CN101252957A

CN101252957A - 使用胎盘源胶原生物纤维的鼓膜修复

Info

Publication number: CN101252957A
Application number: CNA2006800320855A
Authority: CN
Inventors: 约瑟夫·W·萨尔纳; 贾尼斯·斯米埃尔; 莎伦·L·伯克; 帕特丽夏·A·墨菲
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2008-08-27
Also published as: CA2613548A1; JP2008544818A; MX2007016268A; US20070038298A1; PE20070497A1; IL188419A0; WO2007005807A3; EP1901789A2; WO2007005807A2; KR20080026198A; BRPI0612121A2; AU2006265601A1

Abstract

本发明提供了使用胶原生物纤维修复鼓膜畸形如鼓膜穿孔的方法，其中鼓膜修复一般被称为鼓室成形术或鼓膜成形术。胶原生物纤维优选为层叠的。本发明进一步提供了含有一片或多片胶原生物纤维如层叠的胶原生物纤维的试剂盒，用于修复鼓膜。

Description

使用胎盘源胶原生物纤维的鼓膜修复

本申请要求2005年6月30日提交的美国临时申请60/696,197的优先权。该申请中的内容全部引入本文作为参考。

1.发明领域

本发明涉及使用胶原生物纤维的鼓膜修复，鼓膜修复一般被称为鼓室成形术或鼓膜成形术。

2.发明背景

中耳用于接收声波的第一个组成部分是鼓膜，也被称为耳鼓。冲击鼓膜的声波经过一系列小骨(锤骨、砧骨、镫骨)传输到耳蜗，声波在耳蜗被感应和处理。鼓膜本身是活组织。

鼓膜畸形，如穿孔，会干扰声音的传导和感知。鼓膜穿孔往往由外伤或感染引起。引起耳鼓穿孔的外伤例子包括用张开的手打耳部(即击打耳部)；头颅骨折；突发爆炸；类似发卡或棉签的物体被过深地推入耳道；焊接时的热熔渣或酸进入耳道以及其它创伤。中耳感染会引起耳鼓的自发性破裂(撕裂)，从而导致穿孔。在这种情况下，耳部可能会有感染液或血流出，这种情况被称为伴有鼓膜穿孔的中耳炎。鼓膜上的洞也可能由手术操作(如鼓室探查术或鼓膜切开术)引起。在之前置入的压力平衡管脱落或被医师移除后，耳鼓上可能留有小洞。

不论是什么原因导致的鼓膜畸形，都希望进行膜的修复。鼓膜穿孔的修复一般都通过鼓室成形术或鼓膜成形术来完成。这两种方法是相似的；然而，除了对鼓膜本身进行修复，鼓室成形术还改善中耳裂病状，如慢性感染、畸囊或听骨链问题。在鼓室成形术或鼓膜成形术中，鼓膜上的洞一般通过移植手段来修复。迄今为止，典型的移植用材料包括天然材料，如颞肌筋膜、耳屏软骨膜、皮肤、骨膜、疏松的叠层组织、脂肪、血管组织、人类羊膜和同源硬脑膜等；和非天然材料，如硅胶、纸和聚四氟乙烯片等。除了修复鼓膜外，鼓室成形术的另一个主要目的是创建一个含有空气的中耳空间。为达到这一目的，用于修复鼓膜的材料不粘连或不促使鼓膜感染，或者形成粘连或促使鼓膜感染的倾向较低是非常重要的。

通常用以下方法来治疗穿孔的鼓膜。在显微镜下，清理耳鼓边缘以更新边缘从而促进边缘生长，然后将闭合材料，一般是薄补片或移植物，置于鼓膜穿孔上，与鼓膜的未受损部分交叠。补片通常是一小节盘纸，它可以为上皮细胞的向内生长提供支架，以填补穿孔。一般在鼓膜闭合后，观察到听力的改善。在鼓膜完全闭合前可能需要多次使用补片(多达三或四次)。如果纸补片未能使耳鼓迅速或充分闭合，亦或者纸补片疗法不成功，则会考虑使用外科手术法，如鼓膜成形术或鼓室成形术。但是，鉴于其较高的失败率，并不是所有的耳鼻喉科医生都认为在穿孔的鼓膜上放置纸补片是充分的治疗方法。

3.发明概述

本发明提供了用于修复鼓膜的方法和组合物。例如，本发明提供了用于修复受损或畸形鼓膜的方法和组合物。在一实施方案中，本发明提供了修复穿孔鼓膜的方法，该方法包括将所述穿孔鼓膜与胶原生物纤维接触。在另一具体实施方案中，所述接触是足以闭合穿孔的。在更具体实施方案中，所述穿孔位是中心穿孔。在又一更具体实施方案中，所述穿孔是边缘穿孔。在另一具体实施方案中，所述穿孔在形成穿孔两个月内没有自发愈合。在具体实施方案中，组成胶原生物纤维的蛋白基本保持了它们的天然构象，如胶原生物纤维未经蛋白酶处理。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维的蛋白并没有交联，如胶原生物纤维没有被固定。在另一具体实施方案中，胶原生物纤维在所述接触前是基本干燥的，即含有约20％重量或更少的水分。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维是单层的。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维是两层或多层的层叠片。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维在所述接触前被修剪。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维在修剪前为约2×2cm见方。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维在修剪前约为3×3cm见方。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维在修剪前约为2×3cm见方。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维在与鼓膜接触前是水合的。在另一具体实施方案中，所述胶原生物纤维在干燥状态下厚度大约为2-150微米。在更具体实施方案中，所述生物纤维在干燥状态下厚度大约为10-50微米。在另一具体实施方案中，所述生物纤维在干燥状态下厚度大约为40-50微米。在更具体实施方案中，在干燥状态下厚度大约为2-150微米的胶原生物纤维是两层或多层的层叠片。在以上实施方案中，范围表示平均厚度，且并非是对厚度的绝对性限制。在另一实施方案中，通过使用敷料器将所述胶原生物纤维与鼓膜接触。在另一实施方案中，发明提供了装在无菌双层易撕袋中的一张或多张胶原生物纤维。

3.1定义

在本文中，“胶原生物纤维”通常指含有胶原蛋白的胎盘羊膜或绒毛膜材料，其可用作薄膜或薄片。优选的胶原生物纤维是Hariri，美国申请公开号US2004/0048796中描述的真空干燥的、非固定的、未经蛋白酶处理的羊膜材料，且是通过该文件和本文中说明的方法(见实施例1、2)制成的，该文件中被完整引入本文。胶原生物纤维优选用羊膜制成，但也可用绒毛膜制成，或由羊膜和绒毛膜制成。

在本文中，术语“生物活性化合物”指在体外或体内对一或多种生物学系统产生可检测影响的任何化合物或分子。

4.发明详述

本发明提供了修复鼓膜畸形的方法，且更具体地，提供了使用胶原羊膜和/或绒毛膜材料(在此被称作胶原生物纤维)进行鼓室成形术或鼓膜成形术的方法。

4.1使用胶原生物纤维的鼓膜修复

本发明提供了使用胶原生物纤维修复鼓膜的方法。在一个实施方案中，待修复的鼓膜是畸形的。此畸形可能是自然形成的，如，由疾病或感染引起，也可能是损伤。在不同的实施方案中，畸形可以是：如穿孔，如急性穿孔或慢性穿孔(如持续长过2个月的穿孔)；鼓膜中胶原的部分或全部流失、正常鼓膜硬度的部分或全部失去、鼓膜塌陷(即鼓膜中使膜坚硬的天然胶原蛋白层部分或完全流失)；由胆脂瘤或其它侵及中耳部位的肿瘤引起的畸形；鼓膜疾病，如二鼓症(dimeric drum)、耳鼓内缩、耳鼓内缩袋(即由于中耳腔的压力丧失，由鼓膜内缩至中耳腔导致的在耳鼓中形成的袋)或鼓室硬化等。

例如，鼓膜畸形的修复可例如包括：使鼓膜与胶原生物纤维在长度足以治愈鼓膜畸形的一段时间内接触，与未与胶原生物纤维接触的鼓膜相比，使鼓膜与胶原生物纤维在长度足以可测地改善鼓膜畸形的一或多个方面的一段时间内接触，或在长度足以减缓鼓膜畸形的一或多个方面的恶化的一段时间内接触。

本文中，“鼓膜畸形的方面”包括可客观测量的指标，如鼓膜传导声音的能力、听力丧失的分贝数、鼓膜或其周围组织的表观、上皮组织向鼓膜穿孔内或周围生长等；或主观指标，如听觉改善的感觉、不适或疼痛的减轻等。

在一个实施方案中，畸形是穿孔。例如，这样的穿孔可以是意外引起的，如外伤、感染；或可以是故意造成的穿孔，例如，为了让中耳内的液体通过鼓膜流出耳道而插入一或多根管而造成的穿孔(如为了鼓膜切开置管的穿孔或外科手术移除患病或受损组织引起的穿孔)。穿孔可以是急性的或慢性的，即存在两个月或两个月以上的穿孔。

在修复鼓膜的一个实施方案中，将具有穿孔的鼓膜与胶原生物纤维接触，以使胶原生物纤维部分或全部闭合穿孔。需被闭合的穿孔可能是中心穿孔，即不涉及鼓膜边缘(即其边缘在耳道中)的任意大小的穿孔，该穿孔也可能是边缘穿孔(即触及鼓膜边缘或很大程度侵及鼓膜边缘的穿孔)。在另一实施方案中，只有鼓膜有穿孔，其它耳部结构都没有穿孔或损伤。在另一实施方案中，穿孔闭合是其它至少一种涉及外耳、中耳或内耳手术过程的附属操作。在另一实施方案中，鼓膜修复是鼓室成形术。在另一实施方案中，鼓膜修复是鼓膜成形术。

闭合鼓膜穿孔的益处包括防止淋浴、盆浴或游泳时耳部进水(这可能会引起耳部感染)、改善听力和减少耳鸣。其还可以防止胆脂瘤(中耳内的皮肤囊肿)的发展，胆脂瘤会造成慢性感染和对耳结构的破坏。

鼓室成形术和鼓膜成形术一般是门诊操作。耳鼻喉科医生可通过耳道(经外耳道途径)修复鼓膜穿孔，也可通过在耳后开口，再将耳向前折，以暴露鼓膜来进行操作(耳后途径)。

在企图进行穿孔的任何矫正前，一般先进行听觉测试，并且评估病人的咽鼓管功能，因为咽鼓管功能部分或完全丧失会加剧鼓膜刺穿，并干扰移植物对鼓膜的粘附。穿孔鼓膜的修复一般包括将闭合材料放置于膜上。对病人进行并发症的评估，如扁平上皮通过穿孔并延伸进中耳腔。这种情况下，如果可能的话，鼓室成形术或鼓膜成形术优选地伴随对并发症的治疗。

本发明包括将用胶原生物纤维修复鼓膜作为第一步或后继的治疗。也就是说，可以在采用其它治疗措施前，用胶原生物纤维来修复鼓膜畸形，如穿孔。或者，也可以在尝试一种或多种治疗措施并失败后，再用胶原生物纤维对鼓膜进行修复。

在一个实施方案中，胶原生物纤维对鼓膜的修复还可以包括在移植物上和/或耳道周围施用抗感染剂。由此，在一个实施方案中，本发明提供了修复鼓膜的方法，包括将鼓膜与胶原生物纤维和抗感染剂接触。该抗感染剂可在鼓膜与胶原生物纤维接触之前、同时或之后与鼓膜接触。该抗感染剂可与胶原生物纤维分开或作为一个整体存在。例如，该抗感染剂可以存在于胶原生物纤维的表面，或可以注入胶原生物纤维中。在具体实施例中，该抗感染剂是抗生素、抑菌剂、抗病毒化合物、病毒抑制剂、抗真菌化合物、真菌抑制剂或抗微生物剂。在具体实施例中，该抗感染剂是离子化银。在更具体的实施例中，离子化银包含在水凝胶中。因为其是广谱的且没有已知的细菌抗药性，离子化银水凝胶是优选的抗感染剂；它的施用和去除都是无痛的，而且水凝胶支持自溶性清除。在优选实施方案中，胶原生物纤维在施用至鼓膜之前被离子化银灌注。在另一实施方案中，胶原生物纤维在施用至鼓膜之后被灌注离子化银，如通过使用耳滴剂。

本发明进一步提供了修复鼓膜的方法，包括将鼓膜与胶原生物纤维和大量干细胞或祖细胞接触。优选的干细胞包括例如美国申请公开号US2003/0032179和US 2003/0180269US中公开的间充质干细胞和胎盘源干细胞，这两个文件的全部内容也引入本文。在一实施方案中，可以在将鼓膜与胶原生物纤维接触之前将胶原生物纤维与干细胞或祖细胞接触。例如，通过将干细胞或祖细胞置于胶原生物纤维表面或内部，给予干细胞或祖细胞充分的时间粘附在胶原生物纤维上，可以在施用于鼓膜前制备胶原生物纤维。在将胶原生物纤维施用于鼓膜前，例如可将干细胞或祖细胞置于胶原生物纤维表面或内部至少或不超过30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时。在另一实施方案中，胶原生物纤维可在施用于鼓膜之后再与干细胞或祖细胞接触。在另一实施方案中，本发明提供了治疗鼓膜的方法，包括将鼓膜与大量的干细胞或祖细胞接触，并且将鼓膜与胶原生物纤维接触，由此胶原生物纤维覆盖了鼓膜和干细胞或祖细胞。

