两次经i.p.注射:PBS;泼尼松龙(5mg/kg);和本发明的化合物(例如以20mg/kg)。在第0天开始注射(注射TNBS的当天)并连续注射至第7天。
如所述的诱发唑酮结肠炎(Fuss I.J.等(2002)《免疫学杂志》(J.Immunol.)168:900)。简单的说,通过在表皮上(epicutaneous)施用在100% EtOH(150μl)中的3%唑酮(4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2唑啉-5-酮,Sigma)使小鼠预先致敏,随后在第5天时,通过通过接近肛门边缘4cm插入的3.5F导管对麻醉的SJL/J雄性小鼠经直肠内施用50% EtOH中的1%唑酮(100μl)。将小鼠分成3个治疗组并且每天两次经i.p.注射:PBS和本发明的化合物。在第0天开始注射并连续注射至第7天或本研究结束。
还如所述的用5%(wt/vol)DSS(ICN Biomedicals Inc.,Ohio,USA)饲喂Balb/c小鼠7天诱发结肠炎(Okayasu I.等(1990)《胃肠病学》(Gastroenterology)98:694)。将小鼠分成3个治疗组并且每天两次经i.p.注射:PBS;泼尼松龙(5mg/kg);和本发明的化合物(例如以20mg/kg)。在第0天开始注射(饲喂DSS的第1天)并连续注射至第7天。
通过监测体重、粪便的稠度、粪便中带血、结肠组织切片的组织学分析并监测几种细胞因子的水平来评价所有模型中的疾病发展情况。
实施例20A
唑酮诱发的结肠炎的抑制
使用实施例20中的方案对唑酮诱发的结肠炎进行研究。在第0天开始注射并持续至本研究结束。通过监测存活率和体重以及通过结肠炎的肉眼可见的证据(即直肠脱出、结肠大小、结肠重量)对疾病的发展情况评价12天(直肠内施用后6天)。从皮肤预先致敏的当天(第0天)开始,每天两次经i.p.施用10mg/kg的(2-苯基烯丙基)肼。结果表明(2-苯基烯丙基)肼与载体组相比显著改善存活率和体重减轻(参见附图12A和12B)。使用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)计算Kaplan-Meyer存活曲线和不配对t检验。
如果按照上述方案,那么在通过体重下降测定的疾病严重程度在第7天达到最大值(直肠内攻击后2天),也是在这一天,动物开始死亡。因此,在最初致敏后的7天处死来自相似研究的动物并取出结肠且固定在1%福尔马林中。在约定的实验室(Pathology Associates,Frederick,MD)以盲法进行组织加工和分析。简单的说,在石蜡包埋后,切5μm的切片并用苏木精和曙红进行染色。从每只动物中取距肛门1cm(切片1)、3cm(切片2)和6cm(切片3)的3个横切片。如下将溃疡、炎症(在粘膜、粘膜下层、浆膜和外肌层)和上皮损伤(包括粘膜和粘膜下层脓肿、粘膜下纤维化、腺畸变和粘膜和粘膜下层水肿/出血)的程度进行半定量分级:0-不存在;1-最小;2-轻度;3-中度;4-显著。附图13表示(2-苯基烯丙基)肼对溃疡、炎症和损伤指数具有显著作用(分别参见附图13A、附图13B和附图13C)。在另一次研究中,在直肠内攻击后1天(第6天)开始给药以便测定诱发疾病后给予SSAO抑制剂是否对存活率产生影响。一次有代表性的实验的数据如附图14中所示。在疾病发作后施用(2-苯基烯丙基)肼对存活率具有显著影响。使用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)计算Kaplan-Meyer存活曲线。
实施例21
伴刀豆凝集素A-诱发的肝损伤的抑制
在肝损伤的伴刀豆凝集素A(Con A)鼠模型中评价通过施用本发明的化合物对炎症的预防。Con A活化T淋巴细胞并在小鼠中导致T细胞-介导的肝损伤。肿瘤坏死因子α是该实验模型中的关键介体。T-细胞-介导的肝损伤包括免疫细胞,特别是CD4+T淋巴细胞迁移入肝组织。如所述的对Balb/c小鼠经i.v.接种在200μl无致热原盐水中的10mg/kg伴刀豆凝集素A(Willuweit A.等(2001)《免疫学杂志》(J Immunol.)167:3944)。在ConA施用前,将动物分入治疗组并且经i.p注射:PBS和不同浓度的本发明化合物(例如20mg/kg)。通过测定肝酶,诸如转氨酶和碱性磷酸酶的血清水平、肝组织病理学和血浆和肝组织中不同炎性细胞因子的水平来评价肝损害。
