CN1960966A - 含酰肼cftr抑制剂化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抑制囊性纤维化跨膜转导调节因子蛋白(CFTR)的组合物、药物制剂和方法，其可用于研究和治疗CFTR介导的疾病和病症。本发明的组合物和药物制剂可包含一种或多种含有酰肼的化合物，以及可另外包含一种或多种药物可接受的载体、赋形剂和/或佐剂。在某些实施方案中，本发明的方法包括对患有CFTR介导的疾病或病症的患者，给予有效量的含酰肼化合物。在其它实施方案中本发明提供了抑制CFTR的方法，其包括使个体中的细胞接触有效量的含酰肼化合物。此外，本发明以CFTR介导的疾病的非人动物模型为特色，该模型是通过对非人动物给予足以抑制CFTR的量的含酰肼化合物而产生。

Description

含酰肼CFTR抑制剂化合物及其用途
关于联邦赞助研究的声明
本发明是在政府支持由NIH资助的补助金HL73854、EB00415、EY13574、DK35124、DK43840和UCl AI062530-01下完成的。政府对本发明具有某些权利。
发明背景
囊性纤维化跨膜转导调节因子蛋白(CFTR)是在哺乳动物呼吸道(airway)、肠、胰脏和睾丸的上皮细胞中表达的cAMP激活的氯(Cl-)通道。CFTR是负责cAMP介导的Cl-分泌的氯通道。诸如β-肾上腺能激动剂的激素或者例如霍乱毒素的毒素引起cAMP升高，激活cAMP依赖的蛋白激酶和磷酸化CFTR Cl-通道，其造成通道开放。细胞钙离子升高也能够激活不同的顶膜通道。蛋白激酶C造成的磷酸化既可以打开也可关闭顶膜的Cl-通道。CFTR主要位于上皮，在这里它为Cl-离子穿过顶膜的移动提供通道，其还是调控跨上皮的盐和水转运的关键点。CFTR氯通道的功能与广谱的疾病相关，包括囊性纤维化(CF)和男性不育的一些病症、多囊性肾病和分泌性腹泻。
遗传致死性疾病囊性纤维化(CF)是由CFTR的突变引起的。在人类囊性纤维化(CF)患者和CF小鼠模型中的观察说明了CFTR在肠和胰脏液体转运以及男性不育中的功能重要性(Grubb等人，1999，Physiol.Rev.79：S193-S214；Wong，P.Y.，1997，MoI.Hum.Reprod.4：107-110)。然而，CFTR缺陷造成呼吸道疾病的机制还不清楚，而呼吸道疾病是囊性纤维化中发病率和死亡率的主要原因(Pilewski等人，1999，Physiol.Rev.79：S215-S255)。对于理解CF中的呼吸道疾病的主要困难包括CF小鼠模型不合适，其较少或不显示呼吸道疾病；缺少CF的大型动物模型；未受到慢性感染或炎症破坏的人类CF呼吸道的可用性有限。尚没有可用的高亲和性、CFTR选择性的抑制剂来研究CF中呼吸道疾病的机制或在大型动物模型上产生CF表型。
高亲和性的CFTR抑制剂同样在分泌性腹泻和囊性肾病的治疗以及抑制男性不育中具有临床用途。已经发现了一些CFTR抑制剂，尽管它们大多数功效较弱且缺乏CFTR特异性。口服的降血糖药物格列苯脲(glibenclamide)在影响其它氯离子和阳离子转运的高微摩尔浓度(Edwards&Weston，1993；Rabe等人，1995，Br.J.Pharmacol.，110：1280-1281；Schultz等人，1999，Physiol.Rev.，79：S109-S144)下，通过开放通道阻塞机制从细胞内侧抑制CFTR氯离子转导(conductance)(Sheppard&Robinson，1997 J.Physiol.，503：333-346；Zhou等人.，2002，J.Gen.Physiol.，120：647-662)。其它非选择性的阴离子转运抑制剂包括二苯基胺-2-羧酸盐(DPC)、5-硝基-2(3-苯基丙基-氨基)苯甲酸盐(NPPB)，以及氟灭酸也通过在胞内位点封闭孔隙而抑制CFTR(Dawson等人，1999，Physiol.Rev.，79：S47-S75；McCarty，2000，J.Exp.Biol.，203：1947-1962)。
因此亟需CFTR抑制剂，特别是那些水溶性的。本发明致力于这些需要，以及其它需要，并解决了在背景技术中发现的不足。
文献
Ma等人，2002，J.Clin.Invest.，110：1651-1658描述了噻唑烷二酮(thiazolidinone)类的CFTR抑制剂。
发明概述
本发明提供了抑制囊性纤维化跨膜转导调节因子蛋白(CFTR)的组合物、药物制剂和方法，它们可用于研究和治疗CFTR介导的疾病和病症。本发明的组合物和药物制剂可包含一种或多种含有酰肼的化合物，以及可任选地还包含一种或多种药物可接受的载体、赋形剂和佐剂。在某些实施方案中，本发明的方法包括对患有CFTR介导的疾病和病症的患者给予有效量的含有酰肼的化合物。在其它实施方案中，本发明提供了抑制CFTR的方法，其包括使个体内的细胞与有效量的含有酰肼的化合物接触。此外，本发明以CFTR介导的疾病的非人动物模型为特色，该模型是通过对非人动物给予足以抑制CFTR的量的含有酰肼的化合物而产生。
通过阅读下面更加充分描述的含酰肼的化合物的细节，对本领域技术人员来说，本发明的这些和其它目的、优点和特征将会变得显而易见。
附图简述
参考附图可以更加全面的理解本发明，而这些附图仅仅是处于说明目的。
图1A是用于检测CFTR抑制剂的筛选技术的示意图。在共表达人CFTR和具有Cl-/I-敏感性荧光的黄色荧光蛋白(YFP)的稳定转染的上皮细胞中，CFTR被多种激动剂最大程度地刺激。在测试化合物加入后，通过加入含I-的溶液诱导I-内流。
图1B显示通过图1A的筛选技术所确定的CFTR抑制剂的化学结构。
图1C是对几种浓度下的CFTR抑制剂N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼(本文称为GlyH-101)使用图1A的筛选技术得到的相对荧光对时间变化的示意图。
图1D是GlyH-101在表达人CFTR的透化处理(permeabilized)的FRT细胞中抑制短路电流的示意图。CFTR被100μM CPT-cAMP刺激。
图2A是抑制时程的示意图，显示在加入10μM GlyH-101后在不同时间CFTR介导的I-转运速率。
图2B是抑制逆转时程的示意图，显示在清除GlyH-101后在不同时间I-的转运速率。
图2C是在CFTR被标明的激动剂(50μM)刺激后GlyH-101(50μM)对碘内流影响的示意图。填充条表示激动剂，空白条表示激动剂加GlyH-101。
图3A提供了一类GlyH-101类似物的化学结构，修饰位点已用括号标出。
图3B描述了合成GlyH-101、N-(6-喹啉基)-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼(本文称为GlyH-126)、3，5-二溴-2，4-二羟基-[2-(2-萘胺)乙酰]苯甲酸酰肼(本文称为GlyH-201)和N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)甲基]甘氨酸酰肼(本文称为GlyH-301)。试剂和条件：(a)ICH2COOEt，NaOAc，95℃；(b)N2H4.H2O EtOH/回流；(c)3，5-di-Br-2，4-di-OH-Ph-CHO，EtOH/回流，(d)3，5-di-Br-2，4-di-OH-Ph-COCl，吡啶，22℃；(e)N2H4.H2O，Pd/C(10％)，DMF/回流；(f)乙醛酸，10℃；(g)Na2BH3CN/CH3CN，48h；无水HCl，EtOH。
图3C是N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]草氨酸酰肼(本文称为OxaH-110)抑制表达人CFTR的经透化处理的FRT细胞中短路电流的示意图(右图)和OxaH-110的结构(左图)。CFTR被100μMCPT-cAMP刺激。
图4A是在表达人CFTR的FRT细胞的全细胞膜片钳实验(whole-cell patch clamp experiment)中测定的GlyH-101抑制的示意图。在5μM佛司可林(forskolin)对CFTR进行最大刺激后，全细胞膜电流受到从-100到+100mV、以20mV步进的电压激发。左图表示在加入GlyH-101前的测量值，右图表示在加入GlyH-101后的测量值。
图4B是在没有抑制剂(对照，空白圆)、加入10μM(填充的方块)和加入30μM GlyH-101(填充的圆)后、清除10μM GlyH-101后(复原，三角形)和加入5μM CFTRinh-172后(填充的圆)的电流-电压关系图。
图4C是在标明的膜电势下测定的GlyH-101量效关系图。
图4D表示代表性的细胞贴附式膜片钳(cell-attached patch-clamp)的记录结果，显示在GlyH-101浓度为0、0.4和5μM时CFTR单个通道的活性。虚线表示零电流水平(通道关闭)，向下的偏移表示通道打开(Cl-离子从吸液管移动进入细胞)。吸液管电势为-60mV。
图5A表示在含有MES、HEPES、硼酸和柠檬酸(各10mM)的NaCl(100mM)中，使用HCl/NaOH滴定至不同pH时，化合物(10μM)(对应的化学结构，左图)的pH依赖性的吸光度的变化。在分析波长为346、348、346和236nm处(由上到下)测定吸光度的变化。
图5B为推断的显示pKa值的GlyH-101离子平衡示意图。
图6A表示GlyH-101抑制鼻部的电势差(PD)，其记录结果显示对于阿米洛利(amiloride)和低Cl-溶液的反应(左图)或平均PD值(右图，平均值±SE，n＝5)。此处标出的低Cl-溶液含有佛司可林，不含有或含有GlyH-101。
图6B表示如图6A中的配对分析图，显示佛司可林、佛司可林和CFTRinh-172、佛司可林和GlyH-101对PD变化(ΔPD)的作用。
图6C表示在一系列的低Cl-诱导的超极化(左图)或佛司可林诱导的超极化(右图)试验中PD的变化(平均值土SE)，其中溶液中含有4，4’-二异硫氰基均二苯乙烯-2，2’-二磺酸(DIDS)或GlyH-101(*P＜0.005减少的ΔPD与对照相比)。
图7A表示T84细胞(上图)、人类呼吸道细胞(中图)和分离的小鼠回肠细胞(下图)在CFTR刺激后，GlyH-101对短路电流的抑制。在恒定基线电流后，加入阿米洛利(10μM，顶端溶液(apical solution))和CPT-cAMP(0.1Mm，两种溶液)，继而是标明浓度的GlyH-101(两种溶液)。
图7B表示在霍乱毒素诱导的液体分泌的封闭肠环模型中GlyH-101对液体分泌的抑制。在注射盐水(对照)、霍乱毒素(1μg)或霍乱毒素+GlyH-101(0.25μg)4个小时后测定的以环重量/长度(gm/cm，SE，6只小鼠)表示的肠腔液体。
图8提供了本发明甘氨酸酰肼化合物的一类非吸收丙二酸二酰肼(称作MalH-x)类似物的化学结构。
图9描述了合成极性非吸收性CFTR抑制剂2-萘氨基-双[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]丙二酸二酰肼(MalH-I)、2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][(2，4-二钠-二磺苯基)亚甲基]丙二酸二酰肼(MalH-2)和2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-(4-钠-磺苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼(MalH-3)的反应路线。试剂和条件：(a)溴代丙二酸二乙酯，NaOAc，90℃，8小时，84％；(b)N2H4.H2O，EtOH/回流，10小时，92％；(c)，(d)3，5-di-Br-2，4-di-OH-苯甲醛(1当量)，EtOH/回流，3小时，58％；(e)2，4-di-SO3Na-苯甲醛，DMF/回流，4小时，58％；以及(f)4-钠磺苯基异硫氰酸酯，DMF/回流，4小时，47％。
图10描述了PEG基化的CFTR抑制剂MalH-(PEG)n(A图)和MalH-(PEG)nB(B图)合成的反应路线。
图11描述了合成PEG基化的CFTR抑制剂GlyH-(PEG)n的反应路线。试剂和条件：(i)Br-buterolactone，NaOAc，90℃，8小时，89％；j)N2H4.H2O，EtOH/回流，10小时，89％；(k)(BOC)2O，THF，室温，86％；(1)TsCl，吡啶，-15℃，8小时，73％；(m)NH2-PEG，DMF，80℃，24小时，38％；(n)TFA，CH2Cl2，室温30分钟，73％；(o)3，5-di-Br-2，4-di-OH-苯甲醛，EtOH/回流，3小时，58％。
图12是一系列表示在表达人野生型CFTR的FRT上皮细胞中抑制顶膜氯电流的图。在处于氯离子梯度并经基底侧膜透化处理后的细胞中通过短路电流分析测定氯电流。CFTR以100μM CPT-cAMP进行刺激。按标明的逐步增加的浓度加入MalH化合物。
图13是一系列显示CFTR抑制剂的肠吸收和止泻功效的图。图A是表示在活小鼠的封闭空肠环中2小时对标明的MalH化合物的吸收的图(SD，n＝4-6只小鼠)。为了比较，显示了按相同方法测定的CFTRinh-172的吸收值。图B是显示在封闭的空肠环中抑制霍乱毒素诱导的液体分泌的图。以盐水(PBS)或含有1μg霍乱毒素(CT)与标明量的MalH化合物的盐水注射肠环。在6小时时测定肠环重量与长度的比值(SD，n＝3-5只小鼠)。
在描述本发明之前，应当了解本发明不限于所描述的具体实施方案，由于这些必然可以改变。同样应当了解此处所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，并非有意的限定，因为本发明的范围只能由所附的权利要求书所限定。
在提供数值范围时，应当理解每一个介于此范围的上下限之间的数值和任何其它在所声明范围内声明的或处于其间的数值均包含于本发明之内，除非上下文以其它方式清楚的提示，将直到下限单位的1/10。这些较小的范围的上下限可独立的包含于较小的范围中，其也包含于本发明的范围中，包括所声明范围内的任何特定排它限定。当声明的范围包括一个或两个界限，排除任一界限的范围也同样包含于本发明中。
除非另有说明，此处所用的所有科技术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常的理解相同的含义。尽管任何与本文描述相似的或等价的方法和材料也可以在本发明的实践或实验中使用，但是优选现在所描述的方法和材料。所有本文提到的出版物在此并入作为参考，以公开和描述与所引用的出版物有联系的方法和/或材料。
应当注意，当用在本文和所附的权利要求中时，除非上下文有清楚的其它指示，单数形式“a”、“and”和“the”包括复数指代物。因此，例如提到“an inhibitor”，包括了这些抑制剂的复数，和提到“the cell”包括了本领域技术人员公知的一个或多个细胞和其等价物，等等。
提供了本文所讨论的出版物仅是因为其在本申请递交日之前公开。所有的一切都不应被理解为承认本发明不能通过在先发明而先于这些出版物享受在先权利。而且，所提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同，需要独立进行证实。
发明详述
本发明基于作为高亲和性CFTR抑制剂的含酰肼化合物的发现。这些在本文中公开具有CFTR抑制活性的化合物及其衍生物的结构以及药物制剂和使用方法在下文有更加详细地描述。
定义
“囊性纤维化跨膜转导调控因子蛋白介导的病症或症状”或“CFTR介导的病症或症状”是指任何由囊性纤维化跨膜转导调控因子蛋白(CFTR)活性(例如CFTR离子转运活性)引致的病症、紊乱或疾病，或者该病症、紊乱或疾病的症状。该病症、紊乱、疾病、或其症状是通过抑制CFTR的活性(例如抑制CFTR离子转运)来治疗。CFTR的活性例如涉及应答包括霍乱毒素在内的多种激动剂的肠分泌(例如参见Snyder等人，1982，Bull.World Health Organ.60：605-613；Chao等人，1994，EMBO J.13：1065-1072；Kimberg等人，1971，J.Clin.Invest.50：1218-1230)。
本文中所用的“CFTR抑制剂”是降低CFTR离子转运功效的化合物，特别是降低CFTR的氯离子转运。本发明CFTR抑制剂优选为特异性的CFTR抑制剂，即抑制CFTR活性的化合物不会显著地或不利地影响其它离子转运蛋白，如其它氯转运蛋白、钾转运蛋白等。优选的CFTR抑制剂是高亲和力CFTR抑制剂，例如与CFTR至少具有约1微摩尔的亲和力，通常约为1至5微摩尔。
术语“分离的化合物”是指已基本上从自然界与其共存的其它化合物中分离出，或相对这些其它化合物浓缩后的化合物。基于重量，优选该化合物至少为约80％纯，更优选为至少90％纯，甚至更优选至少为98％纯，最优选为至少约99％纯。本发明意图包含非对映体以及它们消旋的和拆分的对映体纯形式及其药物可接受的盐。
本文所用的“治疗”涵盖了对个体由CFTR活性介导的疾病、病症、紊乱或症状的治疗，包括：(1)预防该疾病、病症或紊乱，即在可能暴露于或易感于疾病、病症或紊乱但是还没有经历或显示出其症状的个体中导致不出现疾病的临床症状；(2)抑制疾病、症状或紊乱，即阻止或减少疾病、病症或紊乱或其临床症状的发展；或者(3)缓解疾病、病症或紊乱，即引起疾病、症状或紊乱或其临床症状的消退。
“治疗有效量”或“有效量”是指当对哺乳动物或其它的有其需要的个体给药时，本发明化合物的量足以实现对由CFTR活性介导的疾病、病症、紊乱或症状的如上所定义的治疗作用。达到治疗有效量的本发明化合物的量依赖于化合物、疾病和其严重性、以及待治疗的个体的年龄、体重等而变化，但是它可以由本领域普通技术人员根据他自己的知识和本公开常规来确定。