在任一实施方案中置于鼓膜上或胶原生物纤维表面的干细胞或祖细胞的数量均可变化，但可至少为1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹或1×10¹²；或可不超过1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹或1×10¹²个干细胞或祖细胞。因此，在具体实施方案中，本发明提供了修复鼓膜的方法，包括将所述鼓膜按任一顺序与(a)胶原生物纤维和(b)大量干细胞或祖细胞(含有1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹或1×10¹²个干细胞或祖细胞)接触。在其它具体实施方案中，本发明提供了治疗鼓膜的方法，包括将所述鼓膜按任一顺序与(a)胶原生物纤维和(b)大量的干细胞或祖细胞(含有不超过1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹或1×10¹²的干细胞或祖细胞)接触。在更具体的实施方案中，所述大量干细胞包括两种或多种不同的干细胞或祖细胞类型。

本发明进一步提供了：将胶原生物纤维用于修复鼓膜畸形可以成为对鼓膜的单一疗法，或可与其它治疗或疗法同时用于治疗或修复鼓膜的过程中。例如，本发明提供了修复鼓膜的方法，包括将鼓膜与胶原生物纤维接触和用额外的不包括将鼓膜与胶原生物纤维接触的方法来治疗鼓膜，其中，与不将鼓膜与胶原生物纤维接触相比，该接触和该额外的治疗单独地或共同地造成了在鼓膜畸形的至少一个方面可测的改善、维持或减轻恶化。

本发明进一步提供了修复鼓膜的同时，将胶原生物纤维用于修复耳部状况的用途。例如，胶原生物纤维可用于重建或修复外耳或中耳结构，包括耳道和中耳腔。例如，胶原生物纤维可用于修复或充填乳突腔，尤其是在除鼓室成形术还有重建乳突的指征时。在一实施方案中，胶原生物纤维可用于填充乳突腔，其中该乳突腔包含暴露的骨，即没有覆盖上皮细胞层的骨。在另一实施方案中，胶原生物纤维可在单独的或与鼓室成型术或鼓膜成形术相关的镫骨外科手术中用作卵圆窗移植物。

4.2胶原生物纤维

4.2.1描述

用于修复鼓膜的胶原生物纤维可来源于任何哺乳动物的羊膜，例如马、牛、猪或狭鼻猴源，但其最优选来源于人类胎盘。在优选的实施方案中，胶原生物纤维基本上是干燥的，即含有20％(重量)或更少的水分。在另一优选实施方案中，胶原生物纤维保留了羊膜天然的三级和四级结构，即未经蛋白酶处理。在另一优选实施方案中，胶原生物纤维不合有经人工交联如化学交联的胶原和其它结构蛋白，即优选的胶原生物纤维是非固定的。优选的胶原生物纤维是在Hariri的美国申请公开号U.S.2004/0048796中说明的干燥的、非固定的、未经蛋白酶处理的羊膜材料，且该材料是通过该文献和本文(见实施例1、2)中说明的方法制备的，该文献被完整地引入本文。但本发明的方法可使用任何工艺制成的任何胎盘源胶原材料。

在一优选实施方案中，用于治疗或修复鼓膜的胶原生物纤维是半透明的。在其它实施方案中，胶原生物纤维是不透明的、有色的或染色的，如用医学上可接受的染色剂或着色剂将胶原生物纤维永久性地着色或染色。这种染色剂可以吸附在胶原生物纤维上，也可以注入或包被于胶原生物纤维。在该实施方案中，可使用任何无毒、无刺激的着色剂或染料。

当胶原生物纤维基本干燥时，其约为0.1g/cm²-0.6g/cm²。在具体实施方案中，单层的胶原生物纤维至少有2微米厚。在另一具体实施方案中，用于修复鼓膜的单层胶原生物纤维的厚度约为10-40微米，但在干燥状态下其厚度可为大约2-150微米、2-100微米、5-75微米或7-60微米。

在一实施方案中，胶原生物纤维主要由胶原(I、III和IV型，约占生物纤维基质的90％)、纤维蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白组成，且可进一步含有糖胺聚糖和/或蛋白聚糖。在某些实施方案中，胶原生物纤维可含有非结构组分，如一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因-β1。因此，胶原生物纤维的组分就非常适用于促进成纤维细胞和巨噬细胞的迁移，从而促进伤口愈合。

胶原生物纤维可以单层的形式使用，如单层片或非叠层薄膜。或者，胶原生物纤维也可以双层或多层的形式使用，例如胶原生物纤维可以是叠层的。叠层能在伤口愈合过程中提供更强的硬度和耐用性。例如，胶原生物纤维可按照下文所述方法来层叠(见4.2.7节)。

生物胶原纤维可进一步含有非胎盘来源的胶原。例如，可用纯化提取的胶原包被、注入或夹铺于一层或多层的胶原生物纤维。这些胶原例如可通过商业途径得到，或根据已知方法制备，例如在美国专利号4,420,339、5,814,328和5,436,135中公开的方法，这些专利的内容被引入本文作为参考。

用于修复鼓膜的胶原生物纤维可含有一种或多种其来源胎盘材料中不存在的化合物或物质。胶原生物纤维也可含有非自然发生量的一种或多种来源胎盘材料中正常存在的化合物或物质。例如，可将生物活性化合物如下文4.2.2节中列出的化合物注入胶原生物纤维。这些生物活性化合物包括但不仅限于有机小分子(如药物)、抗生素(如克林霉素、米诺环素、脱氧土霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤制剂、抗真菌制剂、抗病毒制剂、疼痛治疗药物、抗组胺剂、抗炎药、抗感染药包括但不仅限于银(如银盐，包括但不限于硝酸银和磺胺嘧啶银)、银元素、抗生素、杀菌酶(如，溶菌酶)、伤口愈合制剂(如细胞因子包括但不限于PDGF、TGF；胸腺肽)、用作伤口愈合制剂的透明质酸、伤口封闭制剂(如，加有或不加有凝血酶的纤维蛋白)、细胞趋化剂和骨架试剂(例如加入的纤维连接蛋白)等。在具体实施例中，胶原生物纤维可被注入至少一种生长因子，如成纤维细胞生长因子、上皮生长因子等。生物纤维也可被注入有机小分子，如具体生化过程的特异性抑制剂(如膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂)、抗癌药物、抗生素等。通过将胶原生物纤维在所需浓度的生物活性化合物溶液中浸渍一段时间，该时间足以使胶原生物纤维吸收并与溶液实现平衡，从而实现胶原生物纤维的生物活性化合物的注入。

在其它实施方案中，胶原生物纤维可与水凝胶组合形成复合物。本领域技术人员已知的任一种水凝胶组合物都可用于本发明中，例如下列综述中公开的任一水凝胶组合物：Graham，1998，Med.Device Technol.9(1)：18-22；Peppas等，2000，Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)：27-46；Nguyen等，2002，Biomaterials，23(22)：4307-14；Henincl等，2002，Adv.DrugDeliv.Rev 54(1)：13-36；Skelhorne等，2002，Med.Device.Technol.13(9)：19-23；Schmedlen等，2002，Biomaterials 23：4325-32，这些综述的内容被完整地引入本文作为参考。在具体实施方案中，将水凝胶组合物施用于胶原生物纤维上，即置于胶原生物纤维的表面。例如，可将水凝胶组合物喷洒或包被在胶原生物纤维的表面，或可用水凝胶组合物来浸湿、浸泡或饱和生物纤维。在另一具体实施方案中，水凝胶夹在两层或多层胶原生物纤维中间。在更具体的实施方案中，水凝胶夹在两层胶原生物纤维中，且两层胶原生物纤维的边缘是密封的，由此基本上或完全地包含了水凝胶。

可用于本发明方法和组合物的水凝胶可由本领域已知的任何水活性或水溶性聚合物制成，包括但不限于聚乙烯醇(PVA)、聚羟乙基异丁烯酸酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、藻酸盐、胶原、明胶、右旋糖苷及它们的衍生物或类似物。

在一些实施方案中，本发明的胶原生物纤维含有一种或多种生物活性化合物，并与水凝胶组合。例如，胶原生物纤维可在与水凝胶组合之前，先被一种或多种生物活性化合物灌注。在其它实施方案中，水凝胶组合物在与本发明的胶原生物纤维组合之前或之后可进一步被一种或多种生物活性化合物灌注，如下文4.2.2节中提到的生物活性化合物。

4.2.2生物活性化合物

在本发明方法中用到的胶原生物纤维可含有(如，被注入或被包被)一种或多种生物活性化合物或药用化合物，如，有机小分子(如药物)、抗生素、抗病毒制剂、抗微生物制剂、抗炎制剂、抗增殖制剂、细胞因子、酶或蛋白抑制剂、抗组胺剂等。在各种实施方案中，胶原生物纤维可用以下物质包被或灌注：抗生素(如克林霉素、米诺环素、脱氧土霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤制剂、抗真菌制剂、抗病毒制剂、疼痛治疗剂(包括昔罗卡因(Xylocaine)、利多卡因、普鲁卡因、奴佛卡因等)、抗组胺制剂(如苯海拉明、苯那君(Benadryl)等)、抗炎制剂、抗感染制剂包括但不仅限于银(如银盐，包括但不仅限于硝酸银和磺胺嘧啶银)、银元素、抗生素、杀菌酶(如溶菌酶)、伤口愈合制剂(如细胞因子包括但不仅限于PDGF(如Regranex^)、TGF；胸腺肽)、作为伤口愈合剂的透明质酸、伤口封闭剂(如加有或不加有凝血酶的纤维蛋白)、细胞趋化和骨架试剂(如纤维连接蛋白)等，或上述任意物质的组合，或上述物质与没有列出的其它化合物的任意组合。可采用本领域已知的任何方法完成这样的灌注或包被，且可对胶原生物纤维的一部分或整体进行这样的包被或灌注。

胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物可不受限地含有此处列出的单独的任何化合物或化合物的任何组合。此处列出的任一生物活性化合物和其它可用于巩膜或眼部的化合物可按照已知方法配制，用于即时或延长释放。另外，胶原生物纤维可以不同的方式含有两种或多种生物活性化合物，如可用一种生物活性化合物灌注生物纤维，并用另一种生物活性化合物包被生物纤维。在另一实施方案中，胶原生物纤维含有一种经配制以延长释放的生物活性化合物和另一种经配制以即时释放的生物活性化合物。

伤口愈合，包括鼓膜(包括穿孔鼓膜)愈合，需要足够的营养物质，尤其是铁、锌、维生素C、精氨酸等的存在。因此，可用伤口愈合所需的一种或多种营养物质的生理学可接受形式来灌注或包被胶原生物纤维。优选地，营养物质经配制用于延长释放。

胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物可含有抗生素。在某些实施方案中，该抗生素是大环内酯类(如妥布霉素(Tobi^))、头孢菌素类(如头孢力新(Keflex^)、头孢雷定(Velosef^)、头孢呋新(Ceftin^)、头孢罗齐(Cefzil^)、头孢克洛(Ceclor^)、头孢克肟(Suprax^)或头孢羟氨苄(Duricef^)、克拉霉素类(如克拉霉素(Biaxin))、琥乙红霉素类(如琥乙红霉素(EMycin^))、青霉素类(如青霉素V(V-CillinK^或Pen VeeK^))或喹诺酮类(如氧氟沙星(Floxin^)、环丙沙星(Cipro^)或诺氟沙星(Noroxin^))、氨基糖苷类抗生素(如阿布拉霉素、阿贝卡星、班贝霉素、布剔罗星、双去氧卡那霉素、新霉素、十一烯酸新霉素、奈替霉素、巴龙霉素、核糖霉素、西苏霉素和大观霉素)、酰胺醇类抗生素(如叠氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素)、安沙霉素类(如利福酰胺和利福平)、碳头孢烯类(如洛拉卡比)、碳青霉烯类(如比阿培南和亚胺培南)、头孢菌素类(如头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢三嗪、头孢吡酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺和头孢匹罗)、头霉素类(如头孢拉宗、头抱美哇和头孢米诺钠)、单酰胺菌素类(如氨曲南、卡芦莫南和替吉莫南)、氧头孢烯类(如头孢佛英和羟羧氧酰胺菌素)、青霉素类(如氮卓西林、匹伏氮卓西林、阿莫西林、巴氨西林、苄青霉素酸、青霉素G钠、依比青霉素、苯苄青霉素、氟氯青霉素、青霉素G双酯、青霉素G乙胺酯、苯明青霉素、青霉素O、青霉素V、苄星青霉素V、哈胺青霉素V、青四环素和青霉素钾)、林可酰胺类(如克林霉素和林可霉素)、大环内酯类(如阿齐红霉素、碳霉素、克拉霉素、地红霉素、琥乙红霉素和红霉素阿西曲酯)、安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、粘菌素E、持久杀菌素、结核放线菌素N、四环素类(如羟哌羧四环素、氯四环素、氯莫环素和脱甲氯四环素)、2，4-二氨基嘧啶类(如溴莫普林)、硝基呋喃(如呋喃他酮和呋唑氯铵)、喹诺酮类及其类似物(如西诺沙星、环丙沙星、克林沙星、氟甲喹和grepagloxacin)、磺胺类(如乙酰磺胺甲氧吡嗪、苄磺胺、苯丙磺胺二磺酸钠、酞磺醋胺、偶氮磺胺和磺胺乙胞嘧啶)、砜类(如麝酚砜、二葡糖氨苯砜钠和苯丙砜)、环丝氨酸、莫匹罗星和抗结核菌素。

