PT1957633E - Imunomodulação utilizando células estaminais da placenta - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Imunomodulação utilizando células estaminais da placenta"

1. CAMPO DO INVENTO São aqui divulgados métodos de utilização de células estaminais da placenta para modular o sistema imunitário e respostas imunitárias a antigénios. São também aqui divulgados compostos compreendendo células estaminais da placenta para utilização em imunomodulação, e métodos de transplante de tecidos e órgãos compreendendo a administração de células estaminais da placenta para impedir ou inibir rejeição mediada pelo sistema imunitário.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

As células estaminais humanas são células precursoras totipotentes ou pluripotentes capazes de gerar uma variedade de linhagens de células humanas maduras. Existem provas que demonstram que as células estaminais podem ser empregues para repovoar muitos, se não todos, os tecidos e restaurar a funcionalidade fisiológica e anatómica.

Muitos tipos diferentes de células estaminais de mamífero foram caracterizados. Ver, p. ex., Caplan et ai., Patente U.S. No. 5486359 (células estaminais mesenquimatosas humanas); Boyse et al., Patente U.S. No. 5004681 (células estaminais e progenitoras hematopoéticas fetais e neonatais); Boyse et al. , U.S. 5192553 (o mesmo); Beltrami et al., Cell 114(6): 763-766 (2003) (células estaminais cardíacas); Forbes et al., J. Pathol. 197(4): 510-518 (2002) (células estaminais hepáticas). Sangue do cordão umbilical e células nucleadas totais derivadas de sangue do cordão foram utilizados em transplantes para restaurar, parcialmente ou totalmente, a função hematopoética em pacientes que tinham sido submetidos a terapia ablativa.

Zhang Yi, et al., "Experimental Hematology", vol. 32, no. 7 (Julho 2004) e Li Chang Dong, et al., Cell Research -Xibao Yanjiu, vol. 15, no. 7 (Julho de 2005) pretendem divulgar uma população isolada de células a partir da 2 1 957 633/ΡΤ placenta, que pode suprimir a proliferação de células T num ensaio de MLR. Roth I, et al., The Journal of Experimental Medicine, vol. 184, No. 2 (1 de Agosto de 1996) pretendem divulgar citotrofoblastos que expressam HLA-G, segregam citocinas e IL-10. McMaster Μ. T., et al., Journal of Immunology, The Williams and Wilkins Co., vol. 154, no. 8 (15 de Abril de 1995) pretendem divulgar um estudo sob a produção de proteina HLA-G através de trofoblastos humanos in vivo e in vitro para avaliar a relevância da expressão de HLA-G para a diferenciação de citotrofoblastos. Clark David A., et al., American Journal of Reproductive Immunology, vol. 50, No. 3 (Setembro de 2003) pretendem divulgar que os trofoblastos da placenta expressam CD200. Poetgens A. J. G., et al., Placenta, W.B. Saunders, vol. 24, no. 4 (Abril de 2003) pretendem divulgar um método para isolamento de trofoblastos da placenta que expressam CD105 e HLA-I. Nenhum destes documentos descreve ou sugere o invento reivindicado. A placenta é uma fonte particularmente atraente de células estaminais. Como as placentas de mamífero são abundantes e são normalmente descartadas como resíduo hospitalar, representam uma fonte única de células estaminais medicamente úteis. O presente invento proporciona tais células estaminais da placenta isoladas, populações de células estaminais da placenta, e métodos de utilização das mesmas.

3. SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona células estaminais da placenta para utilização num método para supressão de uma resposta imunitária, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T estimulada por células B de apresentação do antigénio do vírus de Epstein-Barr, em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos, e em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e 0CT-4; ou expressam CD73, CD105, e HLA-G; e em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária contra um aloenxerto, uma doença auto-imune, diabetes, lúpus eritematoso, artrite reumatóide, ou esclerose 3 1 957 633/ΡΤ múltipla. Ο presente invento proporciona ainda um método de produção de uma população de células estaminais da placenta in vitro compreendendo (a) ensaio de uma pluralidade de células da placenta num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR); e (b) selecção da referida pluralidade de células estaminais da placenta se a referida pluralidade de células estaminais da placenta suprimir de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ estimulada por células B de apresentação do antigénio do virus de Epstein-Barr, em que as referidas células estaminais da placenta aderem a um substrato; em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos; e em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4; ou expressam CD73, CD105, e HLA-G. Além disso, o presente invento proporciona também uma população de células estaminais da placenta isolada produzida de acordo com o método do presente invento. 0 presente invento proporciona ainda uma população isolada de células estaminais da placenta, em que as referidas células estaminais da placenta não são trof oblastos, em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T estimulada por células B de apresentação do antigénio do virus de Epstein-Barr. São aqui divulgados métodos de imunossupressão utilizando pluralidades de células estaminais da placenta ou células estaminais do cordão umbilical, populações de células estaminais da placenta ou células estaminais do cordão umbilical, e composições compreendendo e/ou produzidas através das células estaminais. São também aqui divulgadas composições, incluindo composições compreendendo células estaminais da placenta ou células estaminais do cordão umbilical, possuindo propriedades imunossupressoras. São também aqui divulgadas populações de células da placenta ou células estaminais do cordão umbilical seleccionadas com base na sua capacidade de modular uma resposta imunitária, e composições possuindo propriedades imunomoduladoras. 4 1 957 633/ΡΤ