术语“个体”和“患者”为任何哺乳动物和非哺乳动物种属的一个成员或多个成员，其可能需要本文所述的制药方法、组合物和治疗。由此个体和患者包括但不限于，灵长类(包括人)、犬科、猫科、有蹄类动物(例如，马、牛、猪(例如猪(pig))、鸟类及其它个体。特别关注在商业上重要的人和非人动物(例如家畜和驯养动物)。
“哺乳动物”指任何哺乳动物种属的一个成员和多个成员，并包括作为示例的犬科；猫科；马；牛；羊；啮齿动物等等以及灵长类，特别是人。非人动物模型，特别是哺乳动物，例如灵长类、鼠科动物、兔类等可用于实验研究中。
本文所用的术语“单位剂量形式”指适合作为用于人和动物个体的单一剂量的物理上分散的单位，每一单位中的成分含有预定量的本发明化合物，其根据足以产生所需效果的剂量来计算，并同时含有药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。说明本发明新的单位剂量形式的说明书依据所用的特定化合物和预期产生的作用、以及在宿主中每种化合物的药代动力学来确定。
术语“生理状态”包括与存活细胞相容的状态，例如与存活细胞相容的温度、pH、盐度等等主要的水环境状态。
“药物可接受的赋形剂”指用于制备药物组合物的赋形剂，其通常为安全、无毒、不是生物上或其它方面所不希望的，并包括兽用可接受和人用药物可接受的赋形剂。本发明说明书和权利要求书所用的“药物可接受赋形剂”包括一种和多种此类赋形剂。
本文所用的“药物组合物”包括适于对个体(例如哺乳动物，特别是人)给药的组合物。一般而言，“药物组合物”是无菌的，且优选不含能够在个体内引起不期望反应的污染物。药物组合物可以设计用于个体或对其有需要的患者通过许多不同的给药途径给药，包括口服、口腔、直肠、非肠道的、腹膜内、皮内、气道(intracheal)等。在一些实施方案中，使用不同于DMSO的渗透增强剂，该组合物可适于透皮途径给药。在其它的实施方案中，该药物组合物适于通过透皮给药以外的途径进行给药。
本文所用的本发明化合物的“药物可接受衍生物”包括盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、酮缩醇、原酸酯、半缩醛、半酮缩醇、酸、碱、溶剂化物、水合物或其前药。本领域所属技术人员使用公知的用于这种衍生作用的制备方法可容易地制备这些衍生物。由此制备的化合物可对动物或人给药而无实质性毒性作用，或者其是制药活性的或是前药。
本发明化合物的“药物可接受的盐”指药物上可接受并具有母体化合物的所需药理活性的盐。这类盐包括：(1)酸加和盐，与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等)形成；或与有机酸形成，该有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]八-2-烯基-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4’-亚甲基双-(3-羟基-2-烯基-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、己二烯二酸等等；或(2)当出现在母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土离子或铝离子)取代时形成的盐；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等等)共同形成盐。
本发明化合物的“药物可接受的酯”指药物可接受并具有所述母体化合物的所需药理学活性，包括但不限于酸性基团(包括但不限于羧酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亚磺酸及硼酸)的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基和杂环基酯。
本发明化合物的“药物可接受的烯醇醚”指药物可接受并具有所述母体化合物的所需药理学活性的烯醇醚，包括但不限于通式C＝C(OR)的衍生物，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基或杂环基。
本发明化合物的“药物可接受的烯醇酯”指药物可接受并具有所述母体化合物的所需药理学活性的烯醇酯，包括但不限于通式C＝C(OC(O)R)的衍生物，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基或杂环基。
本发明化合物的“药物可接受的溶剂化物或水合物”指药物可接受并具有所述母体化合物的所需药理学活性的溶剂化物或水合物复合物，包括但不限于本发明化合物与一个或多个溶剂或水分子、或1至约100个、或1至约10个、或1至2、3、或4个溶剂或水分子的复合物。
“前药”指当该前药对哺乳动物个体给药时，在体释放通式(I)的活性母体化合物的任何化合物。所述通式(I)化合物的前药包含在标准的生理状态下可水解成为对应的羧基、羟基或氨基的功能基团。这种功能基团的例子包括但不限于通式(I)化合物中羟基的酯(例如乙酯、甲酯、苯甲酯衍生物)和氨基甲酸酯(例如，N，N-二甲基氨基羰基)等等。其它的例子包括通式(I)化合物中羟基或羧基的二肽或三肽酯等等。这种功能化合物的制备是本领域公知的。例如，含有与之相连的羟基的通式(I)化合物可用含有自由羧基末端的羧酸或二肽来处理，在本领域公知的酯化条件下产生所需的酯类功能基团。同样地，含有与之相连的自由羧基的通式(I)化合物可用含有诸如丝氨酸残基的羟基(例如，-N(H)-C(H)(CH2OH)-C(O)-)的醇或三肽来处理，在本领域公知的酯化条件下产生所需的酯类功能基团。此外，含有与之相连的羧基酯基团的通式(I)化合物可用不同的羧基酯来处理，在酯基转移作用条件下生成具有所需功能酯基与之相连的通式(I)化合物。所有这种功能基团属于本发明的范围。
本文所用术语“有机基团”和“有机原子团”指任何含碳基团，包括烃基，其分为脂肪基、环基、芳香基、其功能化衍生物和/或其各种组合。术语“脂肪基”指饱和或不饱和的直链或支链烃基，例如包括烷基、烯基和炔基。术语“烷基”指取代或非取代、饱和直链或支链烃基或链(例如，C1-C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等等。适合的取代包括羧基、保护的羧基、氨基、保护的氨基、卤素、羟基、保护的羟基、巯基、低级烷基硫基、硝基、氰基、单取代氨基、保护的单取代氨基、双取代氨基、C1-C7烷氧基、C1-C7酰基、C1-C7酰氧基等等。术语“取代的烷基”指上述定义的烷基基团被羟基、保护的羟基、氨基、保护的氨基、氰基、卤素、三氟甲基、单取代氨基、双取代氨基、低级烷氧基、巯基、低级烷基硫基、羧基、保护的羧基、或羧基、氨基、和/或羟基盐取代一至三次。如与杂芳香环的取代基相关联使用，下文定义的术语“取代的(环烷基)烷基”和“取代的环烷基”由所列出的用于“取代的烷基”的相同基团所取代。术语“烯基”指具有诸如乙烯基的一个或多个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃基。术语“炔基”指具有一个或多个碳-碳三键的不饱和直链或支链烃基。术语“环基”指闭合的环烃基，其分为脂环基、芳香基或杂环基。术语“脂环基”指具有类似脂肪族基团性质的环烃基。“芳香基”或“芳基”指单环或多环芳香烃基，并可包括一种或多种杂原子，下文对其做了进一步定义。术语“杂环”指闭合的烃，其中环中的一个或多个原子为非碳元素(例如，N、O、S等)，下文做了进一步定义。
“有机基团”可为功能化的或另外含有附加的与该有机基团相关的功能基团，诸如羧基、氨基、羟基等等，其可以是保护的或未保护的。例如，短语“烷基基团”应不仅包括纯的开链饱和烃烷基取代基，诸如甲基、乙基、丙基、叔丁基等等，而且还包括含有另外本领域公知的取代基的烷基取代基，所述取代基诸如羟基、烷氧基、巯基、烷基硫基、烷基磺酰基、卤素、氰基、硝基、氨基、羧基等等。因此“烷基基团”包括醚、酯、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟基烷基、磺烷基等等。
本文替换使用的术语“卤素基团”或“卤素”指氟、氯、溴、碘基团。
术语“卤代烷基”指由一种或多种卤素原子取代的上述定义的烷基基团。所述的卤素原子可以相同或不同。术语“二卤代烷基”指由两个卤素基团取代的上述烷基基团，卤素基团可以相同或不同。术语“三卤代烷基”指由三个卤素基团取代的上述烷基基团，卤素基团可以相同或不同。术语“全卤代烷基”指烷基基团中的每个氢原子都被卤素原子取代的上述定义的卤代烷基基团。术语“全氟代烷基”指，烷基基团中的每个氢原子都被氟取代的上述定义的卤代烷基基团。
术语“环烷基”指单环、双环或三环的饱和环，其为完全饱和/或部分不饱和。这种基团的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基、环辛基、顺-或反-萘烷、二环[2.2.1]庚-2-烯、环己-1-炔基、环戊-1-炔基、1，4-环辛二炔基，等等。
术语“(环烷基)烷基”指被一个上述环烷基取代的上述定义的烷基基团。这种基团的例子包括(环己基)甲基、3-(环丙基)-正丙基、5-(环戊基)己基、6-(金刚烷基)己基，等等。
术语“取代的苯基”特指由一个或多个部分取代的苯基基团，在一些例子中，由一个或两个或三个选自卤素、羟基、保护的羟基、氰基、硝基、巯基、烷基硫基、三氟甲基、C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7酰基、C1-C7酰氧基、羧基、氧羧基、保护的羧基、羧甲基、保护的羧甲基、羟甲基、保护的羟甲基、氨基、保护的氨基、(单取代的)氨基、保护的(单取代的)氨基、(双取代的)氨基、羧酰胺、保护的羧酰胺、N-(C1-C6烷基)羧酰胺、保护的N-(C1-C6烷基)羧酰胺、N，N-二(C1-C6烷基)羧酰胺、三氟甲基、N-((C1-C6烷基)磺酰)氨基、N-(苯磺酰)氨基或苯基、取代或非取代的例如二苯基或萘基基团产物的部分所取代。
术语“取代的苯基”的例子包括单或双(卤代)苯基基团，例如，2-，3-或4-氯苯基、2，6-二氯苯基、2，5-二氯苯基、3，4-二氯苯基、2-，3-或4-溴苯基、3，4-二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2-，3-或4-氟苯基等等；单或双(羟基)苯基基团，例如2，3，或4-羟基苯基、2，4-二羟基苯基、及其保护的羟基衍生物等等；硝基苯基基团，例如2-，3-或4-硝基苯基；氰基苯基基团，例如2-，3-或4-氰基苯基；单或双(烷基)苯基，例如2-，3-或4-甲基苯基、2，4-二甲基苯基、2-，3-或4-(异丙基)苯基、2-3-或4-乙基苯基、2-，3-或4-(正丙基)苯基等等；单或二(烷氧基)苯基基团，例如2，6-二甲氧基苯基、2-，3-或4-(异丙氧基)苯基、2-，3-或4-(叔丁氧基)苯基、3-乙氧基-4-甲氧苯基等等；单或二(卤代)-，单、二或三(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基、3-溴-4-羟基苯基等；单或二(卤代)-单或二-(羟基)-单或二-(烷氧基)苯基，例如3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基等；2-，3-或4-三氟甲基苯基；单羧基苯基或二羧基苯基或(保护的羧基)苯基基团，例如2-，3-或4-羧基苯基或2，4-二(保护的羧基)苯基；单或二(羟甲基)苯基或(保护的羟甲基)苯基，例如2-，3-或4-(保护的羟甲基)苯基或3，4-二(羟甲基)苯基；单或二(氨基甲基)苯基或(保护的氨基甲基)苯基，例如2-，3-或4-(氨甲基)苯基或2，4-(保护的氨基甲基)苯基；或单或二(N-(甲磺酰氨基))苯基，例如2-，3-或4-(N-(甲磺酰氨基))苯基。而且，术语“取代的苯基”代表双取代苯基基团，其中所述的取代基是不同的，例如，3-甲基-4-羟基苯基、3-氯-4-羟基苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羟基苯基、3-羟基-4-硝基苯基、2-羟基-4-氯苯基等等。
术语“(取代的苯基)烷基”指一种上述取代的苯基基团连接到一种上述烷基基团上。这些基团的例子包括2-苯基-1-氯乙基、2-(4’-甲氧基苯基)乙基、4-(2’，6’-二羟基苯基)-正己基、2-(5’-氰基-3’-甲氧基苯基)-正戊基、3-(2’，6’-二甲基苯基)丙基、4-氯-3-氨基苄基、6-(4’-甲氧基苯基)-3-羧基己基、5-(4’-氨基甲基苯基)-3-(氨甲基)戊基、5-苯基-3-氧戊基-1-基、(4-羟基萘-2-基)甲基等等。
如上所述，术语“芳香的”或“芳基”指五元和六元碳环。同时如上所述，术语“杂芳基”指任意取代的五元或六元环，其含有1-4个杂原子，例如氧、硫和/或氮原子，特别是氮原子，可单独或连同环上的氧或硫原子。这些五元或六元环可以是完全不饱和的。
此外，上述任意取代五元或六元环可任意地稠合到芳香五元或六元环体系中。例如，所述的环能任意地稠合到诸如吡啶或三唑体系的五元或六元环体系中，且优选稠合到苯环。
下列环体系为由术语“杂芳基”表示的杂环(无论取代或非取代)基团的例子：噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基、氧杂二唑基、四唑基、噻三唑基、氧杂三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基四唑并、1，5-[b]哒嗪基及嘌呤基、以及苯并稠合衍生物，例如苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基及吲哚基。
上述任意取代的杂芳基环的取代基来自一到三个卤素、三卤代甲基、氨基、保护的氨基、氨盐、单取的代氨基、双取代的氨基、羧基、保护的羧基、羧酸盐、羟基、保护的羟基、羟基基团的盐、低级烷氧基、巯基、低级烷基硫基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代环烷基、(环烷基)烷基、取代的(环烷基)烷基、苯基、取代的苯基、苯基烷基以及(取代的苯基)烷基。杂芳基基团的取代基如上所定义，或当为三卤代甲基时，为三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基或三碘甲基。用作与上述杂芳基环相关的取代基时，“低级烷氧基”指C1-C4烷氧基基团，同样地，“低级烷基硫基”指C1-C4烷基硫基基团。
术语“(单取代的)氨基”指由一个取代基取代的氨基，该取代基选自苯基、取代的苯基、烷基、取代的烷基、C1-C4酰基、C2-C7烯基、C2-C7取代烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷基芳基、C7-C16取代的烷基芳基及杂芳基基团。(单取代的)氨基可另外含有氨基保护基团，作为术语“保护的(单取代)氨基”所包含的内容。术语“(双取代的)氨基”指由两个取代基取代的氨基基团，该取代基选自苯基、取代的苯基、烷基、取代的烷基、C1-C7酰基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷基芳基、C7-C16取代的烷基芳基和杂芳基。这两个取代基可以相同或不同。
术语“杂芳基(烷基)”指被上述定义的杂芳基基团在任何位置上取代的上述定义的烷基基团。
“任选的”或“任选地”指随后描述的事件、情况、特征或元素可以但不必要发生，且该描述包括该事件和情况发生的例子及其不发生的例子。例如，“以烷基基团任选地单取代或双取代的杂环基团”指所述的烷基可以但不必要出现，且该描述包括以烷基基团对该杂环基团进行单取代或双取代的状态以及不用该烷基基团对该杂环基团进行取代的状态。
术语“吸电子基团”指在分子中功能基团将电子吸至其自身的能力大于于如果是氢原子占据了所述分子中相同的位置时的吸电子能力。吸电子基团的例子包括但不限于，卤素基团，-C(O)R基团(其中R为烷基)；羧酸和酯基；-NR3 +基团(其中R为烷基或氢)；偶氮基；硝基；-OR和-SR基(其中R为氢或烷基)；以及含有此类吸电子基团的有机基团(如本文所定义的)，例如卤代烷基基团(包括全卤代烷基基团)，等等。
具有相同分子式但在性质或其原子成键顺序、或者其原子的空间排列上不同的化合物称为“异构体”。其原子的空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。相互不为镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，而相互为不能重合的镜像的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物具有非对称中心时，例如，其结合有四种不同的基团，一对立体异构体的存在是有可能的。能够利用其非对称中心的绝对构型来表征对映异构体，并可利用Cahn和Prelog的R-与S-顺序规则来描述，或者通过其分子旋转偏振光平面的方式来描述，并可指定为右旋的或左旋的异构体(即，分为别为(+)或(-)异构体)。手性化合物能以单一的对映异构体或以其混合物的形式存在。含有等份对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
本发明的化合物可具有一个或多个非对称中心；因此这种化合物可制备成为独立的(R)-或(S)-立体异构体或其混合物。除非另有说明，本发明说明书和权利要求书中的特定化合物的描述或命名应同时包括单一对映异构体及其混合物、其外消旋体或其它。立体化学的鉴定和立体异构体的分离方法是本领域公知的(参见例如“Advanced OrganicChemistry(高级有机化学)”第四章，第四版，J.March，John Wiley andSons，New York，1992中的讨论).