在某些实施方案中，胶原生物纤维可被抗真菌制剂包被或灌注。合适的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、依曲康唑、酮康唑、氟康唑、intrathecal、氟胞嘧啶、咪康唑、氯苯硫丁唑、克霉唑、制霉素、特康唑、噻康唑、环吡司、益康唑、卤普罗近、萘替芳、特比萘芬、十一烯酸酯和灰黄霉素。

在某些其它的实施方案中，胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物可被抗炎制剂包被或灌注。可用的抗炎制剂包括但不限于非甾体抗炎药，如水杨酸、乙酰水杨酸、水杨酸甲酯、双氟尼酸、双水杨酯、偶氮水杨酸、柳氮磺吡啶、扑热息痛、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、甲芬那酸、甲氧胺苯酸钠、托美汀、酮咯酸氨丁三醇、双氯非那胺、布洛芬、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、非诺洛芬、酮基布洛芬、氟吡洛芬、噁丙嗪、吡罗昔康、美洛昔康、安吡昔康、卓喜康、匹伏昔康、替诺昔康、萘丁美酮、苯丁唑酮、羟基保泰松、安替比林、氨基比林、阿扎丙宗和尼美舒利；白细胞三烯拮抗剂包括但不限于弃白通、硫代葡萄糖金、硫代苹果酸金钠和瑞得金诺芬；以及其它抗炎剂包括但不限于甲氨喋呤、秋水仙碱、别嘌醇、丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴马隆。

在某些实施方案中，胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物可被抗病毒制剂包被或灌注。可用的抗病毒制剂包括但不限于核苷类似物，如齐多夫定、阿昔洛维、gangcyclovir、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、以及三氮唑核苷、膦甲酸、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、印地那韦、利托那韦和α-干扰素。

胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物也可被细胞因子受体调节剂包被或灌注。细胞因子受体调节剂的例子包括但不限于可溶性细胞因子受体(如TNF-α受体的胞外域或其片段、IL-10受体的胞外域或其片段和IL-6受体的胞外域或其片段)、细胞因子或其片段(如白细胞介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和GM-CSF)、抗细胞因子受体抗体(如抗IFN受体抗体、抗IL-2受体抗体(如赛尼哌(Protein Design Labs))、抗IL-4受体抗体、抗IL-6受体抗体、抗IL-10受体抗体和抗IL-12受体抗体)、抗细胞因子抗体(如抗-IFN抗体、抗TNF-α抗体、抗IL-10抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8抗体(如ABX-IL-8(Abgenix)和抗IL-12抗体)。在具体实施方案中，细胞因子受体调节剂是IL-4、IL-10或它们的片段。在另一实施方案中，细胞因子受体调节剂是抗IL-1抗体、抗IL-6抗体、抗IL-12受体抗体或抗TNF-α抗体。在另一实施方案中，细胞因子受体调节剂是TNF-α受体的胞外域或其片段。在某些实施方案中，细胞因子受体调节剂不是TNF-α拮抗剂。

在优选实施方案中，用作免疫调节剂的蛋白、多肽或肽(包括抗体)源自与该蛋白、多肽或肽的接受者相同的物种，由此降低对这些蛋白、多肽或肽产生免疫应答的可能性。在另一优选实施方案中，当受试者是人时，用作免疫调节剂的蛋白、多肽或肽是人的或人源化的。

胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物也可被细胞因子包被或灌注。细胞因子的例子包括但不限于集落刺激因子1(CSF-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素18(IL-18)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(Epo)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)(碱性或酸性)、粒性白细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝磷脂结合表皮生长因子(HEGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、泌乳素、干扰素(IFN)(如INF-α和INF-γ)、转化生长因子α(TGF-α)、TGF β1、TGF β2、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)等。

胶原生物纤维也可被激素包被或灌注。激素的例子包括但不限于促黄体激素释放激素(LHRH)、生长激素(GH)、生长激素释放激素、ACTH、生长激素抑制素、生长激素、生长调节素、甲状旁腺素、下丘脑释放因子、胰岛素、高血糖素、脑啡肽、后叶加压素、降血钙素、肝素、低分子量肝素、类肝素、合成或天然阿片类物质、胰岛素促甲状腺激素和内啡肽。β-干扰素的例子包括但不限于干扰素β1-a和干扰素β1-b。

胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物也可被烷化剂包被或灌注。烷化剂的例子包括但不限于氮芥、次乙亚胺、甲基三聚氢胺(methylmelamines)、烷基磺酸、亚硝基脲、三氮烯、双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、六甲密胺、塞替派、白消安、卡氮芥、链唑霉素、氮烯咪胺和替莫唑胺。

胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物也可被免疫调节剂包被或灌注，免疫调节剂包括但不限于氨甲喋呤、来氟米特、环磷酰胺、环胞素A、大环内酯类抗生素(如FK506(他克莫司))、甲基氢化泼尼松(MP)、皮质激素、类固醇、麦考酚酸吗乙酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、异噁唑类(如来氟米特)、T细胞受体调节剂、细胞因子受体调节剂、肽模拟物、抗体(如人的、人源化的、嵌合的、单克隆的、多克隆的Fvs、ScFvs、Fab或F(ab)₂片段或抗原表位结合片段)、核酸分子(如反义核酸分子和三重螺旋)、小分子、有机化合物和无机化合物。特别地，免疫调节剂包括但不限于氨甲喋呤、来氟米特、环磷酰胺、cytoxan、硫唑嘌呤(Immuran)、环胞素A、米诺环素、硫唑嘌呤、抗生素(如FK506(他克莫司))、甲基氢化泼尼松(MP)、皮质激素、类固醇、麦考酚酸吗乙酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、异噁唑类(如来氟米特)、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。T细胞受体调节剂的例子包括但不限于抗-T细胞受体抗体(如抗-CD4抗体(如cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9.Is(IDEC和SKB)、mAB4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗-CD3抗体(如Nuvion(Product Design Labs)、OKT3(Johnson & Johnson)或Rituxan(IDEC))、抗-CD5抗体(如抗-CD5蓖麻毒素免疫交联物)、抗-CD7抗体(如CHH-380(Novartis))、抗-CD8抗体、抗-CD40配体单克隆抗体(如IDEC-131(IDEC))、抗-CD52抗体(如CAMPATH 1H(Ilex))、抗-CD2抗体、抗-CD1 la抗体(如Xanelim(Genentech))和抗-B7抗体(如IDEC-114(IDEC)))和CTLA4-免疫球蛋白。在具体实施方案中，T细胞受体调节剂为CD2拮抗剂。在其它实施方案中，T细胞受体调节剂不是CD2拮抗剂。在另一具体实施方案中，T细胞受体调节剂是CD2结合分子，优选MEDI-507。在其它实施方案中，T细胞受体调节剂不是CD2结合分子。

胶原生物纤维或含有胶原生物纤维的复合物也可被一类被称作IMiDs^的免疫调节化合物包被或灌注。除非特别指出，本文中使用的术语“IMiD^”和“IMiDs^”(Celgene公司)包括能显著抑制TNF-α、LPS诱导的单核细胞IL1β和IL12、并部分抑制IL6生成的有机小分子。以下讨论具体的免疫调节化合物。

这些免疫调节化合物的具体例子包括但不限于：被取代的苯乙烯的氰基或羧基衍生物，如美国专利号5,929,117中说明的此类化合物；1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)异吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)异吲哚啉，如美国专利号5,874,448和5,955,476中说明的此类化合物；美国专利号5,798,368中说明的四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉；1-氧代-和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉(如沙利度胺的4-甲基衍生物)，包括但不限于美国专利号5,635,517、6,476,052、6,555,554和6,403,613中公开的此类化合物；美国专利号6,380,239中提到的吲哚啉环4位或5位被取代的1-氧代-和1，3-二氧代异吲哚啉(如4-(4-氨基-1，3-二氧代异吲哚啉-2-基)-4-氨甲酰丁酸)；美国专利号6,458,810中说明的2位被2，6-二氧代-3-羟基哌啶-5-基取代的异吲哚啉-1-酮和异吲哚啉-1，3-二酮(如，2-(2，6-二氧代-3-羟基-5-氟哌啶-5-基)-4-氨基异吲哚啉-1-酮)；美国专利号5,698,579和5,877,200中公开的一类非多肽环酰胺类；氨基沙利度胺及氨基沙利度胺的类似物、水解产物、代谢产物、衍生物和前体，以及取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)酞酰亚胺类和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉，如美国专利号6,281,230和6,316,471中说明的此类化合物；以及异吲哚-亚胺类化合物，如2001年10月5日提交的美国专利申请号09/972,487、2001年12月21日提交的美国专利申请号10/032,286和国际申请号PCT/US01/50401(国际公开号WO02/059106)中说明的此类化合物。这里提到的所有专利和申请文件都被完整地引入本文作为参考。免疫调节化合物不包括沙利度胺。

其它具体的免疫调节化合物包括但不限于美国专利号5,635,517中说明的苯环上被氨基取代的1-氧代-和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉，此专利被引入本文作为参考。这些化合物具有结构I：

其中，X和Y中的一个为C＝O，X和Y中的另一个为C＝O或CH₂；R²为氢或低级烷基，尤其为甲基。具体免疫调节化合物包括但不限于：

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基异吲哚啉；

1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-7-氨基异吲哚啉；

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基异吲哚啉；和

1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基异吲哚啉。

其它具体免疫调节化合物属于一类取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)酞酰亚胺类和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异引哚类，如美国专利号6,281,230、6,316,471、6,335,349、6,476,052和国际专利申请号PCT/US97/13375(国际公开号WO 98/03502)中说明的此类化合物，这些专利和专利申请被引入本文作为参考。代表性的化合物如下式：

其中：

X和Y中的一个为C＝O，另一个为C＝O或CH₂；

(i)R¹、R²、R³和R⁴中的每一个独立地为卤素、1-4个碳原子的烷基或碳1-4个碳原子的烷氧基，或(ii)R¹、R²、R³和R⁴中的一个为-NHR⁵，其余为氢；

R⁵为氢或1-8个碳原子的烷基；

R⁶为氢或1-8个碳原子的烷基、苄基或卤素；

当X和Y为C＝O，且(i)R¹、R²、R³和R⁴均为氟或(ii)R¹、R²、R³和R⁴中的一个为氨基时，R⁶不是氢。

代表性的此类化合物如下式：

其中，R¹为氢或甲基。在一单独的实施方案中，本发明包括使用这些化合物的对映异构纯的形式(如光学纯的(R)或(S)对映异构体)。

还有其它具体的免疫调节化合物属于美国专利申请公开号US2003/0096841和US 2003/0045552和国际申请号PCT/US01/50401(国际公开号WO 02/059106)中公开的异吲哚-亚胺类，这些专利文件都被引入本文作为参考。代表性的化合物如式II：

及其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映体、外消旋体和气立体异构体混合物，其中：

X和Y之一为C＝O且另一个为CH₂或C＝O；

R¹为H、(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、C(O)R³、C(S)R³、C(O)OR⁴、(C₁-C₈)烷基-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、C(O)NHR³、C(S)NHR³、C(O)NR³R³′、C(S)NR³R³′或(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵；

R²为H，F，苄基，(C₁-C₈)烷基，(C₂-C₈)烯基，或(C₂-C₈)炔基；

R³和R³′各自独立地为(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、(C₀-C₈)烷基-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵或C(O)OR⁵；

R⁴为(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、(C₁-C₄)烷基-OR⁵、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基或(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基；

R⁵为(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基或(C₂-C₅)杂芳基；

每个R⁶各自独立地为H、(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₂-C₅)杂芳基或(C₀-C₈)烷基-C(O)O-R⁵，或多个R⁶基团可一起形成杂环烷基；

n为0或1；且

^*代表手性碳中心。

在式II的具体化合物中，当n为0，则R¹为(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、C(O)R³、C(O)OR⁴、(C₁-C₈)烷基-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、C(S)NHR³或(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵；

R²为H或(C₁-C₈)烷基；且

R³为(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、(C₅-C₈)烷基-N(R⁶)₂；(C₀-C₈)烷基-NH-C(O)O-R⁵；(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵或C(O)OR⁵；且其它变量具有相同的定义。

在式II的其它具体化合物中，R²为H或(C₁-C₄)烷基。

在式II的其它具体化合物中，R¹为(C₁-C₈)烷基或苄基。

在式II的其它具体化合物中，R¹为H、(C₁-C₈)烷基、苄基、CH₂OCH₃、CH₂CH₂OCH₃或

在式II化合物的另一实施方案中，R¹为

或

其中，Q为O或S，且每个R⁷都各自独立地为H、(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、卤素、(C₀-C₄)烷基-(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、(C₀-C₈)烷基-N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基-OR⁵、(C₁-C₈)烷基-C(O)OR⁵、(C₁-C₈)烷基-O(CO)R⁵或C(O)OR⁵，或相邻的R⁷连接起来形成二烷环或二芳环。