Num aspecto, é aqui divulgado um método de supressão ou redução de uma resposta imunitária compreendendo o contacto de uma pluralidade de células imunitárias com uma pluralidade de células estaminais da placenta durante um tempo suficiente para as referidas células estaminais da placenta suprimirem de forma detectável uma resposta imunitária, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4; expressam CD73, CD105, e HLA-G; expressam CD73 e CD105 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende a pluralidade de células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides; e/ou expressam OCT-4 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende a pluralidade de células estaminais da placenta, quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides. Noutra concretização especifica, a referida pluralidade de células imunitárias são células T ou células NK (assassinas naturais). Numa concretização mais específica, as referidas células T são células T CD4+. Noutra concretização mais específica, as referidas células T são células T CD8+. Noutra concretização específica, o referido contacto é realizado in vitro. Noutra concretização específica, o referido contacto é realizado in vivo. Numa concretização mais específica, o referido contacto in vivo é realizado num sujeito mamífero, p. ex., um sujeito humano. Noutra concretização mais específica, o referido contacto compreende a administração das referidas células da placenta por via intravenosa, intramuscular, ou num órgão no referido sujeito (p. ex., um pâncreas). 0 método de supressão de uma resposta imunitária, particularmente in vivo, pode compreender adicionalmente a administração ao referido sujeito (p. ex., a um mamífero), p. ex., de uma proteína inflamatória anti-macrófagos (MIP)-l ou anticorpo anti-MIP-1 , em que o referido anticorpo é administrado numa quantidade suficiente para causar uma queda detectável na 5 1 957 633/ΡΤ quantidade de MIP-1 ou anti-MIP-1 , p. , exro sangue do referido sujeito.

Numa concretização mais específica do método, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD200 e HLA-G expressam também CD73 e CD105, isto é, são CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, as referidas células da placenta são CD34“, CD38~ ou CD45“. Numa concretização mais específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38~, CD45”, CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, a referida pluralidade de células estaminais da placenta facilita o desenvolvimento de um ou mais corpos semelhantes a embrióides a partir de uma população isolada de células da placenta compreendendo as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais especifica do método, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD73, CD105, e CD200 são também HLA-G+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38” ou CD45~. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD34“, CD38~ e CD45~. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD34“, CD38~, CD45“, e HLA-G+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta facilitam o desenvolvimento de um ou mais corpos semelhantes a embrióides de uma população isolada de células da placenta compreendendo as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais especifica do método, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD200 e OCT-4 expressam também CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são HLA-G+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34-, CD38~ ou CD45”. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38~ e CD45-. Numa concretização mais 6 1 957 633/ΡΤ específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34“, CD3 8~, CD45”, CD73 + , CD105+ e HLA-G+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides de uma população isolada de células da placenta compreendendo células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais específica, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD73, CD105, e HLA-G são também CD34”, CD38” ou CD45~. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD34”, CD38~ e CD45”. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são 0CT-4+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD200+. Numa concretização mais específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38~, CD45”, 0CT-4+ e CD200+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides de uma população isolada de células da placenta compreendendo as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais especifica, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD73 e CD105, e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, são também CD34~, CD38~ ou CD45”. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são 0CT-4+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD200+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são 0CT-4+, CD200+, CD34”, CD38~ e CD45“.

Noutra concretização mais específica, as referidas células estaminais da placenta que expressam OCT-4, e 7 1 957 633/ΡΤ facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, são também CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38~ e CD45~. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD200+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD73+, CD105+, CD200 + , CD34“, CD38~ e CD45~.

Noutra concretização especifica do método de redução ou supressão de uma resposta imunitária, a referida resposta imunitária é doença de enxerto-versus-hospedeiro. Noutra concretização especifica, a referida resposta imunitária é uma doença auto-imune, p. ex., diabetes, lúpus eritematoso, ou artrite reumatóide.

Noutra concretização especifica do método, a referida pluralidade de células imunitárias é também colocada em contacto com uma pluralidade de células não placentárias. Tais células não placentárias podem, p. ex., compreender células CD34+. Numa concretização mais especifica, as referidas células CD34+ são células progenitoras hematopoéticas de sangue periférico, células progenitoras hematopoéticas de sangue do cordão, ou células progenitoras hematopoéticas de sangue da placenta. Noutra concretização especifica, as referidas células não placentárias compreendem células estaminais mesenquimatosas. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais mesenquimatosas são células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea. Noutra concretização especifica, as referidas células não placentárias estão contidas dentro de um aloenxerto. 0 método pode empregar tantas células estaminais da placenta consoante as necessárias para efectuar uma supressão detectável de uma resposta imunitária. Por exemplo, a pluralidade de células estaminais da placenta processadas para contactar a pluralidade de células imunitárias pode compreender lxlO5 células estaminais da placenta, lxlO6 8 1 957 633/ΡΤ células estaminais da placenta, lxlO7 células estaminais da placenta, ou lxlO8 células estaminais da placenta, ou mais. São também aqui divulgados métodos de produção de populações de células compreendendo células estaminais da placenta seleccionadas com base na sua capacidade de modular (p. ex., suprimir) uma resposta imunitária. Numa concretização, por exemplo, o invento proporciona um método de selecção de uma população de células estaminais da placenta in vitro compreendendo (a) ensaio de uma variedade de células da placenta num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR); e (b) selecção da referida pluralidade de células estaminais da placenta se a referida pluralidade de células estaminais da placenta suprimir de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ estimulada por células B de apresentação do antigénio do vírus de Epstein-Barr, em que as referidas células estaminais da placenta: (i) aderem a um substrato, e (ii) expressam CD200 e HLA-G, ou expressam CD73, CD105, e CD200, ou expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G. É também aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção, a partir de uma pluralidade de células, de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD200 e HLA-G, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR (reacção linfocitária mista); e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular. É também aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção, a partir de uma pluralidade de células, de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73, CD105, e CD200, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ de uma MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular. É também aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD200 e OCT-4, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ de uma MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da 9 1 957 633/ΡΤ placenta de outras células para formar uma população celular. É aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção, a partir de uma pluralidade de células, de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73 e CD105, (c) formam corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e (d) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ de uma MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular. É aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção, a partir de uma pluralidade de células, de células da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73, CD105, e HLA-G, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ de uma MLR; e o isolamento das referidas células da placenta de outras células para formar uma população celular. É aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção, a partir de uma pluralidade de células, de células da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam OCT-4, (c) formam corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e (d) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ de uma MLR; e o isolamento das referidas células da placenta de outras células para formar uma população celular.