概述
本发明提供了含有酰肼的化合物、衍生的组合物及其用于高亲和性地抑制囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)和用于研究和治疗CFTR介导的疾病和病症的方法。含酰肼主题化合物和衍生物的发现是基于使用为鉴定直接与CFTR相互作用的CFTR抑制剂而设计的测定法对大量潜在候选化合物的筛选而实现的。不为任何特殊理论或操作模式所束缚，既然多种在不同激活途径中起作用的CFTR活化剂包括在导致确定主题化合物的研究中，所以本发明的抑制性化合物很可能通过作用在位于或接近CFTR氯离子转运通道处而实现抑制。对100,000个不同化合物的筛选确认了一些作为有效的CFTR抑制剂的化合物和衍生物(图1B)。这些化合物和衍生物与已知的CFTR活化剂或已知的CFTR抑制剂DPC、NPPB格列苯脲或噻唑烷二酮在化学上和结构上不相关。从筛选中确认的最有效的CFTR抑制剂具有抑制人类呼吸道细胞中氯离子流的约2μM的Ki。抑制作用是快速、可逆和CFTR特异性的。
现在将更加详细地描述本发明的组合物和方法。
含酰肼化合物
本文中描述的含酰肼化合物包含芳香基-或杂芳香基取代的氮、酰肼(可为甘氨酸或草氨酸酰肼)以及取代或取代的芳基。在特定的实施方案中，作为单独立体异构体或其混合物的主题化合物或其药物可接受的衍生物一般以如下式(I)来描述：
其中，X是独立地选自烷基或羰基；Y是独立地选自烷基；具有诸如磺基或羧基的极性取代的烷基，或链接(linker)，例如用以提供与一个或多个较大极性分子连接的酰胺键或醚链接，这些较大极性分子例如为聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、二糖，取代或未取代的苯基、聚烷基亚胺、0-10代的树枝状聚合物(dendrimer)等，其中Y还可包括此种连接的极性分子；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的杂芳基如取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的蒽基、取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢和烷基。在一个实施方案中，R1选自取代的苯基、未取代的喹啉基、未取代的蒽基和未取代的萘基；R2是取代的苯基；R3独立地选自氢和烷基。R1、R2和R3的示例性取代基在下文中更加详细地描述。
在某些实施方案中，所述含酰肼化合物通常用式(I)描述，其中X是烷基。这些化合物通常用如下式(Ia)来描述：
其中Y是氢或烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；X1独立地选自氢或烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基，或包含极性分子的烷基，该极性分子选自磺基、羧基、羧酰胺基、聚氧烷基聚醚、二糖、取代或未取代的苯基、或聚乙烯亚胺(PEI)、或0-10代的树枝状聚合物；R1独立地选自取代或未取代苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基、取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢和烷基。在某些实施方案中，当X1是氢时，R1是取代或未取代的蒽基或杂芳香基。在其它实施方案中，当X1是氢时，Y不是氢。
在具体的实施方案中，R1独立地选自单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-氯苯基；单-(烷基)苯基，例如2-、3-或4-甲苯基；萘基，例如1-或2-萘基；单-或二(卤代)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-氯萘基，3，4-或5，6-或5，7-或5，8-二氯萘基；单-或二(羟基)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-羟基萘基，1，8-、3，4-二羟基萘基；单-或二或三(烷氧基)萘基，例如1-、3-、5-、6-、7-或8-甲氧基萘基，5，8-二甲氧基萘基，1，4，8-三甲氧基萘基；单-或二(烷基)萘基，例如1-、3-、4-、5-或6-甲基萘基，4，5-、4，6-二甲基萘基；单-(羟基)-单或二(磺基)萘基，例如4-羟基-2-磺基-萘基、8-羟基-3，6-二磺基萘基；单(烷基)-单-或二(烷氧基)萘基，例如1-甲基-5，6-二甲氧基萘基；或喹啉基，如6-喹啉基；R2独立地选自取代的苯基，例如：单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-溴苯基；单或二(羟基)苯基，如2、3、4-羟基苯基和2，4-二羟基苯基；单-或二(卤代)-单-、二-或三-(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基和3-溴-4-羟基苯基；单-或二(卤代)-单-或二-(羟基)-单-或二-(烷氧基)苯基，例如3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基；以及R3独立地选自氢或烷基。
在其它实施方案中，式(Ia)的含酰肼化合物和衍生物可包括化合物，其中Y是氢；X是氢、甲基或乙基；R1独立地选自单-(卤代)苯基(如2-、3-或4-氯苯基)、萘基(如2-萘基或1-萘基)；R2独立地选自二-(卤代)-单-或二(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基；R3是氢或甲基。
在其它实施方案中，所述含酰肼化合物通常用式(I)描述，其中X是CH2。这些化合物通常用如下式(Ib)描述：
其中，Y是氢或烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R1独立地选自取代或未取代的苯基、的取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基、取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢和烷基。
在某些实施方案中，Y是烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基以及取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；以及R3独立地选自氢和烷基。
在特定的实施方案中，R1独立地选自单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-氯苯基；单-(烷基)苯基，例如2-、3-或4-甲苯基；萘基，例如1-或2-萘基；单-或二(卤代)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-氯萘基，3，4-或5，6-或5，7-或5，8-二氯萘基；单-或二(羟基)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-羟基萘基，1，8-、3，4-二羟基萘基；单-或二或三(烷氧基)萘基，例如1-、3-、5-、6-、7-或8-甲氧基萘基，5，8-二甲氧基萘基，1，4，8-三甲氧基萘基；单-或二(烷基)萘基，例如1-、3-、4-、5-或6-甲基萘基，4，5-、4，6-二甲基萘基；单-(羟基)-单或二(磺基)萘基，例如4-羟基-2-磺基-萘基、8-羟基-3，6-二磺基萘基；单(烷基)-单-或二(烷氧基)萘基，例如1-甲基-5，6-二甲氧基萘基；或喹啉基，例如6-喹啉基；R2独立地选自由取代的苯基组成的组，例如：单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-溴苯基；单或二(羟基)苯基，例如2、3、4-羟基苯基和2，4-二羟基苯基；单-或二(卤代)-单-、二-或三-(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基和3-溴-4-羟基苯基；单-或二(卤代)-单-或二-(羟基)-单-或二-(烷氧基)苯基，例如3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基；以及R3独立地选自氢或烷基。式(Ib)描述的化合物通常称为甘氨酸酰肼。
在其它实施方案中，式(Ib)的含酰肼化合物和衍生物可以包括这样的化合物，其中Y是氢；R1独立地选自单-(卤代)苯基(如2-、3-或4-氯苯基)、萘基(如2-萘基或1-萘基)；R2独立地选自二-(卤代)-单-或二(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基；以及R3是氢或甲基。
然而在其它实施方案中，含酰肼化合物通常用式(I)描述，其中X是羰基。该化合物通常用下式Ic)描述：
其中，Y是氢或烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基以及取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；以及R3独立地选自氢和烷基。
在某些实施方案中，Y是烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R1独立地选自取代或未取代苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基以及取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；以及R3独立地选自氢和烷基。
在特定的实施方案中，R1独立地选自单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-氯苯基；单-(烷基)苯基，例如2-、3-或4-甲苯基；萘基，例如1-或2-萘基；单-或二(卤代)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-氯萘基，3，4-或5，6-或5，7-或5，8-二氯萘基；单-或二(羟基)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-羟基萘基，1，8-、3，4-二羟基萘基；单-或二或三(烷氧基)萘基，例如1-、3-、5-、6-、7-或8-甲氧基萘基，5，8-二甲氧基萘基，1，4，8-三甲氧基萘基；单-或二(烷基)萘基，例如1-、3-、4-、5-或6-甲基萘基，4，5-、4，6-二甲基萘基；单-(羟基)-单或二(磺基)萘基，例如4-羟基-2-磺基-萘基、8-羟基-3，6-二磺基萘基；单(烷基)-单-或二(烷氧基)萘基，例如1-甲基-5，6-二甲氧基萘基；或喹啉基，例如6-喹啉基；R2独立地选自由取代的苯基组成的组，例如：单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-溴苯基；单或二(羟基)苯基，例如2、3、4-羟基苯基和2，4-二羟基苯基；单-或二(卤代)-单-、二-或三-(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基和3-溴-4-羟基苯基；单-或二(卤代)-单-或二-(羟基)-单-或二-(烷氧基)苯基，例如3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基；以及R3独立地选自氢或烷基。式(Ic)描述的化合物通常称为草氨酸酰肼。
在其它实施方案中，式(Ic)的含酰肼化合物和衍生物可以包括这样的化合物，其中Y是氢；R1是萘基(如2-萘基或1-萘基)；R2是二-(卤代)-单-或二(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基；以及R3是氢或甲基。
在本发明的一些实施方案中，含酰肼化合物可以包含如下式的化合物：
本文中描述的含酰肼化合物可以被修饰，以例如提供希望的特性。优选地，化合物的修饰不会显著地或不希望地不利影响含酰肼化合物的所需特性，例如化合物抑制CFTR功能的能力和水溶性。例如，本文所述的化合物可以被修饰从而降低通过细胞膜(如衬在粘膜表面内的细胞(如胃肠细胞)的细胞膜)的能力。本文公开的化合物的膜不通透性可以通过例如增加该化合物的大小或其它物理性质来提高。
在这些实施方案中，通常用式I描述的化合物的膜通透性通过添加诸如磺基和烷基-羧基的极性基团来降低。这些化合物通常用如下式
(I)描述：
Figure A20058001712100361
其中，Y独立地选自烷基；具有极性取代的烷基，例如磺基或羧基取代的烷基；或链接，例如酰胺键或醚链接以提供与一个或多个较大极性分子的连接，这些较大极性分子例如为聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、二糖、聚烷基亚胺等，其中Y还可包括这类连接的极性分子；X独立地选自烷基或羰基；R1独立地选自取代或未取代苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基以及取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；以及R3独立地选自氢和烷基。
在特定的实施方案中，Y独立地选自取代或未取代的烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；带有诸如羟基、磺基、羧化物和取代或未取代的羧酰胺基的极性基团的烷基(其中示例性的基团包括3-磺丙基、4-磺丁基、羧甲基、2-羧丙基、2-甲氧基-2-氧乙基、3-甲氧基-3-氧丙基)；或链接，例如酰胺键或醚链接以提供与一个或多个较大极性分子的连接，这些较大极性分子例如为聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、聚乙烯亚胺、二糖、三糖、聚烷基亚胺、小分子氨基葡聚糖等，其中Y还可包括这类连接的极性分子。
在一些实施方案中，化合物的不饱和酰胺键的氮可以被取代，举例如下：
其中，X独立地选自烷基或羰基；R1独立地选自取代或未取代苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基以及取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢和烷基；Y′独立地选自取代或未取代的烷基，如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；带有诸如羟基、磺基、羧化物和取代或未取代的羧酰胺基的极性基团的烷基(其中示例性的基团包括3-磺丙基、4-磺丁基、羧甲基、2-羧丙基、2-甲氧基-2-氧乙基、3-甲氧基-3-氧丙基)；或链接，例如酰胺键或醚链接以提供与一个或多个较大极性分子的连接，这些极性分子例如为聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、聚乙烯亚胺、二糖、三糖、聚烷基亚胺、小分子氨基葡聚糖等，其中Y′还可以包括这些连接的极性分子。
在一些实施方案中，X独立地选自羰基；烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，包括亚甲基、取代烷基，例如丙烯；取代或未取代苯基，例如带有极性基团的苯基；或带有极性基团的链接；R1独立地选自单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-氯苯基；单-(烷基)苯基，例如2-、3-或4-甲苯基；萘基，例如1-或2-萘基；单-或二(卤代)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-氯萘基，3，4-或5，6-或5，7-或5，8-二氯萘基；单-或二(羟基)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-羟基萘基，1，8-、3，4-二羟基萘基；单-或二或三(烷氧基)萘基，例如1-、3-、5-、6-、7-或8-甲氧基萘基，5，8-二甲氧基萘基，1，4，8-三甲氧基萘基；单-或二(烷基)萘基，例如1-、3-、4-、5-或6-甲基萘基，4，5-、4，6-二甲基萘基；单-(羟基)-单或二(磺基)萘基，例如4-羟基-2-磺基-萘基、8-羟基-3，6-二磺基萘基；单(烷基)-单-或二(烷氧基)萘基，例如1-甲基-5，6-二甲氧基萘基；或喹啉基，例如6-喹啉基；R2独立地选自由取代的苯基组成的组，例如单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-溴苯基；单或二(羟基)苯基，如2、3、4-羟基苯基和2，4-二羟基苯基；单-或二(卤代)-单-、二-或三-(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基和3-溴-4-羟基苯基；单-或二(卤代)-单-或二-(羟基)-单-或二-(烷氧基)苯基，例如3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基；以及R3独立地选自氢或烷基。
在一些实施方案中，化合物中的X可以被取代，举例如下：
Figure A20058001712100381
其中，X是烷基；R1独立地选自取代或未取代苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳香基、取代或未取代的蒽基以及取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢和烷基；Y"独立地选自取代或未取代的烷基，例如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；带有诸如羟基、磺基、羧化物和取代或未取代的羧酰胺的极性基团的烷基(其中示例性的基团包括3-磺丙基、4-磺丁基、羧甲基、2-羧丙基、2-甲氧基-2-氧乙基、3-甲氧基-3-氧丙基)；或链接，例如酰胺键或醚链接以提供与一个或多个较大极性分子的连接，这里极性分子例如为取代或未取代的苯基、聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、聚乙烯亚胺、二糖、三糖、聚烷基亚胺、小分子氨基葡聚糖、0-10代的树枝状聚合物等，其中Y″还可包括这些连接的极性分子。
在一些实施方案中，X是取代的烷基，如带有极性基团的甲基或带有极性基团的链接；R1独立地选自单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-氯苯基；单-(烷基)苯基，例如2-、3-或4-甲苯基；萘基，例如1-或2-萘基；单-或二(卤代)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-氯萘基，3，4-或5，6-或5，7-或5，8-二氯萘基；单-或二(羟基)萘基，例如1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-羟基萘基，1，8-、3，4-二羟基萘基；单-或二或三(烷氧基)萘基，例如1-、3-、5-、6-、7-或8-甲氧基萘基，5，8-二甲氧基萘基，1，4，8-三甲氧基萘基；单-或二(烷基)萘基，例如1-、3-、4-、5-或6-甲基萘基，4，5-、4，6-二甲基萘基；单-(羟基)-单或二(磺基)萘基，例如4-羟基-2-磺基-萘基、8-羟基-3，6-二磺基-萘基；单(烷基)-单-或二(烷氧基)萘基，例如1-甲基-5，6-二甲氧基萘基；或喹啉基，例如6-喹啉基；R2独立地选自由取代的苯基组成的组，例如：单-(卤代)苯基，例如2-、3-或4-溴苯基；单或二(羟基)苯基，例如2、3、4-羟基苯基和2，4-二羟基苯基；单-或二(卤代)-单-、二-或三-(羟基)苯基，例如3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基和3-溴-4-羟基苯基；单-或二(卤代)-单-或二-(羟基)-单-或二-(烷氧基)苯基，例如3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基；R3独立地选自氢或烷基；以及Y″独立地选自烷基；具有极性取代的烷基，例如磺基或羧基取代的烷基；或链接，例如酰胺键或醚链接，以提供与一个或多个较大极性分子的连接，这些极性分子例如为聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇、聚羟乙基甘油)、二糖、聚烷基亚胺和取代或未取代苯基(例如2，4-二羟基-3，5-二溴苯基、2，4-二钠二磺基苯基和3-单钠单磺基苯基，其中Y还可包括这些连接的极性分子。