在式II的其它具体化合物中，R¹为C(O)R³。

在式II的其它具体化合物中，R³为(C₀-C₄)烷基-(C₂-C₅)杂芳基、(C₁-C₈)烷基、芳基或(C₀-C₄)烷基-OR⁵。

在式II的其它具体化合物中，杂芳基是吡啶基，呋喃基或噻吩基。

在式II的其它具体化合物中，R¹为C(O)OR⁴。

在式II的其它具体化合物中，C(O)NHC(O)中的H可被(C₁-C₄)烷基、芳基或苄基取代。

此类化合物可的进一步例子包括但不限于：[2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基]-酰胺、(2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-氨基甲酸叔丁酯；4-(氨甲基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮、N-(2-(2，6-二氧代-哌啶-3-基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基甲基)-乙酰胺、N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}环丙基-羧酰胺、2-氯-N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}乙酰胺、N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)-3-吡啶基羧酰胺、3-{1-氧代-4-(苄氨基)异吲哚啉-2-基}哌啶-2，6-二酮、2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-4-(苄氨基)异吲哚啉-1，3-二酮、N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}丙酰胺、N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}-3-吡啶基羧酰胺、N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}庚酰胺、N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基}-2-呋喃基羧酰胺、{N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨甲酰}乙酸甲酯、N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)戊酰胺、N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)-2-噻吩基羧酰胺、N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(丁氨基)羧酰胺、N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(辛氨基)羧酰胺和N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基]甲基}(苄氨基)羧酰胺。

还有其它具体免疫调节化合物属于美国专利申请公开号US2002/0045643、国际公开号WO 98/54170和美国专利号6,395,754中公开的异吲哚-亚胺类，这些专利文件都被引入本文作为参考。代表性的化合物如式III：

及其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映体、外消旋化合物和其立体异构体的混合物，其中：

X和Y之一为C＝O且另一为CH₂或C＝O；

R为H或CH₂OCOR’；

(i)R¹、R²、R³或R⁴中的每一个都独立地为卤素、1-4个碳原子的烷基或1-4个碳原子的烷氧基或(ii)R¹、R²、R³或R⁴之一为硝基或-NHR⁵，其余为氢；

R⁵为氢或1-8碳的烷基

R⁶为氢、1-8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

R’为R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹)；

R⁷为间-亚苯基或对-亚苯基或n为0-4的-(C_nH_2n)-；

R⁸和R⁹中的每一个都独立为氢或1-8个碳原子的烷基，或R⁸和R⁹一同为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-，其中X₁为-O-、-S-或-NH-；

R¹⁰为氢、1-8个碳原子的烷基或苯基；且

^*表示手性碳中心。

其它的代表性的化合物如下式：

其中：

X和Y之一为C＝O且另一为C＝O或CH₂；

(i)R¹、R²、R³或R⁴中的各自独立地为卤素、1-4个碳原子的烷基或1-4个碳原子的烷氧基或(ii)R¹、R²、R³或R⁴之一为-NHR⁵，其余为氢；

R⁵为氢或1-8个碳原子的烷基；

R⁶为氢、1-8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

R⁷为间-亚苯基或对-亚苯基或n为0-4的-(C_nH_2n)-；

R⁸和R⁹中的每一个都独立地为氢或1-8个碳原子的烷基，或R⁸和R⁹一同为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-，其中X₁为-O-、-S-或-NH-；

R¹⁰为氢、1-8个碳原子的烷基或苯基。

其它的典型化合物如下式：

其中：

X和Y之一为C＝O且另一为C＝O或CH₂；

(i)R¹、R²、R³或R⁴中的每一个都独立地为卤素、1-4个碳原子的烷基或1-4个碳原子的烷氧基或(ii)R¹、R²、R³和R⁴之一为硝基或被保护的氨基，其余为氢；且

R⁶为氢、1-8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

其它的代表性的化合物如下式：

其中：

X和Y之一为C＝O且另一为C＝O或CH₂；

(i)R¹、R²、R³或R⁴中的每一个独立地为卤素、1-4个碳原子的烷基或1-4个碳原子的烷氧基或(ii)R¹、R²、R³和R⁴之一为-NHR⁵，其余为氢；

R⁵为氢、1-8个碳原子的烷基或CO-R⁷-CH(R¹⁰)NR⁸R⁹，其中R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰如本文中所定义；且

R⁶为1-8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

化合物的具体例子如下式：

其中：

X和Y之一为C＝O且另一为C＝O或CH₂；

R⁶为氢、1-8个碳原子的烷基、苄基、氯或氟；

R⁷为间-亚苯基、对-亚苯基或n为0-4的-(C_nH_2n)-；

R⁸和R⁹中的每一个都独立地为氢或1-8个碳原子的烷基，或R⁸和R⁹一同为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH₂CH₂X¹CH₂CH₂-，其中X¹为-O-、-S-或-NH-；且

R¹⁰为氢、1-8个碳原子的烷基或苯基。

优选的免疫调节化合物是4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮。这些化合物可通过标准的合成方法制得(见例如，引入本文作为参考的美国专利号5,635,517)。这些化合物可从Celgene公司，Warren，NJ获得。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3-二酮具有如下的化学结构：

化合物3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮具有如下的化学结构：

在另一实施方案中，具体的免疫调节化合物包括3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的多种晶型，如2003年9月4日提交的美国临时申请号60/499,723和2003年9月3日提交的美国非临时申请号10/934,863中公开的A、B、C、D、E、F、G和H晶型，这两个文件都被引入本文作为参考。例如3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的A型晶是可通过非水溶剂体系得到的一种不溶解的晶体物质。A型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为8、14.5、16、17.5、20.5、24和26度处有明显的峰，且差示扫描量热法测熔解温度最大值约为270℃。A型晶不具有或具有微弱的吸湿性，且似乎是迄今为止发现的3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的热力学最稳定的无水晶型。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的B型晶是半水合晶体物质，其可通过多种溶剂体系制得，这些溶剂体系包括但不限于己烷、甲苯和水。B型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为16、18、22和27度处有明显的峰，且它在DSC曲线约146和268℃处吸热，而高温载台显微镜实验证实其在此温度脱水和熔解。互变研究显示B型晶在含水溶剂系统中转变为E型，在丙酮和其它无水系统中转变为其它晶型。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的C型晶是半溶剂化晶体物质，其可从溶剂中制得，这些溶剂例如但不限于丙酮。C型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为15.5和25度处有明显的峰，且差示扫描量热法测熔解温度最大值约为269℃。C型晶在低于85％的湿度下不吸湿，但在相对高的湿度下会转变为B型晶。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的D型晶是晶状的溶剂化多晶型物质，其可从乙腈和水的混合物中制备。D型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为27和28度处有明显的峰，且差示扫描量热法测熔解温度最大值约为270℃。D型晶没有或有微弱的吸湿性，但在相对高的湿度下通常会转变为B型晶。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的E型晶是二水化的晶状物质，通过将3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮与水混成浆状，再使3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮在丙酮∶水大约为9∶1的溶剂体系中缓慢蒸发，即可制得E型晶。E型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为20、24.5和29度处有明显的峰，且差示扫描量热法测熔解温度最大值约为26`9℃。E型晶在丙酮溶剂体系中会转变成C型晶，在THF溶剂体系中转变成G型晶。在含水溶剂体系中，E型晶似乎是最稳定的晶型。E型晶的去溶剂化实验显示，通过在约125℃加热约5分钟，E型晶会转变成B型晶。通过在175℃加热约5分钟，B型晶会转变成F型晶。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的F型晶是不溶性的晶状物质，其可以经E型晶脱水得到。F型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为19、19.5和25度处有明显的峰，且差示扫描量热法测熔解温度最大值约为269℃。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的G型晶是不溶性的晶状物质，其可通过将B型晶和E型晶在溶剂中混浆制得，这些溶剂例如但不限于四氢呋喃(THF)。G型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为21、23和24.5度处有明显的峰，且差示扫描量热法测熔解温度最大值约为267℃。

3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的H型晶是部分水合(约0.25摩尔)的晶状物质，其可通过将E型晶置于0％相对湿度的环境内制得。H型晶的X射线粉末衍射图中在2θ角约为15、26和31度处有明显的峰，且差示扫描量热法测熔解温度最大值约为269℃。

其它具体的免疫调节化合物包括，但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3基)异吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3基)异吲哚啉，如美国专利号5,874,448和5,955,476中说明的此类化合物，这两个文件被引入本文作为参考。代表性化合物如下式：

其中Y为氧或H²；且

R¹、R²、R³和R⁴中的每一个都独立地为氢、卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基或氨基。

其它具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利号5,798,368中提到的四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉，该专利被引入本文作为参考。代表性化合物如下式：

其中，R¹、R²、R³和R⁴中的每一个都独立地为卤素、1-4个碳原子的烷基或1-4个碳原子的烷氧基。

其它具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利号6,403,613中公开的1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉，该专利被引入本文作为参考。代表性的化合物如下式：

其中，

Y为氧或H₂；

R¹和R²中的一个为卤素、烷基、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、氰基或氨甲酰基；R¹和R²中的另一个独立于前一个，为氢、卤素、烷基、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、氰基或氨甲酰基；且

R³为氢、烷基或苄基。

化合物的具体例子如下式：

其中，R¹和R²中的一个为卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4碳原子的烷氧基、二烷基氨基(其中每个烷基具有1-4个碳原子)、氰基或氨甲酰基；

R¹和R²中的另一个独立于前一个，为氢、卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、烷基具有1-4个碳原子的烷基氨基、二烷基氨基(其中每个烷基具有1-4个碳原子)、氰基或氨甲酰基；且

R³为氢、1-4个碳原子的烷基或苄基。具体例子包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚啉。

其它代表性化合物如下式：

其中，R¹和R²中的一个为卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、二烷基氨基(其中每个烷基具有1-4个碳原子)、氰基或氨甲酰基；

R³为氢、具有1-4个碳原子的烷基或苄基。

具体例子包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚啉。

其它具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利号6,380,239和2004年7月28日提交的共同待决美国申请号10/900,270中说明的在吲哚啉环的4位或5位被取代的1-氧代和1，3-二氧代异吲哚啉，这两个文件被被引入本文作为参考。代表性的化合物如下式：

其中，当n不为0且R¹不同于R²时，命名为C^*的碳原子构成手性中心；X¹和X²之一为氨基、硝基、1-6碳的烷基或NH-Z，X¹或X²中的另一个为氢；R¹和R²的每一个都独立地为羟基或NH-Z；R³为氢、1-6碳的烷基、卤素或卤代烷基；Z为氢、芳基、1-6碳的烷基、甲酰基或1-6个碳的酰基；n为0、1或2；如X¹为氨基，n为1或2，则R¹和R²不同时为羟基；及其盐。

进一步的代表性的化合物如下式：

其中当n不为0且R¹不同于R²时，命名为C^*的碳原子构成手性中心；X¹和X²之一为氨基、硝基、1-6碳的烷基或NH-Z，且X¹或X²中的另一个为氢；R¹和R²的每一个都独立地为羟基或NH-Z；R³为1-6碳的烷基、卤素或氢；Z为氢、芳基、1-6碳的烷基或酰基；n为0、1或2。

具体例子包括但不限于2-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-4-氨甲酰基-丁酸和4-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-4-氨甲酰基-丁酸，其分别具有如下结构，及它们的药学可接受的盐、溶剂化物、前体药物和立体异构体：

和

其它代表性的化合物如下式：

其中当n不为0且R¹不同于R²时，命名为C^*的碳原子构成手性中心；X¹和X²之一为氨基、硝基、1-6个碳原子的烷基或NH-Z，且X¹和X²中的另一个为氢；R¹和R²的每一个都独立地为羟基或NH-Z；R³为1-6碳的烷基、卤素或氢；Z为氢、芳基、1-6碳的烷基或酰基；且n为0、1或2；及其盐。

具体例子包括但不限于4-氨甲酰基-4-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸、4-氨甲酰基-2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-丁酸、2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-4-苯羰基-丁酸和2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基}-戊二酸，其分别具有如下结构，及它们的药学可接受的盐、溶剂化物、前体药物和立体异构体：

化合物的其它具体例子如下式：

其中，X¹和X²之一为硝基或NH-Z，X¹和X²中的另一个为氢；

R¹和R²的每一个都独立为羟基或NH-Z；

R³为1-6碳的烷基、卤素或氢；

Z为氢、苯基、1-6碳的烷基或1-6碳的酰基；且

n为0、1或2；

如果X¹和X²之一为硝基且n为1或2，则R¹和R²不为羟基；且

如果-COR²和-(CH₂)_nCOR¹不相同，则命名为C^*的碳原子构成手性中心。其它代表性的化合物如下式：

其中X¹和X²之一为1-6碳的烷基；

R¹和R²中的每一个都独立地为羟基或NH-Z；

R³为1-6碳的烷基、卤素或氢；

Z为氢、苯基、1-6碳的酰基或1-6碳的烷基；且

n为0、1或2；且

如果-COR²和-(CH₂)_nCOR¹不相同，命名为C^*的碳原子构成手性中心。

还有其它的具体免疫调节化合物包括但不限于美国专利号6,458,810中说明的2位被2，6-二氧代-3-羟基哌啶-5-基取代的异吲哚啉-1-酮和异吲哚啉-1，3-二酮，该专利被引入本文作为参考。代表性的化合物如下式：

其中：

^*标注的碳原子构成手性中心；

X为-C(O)-或-CH₂-；

R¹为1-8个碳原子的烷基或-NHR³；

R²为氢、1-8个碳原子的烷基或卤素；且

R³为氢，

无取代的或被1-8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基或1-4个碳原子的烷氨基取代的1-8个碳原子的烷基，

3-18个碳原子的环烷基，

无取代的或被1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基或1-4个碳原子的烷氨基取代的苯基，

无取代的或被1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基或1-4个碳原子的烷氨基或-COR⁴取代的苄基，-COR⁴中，

R⁴为氢，

3-18个碳原子的环烷基，

无取代的或被1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基或1-4个碳原子的烷氨基取代的苯基，或

无取代或被1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的烷氧基、卤素、氨基或1-4个碳原子的烷氨基取代的苄基。