Em concretizações especificas de qualquer uma das reivindicações aqui, as referidas células T e as referidas células estaminais da placenta estão presentes na referida MLR a uma razão de, p. ex., cerca de 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 2:2, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 ou 1:20, de preferência 5:1.

Noutra concretização especifica, os métodos compreendem a selecção de células que expressam ABC-p. Noutra concretização especifica, os métodos compreendem a selecção de células exibindo pelo menos uma caracteristica especifica para uma célula estaminal mesenquimatosa. Numa concretização mais especifica, a referida caracteristica especifica para uma célula estaminal mesenquimatosa é a expressão de CD29, expressão de CD44, expressão de CD90, ou expressão de uma combinação das anteriores. Noutra concretização especifica 10 1 957 633/ΡΤ dos métodos, a referida selecção é alcançada utilizando um anticorpo. Noutra concretização especifica, a referida selecção é alcançada utilizando citometria de fluxo. Noutra concretização especifica, a referida selecção é alcançada utilizando contas magnéticas. Noutra concretização especifica, a referida selecção é alcançada através de separação de células activada por fluorescência. Noutra concretização especifica dos métodos acima, a referida população celular é expandida.

As células estaminais da placenta utilizadas nos métodos aqui podem ser derivadas da placenta inteira, ou de qualquer parte da placenta. Por exemplo, em várias concretizações, as referidas células estaminais da placenta são derivadas principalmente, ou apenas, do âmnio, ou âmnio e córion, ou são derivadas de perfusato placentário colhido durante perfusão da placenta. Em concretizações especificas, as referidas células estaminais da placenta suprimem a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ em pelo menos 50%, 70%, 90%, ou 95% numa MLR em comparação com uma quantidade de proliferação de células T na referida MLR na ausência das referidas células estaminais da placenta. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta suprimem adicionalmente de forma detectável uma actividade das células assassinas naturais (NK). São aqui divulgadas populações isoladas de células compreendendo células estaminais da placenta produzidas através de qualquer um dos métodos aqui descritos para selecção de populações de células da placenta imunomoduladoras, em que tal população foi identificada como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR. Por exemplo, numa concretização, é aqui divulgada uma população celular compreendendo células estaminais da placenta isoladas, em que as referidas células estaminais da placenta: (a) aderem a um substrato; (b) expressam CD200 e HLA-G, ou expressam CD73, CD105, e CD200, ou expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G, ou expressam CD73 e CD105, e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta, quando a referida população é cultivada sob 11 1 957 633/ΡΤ condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, ou expressam OCT-4 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta, quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, em que tal população foi identificada como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR. É aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD200 e HLA-G, e (c) foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR. É aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73, CD105, e CD200, e (c) foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ de uma MLR. É aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD200 e OCT-4, e (c) foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR. É aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73 e CD105, (c) formam corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e (d) foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR. É aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73, CD105, e HLA-G, e (c) foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR. É aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam OCT-4, (c) formam corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e (d) foram identificadas como suprimindo de 12 1 957 633/ΡΤ forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8 + numa MLR.

Numa concretização mais específica da composição, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD200 e HLA-G expressam também CD73 e CD105, isto é, são CD73+ e CD105+. Noutra concretização específica, as referidas células da placenta são CD34“, CD38” ou CD45~. Numa concretização mais específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38“, CD45”, CD73+ e CD105+. Noutra concretização específica, a referida pluralidade de células estaminais da placenta facilita o desenvolvimento de um ou mais corpos semelhantes a embrióides a partir de uma população isolada de células da placenta compreendendo as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais específica da composição, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD73, CD105, e CD200 são também HLA-G+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38~ ou CD45“. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD347-, CD38~ e CD45~. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38~, CD45“, e HLA-G+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta facilitam o desenvolvimento de um ou mais corpos semelhantes a embrióides a partir de uma população isolada de células da placenta compreendendo as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais específica da composição, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD200 e OCT-4 expressam também CD73+ e CD105+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são HLA-G+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38“ ou CD45~. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34”, CD38~ e CD45~. Numa concretização mais 13 1 957 633/ΡΤ específica, as referidas células estaminais da placenta sao CD34“, CD38~, CD45~, CD73 + , CD105+ e HLA-G+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides a partir de uma população isolada de células da placenta compreendendo células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais específica da composição, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD73, CD105, e HLA-G são também CD34~, CD38” ou CD45”. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38” e CD45”. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais da placenta são 0CT-4+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD200+. Numa concretização mais específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34~, CD38~, CD45”, 0CT-4+ e CD200+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides a partir de uma população isolada de células da placenta compreendendo as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização mais específica da composição, as referidas células estaminais da placenta que expressam CD73 e CD105, e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, são também CD34~, CD38^ ou CD45”. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são 0CT-4+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD200+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são 0CT-4+, CD200 + , CD34”, CD38“ e CD45~. 14 1 957 633/ΡΤ