实施例22
银屑病的SCID小鼠模型中皮肤炎症的抑制
使用移植的银屑病斑片新建立的SCID-人皮肤嵌合体打开了研究涉及银屑病的分子复杂性的新前景。该模型还提供了研究多种关键生物事件的独特机会,所述生物事件为诸如细胞增殖、靶组织中T细胞的归巢、炎症和涉及炎症反应的细胞因子/趋化因子级联。SCID小鼠模型已经用于评价几种化合物在银屑病和其它炎性疾病中的功效(Boehncke W.H.等(1999)《皮肤病学研究学报》(Arch Dermatol Res.)291(2-3):104)。
如上所述进行移植(Boehncke,W.H.等(1994)《皮肤病学研究学报》(Arch Dermatol Res.)286:325)。将人全层皮肤异种移植物移植到6-8周龄C.B 17 SCID小鼠(Charles River)背部上。为了进行手术操作,通过腹膜内注射100mg/kg氯胺酮和5mg/kg赛拉嗪使小鼠麻醉。将测量为直径1cm的全层皮肤纺锤形片移植到小鼠剃刮的中央背部相应切下的全层皮肤缺陷上并用6-0号无创伤单丝缝合线固定。在施加无菌凡士林浸渍的纱布后,通过使用相邻侧面的皮肤在移植的区域上缝合皮袋(skin pouch)防止移植物受到损伤。使缝合线和其上扎紧的袋保持就位,直到它们在2-3周后自发分解。使移植物容纳2周并愈合。此后,在移植后15-42天之间每天经腹膜内注射。给小鼠注射终体积为200μl的载体(PBS)、地塞米松(0.2mg/kg体重)或本发明的化合物(例如以20mg/kg体重)。在第42天时处死小鼠,并且在连同周围小鼠皮肤切除后,将移植物进行福尔马林包埋。随后进行常规的苏木精-和-曙红染色并且定性地(表皮分化、炎症浸润)和定量地(表皮厚度)分析移植物的病理变化。
实施例23
本发明化合物在阿尔茨海默氏病小鼠模型中的作用
阿尔茨海默氏病(AD)的临床特征在于起病隐袭的痴呆并且在病理学上的特征在于存在大量神经斑和神经原纤维缠结。这些斑主要由来源于淀粉样前体蛋白(APP)加工产生的β-淀粉状蛋白(Aβ)肽片段组成。缠结由配对的螺旋状丝组成,所述的配对螺旋状丝由微管相关蛋白tau组成。携带APP中致病突变的转基因小鼠从约1年龄开始以来表现出Aβ-蛋白质水平显著升高和大脑皮层和海马中Aβ沉积(Hsiao K.等(1996)《科学》(Science)274:99)。突变体PS-1转基因小鼠未表现出异常病理变化,但确实表现出Aβ42/43肽水平的细微升高(Duff K,等(1996)《自然》(Nature)383:710)。来源于这些小鼠杂交的转基因小鼠(PS/APP)与APP单一转基因小鼠相比表现出Aβ显著加速累积成可见沉积物(Holcomb L.等(1998)《天然药物》(Nat Med)4:97)。此外,最新研究表明在这些小鼠中,炎症反应可能涉及Aβ沉积(Matsuoka Y.等(2001)《美国病理学杂志》(Am J Pathol.)158(4):1345)。
因此,PS/APP小鼠在研究AD淀粉状蛋白表型中具有重要的应用并且用于评价本发明化合物在治疗阿尔茨海默氏病患者中的功效的研究。给小鼠注射载体(例如PBS)或本发明的化合物(例如以10-20mg/kg),并且通过分析记忆缺失、样品组织的组织学特征和疾病发展的其它指征来评价。
实施例24
本发明化合物在I型糖尿病的鼠模型中的作用
可以广泛接受的是促炎细胞因子在1型糖尿病的发展中起重要作用。因此,本发明的化合物可以用于治疗患有这种疾病的患者。可以将带有通过多次低剂量的链唑霉素(STZ)诱发的糖尿病的小鼠用作1型糖尿病的动物模型。STZ用于在C57BL/6J小鼠中诱发糖尿病。简单的说,如所述的经i.p.给予STZ(40mg/kg)或柠檬酸盐缓冲液(载体),每天一次,连续5天(Carlsson P.O等(2000)《内分泌学》(Endocrinology.)141(8):2752)。在STZ注射前5天开始化合物施用(i.p.10mg/kg,每天两次)并持续2周。另一种广泛应用的模型为自身免疫1型糖尿病的NOD小鼠模型(Wong F.S.和Janeway C.A.Jr.(1999)《最新免疫学观点》(Curr Opin Immunol.)11(6):643。从第10周到第25周每天通过注射本发明的化合物(20mg/kg/天)治疗雌性NOD小鼠。还评价了脾细胞从糖尿病型NOD雌性动物中过继性转移后,本发明化合物在NOD-scid/scid雌性动物中预防胰岛炎和糖尿病发展中的作用。就STZ和NOD模型而言,按照几种方式,包括监测血糖水平来监测糖尿病的发病率。评价分离自实验小鼠的胰岛中的胰岛素分泌。测定小鼠血清中的细胞因子产生。定量评价胰岛的编程性细胞死亡。