在本发明的一些实施方案中，所述含酰肼化合物可具有下列化学式：
Figure A20058001712100401
Figure A20058001712100421
在其它实施方案中，所述含酰肼化合物通过使用具有不同链长的双功能链接来二聚化。该化合物细胞不通透归因于它们体积庞大的特性和立体阻碍。在特定的实施方案中，主题化合物通常用如下的式(Id)来描述：
其中，Z是单体或多聚单位，例如聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、直链多胺或双功能多糖；n的范围是0至500、1至450、2至400、5至300、10至250、20至200、30至150、40至100、50至90等。在某些实施方案中，N的范围是0至100、1至95、10至90、20至80、30至70、40至60等。在特定的实施方案中，X独立地选自烷基或羰基；Y独立地选自烷基；具有极性取代的烷基，例如磺基或羧基取代的烷基；或链接，例如酰胺键或醚链接以提供与一个或多个较大极性分子的连接，例如聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、二糖、聚烷基亚胺等，其中Y还可包括这些连接的极性分子；R1独立地选自取代苯基、喹啉基、蒽基和萘基；R2是取代苯基；以及R3独立地选自氢和烷基；或其药物可接受的衍生物，作为单一的立体异构体或其混合物。
在本发明的一些实施方案中，所述含酰肼化合物可具有下式：
药物制剂
本发明还提供了上述主题含酰肼化合物的药物制剂。该主题化合物可被纳入通过多种途径进行治疗性给药的多种制剂中。更具体地，本发明化合物可通过与适合的药物可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂组合被配制成药物组合物，且可以配制成固体、半固体、液体或气体剂型，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。该制剂优选地不含可检测到的DMSO(二甲基亚砜)，或与除DMSO之外的其它渗透促进剂一起配制。该制剂可被设计成通过许多不同的途径(其可为胃肠外的或肠内的)向需要这种制剂的个体或患者给药。示例性的给药途径包括口服、含服、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、经皮、气道等给药。
在药物剂型中，本发明的主题化合物可以以其药物可接受的衍生物的形式(例如盐)给药，或者它们可以单独使用或与其它药物活性化合物组合使用和联合使用。下面的方法和赋形剂仅为示例而绝非限制。
在一个特别有利的实施方案中，以本发明化合物向个体的胃肠道给药来降低液体分泌。适合本发明该项实施方案的制剂包括任何将该化合物递送至胃肠道表面、特别是肠道表面的制剂。
对于口服制剂，主题化合物可单独使用或与适合的添加剂组合来制造片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊，例如与诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉的常规添加剂组合；与诸如淀粉、明胶、天然糖类(如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成的胶质(如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡、微晶纤维素、纤维素衍生物和阿拉伯胶的粘合剂组合；与诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、琼脂、膨润土或黄原胶的崩解剂组合；与诸如滑石粉、油酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸钠、苯甲酸钠、醋酸钠或氯化钠的润滑剂组合；如果需要的话，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、着色剂和调味剂组合。特别有利的是使主题含酰肼化合物与缓冲剂一起配制，以便保护化合物免于胃环境的低pH。还可以优选地提供肠溶衣。在一个实施方案中，该化合物与调味剂一起配制，例如以液体、固体或半固体制剂用于口服。
口服制剂可以作为明胶胶囊来提供，其可包含活性物质和粉状载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的载体和稀释剂可以用来制作压缩片剂。片剂和胶囊剂可制成缓释产品，以让活性成分一段时间持续释放。压缩片剂可以包有糖衣或包有薄膜，以掩饰任何令人讨厌的味道和保护片剂免受空气影响，或者有肠溶包衣以在胃肠道中选择性崩解。口服液体剂型可以含有着色和/或调味剂以使患者易于接受。
其它适合的口服制剂包括提供化合物持续释放的制剂，其可为该化合物的可控释放。该制剂包括水凝胶、微粒和其它本领域公知的剂型和制剂。
水、适合的油、盐水、水性葡萄糖和相关的糖溶液及二醇(如丙二醇或聚乙二醇)可以用作胃肠外给药溶液的载体。该溶液还可以含有活性成分的水溶性盐、适合的稳定剂，且如果必需，还包含缓冲物质。适合的稳定剂包括抗氧化剂，如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸(单独或联合使用)、枸橼酸及其盐和EDTA钠。胃肠外给药溶液还可以包含防腐剂，如苯扎氯胺、尼泊金甲酯或丙酯和氯丁醇。
所述主题化合物可以通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(如植物油或其它类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯类或丙二醇)中配制成注射用制剂；必要时，可连同常规的添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。必要时，使用的增溶剂可包括维生素E TPGS(d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、环糊精等。
此外，所述主题化合物可以通过与多种基质(例如乳化基质或水溶性基质)混合制成栓剂。本发明化合物可以作为栓剂经直肠给药。栓剂可以包含在体温下融化而在室温下固化的载体，例如可可脂、碳蜡和聚乙二醇。
可提供口服或直肠给药的单位剂型，如糖浆剂、酏剂和悬浮剂，其中每一剂量单位(如荼匙、汤匙、片剂或栓剂)中含有预定量的含有一种或多种抑制剂的组合物。类似地，注射或静脉给药的单位剂型可包含在组合物中的抑制剂，该组合物作为无菌水、生理盐水或其它药物可接受的载体的溶液。
本发明化合物可以用作气雾剂来通过吸入法给药。本发明化合物可以配入可加压的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
在一个实施方案中，关注局部给药(如经皮给药)。局部给药制剂可为透皮贴剂、软膏、糊剂、洗剂、乳膏、凝胶剂等的形式。局部给药制剂可包括一种或多种透皮试剂、增稠剂、稀释剂、乳化剂、助分散剂或粘合剂。当化合物被配制为透皮递送时，该化合物可与渗透促进剂一起配制或一起使用。包括化学透皮促进剂和物理透皮促进剂的渗透促进剂促进化合物通过皮肤的递送，而且还可以互换地称作“通透促进剂”。物理渗透促进例如包括电泳技术，如离子透入疗法，以及使用超声(或“超声透入疗法”)等。化学渗透促进剂为在化合物给药前、同时或之后立即施用的试剂，其提高皮肤、特别是角质层的通透性，从而为药物通过皮肤提供增强的渗透性。
用于提高皮肤通透性的化合物包括：亚砜类，二甲基亚砜(DMSO)和癸甲基亚砜(C10MSO)；醚类，如二乙二醇单乙醚、癸氧乙烯-油醚和二乙二醇单甲酯；表面活性剂，如月桂酸钠、月桂硫酸钠、溴化十六烷基三甲铵、苯扎氯胺、泊洛沙姆(231、182、184)、吐温(20、40、60、80)和卵磷脂；1-取代的氮杂环庚烷-2-酮，特别是1-正十二烷基环氮杂环庚烷-2酮；醇类，如乙醇、丙醇、辛醇、苄醇等；石蜡油类，如石油凝胶(石蜡油)、矿油(液体石蜡油)等；脂肪酸类，如C8-C22和其它脂肪酸(如异硬脂酸、辛酸、油酸、月桂酸、戊酸)；C8-C22脂肪醇(如油醇、月桂醇)；C8-C22脂肪酸和其它脂肪酸的低级烷基酯(如油酸乙酯、十四酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸甲酯、十四酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、丙酸甲酯、油酸乙酯)；C8-C22脂肪酸的单酸甘油酯(如甘油单月桂酸酯)；氢糠基醇聚乙二醇醚；2-(2-乙氧乙氧基)乙醇；二乙二醇单甲基醚；聚环氧乙烷的烷芳基醚；聚环氧乙烷单甲基醚；聚环氧乙烷二甲基醚；C6-C8二酸的二低级烷基酯(例如，二异丙基己二酸酯)；乙酸乙酯；乙酰乙酸酯；多元醇及其酯，如丙二醇、乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙二醇和聚乙二醇单月桂酸脂；酰胺和其它含氮化合物，如尿素、二甲乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2-吡咯酮、N-烷基吡咯酮(如1-甲基-2-吡咯酮)；乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；萜类；链烷酮(alkanone)和有机酸，特别是水杨酸和水杨酸盐、柠檬酸和琥珀酸。其它的化学和物理渗透促进剂例如在下列文献中有描述：Transdermal Delivery ofDrugs(药物的透皮给药法)，A.F.Kydonieus(ED)1987CRLPress；Percutaneous Penetration Enhancers(经皮渗透促进剂)，eds.Smith等人(CRC Press，1995)；Lenneruas等人；J Pharm Pharmacol2002；54(4)：499-508；Karande等人，Pharm Res 2002；19(5)：655-60；Vaddi等人，J Pharm Sci 2002July；91(7)：1639-51；Ventura等人，J Drug Target2001；9(5)：379-93；Shokri等人，Int J Pharm 2001；228(1-2)：99-107；Suzuki等人，Biol Pharm Bull 2001；24(6)：698-700；Alberti等人，J ControlRelease 2001；71(3)：319-27；Goldstein等人，Urology 2001；57(2)：301-5；Kiijavainen等人，Eur J Pharm Sci 2000；10(2)：97-102；以及Tenjarla等人，Int J Pharm 1999；192(2)：147-58。
当化合物与化学渗透促进剂一起配制时，选择与化合物相容的渗透促进剂，且该渗透促进剂以足够的量存在以促进化合物通过个体皮肤的递送，例如用于将化合物递送到体循环。在一个实施方案中，化合物与不同于DMSO的渗透皮促进剂一起配制。
在一个实施方案中，化合物提供在递送贴剂(如透粘膜和透皮贴剂)中，且可与渗透促进剂一起配制。该贴剂通常包含对化合物和其它制剂成分不通透的衬里层、与衬里层的一面接触的基质和与基质在衬里层的同一面的粘性层，其中所述基质提供化合物的持续释放，这可为化合物的可控释放。基质可以以适于给药途径来选则，且例如可为聚合的或水凝胶基质。
取决于个体和正在治疗的症状及给药途径，所述主题化合物例如可以每天0.1μg至10mg/kg体重的剂量给药。该范围较宽，因为一般而言对不同哺乳动物治疗作用的效力有很大程度的不同，通常人用剂量(每单位体重)低于大鼠20、30或甚至40倍。同样地，给药模式也可以对剂量有很大影响。
一般的剂型可为适于静脉给药的溶液；每天服用二至六次的片剂，或每天服用一次且含有相应较高含量的活性成分的一长效释放胶囊或片剂等。长效释放效果可以通过在不同pH值下溶解的胶囊材料、通过渗透压缓慢释放的胶囊或其它已知控制释放的方法来实现。
为了在主题方法中使用，所述主题化合物可与其它药物活性试剂一起配制，包括其它CFTR抑制剂或阻断肠内氯通道的试剂。
本发明可用的药物可接受的赋形剂，如介质、佐剂、载体或稀释剂都是公众可容易地获得的。此外，药物可接受的辅助物质，如pH调节或缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等都是公众可容易地获得的。
本领域技术人员容易于理解的是，剂量水平可随特定化合物的功能，症状的严重性和个体对副作用的易感性而不同。给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种方式容易地确定。
本发明提供了一般为口服或可注射用药剂的具有单位剂量主题化合物的药盒。在该药盒中，除了包含单位剂量的容器外，还有提供信息的包装说明书，其描述药物在治疗目标病理状态中的应用和伴随的益处。优选的化合物和单位剂量如上文所述。
可对采用本发明CFTR抑制剂的治疗作出反应的病症
此处所揭示的CFTR抑制剂可用于在治疗CFTR介导的病症，例如因CFTR活性(例如，CFTR在离子转运中的活性)引起的任何病症、紊乱或疾病，或这些病症、紊乱或疾病的症状。这些病症、紊乱、疾病或它们的症状可对抑制CFTR活性(例如，抑制CFTR子转运)的治疗作出反应。
在一个实施方案中，本发明的CFTR抑制剂用于治疗与异常增强的肠分泌相关的病症，特别是急性异常增加的肠分泌。CFTR活性牵涉到响应包括霍乱毒素在内的多种激动剂的肠分泌(例如参见Snyder等人，1982，Bull.World Health Organ.60：605-613；Chao等人，1994，EMBO J.13：1065-1072；Kimberg等人，1971，J.Clin. Invest.50：1218-1230)。因此本发明的CFTR抑制剂可以以有效量给药来抑制CFTR离子转运并因此降低肠液分泌。在这类实施例中，本发明的CFTR抑制剂通常以向胃肠道粘膜表面(例如通过肠内途径，例如，口服、肠内、直肠等等)或者向口腔或鼻腔粘膜表面(例如，鼻内、口腔、舌下等等)给药的方式给药。在某些实施方案中，本发明的对膜相对不通透的(例如，具有降低的膜渗透性特征(例如由于聚乙二醇修饰和如上所描述的那些修饰))CFTR抑制剂特别重要。
因此，CFTR抑制剂可用于肠炎性紊乱和腹泻，特别是分泌性腹泻。分泌性腹泻是发展中国家新生儿死亡的最主要原因，每年死亡约500万(Gabriel等人，1994，Science 266：107-109)。一些研究，包括那些使用CF小鼠的研究表明CFTR是响应多种激动剂而分泌肠氯离子(以及由此液体)的最终的共同途径(Snyder等人，1982，Bull.WorldHealth Organ.60：605-613；Chao等人，1994EMBO.J.13：1065-1072；和Kimberg等人，1971，J.Clin.Invest.50：1218-1230)。
对采用本发明的CFTR抑制剂的治疗作出反应的腹泻可以源自暴露于多种病原菌或药物，包括但不限制于霍乱毒素(Vibrio cholera)、大肠杆菌E.coli(特别是肠毒性的(ETEC))、志贺氏杆菌(Shifella)、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiurra difficile)、寄生虫(例如，贾第鞭毛虫属、痢疾阿米色(Entamoeba histolytica)、隐孢子虫(Cryptosporidiosis)、环孢子虫(Cyclospora))、腹泻病毒(例如轮状病毒)、食物中毒，或接触导致CFTR介导的肠分泌增加的毒素。
其它腹泻包括与AIDS相关联的腹泻(例如AIDS相关性腹泻)、由诸如蛋白酶抑制剂的抗AIDS药物引起的腹泻，以及炎症性胃肠紊乱，例如溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病等等引起的腹泻。已有报道称肠炎调节三种主要的肠盐转运介体的表达，以及通过提高跨上皮的Cl-分泌和抑制上皮的NaCl吸收而在溃疡性结肠炎中促进腹泻(例如参见，Lohi等人，2002，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.283(3)：G567-75)。
本发明的CFTR抑制剂也能用于诸如多囊性肾病的病症治疗，并且通过在睾丸中抑制的CFTR活性而发现了另外的用途，如用作男性不育症药物。
本发明的CFTR抑制剂可在较大的动物模型(例如，在Spira等人，1981，Infect.Immun.32：739-747中描述的兔模型)上进行进一步的筛选。此外，也可以进一步研究利用活的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)进行的粪便排出量分析进一步表征本发明的CFTR抑制剂。
CFTR缺陷的非人动物模型和人组织模型
本发明的CFTR抑制剂也可用于产生非人动物的疾病模型，该疾病与降低的CFTR功能相关(例如，降低的离子转运)。有越来越多的证据表明在CFTR缺陷的个体中，特别是那些患有囊性纤维化(CF)的个体中，呼吸道粘膜下腺的液体和大分子分泌缺陷导致粘液纤毛和细菌清除功能受损；但是，人呼吸道腺体的功能研究局限于在肺移植时获得的严重患病的呼吸道(Jayaraman等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：8119-8123)。急性CFTR抑制使得确定CFTR在粘膜下腺分泌水、盐和大分子中的作用成为可能。高亲和性CFTR抑制剂使得在药理学上建立模拟人CFTR缺陷(例如模拟人CF表型)的非人动物模型成为可能。具体而言，CFTR缺陷(例如CF)的大型动物模型在阐明CF中的呼吸道疾病起始和进展的病理生理学和评价CF治疗的功效中发现有特殊用途，例如，筛选用于治疗CFTR缺陷或其症状的候选药物。
CFTR离子转运的抑制可在呼吸道和胰脏病症以及男性不育中得到证明。例如，对肺和呼吸道中CFTR通道的抑制影响呼吸道表面的液体，导致粘液积累，其进一步阻塞呼吸道和在肺壁上严重堆积，为感染的发生提供了良好的环境，这又进一步引发慢性肺病。同样的现象在胰脏中也可发生，这里积累的粘液中断了胰脏的外分泌功能和阻止必要的食物处理的酶类到达肠部。
这些非人动物模型可通过给予有效量的CFTR抑制剂以降低CFTR在离子转运中的活性来产生。特别重要的是在非人动物上使用本发明的CFTR抑制剂来诱导囊性纤维化(CF)表型。给予有效量的CFTR抑制剂来抑制例如肺中的CFTR，有效地模拟在CF中发现的CFTR缺陷。CFTR抑制剂的递送途径已在上面详细讨论过了。取决于所用的非人动物，受试化合物可以以例如每日一到三次以50-500μg/kg体重的剂量通过腹膜内、皮下或其它途径给药以产生非人动物模型。口服剂量可多至腹膜内或皮下剂量的约10倍。
CFTR相关疾病的非人动物模型可用作任何适合的与CFTR活性降低相关的病症的模型。这些病症包括那些与CFTR突变相关的病症，这些突变导致上皮的离子和水转运异常。这些异常可进一步与呼吸道粘膜纤毛清除以及其它粘膜上皮和导管上皮的紊乱相关。可通过在非人动物上诱导CFTR缺陷表型来建立药理学模型的病症包括，但不限于，囊性纤维化(包括非典型的CF)、原发性慢性胰腺炎(idiopathicchronic pancreatitis)、输精管缺陷(vas deferens defects)、温和性的肺部疾病、哮喘，等等。对于与受损的CFTR功能相关的病症的综述，可见于，例如Noone等人，Respir Res 2328-332(2001)。CFTR抑制剂产生的非人动物模型也可用作在CFTR缺陷的个体上的细菌感染(例如细菌、病毒或真菌感染，特别是呼吸道感染)的模型。在一个特别重要的实施方案中，本发明的CFTR抑制剂用于在药理学上诱导囊性纤维化(CF)表型。
适用于产生本发明的动物模型的动物包括任何动物，特别是哺乳动物，例如非人灵长类(例如猴、猩猩、大猩猩等等)、啮齿类(大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂等等)、兔类动物、猪(swine)(例如猪(pig)、小型猪(miniature pig))、马、犬、猫，等等。大型动物是特别有利的。