Noutra concretização mais específica da composição, as referidas células estaminais da placenta que expressam OCT-4, e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, são também CD73+ e CD105+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD34“, CD38~ e CD45“. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD200+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são CD73 + , CD105 + , CD200 + , CD34', CD38“ e CD45~. São aqui divulgadas composições imunomoduladoras. Numa concretização, é aqui divulgada uma composição compreendendo sobrenadante de uma cultura de qualquer uma das populações de células aqui descritas. Noutra concretização, é aqui divulgada uma composição compreendendo meio de cultura de uma cultura de células estaminais da placenta, em que as referidas células da placenta (a) aderem a um substrato; (b) expressam CD200 e HLA-G, ou expressam CD73, CD105, e CD200, ou expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G, ou expressam CD73 e CD105, e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta, quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, ou expressam OCT-4 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta, quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides; e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR (reacção linfocitária mista), em que a referida cultura de células estaminais da placenta foi cultivada no referido meio durante 24 horas ou mais. Numa concretização específica, a referida composição compreende uma pluralidade das referidas células estaminais da placenta. Noutra concretização específica, a referida composição compreende uma pluralidade de células não placentárias. Numa concretização mais específica, as 15 1 957 633/ΡΤ referidas células não placentárias compreendem células CD34+. As células CD34+ podem ser, p. ex., células progenitoras hematopoéticas do sangue periférico, células progenitoras hematopoéticas do sangue do cordão, ou células progenitoras hematopoéticas de sangue da placenta. Noutra concretização especifica, as referidas células não placentárias compreendem células estaminais mesenquimatosas. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais mesenquimatosas são células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea. Noutra concretização especifica, a composição compreende ainda um anticorpo anti-MIP-1 ou anti-MIP-1

Noutra concretização especifica, qualquer uma das composições anteriores compreende uma matriz. Numa concretização mais especifica, a referida matriz é uma armação tridimensional. Noutra concretização mais especifica, a referida matriz compreende colagénio, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, ou vitronectina. Noutra concretização mais especifica, a matriz é uma membrana amniótica ou um biomaterial derivado de membrana amniótica. Noutra concretização mais especifica, a referida matriz compreende uma proteína da membrana extracelular. Noutra concretização mais específica, a referida matriz compreende um composto sintético. Noutra concretização mais específica, a referida matriz compreende um composto bioactivo. Noutra concretização mais específica, o referido composto bioactivo é um factor de crescimento, uma citocina, um anticorpo, ou uma molécula orgânica de menos de 5000 daltons. São aqui divulgadas populações de células estaminais criopreservadas, p. ex., uma população celular compreendendo células estaminais da placenta, em que a população celular é imunomoduladora, que são aqui descritas. Por exemplo, é aqui divulgada uma população de células estaminais da placenta CD200+, HLA-G+ que foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR), em que as referidas células foram criopreservadas, e em que a referida população está contida dentro de um recipiente. É aqui divulgada uma população de células estaminais da placenta CD73+, CD105+, CD200+ que foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção 16

1 957 633/PT linfocitária mista (MLR), em que as referidas células estaminais foram criopreservadas, e em que a referida população está contida dentro de um recipiente. É aqui divulqada uma população de células estaminais da placenta CD200+, 0CT-4+ que foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR), em que as referidas células estaminais foram criopreservadas, e em que a referida população está contida dentro de um recipiente. É aqui divulgada uma população de células estaminais da placenta CD73+, CD105+ que foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR), em que as referidas células foram criopreservadas, e em que a referida população está contida dentro de um recipiente, e em que as referidas células estaminais facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas com uma população de células da placenta sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides. É aqui divulgada uma população de células estaminais da placenta CD73+, CD105+, HLA-G+ que foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR), em que as referidas células foram criopreservadas, e em que a referida população está contida dentro de um recipiente. É aqui divulgada uma população de células estaminais da placenta 0CT-4+ que foram identificadas como suprimindo de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR), em que as referidas células foram criopreservadas, em que a referida população está contida dentro de um recipiente, e em que as referidas células estaminais facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas com uma população de células da placenta sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Numa concretização especifica de qualquer uma das populações criopreservadas anteriores, o referido recipiente é um saco. Em várias concretizações especificas, a referida população compreende cerca de, pelo menos, ou no máximo lxlO6 das referidas células estaminais, 5xl06 das referidas células estaminais, lxlO7 das referidas células estaminais, 5xl07 das referidas células estaminais, lxlO8 das referidas células 17 1 957 633/ΡΤ estaminais, 5χ108 das referidas células estaminais, lxlO9 das referidas células estaminais, 5xl09 das referidas células estaminais, ou lxlO10 das referidas células estaminais. Noutras concretizações especificas de qualquer uma das populações criopreservadas anteriores, as referidas células estaminais foram passadas cerca de, pelo menos, ou não mais de 5 vezes, não mais de 10 vezes, não mais de 15 vezes, ou não mais de 20 vezes. Noutra concretização especifica de qualquer uma das populações criopreservadas anteriores, as referidas células estaminais foram expandidas dentro do referido recipiente.

3.1 DEFINIÇÕES

Tal como aqui utilizado, o termo "SH2" refere-se a um anticorpo que se liga a um epitopo no marcador CD105. Assim, as células que são referidas como SH2+ são CD105+.