实施例25
本发明化合物在气道炎症模型中的作用
抗炎化合物,诸如SSAO抑制剂可以在气道炎症疾病,诸如哮喘和慢性阻塞性肺疾患中具有有益作用。本文所述的啮齿动物模型广泛用于功效研究。还可以用急性肺炎的其它鼠模型测试本发明的化合物。
为了评价SSAO抑制剂在预防气道炎症中的作用,研究3组致敏的大鼠。在7天期限中每天两次腹膜内施用载体盐水、本发明的化合物或阳性对照(例如泼尼松)后,用气溶胶化的OVA(卵清蛋白)攻击动物。在该周结束时,如所述的麻醉动物用于测定过敏原诱发的气道反应(Martin J.G.等(2002)《免疫学杂志》(J Immunol.)169(7):3963)。用聚乙烯管给动物进行气管内插管并将动物置于热垫上以便维持直肠温度为36℃。通过将气管内插管头置于有机玻璃盒(~250ml)内部测定气流。将连接差动式传感器的呼吸速度描记仪与盒的另一端连接以测定气流。用OVA气溶胶(5% w/v)将动物攻击5分钟。以0.15ml/分钟的输出量使用一次性喷雾器。在攻击后将气流每隔5分钟测定一次,持续30分钟,且随后在15-分钟间隔测定一次,总计8小时。然后处死动物用于支气管肺泡灌洗(BAL)。在用5次滴注5ml盐水攻击后8小时进行BAL。使用血细胞计数器和锥虫蓝染色估计总细胞计数和细胞存活力。使用细胞离心涂片器(Cytospin)制备载玻片并使用May-Grünwald-Giemsa染色评价分化的细胞数并且通过免疫细胞化学评价嗜酸性粒细胞计数。
实施例26
啮齿动物中的口服生物利用率研究
在小鼠和大鼠中进行口服生物利用率研究。简单的说,通过口腔管饲法对C57B1/6雌性小鼠和Sprague Dawley雌性大鼠施用50mg/kg的本发明不同的化合物。在施用化合物后的不同时间间隔对动物取血并使用实施例14中所述的比色测定法测定血浆中抑制剂的水平。有代表性的实验结果如附图5中所示并且表明本发明的化合物为口服生物可利用的。(附图5A表示小鼠中的结果;附图5B表示大鼠中的结果)。因此,这些数据表明本文所述的小分子SSAO抑制剂能够发展成口服施用的药物。在静脉内和腹膜内施用不同剂量的实施例2、8和10中所述本发明化合物后进行相同的研究。结果表明这些化合物在施用那些形式后也易于生物利用。
实施例27
SSAO/VAP-1抑制剂体内施用后的剂量反应作用
评价SSAO在大鼠主动脉和肺中的体内抑制,在这两种组织中,SSAO活性最高。通过口腔管饲法对6周龄雌性Sprague Dawley大鼠施用在2.5ml/kg PBS中0、0.1、1、10和50mg/kg的实施例8的化合物。施用化合物后4小时,将动物实施安乐死并取出主动脉和肺且冷冻在液氮中。将组织在0.1M pH 7.8的磷酸钾缓冲液中匀浆(30ml/g用于主动脉且20ml/g用于肺)并且以1000×g离心15分钟。收集上清液并按照Lizcano J.M.等(1998)在《生物化学杂志》(Biochem.J.)331:69中所述的方案用于放射性试验。通过在室温下将组织匀浆的200μl等分试样与20μl 0.4mM 14C-标记的苄胺底物(6mCi/mmol比活,Pharmacia)一起保温30分钟启动酶反应。通过加入100μl 2M柠檬酸终止试验,用5ml含有0.6%(w/v)2,5-二苯基二唑(oxdazole)(PPO)的甲苯∶乙酸乙酯(1∶1)萃取试验体积并通过液体闪烁法对有机层的等分试样进行计数。因为SSAO和MAO-B均对苄胺具有活性,所以需要对照样品同时进行试验,以便可以鉴定MAO-B和SSAO活性。用0、10、50和500μM氨基脲抑制SSAO以便进行MAO-B测定,并且用0、5和100μM帕吉林抑制MAO-B以便进行SSAO测定。在添加苄胺前,将这些抑制剂加入到组织上清液中。主动脉和肺主要具有SSAO活性;这些结果为公布的数据。附图6表示实施例8化合物对肺和主动脉而言的体内ED50值分别为0.72mg/kg和5mg/kg。
实施例28
SSAO/VAP-1抑制剂对体外粘着的阻断