CFTR抑制剂也可以与分离的人组织接触而产生疾病的离体模型。这些组织与有效量的CFTR抑制剂接触以降低组织中的CFTR活性，这可能需要少则15分钟，或多则两小时或以上。感兴趣的人组织包括，但不限于，肺(包括气管和呼吸道)、肝脏、胰脏、睾丸等等。可在抑制剂处理的组织上进行生理的、生化的、基因组的或其它的研究，以鉴别在疾病的病理生理学中重要的新治疗靶点分子。例如，从无CF的人体分离的组织可暴露于足以诱导CF表型的抑制剂中，并开展这些研究以鉴别在CF的病理生理学中重要的新治疗靶点分子。
本发明化合物的合成
本发明化合物可以依据本领域技术人员公知的方法、或以类似于下述方法的方法来制备。
应理解，在下面的描述中，所述化学式的取代基和/或变量的组合只有在这种作用产生稳定化合物时才是允许的。
本领域技术人员还将理解，在下述方法中中间体化合物的官能团可能需要用合适的保护基团保护。这些官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。合适的羟基保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。合适的氨基、脒基和胍基保护基团包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等。合适的巯基保护基团包括-C(O)-R(其中R是烷基、芳基或芳烷基)、对-甲氧苄基、三苯甲基等。合适的羧酸保护基团包括烷基、芳基或芳烷基酯。
保护基团可以依据常规技术加上或去除，这为本领域技术人员所熟知周知并且如下文所述。
保护基团的使用在Theodora W.Greene，Peter G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)(1999)，第三版，Wiley-Interscience中有详细地描述。保护基团还可以是聚合树脂，如Wang树脂或2-氯三苯甲基氯化物树脂。
本领域技术人员还可理解，虽然如上文(如概述中和在含酰肼化合物及衍生物中)所述，这种被保护的式(I)化合物的衍生物不具备同样的药理活性，但将它们给予哺乳动物，随后它们在体内代谢形成具药理活性的本发明化合物。这种衍生物因此被称作“前药”。所有式(I)化合物的前药都包含在本发明的范围之内。
下列反应路线图阐述了制备本发明化合物的方法。可以理解本领域普通技术人员可通过类似的方法或通过本领域技术人员公知的方法制备本发明的化合物。一般而言，起始组分可以从诸如Aldrich的来源获得，或者依据本领域普通技术中公知的来源合成(见Smith和March，March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，andStructure(March高等有机化学：反应、机理和结构)，第五版(WileyInterscience，New York))。此外，本发明化合物的多种取代基(如R1、R2、R3和X等)可以依据本领域普通技术人员公知的方法连接到起始组分、中间体组分和/或终产物上。
下列反应路线1针对如上文(例如，在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)所述的本发明化合物-式(I)化合物的制备，其中R1、R2和R3都如上文所述(例如，在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)。
反应路线1
Figure A20058001712100531
一般而言，式(I)化合物的制备首先将各10mmol的含有末端胺(该末端胺含Y基)的R1基团与草酸二乙酯或含X的化合物(如X取代的碘乙酸乙酯，其中X如上文所述)混合。随后，得到的反应混合物在升温条件下搅拌过夜。冷却后，滤出固体材料并在己烷中重结晶获得式(A)化合物。接着，式(A)化合物的乙醇溶液与12mmol水合肼一起回流大约10小时。在真空下蒸出溶剂和过量试剂。然后将产物用乙醇重结晶获得式(B)化合物。然后式(B)化合物在乙醇中与含羰基的R2、R3基团(如酮或醛)混合并回流约3小时获得预期的式(I)产物。
或者，式(I)化合物(其中X是含X1的烷基，其中X1是烷基，如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(式Ia化合物))可以依据以下反应路线2来制备，其中R1、R2和R3如上文(例如，在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)所述。
反应路线2
Figure A20058001712100541
一般而言，式(Ia)化合物的制备首先将各为10mmol的含有末端胺(该末端胺含Y基)的R1基团与含X1基的碘乙酸乙酯(X1如上文所述)在20mmol醋酸钠存在下混合。随后，得到的反应混合物在升温条件下搅拌约3小时。冷却后，滤出固体材料并在己烷中重结晶获得式(C)化合物。式(C)化合物的乙醇溶液然后与12mmol水合肼一起回流大约10小时。在真空下蒸出溶剂和过量试剂。然后将产物用乙醇重结晶获得式(D)化合物。然后，式(D)化合物在乙醇中与含羰基的R2、R3基团(如酮或醛)混合并回流约3小时获得预期的式(Ia)产物。
以下反应路线3针对如上文(例如，在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)所述的本发明化合物-式(Ib)化合物(其中X是CH2)的制备，其中R1、R2和R3如上文(例如，在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)所述。
反应路线3
一般而言，式(Ib)化合物的制备首先将各自10mmol的含有末端胺的R1基团与碘乙酸乙酯在20mmol醋酸钠存在下混合。所得到的反应混合物接着在升温条件下搅拌约3小时。冷却后，滤出固体材料并在己烷中重结晶获得式(E)化合物。式(E)化合物的乙醇溶液与12mmol水合肼一起回流过夜约10小时。在真空下蒸出溶剂和过量试剂。然后将产物用乙醇重结晶获得式(F)化合物。然后，式(F)化合物在乙醇中与含羰基的R2、R3基团(如酮或醛)混合并回流约3小时获得预期的式(Ib)产物。
或者，X是羰基的式(I)化合物(式Ic化合物)可以依据以下反应路线4来制备，其中R1、R2和R3如上文概述中所述。
反应路线4
一般而言，式(Ic)化合物的制备首先将含有末端胺(该末端胺含Y基)的R1基团与草酸二乙酯各10mmol混合于甲苯中。所得到的反应混合物在升温条件下搅拌约3小时。冷却后，滤出固体材料并在己烷中重结晶获得式(G)化合物。式(G)化合物的乙醇溶液与12mmol水合肼一起回流大约10小时的时间。在真空下蒸出溶剂和过量试剂。然后将产物用乙醇重结晶获得式(H)化合物。然后，式(H)化合物在乙醇中与含羰基的R2、R3基团(如酮或醛)混合并回流约3小时获得预期的式(Ic)产物。
或者，X是含Y″的烷基的式(I)化合物(式Ie化合物)可依据下列反应路线5-8来制备，其中R1、R2和R3如上文(例如，在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)所述，以及其中Y″独立地选自取代或未取代的烷基，如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C1至C8)，例如包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；带有诸如羟基、磺基、羧基和取代或未取代的羧酰胺基团的极性基团的烷基(其中示例性的基团包括3-磺丙基、4-磺丁基、羧甲基、2-羧丙基、2-甲氧基-2-氧乙基、3-甲氧基-3-氧丙基)；或链接，例如酰胺键或醚链接以提供与一个或多个较大极性分子的连接，例如取代或未取代苯基、聚氧烷基聚醚(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚羟乙基甘油)、聚乙烯亚胺、二糖、三糖、聚烷基亚胺、小分子氨基葡聚糖等，其中Y″还可以包括这些连接的极性分子。
反应路线5
Figure A20058001712100561
一般而言，在一些实施方案中，式(Ie)化合物的制备首先将各10mmol的含有末端胺(该末端胺含Y基)的R1基团与溴代丙二酸二乙酯混合。所得到的反应混合物在升温条件下搅拌约8小时。冷却后，滤出固体材料并在己烷中重结晶获得式(I)化合物。式(I)化合物的乙醇溶液与12mmol水合肼一起回流大约10小时。在真空下蒸出溶剂和过量试剂。然后将产物用乙醇重结晶获得式(J)化合物。然后，式(J)化合物在乙醇中与含羰基的R2、R3基团混合并回流约3小时获得预期的式(K)产物。然后，将式(K)化合物与如上文中(例如，在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)更加详细描述的取代或未取代苯基混合并回流一段时间。然后将产物在乙醇中重结晶获得式(L)化合物。
反应路线6
Figure A20058001712100571
一般而言，在一些实施方案中，式(Ie)化合物的制备首先将各10mmol的含有末端胺(该末端胺含Y基)的R1基团与溴代丙二酸二乙酯混合。所得到的反应混合物随后在升温条件下搅拌约8小时。冷却后，滤出固体材料并在己烷中重结晶获得式(I)化合物。将式(I)化合物的乙醇溶液与12mmol水合肼一起回流大约10小时。在真空下蒸出溶剂和过量试剂。然后将产物用乙醇重结晶获得式(J)化合物。然后，式(J)化合物在乙醇中与含羰基的R2、R3基团混合并回流约3小时获得预期的式(K)产物。然后将式(K)化合物与如上文中(在概述中和含酰肼化合物及衍生物中)更加详细描述的硫氰酸取代的苯基混合，并回流一段时间。然后将产物在乙醇中重结晶获得式(M)化合物。
反应路线7
Figure A20058001712100581
一般而言，在一些实施方案中，式(Ie)化合物的制备通过首先将含有苯基的硫氰酸与氨基-PEG混合于DMF中，并在升温条件下搅拌约24小时。在真空下蒸去DMF，将残余物溶于最少量的EtOAc中并加入到搅拌的Et2O溶液中。过滤得到的沉淀物并用Et2O洗涤后获得含PEG的化合物。然后将含PEG的化合物与式(K)化合物混合并回流一段时间。接着，将产物在乙醇中重结晶获得式(N)化合物。
反应路线8
一般而言，在一些实施方案中，式(Ie)化合物的制备通过首先将含有苯基的硫氰酸与氨基-PEG混合于DMF中，并在升温条件下搅拌约24小时。在真空下蒸去DMF，将残余物溶于最少量的EtOAc中并加入到搅拌的Et2O溶液中。过滤所得到的沉淀物并用Et2O洗涤获得含PEG的化合物。然后将含PEG的化合物与式(K)化合物混合并回流一段时间。然后将产物在乙醇中重结晶获得式(O)化合物。
反应路线9
Figure A20058001712100591
一般而言，在一些实施方案中，式(Ie)化合物的制备通过首先将各10mmol的含有末端胺(该末端胺含有Y基)的R1基团与二乙基bromobuterolacetone或bromobuterolactone混合。所得到的反应混合物在升温条件下搅拌约8小时。冷却后，滤出固体材料并在己烷中重结晶获得式(P)化合物。将式(P)化合物的乙醇溶液与12mmol水合肼回流大约10小时。在真空下蒸出溶剂和过量试剂。然后将产物用乙醇重结晶获得式(Q)化合物。然后在10mL THF中将式(Q)化合物(10mM)与20mM(BOC)2O混合，并在回流条件下加热约5小时。去除溶剂，将残余物用硅胶柱层析纯化，以二氯甲烷洗脱，得到式(R)化合物。将式(R)化合物(1mmol)分成三部分并相互相隔约30分钟与TsCl(1mmol)在吡啶(5ml)中混合。然后将反应混合物在约-15℃的低温下搅拌约8小时。之后使反应混合物升至室温，用1N HCl稀释，然后用EtOAc萃取三次。用盐水洗涤合并的有机萃取物，以NaSO4干燥并蒸干，得到出式(S)化合物。然后将式(S)化合物与氨基-PEG(如2-氨基乙氧乙醇)在DMF中混合并在升温条件下搅拌约24小时。在真空下蒸去DMF，将残余物溶于最少量的EtOAc中并加入到搅拌的Et2O溶液中。过滤得到的沉淀物并在Et2O中洗涤，得到式(T)化合物。将式(T)化合物溶于最少量的三氟乙酸∶CH2Cl2(1∶1)中，并在室温下搅拌约30分钟。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液稀释，并用CH2Cl2萃取。将合并的有机层依次用水和盐水洗涤，干燥并在真空下浓缩，获得式(U)化合物。然后将式(U)化合物在乙醇中与含羰基的R2、R3基团混合，并回流约3小时获得预期的式(V)产物。
通过1H-NMR和质谱法确定结构。通过薄层色谱和HPLC鉴定纯度＞98％。
实施例
给出下列实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，而不是试图限制发明者视为其发明的范围，也不表示下述试验是完成的全部试验或仅有的试验。已经努力确保所用数字(如数量、温度等)的准确性，但应考虑到有一些实验误差和偏差。除非另外指出，份数是指重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏温度，压力是或接近大气压。
方法与材料
下述材料与方法用于随后的实施例中。
              高通量筛选以鉴定CFTR抑制剂
使用由3米的机械臂、CO2培养箱、洗板器、液体操作工作站、条形码阅读器、开盖台(delidding station)、板密封器和两个荧光板阅读器(Optima，BMG Lab Technologies)组成的集成系统(Beckman)来进行筛选，每个系统装备了两个注射泵和HQ500/20X(500±10nm)激发和HQ535/30M(535±15nm)发射滤光片(Chroma)。
对商业来源(ChemBridge and ChemDiv，均位于San Diego，CA)的10万个小分子(多数为350-550道尔顿)使用设计为最大化化学多样性和药物类特性(drug-like property)的算法进行了筛选。化合物以干燥粉末形式获得，在检测前制成DMSO溶液，以2.5mM储存液形式冻存以备进一步使用。
稳定表达野生型人CFTR和YFP-H148Q的Fisher大鼠甲状腺(FRT)细胞按先前描述(Ma等人，J.Biol.Chem.，277：37235-3724l，2002)培养在96孔黑壁板中。为了筛选，将96孔板中的细胞清洗三次，接着通过与含有l 0μM佛司可林、20μM芹菜素(apigenin)和100μM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)的活化鸡尾酒试剂孵育15分钟以使CFTR卤化物转导得以活化。在测定碘化物内流之前5分钟加入待试化合物(终浓度25μM)，其中细胞暴露于100mM向内的碘化物梯度中。在碘梯度产生之前2秒和之后12秒记录YFP荧光。碘内流的最初速率是从在碘梯度后不断衰减的荧光时程计算出(Yang等人，J.Biol.Chem.，35079-35085，2003)。
                    短路电流的测量
FRT、T84结肠上皮细胞和人的呼吸道上皮细胞培养在lcm2表面积的Snapwell滤膜(Coming-Costar)上，使电阻大于1,000Ω·cm2，如前所述(Ma等人，J.Biol.Chem.，277：37235-3724l，2002)。滤膜置于Easymount Chamber System(Physiologic Instruments，San Diego)中。为了测量FRT细胞上的顶部氯离子电流，基底侧的半腔(basolateralhemichamber)用含有(以mM表示)130NaCl、2.7KCl、1.5KH2PO4、1CaCl2、0.5MgCl2、10Na-HEPES、10葡萄糖(pH 7.3)的缓冲液充满。基底侧膜在就要测量之前用两性霉素B(250μg/ml)进行透化处理。在顶端溶液中，65mM NaCl用葡萄糖酸钠替代，并且CaCl2增加至2mM。为了测量(未透化处理的)T84细胞和人呼吸道细胞中的短路电流，两个半腔均含有Kreb’s溶液(以mM表示)：120NaCl，25NaHCO3，3.3KH2PO4，0.8K2HPO4，1.2MgCl2，1.2CaCl2和10葡萄糖(pH 7.3)。溶液以95％O2和5％CO2起泡和维持在37℃。为了小鼠肠的研究，分离回肠部分，以用冰预冷的Kreb’s缓冲液清洗，通过肠系膜的边界纵向打开，并置于micro-Ussing腔中(0.7cm2孔径面积，World PrecisionInstruments)。半腔以含有l0μM吲哚美辛的Kreb’s溶液充满。顶端Cl-/短路电流用带有Ag/AgCl电极和lM KCl琼脂桥的DVC-1000电压钳(World Precision Instruments)记录。
                        膜片钳测定
在室温下用稳定表达野生型CFTR的FRT细胞进行膜片钳试验。使用了细胞贴附式的和全细胞的配置(Hamill等人，Pflugers Arch.391：85-100，1981)。细胞膜使用EPC-7膜片钳放大器(List Medical)在特定电压下夹住。数据在500Hz过滤和在2000Hz数字化。对于全细胞试验，吸液管溶液含有(以mM表示)：120CsCl，10TEA-Cl，0.5EGTA，1MgCl2，40甘露醇，10Cs-HEPES和3mM MgATP(pH 7.3)。对于细胞贴附试验，EGTA以1mM CaCl2替代。用于全细胞试验的浸泡液(bathsolution)含有(以mM表示)：150NaCl，1CaCl2，1MgCl2，10葡萄糖，10甘露醇，10Na-TES(pH 7.4)。在细胞贴附试验中浸泡液含有(以mM表示)：130KCl，2NaCl，2CaCl2，2MgCl2，10葡萄糖，20甘露醇和10K-Hepes(pH 7.3)。抑制剂通过细胞外灌流来使用。在细胞贴附式膜片中的CFTR通道活性如先前所述进行分析(Taddei等人，FEBS Lett.558：52-56，2004)。
                     小鼠鼻电势差的测定
在腹膜注射氯胺酮(90-120mg/kg)和甲苯噻嗪(5-10mg/kg)进行麻醉后，如前所述用21号的血管导管(angiocatheter)进行经口气管插管(orotracheal intubation)来保护呼吸道。将端部拉成0.3mm直径的PE-10导管插入一个鼻孔至距离前鼻孔5mm，并通过1M KCl琼脂桥连接到Ag/AgCl电极和高阻抗的数字电压表(IsoMillivolt Meter，WorldPrecision Instruments)。使用双微量灌注泵以50μL/min向鼻插管中依次灌注PBS、低氯化物PBS(用葡萄糖酸替代氯化物)、含有佛司可林(10μM)而不含GlyH-101(10μM)的低氯化物PBS，以及含有佛司可林(10μM)和GlyH-101(10μM)的低氯化物PBS，接着是PBS。在一些研究中，GlyH-101(10μM)或4，4’-二异硫氰基芪-2，2′-二磺酸(DIDS)(100μM)存在于所有溶液中。参比电极为充满PBS的21号针，插入腹部的皮下组织中并通过1M KCl琼脂桥连接到第二Ag/AgCl电极。
                     肠液分泌测量
小鼠(CD1株系，25-35g)禁食24小时，用氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉。使用加热板使体温维持在36-38℃。在小剖腹手术后，通过缝合术分离3段临近盲肠的封闭回肠环(长度20-30mm)。肠环中注入100μl PBS或含有霍乱毒素(1μg)的PBS，不含或含有GlyH-101(2.5μg)。剖开的腹部用缝线缝合，让小鼠从麻醉中苏醒。在4小时时，麻醉小鼠，取出肠环和测量环的长度与重量以定量液体分泌的净重。
                        霍乱模型
对于封闭的肠环研究，小鼠(CD1株系，28-34g)禁食24小时，接着腹膜内用氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)进行麻醉。使用加热板使体温维持在36-38℃。在小剖腹手术后，通过缝合术分离3段封闭的中部空肠环(长度15-20mm)。肠环中注入100μl PBS或含有霍乱毒素(1μg)的PBS，不含或含有测试化合物。剖开的腹部用缝线缝合，让小鼠从麻醉中苏醒。在4小时时，麻醉小鼠，取出肠环和测量环的长度与重量以定量液体分泌的净重。小鼠用超剂量的氯胺酮和甲苯噻嗪处死。所有的实验设计均得到动物研究的UCSF委员会的批准。