Tal como aqui utilizado, os termos "SH3" e SH4" referem-se a anticorpos que se ligam a epitopos presentes no marcador CD73. Assim, as células que são referidas como SH3+ e/ou SH4+ são CD73+.

Tal como aqui utilizado, o termo "célula estaminal isolada" significa uma célula estaminal que é substancialmente separada de outras células não estaminais do tecido, p. ex., placenta, do qual a célula estaminal é derivada. Uma célula estaminal é "isolada" se pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou pelo menos 99% das células não estaminais com as quais a célula estaminal está naturalmente associada são removidas da célula estaminal, p. ex., durante a colheita e/ou cultura da célula estaminal.

Tal como aqui utilizado, o termo "população isolada de células" significa uma população de células que são substancialmente separadas de outras células do tecido, p. ex., placenta, do qual a população de células é derivada. Uma população de, p. ex., células estaminais é "isolada" se pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou pelo menos 99% das células com as quais a população de células estaminais está naturalmente associada são removidas da população de células 18 1 957 633/ΡΤ estaminais, ρ. ex., durante a colheita e/ou cultura da população de células estaminais.

Tal como aqui utilizado, o termo "célula estaminal da placenta" refere-se a uma célula estaminal ou célula progenitora que é derivada de uma placenta de mamífero, independentemente da morfologia, dos marcadores da superfície celular, ou do número de passagens após uma cultura primária, que adere a um substrato de cultura de tecidos (p. ex., plástico de cultura de tecidos ou uma placa de cultura de tecidos revestida com fibronectina). 0 termo "célula estaminal da placenta" tal como é aqui utilizado não se refere, no entanto, a um trofoblasto. Uma célula é considerada uma "célula estaminal" se a célula mantiver pelo menos um atributo de uma célula estaminal, p. ex., a capacidade de se diferenciar em pelo menos um outro tipo de célula, ou semelhante.

Tal como aqui utilizado, uma célula estaminal é "positiva" para um determinado marcador quando esse marcador é detectável. Por exemplo, uma célula estaminal da placenta é positiva para, p. ex., CD73 porque CD73 é detectável em células estaminais da placenta numa quantidade superior de forma detectável ao fundo (em comparação com, p. ex., um controlo de isotipo). Uma célula é também positiva para um marcador quando esse marcador pode ser utilizado para distinguir a célula de pelo menos um outro tipo celular, ou pode ser utilizado para seleccionar ou isolar a célula quando presente ou expresso pela célula.

Tal como aqui utilizado, "imunomodulação" e "imunomodulador" significa causar, ou possuir, a capacidade de causar uma alteração detectável numa resposta imunitária, e a capacidade de causar uma alteração detectável numa resposta imunitária.

Tal como aqui utilizado, "imunossupressão" e "imunossupressor" significa causar, ou possuir, a capacidade de causar uma redução detectável numa resposta imunitária, e a capacidade de causar uma supressão detectável de uma resposta imunitária. 19 1 957 633/ΡΤ

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1: Viabilidade das células estaminais da placenta de perfusão (A), âmnio (B), córion (C), ou placa cório-amniótica (D), ou células estaminais do cordão umbilical (E).