本文所述的这些免疫调节化合物可通过商业途径购得，也可用本文中提到的专利或专利公开文件中描述的方法制备得到。另外，光学纯的化合物可通过不对称合成制得，采用已知拆分剂、手性柱拆分制得，或用其它的标准合成有机化学技术制备得到。

除特别指出，本文中使用的术语“药学可接受的盐”包括此词所指的化合物的无毒的酸和碱加成盐。可接受的无毒的酸加成盐包括由本技术领域已知的有机和无机酸或碱形成的盐，包括例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲基磺酸、乙酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、山梨酸、乌头酸、水杨酸、邻苯二甲酸、栓子酸(embolic acid)、庚酸等。

在自然界中显酸性的化合物能够与各种药学可接受的碱形成盐。可用于制备这些酸性化合物的药学可接受的碱加成盐的碱是形成无毒碱加成盐的碱，即含有药学可接受的阳离子的盐，例如但不限于碱金属或碱土金属盐，尤其是钙、镁、钠或钾盐。适合的有机碱包括但不限于N，N-二苄乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、meglumaine(N-甲基葡糖胺)、赖氨酸和普鲁卡因。

除特别指出，本文中使用的术语“溶剂化物”指本发明的化合物或其盐，其进一步含有通过非共价分子间力结合起来的化学计量的或非化学计量的溶剂。当溶剂为水时，溶剂化物为水合物。

除特别指出，本文中使用的术语“前体药物”指化合物的衍生物，其经水解、氧化或在生物条件下反应(体外或体内)可以提供该化合物。前体药物的例子包括但不限于含有可生物水解基团的本发明免疫调节化合物的衍生物，可生物水解基团为例如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。前体药物的其他例子包括含有-NO、-NO₂、-ONO或-ONO₂基团的本发明免疫调节化合物的衍生物。前体药物通常可通过众所周知的方法来制备，如1 Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，172-178，949-982(Manfred E.Wolff ed.，第5版1995)和Design of Prodrugs(H.Bundgaard编，Elselvier，New York 1985)中描述的方法。

除特别指出，本文中使用的术语“可生物水解的酰胺”、“可生物水解的酯”、“可生物水解的氨基甲酸酯”、“可生物水解的碳酸酯”、“可生物水解的酰脲”、“可生物水解的磷酸酯”分别指化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲或磷酸酯，其抑或1)不影响此化合物的生物活性，但能够在体内赋予该化合物优良性质，如吸收、作用持续时间或作用起始；抑或2)不具有生物活性，但在体内转化为具有生物活性的化合物。可生物水解酯的例子包括，但不限于低级烷基酯、低级酰氧基烷基酯(如乙酰氧甲基酯、乙酰氧乙基酯、氨基羰基氧甲基酯、特戊酰氧甲基酯和特戊酰氧乙基酯)、内酯酯(lactonyl eater)(如酞基酯和硫酞基酯)、低级烷氧基酰氧烷基酯(如甲氧羰基-氧甲基酯、乙氧羰基氧乙基酯和异丙氧羰基氧乙基酯)、烷氧基烷基酯、胆碱酯和酰氨基烷基酯(如乙酰氨基甲基酯)。可生物水解酰胺的例子包括但不限于低级烷基酰胺、α-氨基酰胺、烷氧酰基酰胺和烷氨基烷羰基酰胺。可生物水解的氨基甲酸酯的例子包括但不限于低级烷基胺、取代的乙二胺、氨基酸、羟烷基胺、杂环胺和杂芳胺、聚醚胺。

除特别指出，本文中使用的术语“立体异构体”包括本发明的所有对映异构体/立体异构体纯的或对映异构体/立体异构体富集的化合物。

除特别指出，本文中使用的“立体异构体纯的”或“对映异构体纯的”指含有一种立体异构体且几乎不含其相反的立体异构体或对映异构体的化合物。例如，当化合物含有80％、90％或95％或更多的一种立体异构体和20％、10％或5％或更少的其相反立体异构体时，为立体异构纯或对映异构体纯的。在某些情况下，当化合物就手性中心而言为大约80％ee(对映体过量)或更多时，优选地，就一特定手性中心而言，等于或大于90％ee时，更优选地，就一特定手性中心而言，为95％ee时，本发明的化合物被认为具有旋光性或是立体异构体/对映异构体纯的(即基本为R-型或基本为S-型)。

除特别指出，本文中使用的术语“立体异构体富集的”或“对映异构体富集的”包括本发明化合物的外消旋混合物和立体异构体的其它混合物(如，R/S＝30/70、35/65、40/60、45/55、55/45、60/40、65/35和70/30)。本发明各种免疫调节化合物含有一个或多个手性中心，可以以对映异构体的外消旋混合物或非对映体的混合物存在。本发明包括这些化合物的立体异构体纯形式的应用，以及这些形式的混合物的应用。例如含有等量或不含量的本发明的一个具体免疫调节化合物的对映异构体的混合物可用于本发明的方法和组合物中。这些异构体可采用标准技术如手性柱或手性拆分剂来不对称合成或拆分。见，如，Jacques，J等，Enantiomers，Racemates and Resolutions(Wiley-Interscience，New York，1981)；Wilen，S.H等，Tetrahedron 33：2725(1977)；Eliel E.L.，Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill，NY，1962)；和Wilen，S.H.，Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions 第268页(E.L Eliel，Ed.，Univ.of Notre Dame Press，Notre Dame，IN，1972)。

应该注意的是，如果图示结构和结构名称之间存在差异，以图示结构为主。另外，如果结构或结构的一部分的立体化学没有用例如粗体或虚线标明，该结构或该结构的该部分应理解为包括它的所有立体异构体。

用来包被或灌注胶原生物纤维的生物活性化合物的量是可变的，其优选地根据需递送的具体生物活性化合物及期望达到的效果来决定。例如，当生物活性化合物为抗炎制剂时，胶原生物纤维表面或内部含有的此抗炎制剂的量应足以使鼓膜和/或鼓膜外周的一种或多种炎症症状或指征可测地减轻。

在各种实施方案中，本发明的胶原生物纤维可被至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、100、1250、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000或至少1000000纳克的生物活性化合物包被或灌注。在另一实施方案中，本发明的胶原生物纤维可被不多于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000或至少1000000纳克的生物活性化合物包被或灌注。

4.2.3胶原生物纤维的构型

胶原生物纤维可被制成有助于其在本发明的方法中使用的任何形状或构型。例如，胶原生物纤维可被制成能促进鼓膜穿孔闭合(特别是在鼓室成形术或鼓膜成形术中)的任何形状或构型。例如，胶原生物纤维能以不同的尺寸提供使得耳鼻喉科医生或其它最终用户能将其用于或将其剪裁成适合大小的片用于具体鼓膜的修复。胶原生物纤维可以如方形、矩形、圆形或椭圆形片提供，或通常可被剪裁使其与鼓膜的形状一致。虽然生物纤维可被裁剪成不同的尺寸，但在本方法的不同实施方案中，用于修复鼓膜的胶原生物蛋白纤维片的尺寸可为约1×1cm、1.5×1.5cm、2×2cm、2.5×2.5cm、3×3cm、3.5×3.5cm、4×4cm、4.5×4.5cm、5×5cm、1×1.5cm、1×2cm、1×2.5cm、1×3cm、1×3.5cm、1×4cm、1×4.5cm、1×5cm、1.5×2cm、1.5×2.5cm、1.5×3cm、1.5×3.5cm、1.5×4cm、1.5×4.5cm、2×2.5cm、2×3cm、2×3.5cm、2×4cm、2×4.5cm、2×5cm、2.5×3cm、2.5×3.5cm、2.5×4cm、2.5×4.5cm、2.5×5cm、3×3.5cm、3×4cm、3×4.5cm、3×5cm、3.5×4cm、3.5×4.5cm、3.5×5cm、4×4.5cm、4×5cm或4.5×5cm，或可为不小于或不大于1×1cm、1.5×1.5cm、2×2cm、2.5×2.5cm、3×3cm、3.5×3.5cm、4×4cm、4.5×4.5cm、5×5cm、1×1.5cm、1×2cm、1×2.5cm、1×3cm、1×3.5cm、1×4cm、1×4.5cm、1×5cm、1.5×2cm、1.5×2.5cm、1.5×3cm、1.5×3.5cm、1.5×4cm、1.5×4.5cm、2×2.5cm、2×3cm、2×3.5cm、2×4cm、2×4.5cm、2×5cm、2.5×3cm、2.5×3.5cm、2.5×4cm、2.5×4.5cm、2.5×5cm、3×3.5cm、3×4cm、3×4.5cm、3×5cm、3.5×4cm、3.5×4.5cm、3.5×5cm、4×4.5cm、4×5cm或4.5×5cm。特别优选尺寸为2×2cm、3×3cm、3×2cm、1×2cm、1×1cm或4×4cm的胶原生物纤维。此外，生物纤维可为一大张，最终用户可以将它剪裁成两块或更多块；也可为一卷或一条。

可用于本发明的治疗方法的胶原生物纤维在被提供给最终用户时，可以是干燥的或者预先用适当的生理学相容的医疗上有益的液体如盐水溶液将其预润湿。在一实施方案中，此溶液中含有一种或多种生物活性化合物，例如但不限于以上4.2.2节中所述的。优选地，将所述生物活性化合物置于胶原生物纤维之上或内部，这样在胶原生物纤维与鼓膜接触的过程中，大部分的生物活性化合物在某一点与鼓膜接触。

4.2.4胶原生物纤维的制备方法

用羊膜制成的胶原生物纤维可通过任何能保持膜成分(主要为胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白)的生物化学和结构特性的方法制得。优选的材料是在Hariri提交的美国申请公开号U.S.2004/0048796A1“胶原生物纤维及其制备方法和用途”中说明的，并通过其中公开的方法制备的胶原生物纤维，此文件被完整地引入本文。

尽管胶原生物纤维可由非人类哺乳动物的羊膜制得，但用于人类个体修复鼓膜的胶原生物纤维优选来源于人类胎盘。当用于治疗非人类哺乳动物的鼓膜时，优选地，使用的胶原生物纤维来源于该种动物的胎盘。

在优选实施方案中，用于本发明的方法的胎盘在新生儿分娩后尽可能快地取得。胎盘可立即使用，也可自分娩起保存2-5天，再做任何进一步的处理。通常将胎盘放血，即将出生后残留的脐带血排尽。优选地，在分娩前采用本领域技术人员所知的标准技术对孕妇进行传染性疾病的筛查，传染性疾病包括但不限于HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其它已知会污染胎盘组织的病毒病原体。

本发明的胶原生物纤维的一示例性制备方法包括以下步骤：

步骤I.将胎盘上的脐带除去；任选地，将羊膜与绒毛膜分开。在优选实施方案中，在切胎盘膜前，将羊膜与绒毛膜分开。在羊膜与绒毛膜及胎盘分离后，用例如剪刀从胎盘上剪除脐带残端。然后可将羊膜保存于无菌、优选缓冲的盐水溶液中，如0.9％无菌NaCl溶液。优选地，将羊膜保存于冰箱中，保存温度应至少为2℃。

步骤II.使羊膜几本上脱细胞；即几乎去除所有的细胞材料和细胞碎片(如所有肉眼可见的细胞材料和细胞碎片)。可采用该领域技术人员所知的任何脱细胞方法，但本发明中采用的羊膜脱细胞方法一般不会破坏组成生物纤维的蛋白的天然构象。羊膜的“充分脱细胞”优选地去除羊膜至少90％的细胞，更优选去除羊膜至少95％的细胞，最优选去除羊膜至少99％的细胞(如成纤维细胞、羊水细胞和绒毛细胞)。按照本发明方法脱细胞的羊膜是均一的薄膜，干燥状态下厚度在约2-150微米范围内不等，光滑(通过触摸可判断)且半透明。脱细胞处理可包括物理刮除(如用无菌细胞刮棒刮除)，并用无菌溶液漂洗。使用的脱细胞技术优选地不造成明显的羊膜解剖学破坏或对羊膜生物机械性质的改变。羊膜脱细胞操作优选包括使用含有去污剂的溶液，如非离子化去污剂、曲拉通X-100、阴离子去污剂、十二烷基硫酸钠。任何温和的(即无腐蚀性的)pH值6-8且低泡的阴离子去污剂都可用于羊膜脱细胞。在一具体实施方案中，将0.01-10％脱氧胆酸钠盐一水合物用于羊膜脱细胞。也可以采用酶溶液(如含有胰蛋白酶的缓冲液)进行脱细胞操作。

在生物纤维的制备过程中限制蛋白酶的活性是极优选的。裂解液、漂洗溶液和储存溶液中的添加剂，如金属离子螯合剂(如1，10-二氮菲和乙二胺四醋酸(EDTA))，形成对许多蛋白水解酶都不利的环境。为蛋白酶(如胶原蛋白酶)提供次优条件有助于在细胞裂解步骤中保护羊膜组分(如胶原)不发生降解。通过配制低渗裂解液以除去或限制溶液中可利用的钙离子和锌离子的量，可获得蛋白酶的次优条件。许多蛋白酶在钙离子和锌离子存在的环境里是有活性的，在没有钙离子和锌离子的环境里会失去大部分的活性。优选地，通过选择pH、减少钙离子和锌离子的可利用性、存在金属离子螯合剂以及使用胶原蛋白酶特异性抑制剂等条件，制备低渗裂解液，从而使该溶液最佳地裂解天然细胞而保护下方的羊膜不发生有害的蛋白水解降解。例如，低渗裂解液可含有水的缓冲溶液，pH5.5-8，优选pH7-8，不含有钙离子和锌离子，含有金属离子螯合剂如EDTA。此外，用低渗裂解液处理羊膜时，对温度和时间参数的控制也可用于限制蛋白酶的活性。