进行本实施例中的研究以便测定转染入内皮细胞的SSAO/VAP-1是否保留了粘着功能和它是否在新近分离的人PBMCs与这些细胞粘着方面起任何作用。此外,这些研究还用于测定阻断SSAO/VAP-1是否对这两种细胞类型的粘着水平具有影响。使用用荧光染料钙荧光素-AM(MolecularProbes,OR,USA)标记的细胞按制造商的说明进行粘着试验。简单的说,将大鼠淋巴结肥厚内皮细胞(HEC;如Ager,A.(1987)在《细胞科学杂志》(J.Cell Sci.)87:133中所述进行分离和培养)在96-孔平板中平板接种过夜(2,000个细胞/孔)。在37℃下用1ml 10μM钙荧光素-AM将PBMCs(外周血单核细胞)(1×107)标记1小时,用RPMI洗涤3次并加入到含有模拟-转染或用全长人SSAO/VAP-1转染的HEC细胞单层的96孔平板中(含有2,000个HEC细胞的每个孔中平板接种60,000个PBMCs)。在37℃下使粘着进行3小时。通过用RPMI洗涤3次除去未粘着的细胞并在荧光平板读出器中在485nm的激发波长和530nm的发射波长处测定荧光。包括几个对照组,诸如仅HEC细胞和PBMCs(标记和未标记的)。在所有实验中,SSAO/VAP-1的表达使PBMCs与HEC细胞的粘着增加了2-5倍。这些结果与其他人公布的数据一致(Smith等《实验药物杂志》(J.Exp Med)(1998)188:17;Salmi等《循环研究》(Circ Res)(2000)86:1245)。
设计下一步实验以便研究阻断酶催化位点是否对SSAO/VAP-1的粘着功能具有影响和本发明的抑制剂是否可以介导粘着-抑制作用。公布的结果提示用氨基脲阻断SSAO活性抑制了完全位于心脏内皮单层上的层下淋巴细胞的滚动(Salmi等《免疫性》(Immunity)(2001)14:265)。使用如上所述的粘着试验重复这些研究以便评价本发明的抑制剂。所用的粘着阻滞剂包括抗-人VAP-1单克隆抗体(Serotec,Oxford,UK)、神经氨酸酶(neuramidase)(一种唾液酸酶,因为SSAO/VAP-1为唾液糖蛋白;Sigma)和几种针对大鼠粘着分子的功能-阻滞抗体(CD31-PECAM、CD54-ICAM-1、CD92P-P选择蛋白)。对照包括SSAO抑制剂氨基脲(Sigma)、MAO-A和MAO-B抑制剂(分别为氯吉灵和帕吉林;Sigma)和小鼠IgGI和IgG2同种型对照品(BD,USA)。将抗体(10μg/ml)和神经氨酸酶(neuramidase)(5mU)与HECs一起在37℃下保温30分钟;在添加标记的PBMCs前洗除过量抗体。将小分子抑制剂在IC100浓度下以相同方式预保温,但不洗涤掉存在于上清液中的量以便在粘着步骤中保持IC100浓度。
附图7表示一个有代表性的实验结果(n=6重复结果)。附图7B表示了显示抗-VAP-1、实施例2的化合物、实施例8的化合物的数据,并且在较低的程度上,氨基脲将PBMCs与SSAO/VAP-1转染的HECs粘着的数量降至与在模拟转染细胞中观察到的相接近的水平。(对模拟转染的细胞测试的相同化合物的数据如附图7A中所示)。本文的抗-VAP-1抗体结果与有关抗-VAP-1mAb对淋巴细胞与VAP-1-转染的HEC细胞的粘着的作用公布的数据一致(Salmi等《循环研究》(Circ Res)(2000)86:1245)。氯吉灵(MAO-A抑制剂)和帕吉林(MAO-B抑制剂)没有作用。有意义的是,VAP-1表达看起来降低了抗-CD54、CD31和CD62P抗体的相对阻滞作用。
概括地说,这些结果表明抑制SSAO酶功能的本发明化合物减少了PBMCs与在体外表达SSAO/VAP-1的HECs的结合;即本发明的SSAO抑制剂能够在体外抑制PBMCs与表达SSAO/VAP-1的HECs的粘着。
实施例29
脂多糖(LPS)-诱发的内毒素血症的抑制
在脓毒症中,所有器官的内皮细胞与升高水平的LPS和炎症细胞因子接触导致粘着分子和趋化因子增量调节,这使得白细胞的粘连、滚动和迁移增加(Pawlinski R.等(2004)《血液》(Blood)103:1342)。LPS-诱发的内毒素血症是得到充分表征的全身炎症模型且由此可以用于研究SSAO抑制在这些炎症机理中的推定作用。通过i.p.施用5mg/kg LPS在C57B1/6J雌性小鼠中诱发脓毒症。LPS注射前60分钟,通过口服对动物施用200μl载体(PBS)或50mg/kg(2-苯基烯丙基)肼。在诱发疾病前1小时经i.p施用浓度为3mg/kg的地塞米松。从麻醉动物的眼眶后血管丛中抽取血液并采集血清并冻干,直到测定细胞因子时。