Os números no eixo dos XX designam a placenta a partir da qual foram obtidas células estaminais. FIG. 2: Percentagem de células HLA ABC“/CD45“/CD34~ /CD133+ de perfusão (A), âmnio (B) , córion (C) , ou placa cório-amniótica (D) , ou células estaminais do cordão umbilical (E) tal como determinado através de FACSCalibur. Os números no eixo dos XX designam a placenta a partir da qual foram obtidas as células estaminais. FIG. 3: Percentagem de células HLA ABC~/CD45“/CD34~ /CD133+ de perfusão (A), âmnio (B) , córion (C) , ou placa cório-amniótica (D) , ou células estaminais do cordão umbilical (E), tal como determinado através de FACS Aria. Os números no eixo dos XX designam a placenta a partir da qual foram obtidas as células estaminais. FIG. 4: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de perfusato placentário. FIG. 5: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD4 4, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de âmnio. FIG. 6 : Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de córion. FIG. 7: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD4 4, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de placa cório-amniótica. FIG. 8 : Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de cordão umbilical. 20 1 957 633/ΡΤ FIG. 9: Expressão média de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de perfusão (A), âmnio (B), córion (C), placa cório-amniótica (D) ou cordão umbilical (E). FIGS. 10A e 10B: A reacção linfocitária mista (MLR) é um modelo para a resposta imunitária ingénua, e é inibida por células estaminais da placenta. A partir dos portões de células T "vivas" fechados e CD8+ e CD4+, a percentagem de células com éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE)Baixo foi monitorizada (Figs. 10A e 10B, respectivamente). Esta percentagem aumentou após uma MLR de seis dias, e com a adição de células estaminais da placenta, o efeito é invertido tanto no compartimento de células T CD8+ como CD4+. FIG. 11: Células estaminais derivadas de placenta da placa cório-amniótica (CA) e estroma de cordão umbilical (CU) suprimem a alo-MLR. A MLR é realizada com células T CD4+ ou células T CD8+, ou quantidades iguais de células T CD4+ e CD8+. Abcissa: percentagem de supressão de proliferação. FIG. 12: As células estaminais da placenta e células estaminais do cordão umbilical inibem a alo-MLR. Um ensaio de seis dias em poços de placas de 96 poços de fundo redondo. Células da placenta:Células T:Células dendríticas = aproximadamente 1:10:1. As células estaminais foram obtidas a partir de cório-amniótica (CA), membrana amniótica (AM) ou cordão umbilical (CU). FB = fibroblasto. BM = células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea. FIG. 13: Células estaminais da placenta de diferentes dadores suprimem a alo-MLR em diferentes extensões. A figura compara a supressão numa MLR através de células estaminais da placenta de dois dadores de placenta, designadas 61665 e 63450. As células estaminais da placenta 63450 parecem suprimir a MLR num grau maior que as células estaminais da placenta 61665. FIG. 14: Ensaio de regressão de dezassete dias e o ensaio de regressão de células estaminais da placenta modificado. O eixo dos xx representa o número de células 21 1 957 633/ΡΤ estaminais da placenta adicionadas ao ensaio. 0 número de sobreviventes de LCL CD23+ (linha celular linfoblastóide, uma linha de células B transformadas criada artificialmente) é medido no eixo dos YY. FIG. 15: Supressão pelas células estaminais da placenta da proliferação de células T no ensaio de regressão de seis dias. Um ensaio de regressão foi montado utilizando células T coradas com CFSE. Após seis dias, a proliferação de células T foi avaliada. É mostrada a supressão relativa da proliferação de células T por células estaminais de cório-amniótica (CA), do cordão umbilical (CU), da membrana amniótica (AM), ou da medula óssea (MO). FIG. 16: Variação percentual na supressão na introdução de inserção transwell na MLR, separando as células da placenta de células T mas permitindo a troca de meio de cultura. As células estaminais do cordão umbilical a 25000, 50000, 75000 ou 100000 por reacção mostraram tanto um grau relativamente elevado de supressão como um grau relativamente elevado de necessidade de contacto célula a célula nos titulos elevados para alcançar a supressão. FIG. 17: Células estaminais de estroma de cordão umbilical (CU) adicionadas a 12500 (CU OP/TW 12,5) a 100000 (CU OP/TW 100) foram separadas da MLR através de uma membrana (TW) ou em contacto com a MLR (OP) . Foi utilizado um número igual de células T CD4+ e células T CD8+, e foi calculada a percentagem de supressão da MLR (% CFSEBaixa = 89%) . FIG. 18: A relação entre a dose de células estaminais da placenta e a dependência de contacto célula a célula não é linear. As alterações na supressão da MLR na introdução da inserção são calculadas a partir dos valores dados na FIG. 17. FIG. 19: Supressão diferencial de respostas de células T por células estaminais da placenta e BMSC. O grau de supressão conferido por PDAC ou BMSC foi calculado comparando a percentagem de células T de MLR no portão CFSEBa, mais de 70%, em relação às células MLR aderentes. A MLR foi separada das células aderentes (transwell), ou foi realizada num poço 22 1 957 633/ΡΤ aberto (aberto) . 0 eixo dos XX dá o número de células aderentes, em milhares, adicionado a 500000 células T e 50000 DC. A razão de células aderentes para células T vai de 1:5 a 1:40. FIG. 20: Requisitos diferenciais de contacto célula a célula para imunossupressão por células estaminais da placenta e células estaminais derivadas da medula óssea. A partir dos dados de supressão mostrados na FIG. 15, a dependência de contacto foi calculada e apresentada contra a razão de células aderentes/células T (n=3, excepto CU: n=2) . FIG. 21: Células T reguladoras não são necessárias para supressão de células T por PDAC. Um ensaio de regressão foi realizado utilizando PBMC totais (gráficos vermelho e azul) ou PBMC sem células T reguladoras (gráfico verde), ambas coradas com CFSE, adição de PDAC de UC nas mesmas condições (gráficos azul e verde). N=l. FIG. 22: Células CFSEe1 proliferam numa MLR secundária. A partir de uma MLR de PDAC utilizando células coradas com CFSE, células T CFSEe1 foram isoladas num FACS Aria. As células foram utilizadas numa MLR. N=1. FIG. 23: O sobrenadante de células estaminais de MLR suprimida não suprime a MLR a uma substituição de 75%. MLR de CU (PUC) , CA (PAC) , e BMSC (PBM) foram realizadas, e todas suprimiram a MLR mais de 50%. O sobrenadante das experiências foi utilizado para substituir de 10 a 150 μΐ dos 200 μΐ de meio utilizado para uma MLR fresca. Como controlos, meio de células T e CA (T/CA) ou co-culturas de células T e células estaminais derivadas da medula óssea (T/MO) foram também utilizadas do mesmo modo (N=2). FIGS. 24A, 24B: A pré-incubação de células T e células aderentes não influencia a supressão de MLR. Células T de 2 dadores foram utilizadas em duas experiências independentes. DC maduras (A) ou células T CD3+ coradas com CFSE (B) foram incubadas com células estaminais do cordão umbilical (CU) ou células estaminais derivadas da medula óssea para o número indicado de dias antes da adição de DC (no dia 0, A) ou células T CD3+ CFSE+ (B) , iniciando assim a MLR. As MLR de 23 1 957 633/ΡΤ células aderentes prosseguiram assim durante seis dias, como normal. N=2. FIGS. 25A, 25B: A. A secreção de MIP-1 e MIP-1 na MLR, e MLR com células estaminais da placenta ou células estaminais derivadas da medula óssea, correlaciona-se inversamente com a supressão de MLR. B: Dados de CFSE de células T e células NK da mesma experiência. Os sobrenadantes foram colhidos a partir da MLR mostrada na FIG. 14B, e analisados para MIP-1 e MIP-1 . B: A MLR foi realizada tal como descrito, e, em média, foram observados 55% (células T) ou 83% (células NK) de células CFSEBaixo. Foi calculado o efeito supressor da adição de células estaminais. N=2 (parte NK: N=1). FIG. 26: No ensaio de regressão modificado e nos sobrenadantes de MLR, foi medida a MCP-1. A supressão por células estaminais da placenta da MLR e o ensaio de regressão correlacionam-se com a secreção do quimioatractor MCP-1. CA: células estaminais de placa cório-amniótica. CU: células estaminais do cordão umbilical. Barras claras: resultados do ensaio de MLR. Barras escuras: resultados do ensaio de regressão. Eixo dos YY: pg de MCP-1 na solução de ensaio. FIG. 27: Medição de IL-β no sobrenadante da MLR modificada e ensaio de regressão. A supressão por células estaminais da placenta da MLR e o ensaio de regressão correlacionam-se com a secreção de IL-6. CA: células estaminais da placa cório-amniótica. CU: células estaminais do cordão umbilical. Barras claras: resultados do ensaio de MLR. Barras escuras: resultados do ensaio de regressão. Eixo dos YY: pg de IL-β na solução de ensaio.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento proporciona células estaminais da placenta para utilização num método para supressão de uma resposta imunitária, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T estimulada por células B de apresentação do antigénio do virus de Epstein-Barr, em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos, e em que 24 1 957 633/ΡΤ pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4; ou expressam CD73, CD105, e HLA-G; e em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária contra um aloenxerto, uma doença auto-imune, diabetes, lúpus eritematoso, artrite reumatóide, ou esclerose múltipla. O presente invento proporciona ainda um método de produção de uma população de células estaminais da placenta in vitro compreendendo (a) ensaio de uma pluralidade de células da placenta num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR); e (b) selecção da referida pluralidade de células estaminais da placenta se a referida pluralidade de células estaminais da placenta suprimir de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ estimulada por células B de apresentação do antigénio do vírus de Epstein-Barr, em que as referidas células estaminais da placenta aderem a um substrato; em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos; e em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4; ou expressam CD73, CD105, e HLA-G. Além disso, o presente invento proporciona também uma população isolada de células estaminais da placenta produzida de acordo com o método do presente invento. O presente invento proporciona ainda uma população isolada de células estaminais da placenta, em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos, em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T estimulada por células B de apresentação do antigénio do vírus de Epstein-Barr.