优选地，羊膜的脱细胞处理还限制新免疫学位点的产生。由于胶原的酶降解被认为会导致增强的免疫原性，本发明包括用酶如核酸酶来处理羊膜，这些酶有效地抑制细胞代谢、蛋白生成和细胞分裂，且将羊膜成分的蛋白水解最小化，由此保护羊膜的下部结构。适用于本发明方法的核酸酶为能有效消化天然细胞DNA和RNA的核酸酶，包括核酸外切酶和核酸内切酶。可用于本发明方法的核酸酶的非限制性例子包括能抑制细胞活性的核酸外切酶如DNA酶I(SIGMA化学品公司，St.Louis，Mo.)和RNA酶A(SIGMA化学品公司，St.Louis，Mo.)和能抑制细胞活性的核酸内切酶如EcoRI(SIGMA化学品公司，St.Louis，Mo.)和HindIII(SIGMA化学品公司，St.Louis，Mo.)。优选地，将所选的核酸酶加入到能使核酸酶具有最佳活性的含有离子(如镁、钙)的生理缓冲溶液中。优选地，由该领域的技术人员通过例行试验来确定缓冲溶液的离子浓度、处理温度和处理时间长度，以确保理想水平的核酸酶活性。优选低渗的缓冲溶液，以使核酸酶加速进入细胞内部。

在步骤I和II的另一个实施方案中，如上，胎盘经初步处理后，在盐水中简单冲洗，以除去胎盘表面的血液。然后，将胎盘浸在浓度为约0.1％-约10％的冷去氧胆酸溶液中，在一具体实施方案中，冷去氧胆酸溶液的浓度为约0.1％-约2.0％。将胎盘在此溶液中在约1-8℃下培养约5天到约6个月。在具体实施方案中，胎盘在溶液中浸泡时间为，例如，约5-约15天、约5-约30天、约5-约60天或长达约一年。在培养过程中，一般每2-5天就要将去氧胆酸溶液更换一次。在另一具体实施方案中，胎盘在0-约8℃下在浓度大约为1％的去氧胆酸溶液中浸泡约5-约15天。这个培养过程有两个目的。第一，在这段培养时间里，可以对胎盘材料和血液进行血清学试验，由此对那些试验结果不符合标准的胎盘不再进行进一步的处理。第二，更长时间的培养有助于除去上皮细胞和成纤维细胞，这能使花费在通过物理刮除将羊膜脱细胞上的时间显著缩短。通常刮除的时间从例如约40分钟减少到约20分钟。之后，将羊膜按下述方法干燥。

因此，在步骤I和II的一实施方案中，如上所述将羊膜从绒毛膜上分离，再简单冲洗羊膜。随后将羊膜在1％的去氧胆酸中在4℃下培养10天，每5天更换去氧胆酸溶液。对血清学测试结果进行评估，部分地参考结果，羊膜会被采用或被淘汰。一旦培养结束，通过刮除将仍然附着在羊膜上的上皮细胞和成纤维细胞去除。漂洗羊膜，随后按下述方法将羊膜干燥。

步骤III.在脱细胞处理后，清洗羊膜以确保除去去污剂和用于脱细胞的酶(如果使用的话)。该操作还能除掉可能有的细胞碎片。洗涤溶液可为去离子水或水性低渗缓冲液。优选地，将羊膜在去污剂中温和晃动(如在摇床上)15-120分钟以帮助脱细胞。在去污剂脱细胞处理后，还可对羊膜再次进行前面提到的物理脱细胞处理；只要羊膜还保持其完整性，如果需要，可重复物理脱细胞和去污剂脱细胞步骤，直至没有肉眼可见的细胞材料和细胞碎片残留。

在某些实施方案中，羊膜在脱细胞和清洗步骤后立即(即在30分钟内)被干燥。或者，当下一步处理操作并不立即进行时，可将羊膜在干燥前冷藏，如保存在约1-约20℃，优选约2-约8℃长达28天。当脱细胞羊膜保存超过3天但不到28天时，优选地，定期更换(如每1-3天)浸泡羊膜的无菌溶液。

在某些实施方案中，当羊膜在清洗后并没有冷藏时，应该在进行制备步骤IV之前将羊膜清洗至少3次。在其它实施方案中，当羊膜已被冷藏且已经更换过一次无菌溶液时，应该在进行制备步骤IV之前将羊膜清洗至少2次。在另一些实施方案中，当羊膜已被冷藏且已经更换过两次或多次无菌溶液时，应该在进行制备步骤IV之前将羊膜清洗至少1次。

在进行步骤IV之前，优选地，评估所有细菌学测试和血清学测试的结果，以确保所有测试结果都是阴性。

步骤IV.胶原生物纤维制备方法的本实施方案中的最后一步包括干燥本发明的脱细胞羊膜以制备胶原生物纤维。任何使羊膜成为扁平、干燥的胶原片的羊膜干燥方法都是可用的。但优选在真空下干燥羊膜。

在具体实施方案中，干燥本发明的脱细胞羊膜的示例性方法包括以下步骤：

装配脱细胞羊膜以进行干燥。将脱细胞羊膜从无菌溶液中取出，温和挤除多余的液体。然后，将脱细胞羊膜的胎侧(fetal side)朝下，如在托盘中，轻轻展开羊膜直至其平整。再将脱细胞羊膜翻转，使胎侧朝上，放在干燥支架上，优选塑料网格干燥支架(如，Quick Count^塑料帆布，Uniek公司，Waunakee，WI)。在其它实施方案中，干燥支架可以为任何耐高压加热的材料，包括但不限于不锈钢网。在最优选实施方案中，约0.5cm羊膜与干燥支架的边缘重叠。在某些实施方案中，将伸展到干燥支架之外与干燥支架重叠的羊膜部分裹在支架上，如用夹子或止血钳。一旦将羊膜固定在干燥支架上后，将无菌纱布放置在加热干燥机(或干胶器)(如型号583，Bio-Rad Laboratories，200 AlfredNobel Drive，Hercules，CA 94547)的干燥台上，使比塑料网支架上羊膜面积稍大的区域被覆盖。纱布层的总厚度优选不超过4×4折叠纱布的厚度。任何适用于干燥片状材料的加热干燥装置都是可用的。将干燥支架放在干燥台上的纱布上，使塑料支架的边缘超出纱布边缘，优选0.1-1.0cm，更优选0.5-1.0cm。在最优选实施方案中，将装有羊膜的干燥支架置于消毒纱布的上面，羊膜的胎侧朝上。在一些实施方案中，将另一塑料支网放在羊膜上。网格架和在其中干燥的膜的图示见图4。在另一实施方案中，将薄塑料片(如SW 182，透明PVC，AEP工业公司，South Hackensack，NJ 07606)或生物可相容的硅脂片放在覆盖了羊膜的网上，使得该片层充分超出所有的边缘。在这个实施方案中，不需要再用第二个网格架。

在可供选择的实施方案中，将羊膜置于一片或多片无菌Tyvek^材料上(如一片医疗包装用Tyvek^，Dupont Tyvek^，邮政信箱80705，Wilmington，DE19880-0705)，任选地，将一片Tyvek^置在膜上方(在放塑料薄膜前)。该可供选择的操作会制出更平滑的生物纤维(即材料轴向和垂直方向上不存在有差异的纤维压缩模式)，这对于某些应用是有益的，如用作细胞扩展的基质。

干燥羊膜。在一实施方案中，本发明包括在真空下加热干燥本发明的羊膜。尽管真空干燥可在约0-约60℃范围内的任何温度下进行，优选地在约35-约50℃范围内，最优选在约50℃干燥羊膜。应注意在超过50℃的温度下，预期会发生胶原的部分降解。干燥温度优选地用具有长探针的经校准的数字温度计来设置和测定。优选地，真空压设置为约-22英寸Hg。干燥步骤一直持续直至羊膜中的胶原基质经检测(如用湿度分析仪检测)含有少于3-12％的水。要达到这一点，可将羊膜加热真空干燥如约60分钟以获得脱水羊膜。在一些实施方案中，将羊膜干燥约30分钟到2小时，优选约60分钟。尽管不受任何理论或作用机理的限制，但相信低温加热设定和真空压力的组合可使羊膜达到脱水状态而又不使胶原蛋白变性。

在本发明干燥处理完成后，真空泵继续运行将羊膜冷却约两分钟。

羊膜的包装和储存。一旦将羊膜干燥，轻轻地将羊膜从干燥支架上揭起。“揭起”羊膜可包括以下步骤：当泵还在运行时，按住羊膜，从角上开始轻轻将塑料膜从羊膜上提开；将覆有羊膜的支架从干燥台上提起并放在切割板上，羊膜侧(amniotic membrane side)向上；在距支架边缘1-2毫米处沿着边缘切开羊膜；随后从支架上剥离羊膜。优选地，在该阶段，用无菌手套进行羊膜的处理。

将羊膜放置在无菌容器(如易撕包装袋)中并密封起来。用本发明中方法制得的生物纤维可于室温下储存一段比上文所述更长的时间。

在可供选择的实施方案中，发明提供了制备含有绒毛膜或同时含有绒毛膜和羊膜的胶原生物纤维的方法。上述方法可用于制备含有绒毛膜或同时含有绒毛膜和羊膜的胶原生物纤维。在一实施方案中，本发明包括下述胶原生物纤维的应用，该胶原生物纤维如下制备：提供含有羊膜和绒毛膜的胎盘；将羊膜与绒毛膜分离；将绒毛膜脱细胞。在具体实施方案中，该方法进一步包括清洗和干燥脱细胞的绒毛膜。在另一实施方案中，发明包括如下胶原生物纤维的应用，该胶原生物纤维如下制备：提供含有羊膜和绒毛膜的胎盘并将羊膜和绒毛膜脱细胞。在具体实施方案中，本方法进一步包括清洗和干燥脱细胞的羊膜和绒毛膜。

4.2.5胶原生物纤维的储存和处理

脱水胶原生物纤维在使用前，可于室温(如25℃)以诸如脱水片的形式储存。在具体实施方案中，胶原生物纤维可在至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃或至少29℃的温度储存。优选地，脱水形式的胶原生物纤维不冷藏。在一些实施方案中，胶原生物纤维可冷藏于约2-约8℃。用本发明方法制得的生物纤维可在任何特定温度下储存12个月或更长，而不会改变其生物化学或结构完整性(如不降解)，不会造成胶原生物纤维的生物化学或生物物理学性质的任何改变。生物纤维可储存几年而没有生物化学或结构完整性的变化(如不降解)，且胶原生物纤维的生物化学或生物物理学性质不改变。可将生物纤维储存在任何适于长期储存的容器中。优选地，将本发明的胶原生物纤维储存在无菌的双层易撕包装袋中。

胶原生物纤维可在使用前进行水合。可以用如消毒生理缓冲液使胶原生物纤维再水合。在具体实施方案中，无菌盐缓冲液是0.9％NaCl溶液。在一些实施方案中，无菌盐溶液是缓冲液。在某些实施方案中，本发明的胶原生物纤维的水合需要至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟或至少20分钟。在优选实施方案中，本发明的胶原生物纤维的水合在5分钟内完成。在另一优选实施方案中，本发明的胶原生物纤维的水合在10分钟内完成。在又一实施方案中，本发明的胶原生物纤维的水合用时不超过10分钟。一经水合，可将胶原生物纤维在溶液如无菌0.9％NaCl溶液中放置长达6个月，期间更换溶液，如每三天一次。

4.2.6灭菌

生物纤维的灭菌可用任何医学上适用的方法进行，优选地使用那些不会显著改变羊膜蛋白三级和四级结构的方法。例如，可用气体如二氧乙烯(ethylene dioxide)来灭菌。也可用辐射如伽玛射线来灭菌，且优选通过本领域技术人员已知的方法用电子束照射来灭菌，如Gorham，D.Byrom(编)，1991，Biomaterials，Stockton Press，New York，55-122。任何足以杀灭至少99.9％的细菌或其它潜在污染的生物体的辐射剂量都在本发明的范围内。在优选的实施方案中，用至少18-25kGy的剂量来实现对生物纤维的最终灭菌。

4.2.7层叠片

胶原生物纤维可以被层叠以在治愈过程中提供更大的硬度和耐久性(一般约为三个月)。胶原生物纤维可按下述方法层叠。

通常，通过将两层或更多层胶原生物纤维摞起并密封或干燥来将胶原生物纤维层叠。胶原生物纤维可以在干燥状态或再水合后进行层叠。或者，可在去除细胞(例如通过细胞刮除步骤)之后初始干燥之前将两层或多层的诸如羊膜层叠(见以下实施例)。如果在初始干燥前就进行层叠，可将两层或多层胶原生物纤维摞起再干燥，干燥可用例如冷冻干燥法，或在真空或非真空下适度加热干燥。优选地，使用的热度不能过强而导致胶原生物纤维的蛋白成分尤其是胶原蛋白破坏或分解。一般使用的热度不高于约70℃，优选不高于约60℃，更优选约50℃。层叠的时间根据例如被层叠的层数而有所不同，但对用于鼓膜修复所需尺寸的胶原生物纤维片的层叠在50℃需1-2小时。胶原生物纤维叠层片中优选含有2-6层胶原生物纤维。在一优选实施方案中，胶原生物纤维层叠片有两层，厚度约50微米。在另一实施方案中，胶原生物纤维层叠片有两层，厚度约20-60微米。优选地，层叠片中的各层来自同一批胶原生物纤维，即来自同一个胎盘。