通过使用商购试剂盒(R & D Systems,Minneapolis,MN),按照制造商的说明进行ELISA来测定IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度。附图15表明(2-苯基烯丙基)肼显著降低该模型中循环TNF-α和IL-6的水平。使用GraphPad Prism软件(San Diego,CA),通过方差分析后的邓奈特检验来分析数据。附图16表示研究结果,设计该研究是为了研究SSAO抑制是否能够影响LPS休克后动物的存活率。通过i.p.注射对小鼠施用均溶于PBS的2mg/kg LPS与300mg/kg D-半乳糖胺(GalN,Sigma)。在所示的时间点,来自不同治疗组的动物通过口服施用接受200μl载体(PBS)或30mg/kg(2-苯基烯丙基)肼。数据表明SSAO抑制延长了LPS休克后小鼠的存活。
将本文参考的通过确定引述内容披露的所有公开文献、专利、专利申请和公布的专利申请的全部内容引入本文作为参考。
尽管为清楚理解的目的通过解释和实施例在一定程度上详细描述了前述的本发明,但是本领域技术人员显然可以进行某些较小程度的改变和修改。因此,本说明书和实施例不应视为对本发明范围的限定。
Claims (45)
1.通式I-P的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐:
其中R1p独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基、C5-C14取代的杂芳基、R4-(CH2)n-和R5-Y1-CH2-组成的组;
n独立地为1或2;
Y1独立地为S或O;
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R4独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R5独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;且
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
条件是当R1为未被取代的苯基,R2为H且X为NH时,R3不为H。
2.权利要求1的化合物,其中R1p为未被取代的苯基。
3.权利要求1的化合物,其中R1p为取代的苯基。
4.权利要求1、2或3的化合物,其中R2为H。
5.权利要求1、2、3或4的化合物,其中X为O。
6.权利要求1、2、3或4的化合物,其中X为NR6。
7.权利要求1、2、3、4、5或6的化合物,其中R3为H或C1-C4烷基。
8.权利要求1、2、3、4、5或6的化合物,其中R6为H或C1-C4烷基。
9.根据通式I-AP的权利要求1的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐:
其中:
Rlap为取代或未被取代的苯基;
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
条件是当R1为未被取代的苯基,R2为H且X为NH时,R3不为H。
10.权利要求9的化合物,其中Rlap为未被取代的苯基。
11.权利要求9的化合物,其中Rlap为取代的苯基。
12.权利要求9、10或11的化合物,其中X为O。
13.权利要求9、10或11的化合物,其中X为NR6。
14.权利要求9、10、11、12或13的化合物,其中R3为H或C1-C4烷基。
15.权利要求9、10、11、12或13的化合物,其中R6为H或C1-C4烷基。
16.通式I-B的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐:
其中:
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
R91和R92独立地选自H、F、Br、Cl、I、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。
17.权利要求16的化合物,其中X为NR6。
18.权利要求16或17的化合物,其中R3为H或C1-C4烷基。
19.权利要求16、17或18的化合物,其中R6为H或C1-C4烷基。