                      肠吸收的研究
使用如上所述制成的中部空肠环进行吸收研究。肠环中分别注入含有10-20μg测试化合物和5μg FITC-葡聚糖(40kDa)的MalH-1、MalH-2、MalH-3、MalH-(PEG)n和GlyH-(PEG)n。2小时后抽取肠液并测定测试化合物与FITC的光吸收度(OD342/OD494nm)。FITC-葡聚糖设为零吸收，计算肠吸收的百分率。
                      化合物的合成
本发明化合物的合成以下列实施例举例说明，但不限于以下实施例。所有合成的化合物纯度均＞98％(TLC/HPLC)，且经质谱和1H核磁共振谱确认。
N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼(GlyH-101)及相关甘氨酸酰肼类(GlyH-102-109114-127)的合成
将2-萘胺(化合物I，图3B)(1.43g，10mmol)、碘乙酸乙酯(2.14g，10mmol)和醋酸钠(1.64g，20mmol，溶于2ml水)在90℃搅拌3小时。将冷却后所得的固体物质过滤，并在己烷中重结晶获得1.5g N-(2-萘基)甘氨酸乙酯(化合物II，图3B)(产率，65％，熔点83-84℃)(Ramamurthyand Bhatt，J.Med.Chem.32：2421-2426，1989)。将上述产物(2.29g，10mmol)在乙醇(10ml)中的溶液与水合肼(0.6g，12mmol)一起回流10小时。真空下蒸去溶剂和过量的试剂。将产物用乙醇重结晶获得1.8gN-(2-萘基)甘氨酸酰肼(化合物III，图3B)(产率82％熔点147-148℃)。将化合物III(2.15g，10mmol)和3，5-二溴-2，4-二羟基苯甲醛(3g，10mmol)在乙醇(5ml)中的混合物回流3小时。将冷却后结晶的腙过滤，用乙醇冲洗，且用乙醇重结晶获得3.8g(78％)GlyH-101。熔点(mp)＞300℃，ms(ES-)：M/Z 492(M-)；1H nmr(DMSO-d6)：δ4.1(s，2H，CH2)，6.5-7.5(m，9H，芳香性，NH)，8.5(s，1H，CH＝N)，10.4(s，1H，NH-CO)，11.9(s，1H，OH)，12.7(s，1H，OH)。化合物GlyH-102-109、GlyH-114-127和AceH401-404是类似地通过合适的肼类与取代的苯甲醛缩合来合成。
N-(6-喹啉基)-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼(GlyH-126)及相关喹啉基-甘氨酸肼类的合成
向搅拌的6-氨基喹啉(化合物IV，图3B)(0.72g，5mmol)在乙腈(20ml)的溶液中加入33％乙醛酸(1.85g，20mmol)水溶液。然后在3℃时在20分钟内加入NaBH3CN(0.64g，10.2mmol)的乙腈(20ml)溶液，并将反应混合物加热至室温，搅拌48小时。真空下蒸去乙腈，向残余物中加水(20ml)，将该溶液碱化至pH 9.5，用醚萃去未反应的胺。向水溶液中加入浓HCl(25ml)，将该混合物在25℃搅拌1小时。真空下蒸去溶剂。得到的N-(6-喹啉基)甘氨酸的残余物溶于用无水HCl饱和的无水乙醇(50ml)中，搅拌过夜然后回流3小时。蒸去乙醇，盐酸酯在无水醚中悬浮，以氨气起泡。将氯化铵过滤，通过蒸发除去醚，获得N-(6-喹啉基)甘氨酸乙酯(0.5g，87％，mp 122-123℃)。N-(6-喹啉基)甘氨酸酰肼(化合物VI，图3B)通过对上述酯的肼解作用来合成，再与3，5-二溴-2，4-二羟基苯甲醛反应获得GlyH-126。类似的方法用于GlyH-127的合成。
草氨酸酰肼(OxaH-110-113)的合成
草氨酸酰肼是通过加热2-萘胺与草酸二乙酯在甲苯中的混合物来合成。所得的N-取代的草酸乙酯用水合肼处理，随后与取代的苯甲醛缩合可获得OxaH-110-113。
3，5-二溴-4-羟基-[2-(2-萘胺)丙酮]苯甲酸酰肼(GlyH-202)和相关的GlyH-201和Oxa-203-204的合成
使N-(2-萘基)甘氨酸酰肼(化合物III，图3B)(2.15g，10mmole)与3，5-二溴-4-羟基苯甲酰氯(3.14g，10mmole)在吡啶(10ml)中反应(Gilbert等人，Eur.J.Med.Chem.，17：581-588，1982)5小时。除去吡啶并将残余物用水稀释。该产物用乙醇重结晶可获得灰色粉末3.8g(77％)，熔点＞300℃。化合物GlyH-201和Oxa-203-204用类似方法制备。
N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)甲基]甘氨酸酰肼(GlyH-301)及相关甘氨酸肼类(GlyH-302，OxaH-303-304)的制备
将GlyH-101(1.5g，3mmole)、水合肼(0.15ml，3mmol)和Pd/C催化剂(0.1g，10％Pd)在5ml二甲基酰胺中的混合物回流6-8小时(Verma等人，Arch.Pharm.317：890-894，1984)。将该反应混合物过滤，用冷水稀释，以乙醚萃取。GlyH-301用乙醚重结晶获得0.9g(60％)，熔点258-260℃。化合物GlyH-302和OxaH-303-304类似地进行制备。
                      类似物的合成
本发明化合物类似物的合成以下列实施例举例说明，但不限于以下实施例。所有合成的化合物纯度均＞98％(TLC/HPLC)，且经质谱和1H核磁共振谱确认。1H NMR谱在CDCl3或DMSO-d6中获得，使用400MHz Varian光谱仪，以CDCl3或DMSO-d6为参照。质谱使用WatersLCMS系统(Alliance HT 2790+ZQ，HPLC：Waters2960型，Milford，MA)完成。快速层析法使用EM硅胶(230-400目)，薄层色谱在Merk硅胶60F254板上完成。
(2-萘氨基)-丙二酸二乙酯(化合物2，图9)的合成
将2-萘胺(化合物1，图9)(10mmol)、溴代丙二酸二乙酯(10mmol)和醋酸钠(1.64g，20mmol，溶于4ml水)的混合物在90℃下搅拌8小时。过滤冷却后获得的黑色固体物质，并用己烷重结晶获得2.5g的2(产率84％)；熔点189-190℃；ms(ES+)：M/Z 302(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ1.17(t，6H，7.33Hz)，4.17(q，4H，7.33)，5.10(d，1H，8.79Hz)，6.54(d，1H，8.79Hz)，6.75(d，1H，2.20Hz)，7.13(t，1H，7.32Hz)，7.19(dd，1H，2.19，8.79Hz)，7.28(t，1H，8.06Hz)，7.51(d，1H，8.42Hz)，7.61(t，2H，8.79Hz)。
(2-萘氨基)-丙二酸二酰肼(化合物3，图9)的合成
使化合物2(图9)(10mmol)的乙醇(10ml)溶液与水合肼(12mmol)一起回流10小时。真空下蒸去溶剂和过量的试剂。产物用乙醇重结晶获得2.5g化合物3(92％)；熔点268-270℃；ms(ES+)：M/Z 274(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ4.29(d，4H，4.03)，4.56(d，1H，8.79Hz)，6.03(d，1H，8.79Hz)，6.62(d，1H，1.46Hz)，7.09(m，2H)，7.28(t，1H，8.05Hz)，7.50(d，1H，8.06Hz)，7.61(m，2H)，9.22(s，2H)。
2-萘氨基-双[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]丙二酸二酰肼(MalH-1)的合成
使化合物3(图9)(10mmol)和3，5-二溴-2，4-二羟基苯甲醛(20mmol)在乙醇(5ml)中的混合物回流3小时。将冷却后结晶出的腙滤出，用乙醇冲洗，然后通过柱层析纯化(硅胶EtOAc∶己烷2∶3)获得3.2g化合物4(58％)，为米黄色固体；熔点249-248℃；ms(ES+)：M/Z 830(M+1)+；1Hnmr(DMSO-d6)：δ4.91，5.48(d，1H，7.69，9.15Hz)，6.62(d，1H，7.32Hz，)，6.73，6.84(s，1H)，7.13-7.32(m，3H)，7.57(d，1H，8.06Hz)，7.61-7.70(m，3H)，7.80，7.90(s，1H)，8.15，8.37(s，2H)，10.10-10.40(宽s，2H)，11.72，11.90(s，2H)，12.22，12.53(s，2H)。
2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][(2，4-二磺基苯基二钠)亚甲基]丙二酸二酰肼(MalH-2)的合成
使二酰肼4(图9)(5mmol)与2，4-二磺基苯甲醛二钠(5mmol)在DMF(5ml)中的混合物回流4小时。冷却后的反应混合物逐滴加入搅拌的EtOAc∶EtOH(1∶1)溶液中，过滤，用乙醇洗涤，进一步通过柱层析(硅胶EtOAc∶己烷2∶3)纯化获得2.3g化合物MalH-2(58％)，为米黄色固体；mp＞300℃；ms(ES+)：M/Z 800(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ4.95，5.44(d，1H，7.63，9.16Hz)，6.64(d，1H，7.31Hz)，6.70，6.81(s，1H)，7.12-7.44(m，4H)，7.59(d，1H，8.00Hz)，7.64-7.76(m，4H)，7.80，7.90(s，1H)，8.25，8.37(s，2H)，10.36(宽s，1H)，11.62，11.82(s，1H)，12.11，12.43(s，2H)。
除了分别使用4-钠-磺基苯基异硫氰酸酯和化合物6(图10)代替2，4-二磺基苯甲醛二钠之外，2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-(4-钠-磺基苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼(MalH-3)和2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-[4-(3-(PEG)n-硫脲基)苯基]硫脲基]丙二酸二酰肼(MalH-(PEG)n)依据类似于MalH-2所用的反应条件来合成。
MalH-3：mp＞300℃；ms(ES-)：M/Z 765(M-1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ4.90，5.31(d，1H，7.61，9.12Hz)，6.54(d，1H，7.31Hz)，6.70，6.81(s，1H)，7.12-7.44(m，4H)，7.59(d，1H，8.00Hz)，7.64-7.76(m，4H)，7.90(d，2H)，8.25，8.37(s，1H)，9.88(s，1H)10.05(s，1H，CSNH)，10.36(s，1H，OH)，11.11，11.43(s，2H，CONH)，11.62，11.82(s，1H，OH)。
MalH-(PEG)1：mp＞300℃；ms(ES+)：M/Z 849(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ3.70-4.37(m，8H)，4.81，5.01(d，1H，7.51，9.13Hz)，5.27(s，1H)，6.60(d，1H，7.31Hz)，6.75(s，1H)，7.19-7.38(m，4H)，7.59(d，2H，8.00Hz)，7.64-7.76(m，3H)，7.90(d，2H，8.00Hz)，8.21，8.30(s，1H)，9.76(s，2H)9.83(s，1H)，10.01(s，1H)，10.36(s，1H)，11.20，11.51(s，2H)，11.54，11.62(s，1H)。
2-[3-(4-异硫氰酸基苯基)-硫脲基]乙基-(PEG)1(化合物6a，图10)的合成
在30分钟内向1，4-亚苯基二异硫氰酸酯溶液(1mmol，2ml DMF)中加入2-氨基乙氧基乙醇(0.3mmol，2mL DMF)。再搅拌30分钟，将DMF蒸去，产物用硅胶柱层析纯化，用溶剂正己烷∶AcOEt(1∶1)洗脱。蒸发馏分后获得58mg化合物2(65％)；ms(ES+)：M/Z 298(M+1)+；1Hnmr(DMSO-d6)：δ2.84(t，2H，6.46Hz)，2.95(t，2H，6.31Hz)，3.12(t，2H，6.38Hz)，3.58(q，2H，5.98Hz)，5.63(s，1H)，7.15(d，2H，8.62Hz)，7.44(d，2H，8.62Hz)，7.97(s，2H，NH)。类似地，化合物6b使用合适的氨基-PEG来合成；产率，58％；ms(ES+)：M/Z 736(+/-44，88，132，176)(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ3.24(s，3H)，3.31-3.82(m)，7.21(d，2H，8.60Hz)，7.47(d，2H，8.60Hz)，7.92(s，2H)。
2-(2-萘氨基)-4-羟基丁酸酰肼(化合物7，图11)的合成
该化合物依据类似于化合物2和3合成所使用的反应条件来合成。89％；mp 258-260℃；ms(ES+)：M/Z 260(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ1.79(m，2H)3.46(q，2H)3.98(s，1H)，4.17(d，2H)4.52(t，1H)，5.94-5.96(s，1H)，6.68(s，1H)，6.98(dd，1H)，7.05(t，1H)，7.24(t，1H)，7.46(d，1H)，7.52-7.60(m，2H)9.17(s，1H)。
[2-(2-萘氨基)-4-羟基]丁酸-2-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]酰肼(化合物8，图11)的合成
向酰肼7(10mM)的THF(10ml)溶液中加入(BOC)2O(20mM)，并加热回流5小时。将溶剂除去，残余物通过硅胶柱层析纯化。用二氯甲烷洗脱获得到3.1g化合物8(86％)，为白色固体；mp 235-237℃；ms(ES+)：M/Z 360(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ1.33(s，9H)，1.92(m，2H)，3.52(q，2H)，4.01(q，1H)，4.52(t，1H)，6.00(d，1H)，6.70(s，1H)，6.97(dd，1H)，7.06(t，1H)，7.25(t，1H)，7.45(d，1H)，7.52-7.59(m，2H)，8.73(s，1H)，9.77(s，1H)。
[2-(2-萘氨基)-4-(对甲苯磺酰基)]丁酸-2-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]酰肼(化合物9，图11)的合成
分三部分每隔30分钟向酰肼7(1mmol)的吡啶(5ml)溶液中加入p-TsCl(1mmol)(-15℃)。反应混合物在-15℃下搅拌8小时，使其升至室温，用1N HCL稀释，用EtOAc萃取三次。合并的有机萃取物用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并蒸至干燥，获得374mg化合物9(73％)，为浅黄色油，下一步使用时没有经过进一步的纯化；ms(ES+)：M/Z 514(M+1)+。
[2-(2-萘氨基)-4-(PEG-氨基)]丁酸-2-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]酰肼(化合物10，图11)的合成
将2-氨基乙氧基乙醇(1mM)和化合物9(1mM)的DMF(2ml)溶液在80℃搅拌24小时。在真空下蒸去DMF，将残余物溶于最少量的EtOAc并加至搅拌的Et2O溶液中。将白色粉状沉淀物过滤，并用Et2O洗涤，获得170mg化合物9(38％)，为黄色粘块；ms(ES+)：M/Z 447(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：δ1.35(s，9H)，1.71(m，2H)3.40-3.51(m，4H)，3.57(t，2H)，3.68-3.79(m，5H，CH2)，3.93(s，1H)，4.52(t，1H)，6.04，6.16(s，1H)，6.67(s，1H)，6.93(dd，1H)，7.03(t，1H)，7.32(t，1H)，7.45(d，1H)，7.50-7.62(m，2H)，9.27(s，1H)，9.89(s，1H)。
[2-(2-萘氨基)-4-(PEG-氨基)]丁酸酰肼(化合物11，图11)的合成
将酰肼10(1mM)溶于最少量的三氟乙酸∶CH2Cl2(1∶1)中，并在室温搅拌30分钟。反应混合物用饱和NaHCO3水溶液稀释并用CH2Cl2萃取。合并的有机层依次用水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，真空下浓缩获得253mg化合物11(73％)，为黄色半固体；ms(ES+)：M/Z 347(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：1H nmr(DMSO-d6)：1H nmr(DMSO-d6)：δ1.71(m，2H)3.40-3.51(m，4H)，3.57(t，2H)，3.68-3.79(m，5H，CH2)，3.93(s，1H)，4.26(d，2H)4.52(t，1H)，6.02，6.21(s，1H)，6.71(s，1H)，6.85(dd，1H)，7.10(t，1H)，7.34(t，1H)，7.51(d，1H)，7.53-7.76(m，2H)，9.27(s，1H)。
[2-(2-萘氨基)-4-(PEG-氨基)]丁酸-2-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]酰肼(化合物12，图11)的合成
使化合物11(1mmol)和3，5-二溴-2，4-二羟基苯甲醛(1mmol)在乙醇(2ml)中的混合物回流3小时。将反应混合物浓缩并加至搅拌的Et2O溶液中，将沉淀的腙过滤，用Et2O洗涤后获得362mg化合物12(58％)；ms(ES+)：M/Z 625(M+1)+；1H nmr(DMSO-d6)：1H nmr(DMSO-d6)：δ1.75(m，2H)3.43-3.48(m，4H)，3.59(t，2H)，3.72-3.81(m，5H，CH2)，3.97(s，1H)，4.59(t，1H)，6.12，6.26(s，1H)，6.75(s，1H)，6.85-6.96(m，2H)，7.15-7.51(t，3H)，7.53-7.76(m，2H)，8.87(s，1H)，9.27(s，1H)，10.68(s，1H)，11.92(s，1H)。
                        实施例1
                  新型CFTR抑制剂的发现
对100,000种类似药物的小分子化合物的集合进行筛选以鉴定新的CFTR抑制剂。如图1A所示，在用含有佛司可林、IBMX和芹菜素的激动剂混合物活化CFTR后，化合物在25mM以基于细胞的碘内流测定进行筛选。碘内流的最初速率从氯被碘置换后荧光减弱的动力学计算。鉴定了四种降低碘内流超过50％的化合物(图1B)，其与已知的CFTR活化剂或抑制剂结构上无相关性。12种化合物降低碘内流25-50％，其大多数与图1B中的化合物或噻唑烷二酮类结构上相关。