胶原生物纤维也可以通过，例如，在两层或更多层胶原生物纤维或羊膜间使用粘合剂来层叠。这样的粘合剂优选是医学适用的，可以包括，例如，天然生物粘合剂如纤维蛋白胶、合成的粘合剂或它们的组合。粘合剂可进一步在层叠过程中从前体通过化学转化而成。

4.2.8干细胞

如本文中所述，鼓膜修复方法和用于该治疗方法的胶原生物纤维也可以含有干细胞或祖细胞。优选地，该治疗方法包括使用干细胞或祖细胞来促使鼓膜再生。优选地，生物胶原纤维含有间质或类间质干细胞，例如美国专利号5,486,359、6,261,549和6,387,367中所述的细胞，或含有胎盘来源的干细胞，如美国申请公开号2002/0123141、2003/0032179和2003/0180269中所述的细胞。但胶原生物纤维可含有来源于任何组织的干细胞或祖细胞，优选哺乳动物干细胞或祖细胞。胶原生物纤维可含有胚胎干细胞或胚胎生殖细胞。

可在将胶原生物纤维施用于鼓膜之前或在施用过程中进行胶原生物纤维和干细胞或祖细胞的组合。例如，可在即将施用于鼓膜之前，将干细胞或祖细胞的溶液置于胶原生物纤维的表面并使干细胞或祖细胞有充分的时间附着在胶原生物纤维上，从而制备胶原生物纤维层或片。或者，可在胶原生物纤维施用于鼓膜前约30分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、10、12、24或更多小时，将干细胞或祖细胞置于胶原生物纤维表面。置于胶原生物纤维表面的干细胞或祖细胞的数目是可变的，可以至少为1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹或1×10¹²；或不多于1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹或1×10¹²个干细胞或祖细胞。或者，在另一实施方案中，可在将胶原生物纤维施用于鼓膜后，将上述数量的干细胞或祖细胞置于胶原生物纤维表面。在另一实施方案中，将任何上述数量的干细胞直接施用于鼓膜上，并用胶原生物纤维覆盖鼓膜。在更一个具体实施方案中，将干细胞加入生理可接受的液体如盐溶液中，或将干细胞埋入生理可接受的凝胶如水凝胶中而施用，在其中干细胞或祖细胞可以维持并迁移。在与鼓膜接触前或接触后，可将干细胞与一种或多种分化调节制剂接触，如美国申请公开号2003/0235909、2004/0028660或国际申请公开号WO03/087333中说明的分化调节剂。将干细胞分化成例如表皮、中胚层和其它细胞类型的方法是本领域已知的，在例如美国申请公开号2004/0028660中说明。

4.3试剂盒

可用于本发明鼓膜修复方法的胶原生物纤维可以在包装纸或容器中提供，作为促进鼓膜修复的试剂盒的一部分。在具体实施方案中，胶原生物纤维在无菌的双层易撕包装中提供。在一个更具体的实施方案中，胶原生物纤维为约6×8cm。试剂盒可包括一或多片胶原生物纤维和任何其它可促进鼓膜修复的医疗设备、耗材或药物。试剂盒中的每片胶原生物纤维优选以单层或单片装在无菌容器或包装纸中，与试剂盒的其它物品分开。在另一实施方案中，试剂盒包括两片或多片独立包装的胶原生物纤维。在另一实施方案中，所述试剂盒包括胶原生物纤维的支撑物。在具体实施方案中，该支撑物可以是天然或人造材料。在其它具体实施方案中，所述支撑物是塑料膜，塑料片或可拉伸的塑料包装。在另一实施方案中，所述试剂盒包括一种或多种耗材。在具体实施方案中，所述耗材是绷带、用来消毒鼓膜周围皮肤的工具、棉球、手套或无菌布。在另一实施方案中，所述试剂盒包括抗生素软膏、乳剂或喷剂。在另一实施方案中，所述试剂盒包括一片胶原生物纤维和一种或多种伤口愈合剂。在具体实施方案中，所述伤口愈合剂是PDGF、TGF、透明质酸、纤维蛋白或纤维连接蛋白。

5.实施例

5.1实施例1：制备胶原生物纤维的方法

材料

以下材料用于制备胶原生物纤维。

材料/设备

·分娩记录副本

·材料/家庭健康史/同意书的副本

·来源条形码标签(捐赠人ID号码)

·采样号#(给新采集的材料指定的顺序号)

·组织处理记录(文档ID#ANT-19F)；保存每一批号加工处理的详细记录

·人胎盘(从分娩到处理操作开始的时间应小于48小时)

·无菌手术钳/止血钳

·无菌剪刀

·无菌解剖刀

·无菌Steri-Wipe酒精棉球

·无菌细胞刮棒(Nalgene NUNC公司R0896)

·无菌纱布(非无菌PSS 4416，经灭菌处理)

·无菌不锈钢漂洗盘

·消毒不锈钢处理盘

·消毒塑料箱

·无菌0.9％NaCl溶液(Baxter 2F7124)

·无菌水(Milli Q plus 09195或Baxter 2F7113)

·无菌样本容器(VWR 15704-014)

·个人防护装备(包括无菌和非无菌手套)

·标准洁净室

·预先制备的脱细胞溶液(D-Cell)；0.01-1％去氧胆酸钠一水合物

·消毒箱

·摇床(VWR型号100)

·计时器(VWR 21376890)

·消毒塑料网格架

·聚氯乙烯包装膜

·真空泵(Schuco-Vac 5711-130)

·干胶器(即加热干燥器，BioRad型号583)

·消毒不锈钢切割板

·包装袋

·无菌不锈钢尺(General Tools MFG.Co 1201)

·可追踪数字温度计(型号61161-364，Control公司)

·Accu-Seal自动封口机(Accu-Seal，型号630-1B6)

对孕妇在分娩时经过传染性疾病的筛查，例如HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其它可能污染待收集胎盘组织的病毒及细菌性病原体。只有那些其母亲在上述病原体测试结果为阴性或无反应性的捐赠者处收集的组织才会用于制备胶原生物纤维。

正常分娩后，胎盘、脐带和脐带血自行从收缩子宫中排出。分娩后收集胎盘、脐带和脐带血。这些原料被运到实验室，在有HEPA过滤系统的洁净室里，在无菌状态下对原料进行处理，HEPA过滤系统在处理前至少1个小时打开。处理样品的整个过程都带手套(无菌的或适当时非无菌的)进行。羊膜/绒毛膜的所有不使用的部分(废料)和处理组织的过程中产生的污染液体都尽快处理掉。

步骤I

用无菌Steri-Wrap布创建一个无菌区域，再将以下用于处理操作的工具和装置放在上面。

·无菌托盘包

·无菌细胞刮棒

·无菌解剖刀

·消毒处理盘

将无菌包装ID#记录在处理记录中。

将胎盘从运输容器中取出，放置在消毒不锈钢托盘上。用手术钳和剪刀将脐带在离胎盘约2英寸处剪断。将脐带放到另一个单独的无菌容器中等待进一步处理。容器上用组织ID条形码作标记；标明材料和存在的存储液(如基质类型)。有时，如果没有其它项目需要，会将脐带丢弃。

用手指从胎盘膜边缘开始钝性分离羊膜和绒毛膜。此操作在切割膜之前进行。

在羊膜与绒毛膜和胎盘的整个表面分开后，用剪刀沿着脐带残端将羊膜剪开，使其与胎盘分离。有些情况下，如果分离羊膜和绒毛膜无法避免撕裂组织，则将羊膜和绒毛膜作为一片从胎盘上切下，再将两者剥离。

将绒毛膜放在一个单独的样本容器中为其它项目备用。容器上用组织ID条形码作标记，标明材料和存在的存储液(如基质类型)，签字并注明日期。

如果羊膜仍有部分与胎盘连在一起，则将其从胎盘上剥离，用剪刀绕脐带周围剪下羊膜。将胎盘放回运输容器为其它项目备用。

将正确的数据记入组织加工记录。

羊膜保存在有无菌0.9％NaCl溶液的托盘里。优选地，从分娩起至进行处理的下一步骤前，将羊膜冷藏保存最多72小时。

步骤II

将羊膜从样本容器中取出，每次一片，放在消毒不锈钢托盘上。其它羊膜片在清洗前都放置在装有无菌水的无菌不锈钢托盘里。将处理盘中多余的羊膜片取出，放入单独的装有无菌水的不锈钢漂洗盘中。

如果羊膜被母源血或胎液/物明显污染，用无菌水漂洗羊膜，如需要，更换无菌水。

将羊膜的母体侧(maternal side)向上放置在处理盘上。用无菌细胞刮棒小心地尽量除去羊膜母体侧肉眼可见的污物和细胞物质(注意：此步骤操作应使用最小的压力以免撕裂羊膜)。用无菌水协助去除细胞和细胞碎片。在一个独立的无菌不锈钢漂洗盘中用无菌水进一步漂洗羊膜。

将羊膜翻转，使胎侧向上，并放回处理盘中，用无菌水漂洗。用细胞刮棒轻轻除去可见的细胞物质和碎片(注意：此步骤操作应使用最小的压力以免撕裂羊膜)。用无菌水协助去除细胞和细胞碎片。

在各轮次清除操作之间，用无菌水在另外的无菌漂洗盘里漂洗羊膜。如必要，可将清除操作进行多次(清除轮次)，以将羊膜两侧肉眼可见的细胞物质和碎片完全或尽量除去。每次漂洗之间，更换漂洗盘里的无菌水。

在每轮清除操作后，都用无菌水漂洗处理盘。

所有其它羊膜片都按同样的方法处理，并放入同一个容器中。附上组织ID条形码，标明材料和存在的存储液(如基质类型)，写明日期。

将正确的信息和日期记入组织处理记录。

步骤III

将羊膜从漂洗盘中(或从储存容器中)取出，用手指轻轻挤去多余的液体，并将膜放入无菌样本容器中。向容器中加D-Cell溶液至150毫升刻度，确保羊膜全部浸入液体中，并将容器闭合。

将样本容器放进摇床上的料箱里。启动摇床，使羊膜在D-Cell溶液中在6#设置状态下晃动最少15分钟，最多120分钟。

按步骤I的方法用新的无菌设备和消毒托盘建立起新的无菌区域。将无菌包装ID#记入加工记录。

振摇结束后，关闭摇床，将羊膜从容器中取出。将羊膜放入新的无菌不锈钢处理盘中。加入无菌0.9％NaCl溶液，盖住盘底。

用新的细胞刮棒将组织两侧的残留D-Cell和细胞材料(如果有的话)除去。此步骤如需要可反复数次以尽可能多地除去羊膜两侧整个表面上肉眼可见的残留细胞物质。在清除轮次之间，用无菌0.9％NaCl溶液在另外的漂洗盘中漂洗羊膜。在漂洗之间，更换漂洗盘中的无菌0.9％NaCl溶液。

在最后一轮清除操作完成后，用无菌0.9％NaCl溶液漂洗羊膜，将羊膜放进新的装有无菌0.9％NaCl溶液的无菌样本容器中。

所有其它羊膜片也按完全相同的方法处理。

当所有羊膜片都处理完并装入有无菌0.9％NaCl溶液的容器后，将容器放进摇床的料箱中在6#设置状态下振摇至少5分钟。振摇结束后，从样本容器中取出羊膜，更换容器中的无菌0.9％NaCl溶液，再将羊膜放回样本容器。

在样本容器上标上组织ID条形码和检疫标签。标明材料和存在的存储液(如基质类型)，签字并注明日期。将样本容器放进一个干净的拉链袋中，再放入冰箱(2-8℃)。

将所有正确的数据记入组织加工记录。

血清学检测结果出来后，在检疫标签的上方标上合适的标记(血清学检测阴性或仅作为研究使用)。将这些样本容器与留验的那些隔离开。

步骤IV

在进行步骤IV操作前，检查组织状态报告，确保所有得到的检测结果为阴性。

用无菌Steri-Wrap布建立消毒区域，按照步骤II和III的相同方式放置所有无菌和消毒工具及零件。

从冰箱中取出羊膜，放入新的无菌不锈钢处理盘中。加入无菌0.9％NaCl溶液盖住盘底。

用新的无菌细胞刮棒轻轻除去所有肉眼可见的细胞材料和碎片(如果有的话)(注意：此步骤操作应使用最小的压力，以免撕裂羊膜)。用无菌0.9％NaCl溶液协助除去细胞和碎片。

在装有无菌0.9％NaCl溶液的独立无菌不锈钢漂洗盘中漂洗羊膜。在清除轮次之间，更换无菌0.9％NaCl溶液。将羊膜放入新的无菌样本容器，向容器中加入新鲜的无菌0.9％NaCl溶液，并将容器放在摇床上在6#设置状态下振摇至少为5分钟。