5.1 IMUNOMODULAÇÃO UTILIZANDO CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA É aqui divulgada a modulação, p. ex., supressão, da actividade, p. ex., proliferação, de uma célula imunitária, ou pluralidade de células imunitárias, através do contacto da ou das células imunitárias com uma pluralidade de células estaminais da placenta. Numa concretização, é aqui divulgado 25 1 957 633/ΡΤ um método de supressão de uma resposta imunitária compreendendo o contacto de uma pluralidade de células imunitárias com uma pluralidade de células estaminais da placenta durante um tempo suficiente para que as referidas células estaminais da placenta suprimam de forma detectável uma resposta imunitária, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR).

As células estaminais da placenta são, p. ex., as células estaminais da placenta aqui descritas (ver Secção 5.2). As células estaminais da placenta utilizadas para imunossupressão podem ser derivadas ou obtidas a partir de uma única placenta ou de múltiplas placentas. As células estaminais da placenta utilizadas para imunossupressão podem também ser derivadas de uma única espécie, p. ex., da espécie do receptor pretendido ou da espécie das células imunitárias cuja função se pretende reduzir ou suprimir, ou podem ser derivadas de múltiplas espécies.

Uma "célula imunitária" no contexto deste método significa qualquer célula do sistema imunitário, particularmente células T e células NK (assassinas naturais). Assim, em várias concretizações do método, as células estaminais da placenta são colocadas em contacto com uma pluralidade de células imunitárias, em que a pluralidade de células imunitárias é, ou compreende, uma pluralidade de células T (p. ex., uma pluralidade de células T CD3+, células T CD4+ e/ou células T CD8+) e/ou células assassinas naturais. Uma "resposta imunitária" no contexto do método pode ser qualquer resposta de uma célula imunitária a um estimulo normalmente percebido por uma célula imunitária, p. ex., uma resposta à presença de um antigénio. Em várias concretizações, uma resposta imunitária pode ser a proliferação de células T (p. ex., células T CD3 + , células T CD4+ e/ou células T CD8+) em resposta a um antigénio estranho, tal como um antigénio presente numa transfusão ou enxerto, ou a um auto-antigénio, tal como numa doença auto-imune. A resposta imunitária pode também ser uma proliferação de células T contidas dentro de um enxerto. A resposta imunitária pode também ser qualquer actividade de uma célula 26 1 957 633/ΡΤ assassina natural (NK), a maturação de uma célula dendritica, ou semelhante. A resposta imunitária pode também ser uma actividade local, especifica do tecido ou do órgão, ou um efeito sistémico de uma actividade de uma ou mais classes de células imunitárias, p. ex., a resposta imunitária pode ser doença de enxerto versus hospedeiro, inflamação, formação de tecido de cicatriz relacionado com inflamação, uma condição auto-imune (p. ex., artrite reumatóide, diabetes Tipo I, lúpus eritematoso, etc.) e semelhantes. "Contacto" neste contexto engloba a colocação das células estaminais da placenta e células imunitárias juntas num único recipiente (p. ex., placa de cultura, balão, frasco, etc.) ou in vivo, por exemplo, no mesmo indivíduo (p. ex., mamifero, por exemplo, humano). Numa concretização preferida, o contacto é durante um tempo suficiente, e com um número suficiente de células estaminais da placenta e células imunitárias, para que uma alteração numa função imunitária das células imunitárias seja detectável. De maior preferência, em várias concretizações, o referido contacto é suficiente para suprimir a função imunitária (p. ex., proliferação de células T em resposta a um antigénio) em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%, em comparação com a função imunitária na ausência das células estaminais da placenta. Tal supressão num contexto in vivo pode ser determinada num ensaio in vitro (ver abaixo); isto é, o grau de supressão no ensaio in vitro pode ser extrapolado, para um determinado número de células estaminais da placenta e um número de células imunitárias num indivíduo receptor, para um grau de supressão no indivíduo. São aqui divulgados métodos de utilização de células estaminais da placenta para modular uma resposta imunitária, ou a actividade de uma pluralidade de um ou mais tipos de células imunitárias, in vitro. O contacto das células estaminais da placenta com uma pluralidade de células imunitárias pode compreender a combinação das células estaminais da placenta com células imunitárias no mesmo espaço físico de modo a que pelo menos uma porção da pluralidade de células estaminais da placenta interaja com pelo menos uma porção da pluralidade de células imunitárias; mantendo as células estaminais da placenta e as células 27 1 957 633/ΡΤ imunitárias em espaços físicos separados com meio comum; ou pode compreender o contacto de meio de uma, ou de uma cultura de células estaminais da placenta ou células imunitárias com o outro tipo de célula (por exemplo, obtendo meio de cultura de uma cultura de células estaminais da placenta e ressuspendendo células imunitárias isoladas no meio). Num exemplo específico, o contacto é uma Reacção Linfocitária Mista (MLR).