为了选择抑制剂进行进一步评价，对图1B中的化合物进行了量效关系的测定，并且通过短路电流分析从电生理上确证了CFTR的抑制作用。对于化合物a-d，Ki分别为约7、5、5和5μM。对于化合物d，图1C显示了代表性的荧光和图1D显示了的短路电流数据的代表图。筛选了每类化合物的100-250种商业上可购得的类似物以确定是否存在有活性的结构类似物，这是通过定向合成类似物来接着进行化合物优化的重要前提。然而几乎没有或完全没有发现化合物a、b和c的活性类似物，化合物d(取代的甘氨酸酰肼，GlyH)的285种类似物的初期筛选显示34种类似物在25μM抑制CFTR介导的碘内流超过25％。
确定了合成的GlyH类似物的构效分析和抑制机制特征，以及作用的时程和作用的可逆性。此外，也分析了类似物对于不同的CFTR活化机制的效力。图2A显示了在GlyH-101加入后荧光和短路电流测定中碘离子内流的快速抑制。有趣的是，在加入/混合约1秒钟之内发生了约50％的抑制，超过约1分钟有更多的抑制。图2B说明GlyH-101清洗后完全的抑制逆转，5分钟有超过75％的逆转。图2C说明在不同类型的激动剂活化后GlyH-101有效的CFTR抑制，这些激动剂包括不升高细胞质内cAMP或抑制磷脂酶活性的直接有效的CFTR活化剂(CFTR-act-01，08和10；Ma等人，J.Clin.Invest.110：1651-1658，2002)。
                        实施例2
             甘氨酸酰肼的化学和结构-活性关系
通过对GlyH-101的结构经过系统地修饰来确定构效关系，并鉴别具有改进的CFTR抑制活性的类似物。图3A表示合成的和用于检测CFTR抑制作用的多种类型的结构类似物。结构修饰在甘氨酸酰肼骨架的两端进行(图3A，左侧，上和中)。用羰基替换甘氨酸亚甲基和用氧替换氮分别产生草氨酸酰肼(OxaH，右侧，上)和醋酸酰肼(AceH，右侧，中)。腙基修饰产生两类重要系列的化合物(中部，下和右侧，下)。还显示在腙键上含有额外甲基(上部，中)和含有替代萘基的6-喹啉基(左侧，下)的化合物。
图3B显示了开发的合成不同类型甘氨酸酰肼类似物的反应路线。GlyH-101的合成涉及2-萘胺与碘乙酸乙酯反应及随后与水合肼和2，4-二羟基-3，5-二溴苯甲醛的反应。多数剩下的甘氨酸酰肼衍生物(在表1中列出)都采用了类似的方法合成。含有6-喹啉鎓基的杂芳香族类似物需要不同的合成路径，其中6-氨基喹啉与乙醛酸缩合，然后用氰基硼氢化钠还原(获得N-6-喹啉甘氨酸，Ramamurthy等人，1989)，然后进一步酯化且与水合肼和苯甲醛反应。草氨酸酰肼的合成是由芳香胺和草酸二乙酯开始。
结构修饰最初是在N-芳基(R1)和苯甲醛(R2)位置(见表1-4中R-和X-基团的定义和CFTR抑制作用)。当R2含有3，5-二溴且至少在4位有一个羟基取代基(GlyH-102、105、114)时发现具有好的CFTR抑制作用；第二个羟基的添加提高了抑制作用(GlyH-101、104、115-116)。当R2含有4-溴苯基或4-羧基苯基取代基时(GlyH-120-121)抑制作用减弱。此外，在GlyH-101中的4-羟基对抑制作用很重要，因为它的4-甲氧基类似物GlyH-103几乎没有活性。类似的构效结果在GlyH-115和GlyH-122中也被发现。
在保持R2为2，4-二羟基-3，5-二溴苯基和3，5-二溴-4-羟基苯基的情况下完成R1基团的修饰。R1为2-萘基的类似物是比R1为4-氯苯基或4-甲苯基的类似物更好的抑制剂。用1-萘基(GlyH-104)替换GlyH-101的2-萘基，降低了10倍的抑制活性，证明了需要2-萘基取代基。含有2-蒽基的GlyH-124-125活性更低。用极性更强的杂芳环如6-喹啉基替换GlyH-101和GlyH-102中的2-萘基得到具有很弱活性的化合物(Gly-126-127)，2-萘氧基类似物AceH-401和AceH-402也是如此。
接下来保持2-萘基为R1和二溴二羟基苯基为R2，修饰X(替换亚甲基)。在GlyIH-101和GlyH-102的X处引入羰基，获得OxaH-110和OxaH-111，得到了2-3倍增强的抑制效果。图3C显示活性最强的类似物OxaH-110对CFTR抑制作用的短路电流分析，其表观Ki约为2μM。用CHCH3替换CH2(GlyH-106-107)也可以提高CFTR抑制作用。在另一结构改变中，在GlyH-102中的R3上增加甲基，获得GlyH-109，得到了提高的CFTR抑制作用。GlyH-101和GlyH-102中的N＝C基团修饰为GlyH-301和GlyH-302中的NH-CH2，或修饰为GlyH-201和GlyH-202中的NH-CO，降低了CFTR抑制效果。
          表1：第1组含酰肼化合物的构效关系
Figure A20058001712100731
OxaH-112OxaH-113GlyH-114GlyH-115GlyH-116GlyH-117GlyH-118GlyH-119GlyH-120GlyH-121GlyH-122GlyH-123GlyH-124GlyH-125GlyH-126GlyH-127 2-萘基2-萘基4-Cl-Ph4-Cl-Ph4-Me-Ph2-Me-Ph1-萘基2-萘基2-萘基2-萘基4-Cl-Ph4-Cl-Ph2-蒽基2-蒽基6-喹啉基6-喹啉基 COCOCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2   H-Ph3，5-di-Br-2，4-di-OH-Ph3，5-di-Br-4-OH-Ph3，5-di-Br-4-OH-Ph3，5-di-Br-2，4-di-OH Ph3，5-di-Br-2，4-di-OH-Ph3，5-di-Br-2，4-di-OH-Ph3-Br-4-OH-Ph2，4-di-OH-Ph4-Br-Ph4-羧基-Ph3，5-di-Br-2-OH-4-OMe-Ph2，4-di-OH-Ph3，5-di-Br-2，4-di-OH-Ph3，5-di-Br-4-OH-Ph3，5-di-Br-2，4-di-OH-Ph3，5-di-Br-4-OH-Ph CH3CH3HHHHHHHHHHHHHH 33551O 9590959179
           表2：第2组含酰肼化合物的构效关系
Figure A20058001712100751
           表3：第3组含酰肼化合物的构效关系
             表4：第4组含酰肼化合物的构效关系
(表1-4：Ki是指在表达CFTR的FRT细胞上进行的短路电流分析中得到CFTR Cl-转导50％抑制时的浓度)
                         实施例3
                CFTR抑制机制的膜片钳分析
使用膜片钳技术的全细胞配置研究GlyH-101阻断CFTR的机制。用5μM佛司可林对稳定转染的FRT细胞进行CFTR最大活化之后，在GlyH-101浓度从0到50μM测定电流-电压关系。代表性的原始电流记录显示于图4A。在没有抑制剂时(左图)，膜电流随电压线性地增加和不显示松弛现象(relaxation phenomena)，正如所期望的纯CFTR氯离子电流。用10μM GlyH-101胞外灌流立即产生了显著依赖于膜电势的电流减小(图4A，右图)。在较高的正膜电势下，向外的正电流(Cl-离子向细胞内移动)与向内的电流相比减小了。图4B显示GlyH-101浓度为0(对照)、10和30μM和清洗30μM GlyH-101后(复原)时的电流-电压关系。作为比较，显示了噻唑烷二酮3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷二酮(本文称为CFTRinh-172)(5μM)的数据。在没有抑制剂时、GlyH-101清洗后和CFTRinh-172抑制后电流-电压关系为线性，然而GlyH-101在低于最大浓度时产生内向整流性(inward rectification)。图4C概述了在不同膜电压下作为GlyH-101浓度函数的CFTR电流阻断百分数。GlyH-101的抑制能力在较高的负电压下降低，其表观Ki在电压为+60，+20，-20和-60mV下分别为1.4，3.8，5.0和5.6μM(Hill系数，nH＝0.5，0.7，1.3，1.8)。
进行细胞贴附式膜片钳试验来研究GlyH-101在单通道水平阻断CFTRCl-电流的机制。图4D显示了CFTR通道活性GlyH-101浓度依赖性的降低，而单通道转导无改变。平均通道开放时间显著减少，在开放脉冲之间出现短暂的关闭，该开放脉冲的频率随GlyH-101浓度而增加。在无抑制剂时，平均通道开放时间为264±11ms(SE，n＝10)。在+60mV时，GlyH-101浓度为0.4，1和5μM时，平均通道开放时间分别为181±29，38±5和13±2ms(n＝5；对于所有浓度，与对照相比p＜0.01)。
动力学和电生理学数据说明含有酰肼的化合物通过在或接近外侧膜表面处阻塞CFTR阴离子孔来阻断CFTR Cl-转导。与所有其它包括噻唑烷二酮CFTRinh-172在内的CFTR抑制剂不同，由含有酰肼的GlyH-101造成的CFTR阻断产生了向内调整的CFTR Cl-电流。与CFTRinh-172相比，GlyH-101水溶性强约50倍和当加入胞外溶液或从胞外溶液中去除时其作用或逆转更迅速，这与其在CFTR的外表面起作用相符。对一系列的含有酰肼的目标类似物的构效关系分析确定了抑制CFTR的结构决定簇和提供了具有更强的CFTR抑制潜力的类似物，最佳的是OxaH-110，其Ki约2μM。尽管最有效力的噻唑烷二酮CFTRinh-172在经透化处理的细胞制剂中的Ki为0.2-0.3μM，但其在多数的完整上皮细胞中Ki为2-5μM，因为内部的负膜电势降低了其在细胞质中的浓度。因此，含有酰肼的化合物效力相当于或超过了噻唑烷二酮类，与噻唑烷二酮类相似，它们在体内鼻部和肠上皮中阻断CFTR。
膜片钳研究说明GlyH-101对CFTR的抑制对膜电势敏感。在低于GlyH-101最大浓度下，CFTR电流-电压关系中有显著的内向整流性，说明从膜的细胞外侧到细胞内侧的Cl-流动比反方向受到更强的阻塞。当提供的电势从+60到-60mV变化时，表观Ki增加了约4倍。由于GlyH-101在pH 6-8时带负电荷，这些数据的最简单的解释就是GlyH-101的抑制涉及直接作用于膜的细胞外侧的通道孔。相应的，负膜电势通过静电排斥降低带负电荷的GlyH-101的抑制效能，其中静电排斥驱动化合物排出孔外。相反的，被认为从CFTR孔的细胞内侧起作用的开放通道阻断剂格列本脲(Sheppard&Robinson，1997 J.Physiol，503：333-346)产生了CFTR电流-电压关系的外向整流性(Zhou等人，2002，J.Gen.Physiol，120：647-662)。
对GlyH-101量效关系数据的分析还揭示了在较强的负膜电势下表观Hill系数的增加，证明在孔内抑制剂结合位点超过一个和/或抑制剂分子间协同相互作用的可能性，正如以前所报道的其它离子通道一样(Pottosin等人，1999，Biophys.J.，77：1973-1979；Brock等人，2001，J.Gen.Physiol.118：113-134)。在GlyH-101是开放通道阻断剂的假说的证据中，细胞贴附式膜片钳实验揭示了在通道开放脉冲之中的快速关闭。快速关闭的频率随GlyH-101浓度增加，造成如格列本脲一样的平均通道开放时间的减少(Sheppard&Robinson，1997 J.Physiol，503：333-346)。在毫秒级时间尺度上的关闭事件的出现将GlyH-101归为“中间”型的通道阻断剂，与格列本脲相似；相反的，“快速”的阻滞剂降低表观单通道转导，而“慢速”的阻滞剂造成数秒的持续关闭。在全细胞膜片钳和短路电流试验中，CFTR Cl-转导被高浓度(≥30μM)的GlyH-101完全抑制。这些结果共同证明GlyH-101抑制机制涉及位于或接近面向细胞外的孔表面处直接的CFTR孔阻塞。
                        实施例4
                 甘氨酸酰肼的物理性质
对电压依从性抑制机理的解释需要了解与CFTR相互作用的GlyH-101离子种类。短路研究显示GlyH-101抑制CFTR Cl-电流的Ki在pH6-8范围内不依赖于pH(未示出)，此时化合物水溶性很强(水中0.8-1.3mM，22℃)。GlyH-101上在pH3-10范围内的可能的可滴定基团包括二级甘氨酸胺和间苯二酚羟基。GlyH-101的分光光度滴定指示在pH4和9之间至少有两次质子化/去质子化(图5A，上图)。为确定pKa值，合成了缺少1个或多个可滴定基团的GlyH-101类似物。二级胺的去除(AceH-403)对滴定几乎没有影响，曲线的上升部分只有较小的左移，显示第一个酚羟基滴定的pKa为～5.5。一个邻位羟基的去除(GlyH-102)消除了曲线的下降部分，确定第一个对羟基的pKa为～5.5且第二个邻位羟基的pKa为～8.5。含有间苯酚羟基芳香环的去除(N-(2-萘基)甘氨酸乙酯，图5A，下图)显示剩余二级胺的pKa为～4.7。通过这些数据推断的GlyH-101离子形式间的平衡如图5B所示。在pH6和8之间GlyH-101主要以单电荷阴离子形式存在。
                         实施例5
                  在小鼠体内的CFTR抑制
通过小鼠鼻电势差(PD)的测定证明了对体内CFTR依赖的呼吸道上皮Cl-流的抑制。连续测定了鼻的PD对一系列溶液替换的反应，其中有加入阿米洛利(以阻断ENaC Na+通道)，随后Cl-由葡萄糖酸置换(以诱导Cl-依赖的超极化)，加入佛司可林(以活化CFTR)和加入GlyH-101(以抑制CFTR)。在图6A中记录的代表性的PD(左图)显示了在低Cl-和佛司可林溶液后的超极化(更大的负电势差)，分别代表CFTR不依赖和依赖的Cl-流。在灌流液中局部应用GlyH-101迅速逆转了佛司可林诱导的超极化。在图6A(右图)中总结了来自一系列测量的平均结果。PD变化(ΔPD，图6B)的配对分析表明在佛司可林后的约-4mV的超极化与GlyH-101后的相似强度的去极化；为了比较，显示了来自以前研究的CFTRinh-172的数据。在独立的一系列试验中，除了所有溶液中均含有DIDS或GlyH-101之外，如A中一样测定了鼻的PD。图6C显示了由低Cl-产生的(CFTR依赖的)超极化被DIDS部分抑制(左图)，以及由佛司可林诱导的超极化被GlyH-101显著抑制(右图)。综合这些结果说明局部GlyH-101对上呼吸道CFTR Cl-转导的快速抑制作用。
还评价了GlyH-101在抑制cAMP/霍乱毒素诱导的肠液分泌中的效能。在不同的细胞类型中和在非透化状态的完整小鼠回肠中以及缺少Cl-梯度下进行了短路电流试验。在每种状态下用阿米洛利抑制ENaC后通过CPT-cAMP活化CFTR。图7A显示，在T84细胞中(上图)、人的初级支气管细胞培养物中(中图)以及完整的小鼠回肠中(下图)，由GlyH-101产生的对cAMP刺激的短路电流的抑制具有相似的Ki约5μM。在较高的GlyH-101浓度下抑制达到约100％。在封闭肠环的体内模型中测定了霍乱毒素诱导的肠液分泌，在此模型中对每只小鼠的肠环注射生理盐水(对照)、霍乱毒素(1μg)或霍乱毒素+GlyH-101(0.25μg)。基于早期的显示弱的肠吸收和全身性给予的化合物基本无效的研究，将GlyH-101加入至内腔(而不是全身性)。与生理盐水对照相比，根据肠环重量-长度比率定量，霍乱毒素诱导的4小时肠液分泌增加被GlyH-101降低了80％。
                         实施例6
             高水溶性的CFTR孔阻断化合物的合成
设计具有最小肠吸收的高水溶性CFTR抑制剂化合物的策略是通过添加极性大基团来修饰GlyH-101的结构，如图8所示。通过分析甘氨酸酰肼化合物的构效关系，发现在甘氨酸甲基位置的较小改变不影响CFTR抑制活性。高水溶性CFTR抑制剂的有效合成通过利用溴代丙二酸二乙酯中间体(图9-11)来设计。使2-萘胺与溴代丙二酸二乙酯反应，随后与肼反应产生通用的丙二酸二酰肼中间体(图9)。这种二酰肼与3，5-二溴-2，4-二羟基苯甲醛缩合产生关键中间体化合物4，其与相同的醛进一步缩合产生化合物MalH-1。类似地，2，4-二钠-二磺基苯甲醛与4-钠-磺苯基异硫氰酸酯与化合物4缩合分别产生化合物MalH-2和MalH-3。
MalH-1在结构上类似于GlyH-101，除了有一个额外的苯甲醛部分，使得其带双倍电荷、更庞大且更加亲水。MalH-1水溶性＞5mM。MalH-2有两个二磺酸基，MalH-3含有一个带有亲水硫脲链接的磺酸部分。两个化合物都易溶于水或盐水(＞50％重量/体积，20℃)。
中间体化合物4还通过与多种带有PEG的苯基异硫氰酸酯6a和6b(图10)缩合而用于产生MalH-(PEG)n和MalH-(PEG)n B。中间体化合物6a和6b通过1，4-亚苯基二异硫氰酸酯5a和双[(4-异硫氰酸基)苯基]甲烷6b与合适的氨基PEG反应来合成。PEG部分使水溶性升至～10mM。合成PEG基化的化合物的另一方法涉及将羟乙基部分并入甘氨酸甲基并进一步处理羟基使其连接到PEG链(图11)。bromobuterolactone与2-萘胺反应及随后与肼反应产生酰肼7。使用标准保护-脱保护Boc化学法，该酰肼通过利用其羟基被PEG基化。PEG基化的酰肼11与芳香醛缩合产生GlyH-(PEG)n，其具有与MalH-(PEG)n近似的水溶性。
                        实施例7
       高水溶性的CFTR孔阻断化合物的CFTR抑制作用
使用表达人野生型CFTR的FRT细胞进行的短路电流分析测定了MalH化合物对CFTR的抑制。在存在跨内皮氯梯度下进行细胞基底侧膜透化处理后，测定了顶端膜氯离子流。如图12所示，CFTR被细胞渗透性的cAMP激动剂CPT-cAMP活化后，接着加入逐渐增大浓度的MalH化合物。结果显示在高浓度的MalH下抑制作用快速而几乎完全。此外，结果也显示抑制能力(KI)在2-8μM范围内。
在表达CFTR的单层上皮细胞中的短路电流分析显示对加入腔内溶液的化合物的响应产生了氯电流的快速抑制。重要的是，在高抑制浓度下实现了几乎100％的氯电流阻断。而且，抑制剂在肠内容物存在时是化学稳定的，以及当高浓度的抑制剂存在于细胞培养物中或对小鼠全身性用药时未见到任何毒性。当这些水溶的非透过性的化合物外加时产生的有效的CFTR阻断提供了阻断位点是位于CFTR外侧表面的直接证据。
                        实施例8
    高水溶性的CFTR孔阻断化合物的肠吸收和抗腹泻功效研究
在小鼠体内根据MalH化合物在2小时期间从封闭的中段回肠环腔中的消失来测定肠吸收。在这些试验中，含有MalH的溶液中包括了甘露醇以阻止液体吸收。吸收率比照大的FITC-葡聚糖，其假定在2小时的研究期间无吸收。图13A图中的概要数据显示两小时中MalH化合物的吸收低于5％，但是此期间超过90％的噻唑烷酮CFTRinh-172被吸收。
抗腹泻功效是在小鼠封闭的中段回肠环中测定的。肠环注射生理盐水或含有不同浓度的MalH化合物的霍乱毒素溶液。在6小时通过测定肠环的长度和重量来确定肠液分泌。图13B图中的数据概要显示肠环的重量-长度比率(相应于100％抑制)在注射生理盐水的环中为～0.09，在注射霍乱毒素的环中为0.28(相应于0％抑制)。结果表明每一种MalH化合物以剂量依赖的方式抑制肠环分泌，在较高浓度下基本上全部抑制。
结果显示基于甘氨酸酰肼的CFTR抑制剂基本没有肠吸收，并且在霍乱毒素诱导液体分泌的啮齿类模型中对于阻止霍乱毒素诱导的液体分泌有效。使用非吸收性的化合物进行抗腹泻治疗的优点是在肠中可以获得高浓度，而对于与细胞摄取和系统吸收有关的毒性和靶点外效应的担心最小。
尽管本发明以其具体实施例作为参考进行描述，但是本领域技术人员应理解在不脱离本发明的实质精神和范围时可以进行各种该变和可以以等同物替换。此外，可以进行许多修改以调整具体的情况、材料、物质组合、方法、方法中的一步或多步来适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都应理解为处于此处所附的权利要求书的范围之内。

Claims (55)

1.药物组合物，其包含单一立体异构体或其混合物形式的式(I)的化合物，或其药物可接受的衍生物，或其药物可接受的盐，