将之前的步骤重复三次，在每次振摇间隙更换无菌0.9％NaCl溶液。将正确的数据记入组织加工记录。

从样本容器中取出羊膜，每次一片，用手指轻轻挤去多余的液体，将羊膜放在无菌处理盘上。轻轻将羊膜展平，让其胎侧向下。

用无菌剪刀剪裁消毒塑料布来制作支架。支架尺寸应在各维度均比羊膜片小约0.5cm。在装有无菌0.9％NaCl溶液的漂洗盘中漂洗支架。

将支架放在轻微拉伸的羊膜表面上，并对它轻压。必须使塑料支架的光滑面面向羊膜。

用解剖刀沿着支架将羊膜裁，使其超出支架边缘约0.5cm。将多余的羊膜放回样本容器中。

用夹子或止血钳将羊膜超出支架的部分裹在支架边缘，并将其放在此托盘的一边。

用同样的方法处理下一片羊膜。重要的是每台加热干燥器需干燥的总面积不超过300cm²。“架撑”羊膜片时，还未装支架的羊膜片还应保存在有无菌0.9％NaCl溶液的容器中。

用具有长探针的校准数字温度计来设置和测定干燥器的干燥温度。干燥温度设为50℃。将数据记入组织加工记录。

启动真空泵。

将无菌纱布放在加热干燥器的干燥台上，使其覆盖比装了支架的羊膜稍大的面积。非常重要的是确保纱布层的总厚度不超过4×4折叠纱布的厚度。

在纱布上放一张塑料支架网。塑料网的边缘应超出纱布边缘约0.5-1.0cm。

轻轻拿起装好支架的羊膜，使膜侧向上，放在干燥台上的塑料网上。重复这一操作，直至干燥台上的羊膜数量不能再多(不超过300cm²)。(注意：羊膜的胎侧应朝上)。

切好一片大小足以盖住干燥器整个干燥台再多一英尺的PVC包装膜。

运行真空泵，用塑料膜轻轻盖住干燥器的整个干燥台，在干燥台的两边都留出1/2英尺。小心地将塑料膜在羊膜和支架片上拉紧(即膜被真空“吸住”)，没有气体渗漏且组织区域上没有褶皱。然后盖上盖子。

真空泵设为约-22英寸Hg真空。真空计在真空循环2-3分钟后开始记录。将羊膜真空加热干燥约60分钟。干燥过程进行到约15-30分钟时，将加热干燥器里的无菌纱布层更换成新的。纱布层的总厚度必须不超过4×4折叠纱布的厚度。

更换纱布后，小心地将塑料膜在羊膜和支架片上拉紧，没有气体渗漏且膜区域上没有褶皱。

通过检查泵的压力计定时检查真空密闭性是否完好。干燥处理完成后，打开加热干燥器，泵继续运行，将羊膜冷却大约2分钟。

用无菌Steri-wrap和它下面的消毒不锈钢切割板建立新的无菌区域。此时带上无菌手套。泵继续运行，从角上开始轻轻将塑料膜从羊膜片上移开并用带手套的手压住羊膜片。轻轻将装有羊膜的支架从加热台上拿起，将羊膜侧朝上放到消毒不锈钢切割板上的无菌区域里。用解剖刀沿离支架边缘1-2mm的位置切开羊膜片。用戴手套(无菌手套)的手将羊膜放好。轻轻将羊膜从支架上慢慢剥离，然后放到切割板的无菌区域上。

用解剖刀或锋利的剪刀将羊膜片切割成特定大小的块。在包装前将所有的羊膜片切割并放在无菌区域。用一只手(非无菌)拿住包装袋，同时用另一只手(无菌)将一单片羊膜放进里层的易撕包装袋里。注意不要用无菌的手碰触袋子。将所有羊膜片装入内袋后，将袋密封。在袋的外部指定位置贴上有正确信息(如部分#、批#等)的标签。用相同方式处理所有的羊膜片。将有标签的密封易撕包装袋放在防水的拉链包中保存，直至运送到灭菌实验室或分销商。所有正确的数据都记入组织处理记录。

5.2实施例2：制备胶原生物纤维的另一方法

基本按照实施例1中的步骤I中所述，用实施方案1中的材料制备胎盘。在分娩时对孕妇进行传染性疾病的筛查，例如HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其它可能污染待采集胎盘的病毒或细菌性病原体。只有从那些其母亲对上述病原体检测结果为阴性或无反应性的捐助者处采集的组织被用于制备胶原生物纤维。

用消毒Steri-Wrap布创建无菌区域，再将以下用于处理操作的工具和设备放在上面：无菌托盘包、漂洗盘、不锈钢杯、夹子/止血钳、镊子、剪子、纱布。

从运输容器中取出胎盘，放在消毒不锈钢托盘上。用手术钳和剪刀在离胎盘约2英寸处剪断脐带。

从胎盘膜的边缘开始，用手指将羊膜与绒毛膜钝性分离。这一操作应在切割膜之前进行。将羊膜与绒毛膜和胎盘的整个表面分开后，沿脐带残端周围用剪刀将羊膜剪开，使其与胎盘分离。在某些情况下，如果在分开羊膜和绒毛膜时不能避免撕裂组织，则将羊膜和绒毛膜从胎盘上作为一整片切下，再将两者剥开。

将正确的数据记入组织加工记录。

用无菌0.9％NaCl溶液漂洗羊膜，以除掉血和胎液或物质。漂洗过程中，在必要时更换盐水溶液。

然后将羊膜放入装有含0.9％盐和1.0％去氧胆酸溶液的样本容器，在2-8℃下冷藏长达15天，每3-5天更换一次溶液。在培养过程中或培养结束时，评估前文提到的血清学结果。如果检测结果显示羊膜染有一种或多种病原体，则此羊膜不再用于进一步加工处理。但来自CMV阳性捐赠者的组织仍可用于制备生物纤维。

培养一旦结束，马上将羊膜从样本容器中取出，放入无菌托盘，用0.9％NaCl溶液漂洗三次，以除去组织里的去氧胆酸。将羊膜母体侧朝上，用细胞刮棒轻轻刮羊膜以去尽可能多的细胞物质。按需加入额外的盐水以协助除去细胞和细胞碎片。对羊膜胎侧也重复同样的步骤。在刮除之后进行漂洗，可将羊膜的两面重复刮洗多次以去除细胞和细胞材料。将刮净的羊膜装在有0.9％盐水溶液的独立容器里，于摇床上在6#设置状态振摇漂洗5-120分钟。更换盐水溶液，再次振摇漂洗。

漂洗完后，任选地，将羊膜放在拉链包中储存在冰箱中。

将刮净的羊膜胎侧朝下放在无菌处理盘上。用手轻揉羊膜，除去多余的液体，并将羊膜铺平。切割无菌塑料布使其各维度都比铺平的羊膜小约0.5cm。将塑料布在0.9％NaCl溶液中漂洗片刻。将塑料布的光滑面向下放在铺平的羊膜上，使羊膜的边缘露在外面。用解剖刀修剪羊膜，使其超出塑料布边缘约0.5cm。将多出的羊膜边缘包在塑料布上。对每一台标准真空加热干燥器，待干燥组织的总面积不应超过300cm²。

将无菌纱布放在真空加热干燥器里。将薄塑料网放在纱布上，使其边缘超出纱布约0.5-10.0cm。再将羊膜和塑料布放进真空加热干燥器，放在塑料网上，组织侧朝上，用一片PVC包装膜盖住羊膜。将干燥器设为50℃，且定时检查温度，以确保温度维持在50℃±1℃。随后启动真空泵，将其设置为约-22英寸Hg真空。干燥可进行60分钟。

将干燥羊膜储存在密封的塑料容器中备用。

5.3实施例3：使用胶原生物纤维的鼓膜成形术

病人患有听力丧失，且其骨传导强于气传导。鼓膜肉眼检查显示鼓膜上有一个约占鼓膜面积40％的边缘孔，是由棉签过度深入耳道造成的。估算鼓膜的面积，从2×2cm²的生物纤维上剪下一片形状与鼓膜相近的胶原生物纤维叠层片。胶原生物纤维叠层片含有来自同批的(即来源于同一胎盘的)5层胶原生物纤维。将修剪好的胶原生物纤维经过耳道放在鼓膜上穿孔的位置并轻压，其中该穿孔的边缘被刚刚清创并可能有分泌物渗出。分泌物的天然粘性有助于生物材料粘附在鼓膜上。暂时用明胶海绵填充耳道，使胶原生物纤维层叠片固定在鼓膜上。

5.4实施例4：使用胶原生物纤维的鼓膜成形术

病人患有听力丧失，且其骨传导强于气传导。鼓膜肉眼检查显示鼓膜上有一个由以前的感染形成的约占鼓膜面积40％的边缘孔。在耳后褶皱后方约1cm处切开一个耳后切口。在乳突上的骨膜上切一个T-形口。将骨膜提起，并向前移进耳道。用鸭嘴起子或圆刀提起耳道皮肤和骨膜。放置一个自固定牵开器以向前拉伸耳道皮肤及耳。设计耳道切口以形成侧向的耳道皮瓣或血管带。先在环形区域的12-8点钟位置(右耳)沿侧向切出约2-5cm的水平切口。然后切出垂直切口。将皮瓣向前提，直至到达穿孔。再用明胶海绵填充咽鼓管和中耳。然后，将胶原生物纤维叠层片处理成穿孔所需的合适大小。将胶原生物纤维叠层片置于前部残存鼓膜下方，后部耳道壁上。然后，将环状区域放回原来的位置，小心地将血管带移至它的解剖位置。在残存耳鼓、移植物和血管带上放上明胶海绵，并将外耳道涂满抗生素软膏。用吸收性缝线皮下缝合耳后切口，并给乳突敷上敷料，以提供轻微压力和保护。

5.5实施例5：胶原生物纤维层叠片

将用上述方法制成的胶原生物纤维按照以下方法层叠。在一些例子中，将干燥的胶原生物纤维在无菌0.9％NaCl溶液中再水合1小时、10分钟到1小时、30分钟。通过上述全部操作步骤(实施例1)制备干燥胶原生物纤维，然后将其层叠。制备湿的胶原生物纤维直至步骤III，然后将其层叠。切割固定架后，将再水合组织胎侧向下放置，将固定架放在组织上，切割组织，使在支架周围留有约1cm的边缘，从而将再水合组织固定。用细胞刮棒将1cm的边缘叠在支架的边缘上。重复以上操作以添加其它的湿胶原生物纤维片。然后，将层叠好的生物纤维放在干胶器里，干燥至几乎无水(水分含量＜20％重量)。再将层叠片切成2×6cm的样品。

对不同批次的胶原生物纤维层叠片评估如下。对含有2、3、5或8层的干燥(DT)和湿润(WT)胶原生物纤维层叠片的规格进行测量，如表1所示：

表1

	厚度(微米)	长度(毫米)	宽度(毫米)	重量(毫克)
	厚度(微米)	长度(毫米)	宽度(毫米)	重量(毫克)	DT2DT3WT2WT3WT5WT8	29±1232±220±1515±531±5115±26	20.0±0.320.5±0.120.2±0.219.6±0.119.8±0.420.3±0.2	5.2±0.15.2±0.25.0±0.35.1±0.35.3±0.15.1±0.4	0.87±0.021.26±0.110.93±0.170.9±0.042.06±0.24.92±0.56

样品检测结果显示在室温干燥条件下叠层之后两天没有出现脱层现象。在室温搅动的0.9％盐水中保存十天，胶原生物纤维层叠片仍没有脱层现象。

对更大尺寸的胶原生物纤维层叠片样品进行层叠耐久性和脱层叠抵抗力的测试。将上表中列出的1×2cm的样本(即DT2、DT3、WT2、WT3、WT5和WT8)放进有5毫升磷酸盐缓冲盐水的有盖培养皿(Petri dishes)中。将样本放在定轨摇床上于95转/分振摇约24小时。在振摇过程中或之后的简单处理中，都没有观察到样本的脱层现象。

等同内容

本发明并不受限于本文中具体实施方案的范围。实际上，本领域技术人员很容易根据前文的描述和附图对本发明做各种修改。这些修改也在所附权利要求的范围内。

本文引用了各种出版物、专利和专利申请文件，它们的公开内容都是作为参考内容完整地引入本文。

Claims

1.修复畸形鼓膜的方法，包括将所述鼓膜与胶原生物纤维接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述畸形是穿孔。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述畸形是鼓膜塌陷、与胆脂瘤相关的畸形、内缩袋或由鼓室硬化引起的畸形。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述穿孔是由外伤引起的。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述穿孔是作为外科手术操作的一部分而引起的。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述接触足以闭合穿孔。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述穿孔在形成后两个月内没有自然愈合。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原生物纤维是单层羊膜。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原生物纤维是两层或多层羊膜的层叠片。

10.根据权利要求11所述的方法，其中所述层叠片有两层，厚度为约20至60微米。

11.根据权利要求12所述的方法，其中所述层叠片的厚度为约50微米。

12.根据权利要求2所述的方法，其中所述胶原生物纤维在与鼓膜接触时含有低于约20％重量的水分。

13.根据权利要求2所述的方法，其中所述胶原生物纤维在与鼓膜接触前是水合的。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原生物纤维的厚度为约2至约150微米。

15.根据权利要求20所述的方法，其中所述胶原生物纤维的厚度为约1至约40微米。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原生物纤维被装在双层易撕袋中提供。

17.胶原生物纤维，其中所述胶原生物纤维是具有两层或更多层的层叠片。

18.根据权利要求23的胶原生物纤维，其中所述胶原生物纤维是两层的层叠片且其平均厚度为约20至约60微米。

19.根据权利要求24的胶原生物纤维，其中所述胶原生物纤维平均厚度为约50微米。

20.根据权利要求23的胶原生物纤维，尺寸测量为约3×3cm或更小。