20.权利要求16、17、18或19的化合物,其中R91和R92均为H。
21.通式I-C的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐:
其中:
R2独立地选自H、C1-C4烷基、Cl、F或CF3;
R91和R92独立地选自H、F、Br、Cl、I、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基;
X独立地选自O或NR6;
R3独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
R6独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。
22.权利要求21的化合物,其中X为NR6。
23.权利要求21或22的化合物,其中R3为H或C1-C4烷基。
24.权利要求21、22或23的化合物,其中R6为H或C1-C4烷基。
25.权利要求21、22、23或24的化合物,其中R91和R92均为H。
26.通式III的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐:
其中R27独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基、C5-C14取代的杂芳基、R23-(CH2)n-和R24-Y2-(CH2)-;
R22独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
n独立地为1或2;
n3独立地为0、1或2;
Y2独立地为S或O;且
R23和R24独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。
27.权利要求26的化合物,其中R27为未被取代的苯基。
28.权利要求26的化合物,其中R27为取代的苯基。
29.权利要求26、27或28的化合物,其中R22为H或C1-C4烷基。
30.通式III-A的权利要求26的化合物,包括其所有的立体异构体、其所有的E/Z(顺式/反式)异构体、其所有的溶剂合物和水合物、其所有的晶形和非晶形及其所有的盐:
其中R21独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基、C5-C14取代的杂芳基、R23-(CH2)n-和R24-Y2-(CH2)-;
R22独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基;
n独立地为1或2;
Y2独立地为S或O;且
R23和R24独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、C6-C14芳烷基、C4-C9杂芳基、C6-C14取代的芳基和C5-C14取代的杂芳基。
31.权利要求30的化合物,其中R27为未被取代的苯基。
32.权利要求30的化合物,其中R27为取代的苯基。
33.权利要求30、31或32的化合物,其中R22为H或C1-C4烷基。
35.权利要求34的化合物,其中R27为未被取代的苯基。
36.权利要求34的化合物,其中R27为取代的苯基。
37.权利要求34、35或36的化合物,其中R22为H或C1-C4烷基。
39.权利要求38的化合物,其中R27为未被取代的苯基。
40.权利要求38的化合物,其中R27为取代的苯基。
41.权利要求38、39或40的化合物,其中R22为H或C1-C4烷基。
42.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41的化合物,其用于治疗。
43.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41的化合物,其用于治疗炎症或炎性疾病。
44.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41的化合物,其用于治疗免疫疾病或自身免疫病。
45.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41的化合物,其用于治疗多发性硬化。
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