其中X独立地选自烷基或羰基；Y是独立地选自氢、烷基、酰胺键链接或醚链接；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳基、取代或未取代的蒽基和取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；以及R3独立地选自氢或烷基。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种药物可接受的载体、药物可接受的稀释剂、药物可接受的赋形剂或药物可接受的佐剂。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物不含有可检测到的二甲基亚砜。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物选自：N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-(取代的-2-(萘基)-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-(取代的-1-萘基)-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]丙酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]丙酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚乙基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚乙基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]草氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]草氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚乙基]草氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚乙基]草氨酸酰肼；4-氯苯基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-氯苯基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-甲苯基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；2-甲苯基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3-溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(4-溴苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(4-羰基-苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-氯苯基-[(3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-氯苯基-[(2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-蒽基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-蒽基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-6-喹啉基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-6-喹啉基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-(杂芳基)-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；2-萘氨基-双[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]丙二酸二酰肼；2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][(2，4-二钠-二磺基苯基)亚甲基]丙二酸二酰肼；2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-(4-钠-磺基苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼；2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-[4-(3-(PEG)n-硫脲基)苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼；[2-(2-萘氨基)-4-(PEG-氨基)]丁酸酰肼或2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-[4-((3-(PEG)n-硫脲基)苯基-甲基)苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼[MalH-(PEG)nB]。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)的化合物是式(Ia)的化合物：
Figure A2005800171210004C1
其中，X1独立地选自氢或取代或未取代的烷基；Y独立地选自氢、烷基、酰胺键链接或醚链接；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳基、取代或未取代的蒽基和取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢或烷基。
6.如权利要求5所述的组合物，其中X1选自甲基、乙基或包含极性分子的烷基，所述极性分子选自磺基、羧基、羧酰胺基、聚氧烷基聚醚、二糖、取代或未取代的苯基或聚乙烯亚胺(PEI)。
7.如权利要求5所述的组合物，其中R1选自取代的2-萘基、未取代的2-萘基、取代的1-萘基或未取代的1-萘基。
8.如权利要求5所述的组合物，其中R2选自3，5-二溴-2，4-二羟基苯基或3，5-二溴-4-羟基苯基。
9.如权利要求5所述的组合物，其中R3选自氢、甲基或乙基。
10.如权利要求5所述的组合物，其中Y选自氢和包含磺基、羧基、取代或未取代的羧酰胺基、聚氧烷基醚基、二糖、聚胺或聚乙烯亚胺(PEI)的取代烷基。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)的化合物是式(Ib)的化合物：
其中，Y独立地选自氢、烷基、酰胺键链接或醚链接；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳基、取代或未取代的蒽基和取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢或烷基。
12.如权利要求1所述的组合物，其中R1选自1-萘基、1-[取代的-萘基]、2-萘基、2-[取代的-萘基]、2-氯苯基、4-氯苯基、4-甲苯基、2-蒽基或6-喹啉基。
13.如权利要求1所述的组合物，其中R2选自3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基、3，5-二溴-2-二羟基-4-甲氧基苯基、3-溴-4-羟基苯基、2，4-二羟基苯基、4-溴苯基或4-羧基苯基。
14.如权利要求1所述的组合物，其中R3选自氢或甲基。
15.如权利要求1所述的组合物，其中Y是包含磺基、羧基、取代或未取代羧酰胺基、聚氧烷基醚基、二糖、聚胺或聚乙烯亚胺(PEI)的取代烷基。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)的化合物是式(Ie)的化合物：
其中，Y″独立地选自氢、烷基、酰胺键链接或醚链接；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳基、取代或未取代的蒽基和取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢或烷基。
17.如权利要求16所述的组合物，其中R1选自1-萘基、1-[取代的-萘基]、2-萘基、2-[取代的-萘基]、2-氯苯基、4-氯苯基、4-甲苯基、2-蒽基或6-喹啉基。
18.如权利要求16所述的组合物，其中R2选自3，5-二溴-2，4-二羟基苯基、5-二溴-2，4，6-三羟基苯基、3，5-二溴-4-羟基苯基、3，5-二溴-2-二羟基-4-甲氧基苯基、3-溴-4-羟基苯基、2，4-二羟基苯基、4-溴苯基或4-羧基苯基。
19.如权利要求16所述的组合物，其中R3选自氢或甲基。
20.如权利要求16所述的组合物，其中Y″是含有磺基、羧基、取代或未取代的羧酰胺基、聚氧烷基醚基、二糖、聚胺、取代或未取代的苯基、聚乙烯亚胺(PEI)或0-10代树枝状聚合物的取代烷基。
21.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)的化合物是式(Ic)的化合物：
Figure A2005800171210007C1
其中，Y是独立地选自氢、烷基、酰胺键链接或醚链接；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳基、取代或未取代的蒽基和取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢或烷基。
22.如权利要求21所述的组合物，其中R1是2-萘基。
23.如权利要求21所述的组合物，其中R2选自3，5-二溴-2，4-二羟基苯基或3，5-二溴-4-羟基苯基。
24.如权利要求21所述的组合物，其中R3选自氢、甲基或乙基。
25.如权利要求21所述的组合物，其中Y是包含磺基、羧基、取代或未取代羧酰胺基、聚氧烷基醚基、二糖、聚胺或聚乙烯亚胺(PEI)的取代烷基。
26.式(Ia)的化合物：
Figure A2005800171210007C2
其中，X1独立地选自氢或取代或未取代的烷基；Y独立地选自氢、烷基、酰胺键链接或醚链接；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳基、取代或未取代的蒽基和取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；R3独立地选自氢或烷基；
其中，当X1是氢时，R1是取代或未取代的蒽基、取代或未取代苯基或杂芳基。
27.如权利要求26所述的化合物，其中X1选自甲基、乙基或包含极性分子的烷基，所述极性分子选自磺基、羧基、羧酰胺基、聚氧烷基聚醚、二糖、取代或未取代的苯基、聚乙烯亚胺(PEI)或0-10代的树枝状聚合物。
28.如权利要求26所述的化合物，其中R1选自取代的2-萘基、未取代的2-萘基、取代的1-萘基或未取代的1-萘基。
29.如权利要求26所述的化合物，其中R2选自3，5-二溴-2，4-二羟基苯基或3，5-二溴-4-羟基苯基。
30.如权利要求26所述的化合物，其中R3选自氢、甲基或乙基。
31.如权利要求26所述的化合物，其中Y选自氢或包含磺基、羧基、取代或未取代的羧酰胺基、聚氧烷基醚基、二糖、聚胺、取代或未取代的苯基、聚乙烯亚胺(PEI)或0-10代的树枝状聚合物的取代烷基。
32.如权利要求26所述的化合物，其中X1是包含极性分子的烷基，所述极性分子选自磺基、羧基、羧酰胺基、聚氧烷基聚醚、二糖、取代或未取代的苯基、聚乙烯亚胺(PEI)或0-10代的树枝状聚合物。
33.式(Ic)的化合物：
Figure A2005800171210009C1
其中，Y独立地选自烷基、酰胺键链接或醚链接；R1独立地选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的诸如喹啉基的杂芳基、取代或未取代的蒽基和取代或未取代的萘基；R2是取代或未取代的苯基；以及R3独立地选自氢或烷基。
34.如权利要求33所述的组合物，其中R1是2-萘基。
35.如权利要求33所述的组合物，其中R2选自3，5-二溴-2，4-二羟基苯基或3，5-二溴-4-羟基苯基。
36.如权利要求33所述的组合物，其中R3选自氢、甲基或乙基。
37.如权利要求33所述的组合物，其中Y是包含磺基、羧基、取代或未取代的羧酰胺基、聚氧烷基醚基、二糖、多胺、取代或未取代的苯基、聚乙烯亚胺(PEI)或0-10代的树枝状聚合物的取代烷基。
38.如权利要求33所述的化合物，其中所述式(Ic)的化合物是N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]草氨酸酰肼。
39.治疗具有与个体中由囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)引起的异常离子转运有关的病症的个体的方法，所述方法包括：
给予所述个体有效量的含酰肼化合物；
其中CFTR离子转运被抑制以及所述病症被治疗。
40.如权利要求39所述的方法，其中异常增强的CFTR离子转运与多囊性肾病有关。
41.如权利要求39所述的方法，其中异常增强的CFTR离子转运与腹泻有关。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述腹泻为分泌性腹泻。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述含酰肼化合物具有权利要求1所述的化合物的结构式。
44.如权利要求39所述的方法，其中所述含酰肼化合物具有权利要求26所述的化合物的结构式。
45.如权利要求39所述的方法，其中所述含酰肼化合物具有权利要求33所述的化合物的结构式。
46.如权利要求39所述的方法，其中所述式(I)的化合物选自：N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-(取代的-2-(萘基)-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-(取代的-1-萘基)-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]丙酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]丙酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚乙基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚乙基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]草氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]草氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚乙基]草氨酸酰肼；N-2-萘基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚乙基]草氨酸酰肼；4-氯苯基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-氯苯基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-甲苯基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；2-甲苯基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-1-萘基-[(3-溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(4-溴苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-萘基-[(4-羰基-苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-氯苯基-[(3，5-二溴-2-羟基-4-甲氧基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；4-氯苯基-[(2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-蒽基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-2-蒽基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-6-喹啉基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-6-喹啉基-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；N-(杂芳基)-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼；2-萘氨基-双[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基]丙二酸二酰肼；2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][(2，4-二钠-二磺基苯基)亚甲基]丙二酸二酰肼；2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-(4-钠-磺基苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼；2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-[4-(3-(PEG)n-硫脲基)苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼；[2-(2-萘氨基)-4-(PEG-氨基)]丁酸酰肼或2-萘氨基-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苯基)亚甲基][3-[4-((3-(PEG)n-硫脲基)苯基-甲基)苯基)-硫脲基]丙二酸二酰肼[MalH-(PEG)nB]。
47.在体外测定中抑制细胞中囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)活性的方法，包括使所述细胞与有效抑制CFTR活性的量的权利要求1所述的化合物接触。
48.在体外测定中抑制细胞中囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)活性的方法，包括使所述细胞与有效抑制CFTR活性的量的权利要求26所述的化合物接触。
49.在体外测定中抑制细胞中囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)活性的方法，包括使所述细胞与有效抑制CFTR活性的量的权利要求33所述的化合物接触。
50.在非人动物中产生囊性纤维化(CF)表型的方法，其中所述方法包括以有效抑制CFTR离子转运的量向所述非人动物给予权利要求1所述的化合物。
51.由权利要求50所述的方法产生的具有囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)缺陷的非人动物，其中所述缺陷通过向所述动物给予含酰肼化合物而产生。
52.在非人动物中产生囊性纤维化(CF)表型的方法，其中所述方法包括以有效抑制CFTR离子转运的量向所述非人动物给予权利要求26所述的化合物。
53.由权利要求52所述的方法产生的具有囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)缺陷的非人动物，其中所述缺陷通过向所述动物给予含酰肼化合物而产生。
54.在非人动物中产生囊性纤维化(CF)表型的方法，其中所述方法包括以有效抑制CFTR离子转运的量向所述非人动物给予权利要求33所述的化合物。
55.由权利要求54所述的方法产生的具有囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)缺陷的非人动物，其中所述缺陷通过向所述动物给予含酰肼化合物而产生。
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