Tal contacto pode, por exemplo, ocorrer numa configuração experimental concebida para determinar a extensão à qual uma determinada pluralidade de células estaminais da placenta é imunomoduladora, p. ex., imunossupressora. Uma tal configuração experimental pode ser, por exemplo, uma reacção linfocitária mista (MLR) ou um ensaio de regressão. Procedimentos para realizar a MLR e os ensaios de regressão são bem conhecidos na técnica. Veja-se, p. ex., Schwarz, "The Mixed Lymphocyte Reaction: An In vitro Test for Tolerance". J. Exp. Med. 127(5): 879-890 (1968); Lacerda et ai., "Human Epstein-Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17 Scid/Scid Mice", J. Exp. Med. 183: 1215-1228 (1996). Numa concretização preferida, é realizada uma MLR em que uma pluralidade de células estaminais da placenta é colocada em contacto com uma pluralidade de células imunitárias (p. ex., linfócitos, por exemplo, linfócitos T CD3 + , CD4+ e/ou CD8 + ) . A MLR pode ser utilizada para determinar a capacidade imunossupressora de uma pluralidade de células estaminais da placenta. Por exemplo, uma pluralidade de células estaminais da placenta pode ser testada numa MLR compreendendo a combinação de células T CD4+ ou CD8+, células dendríticas (DC) e células estaminais da placenta numa razão de cerca de 10:1:2, em que as células T são coradas com um corante tal como, p. ex., CFSE que se divide nas células filhas, e em que as células T são deixadas proliferar durante cerca de 6 dias. Uma pluralidade de células estaminais da placenta é imunossupressora se a proliferação de células T aos 6 dias na presença de células estaminais da placenta for reduzida de forma detectável em comparação com a proliferação de células 28 1 957 633/ΡΤ Τ na presença de DC e ausência de células estaminais da placenta. Numa tal MLR, as células estaminais de placenta são descongeladas ou colhidas de cultura. Cerca de 20000 células estaminais da placenta são ressuspensas em 100 μΐ de meio (RPMI 1640, tampão HEPES 1 mM, antibióticos, e soro humano reunido a 5%) , e deixadas aderir ao fundo de um poço durante 2 horas. Células T CD4+ e/ou CD8+ são isoladas a partir de contas magnéticas Miltenyi de células mononucleares de sangue periférico total. As células são coradas com CFSE, e um total de 100000 células T (células T CD4+ apenas, células T CD8+ apenas, ou quantidades iguais de células T CD4+ e CD8+) é adicionado por poço. O volume no poço é levado até 200 μΐ e a MLR é deixada prosseguir.

Numa concretização, portanto, é aqui divulgado um método de supressão de uma resposta imunitária compreendendo o contacto de uma pluralidade de células imunitárias com uma pluralidade de células estaminais da placenta durante um tempo suficiente para que as referidas células estaminais da placenta suprimam de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização, as referidas células estaminais da placenta utilizadas na MLR representam uma amostra ou aliquota de células estaminais da placenta de uma população maior de células estaminais da placenta.

As populações de células estaminais da placenta obtidas a partir diferentes placentas, ou diferentes tecidos dentro da mesma placenta, podem diferir na sua capacidade de modular uma actividade de uma célula imunitária, p. ex., podem diferir na sua capacidade de suprimir a actividade de células T ou a proliferação ou a actividade de células NK. É assim desejável determinar, antes de usar, a capacidade de uma determinada população de células estaminais da placenta para imunossupressão. Tal capacidade pode ser determinada, por exemplo, através do teste de uma amostra da população de células estaminais da placenta numa MLR ou num ensaio de regressão. Numa concretização, é realizada uma MLR com a amostra, e é determinado um grau de imunossupressão no ensaio atribuível às células estaminais da placenta. Este grau de imunossupressão pode ser atribuído à população de células estaminais da placenta que foi amostrada. Assim, a MLR pode 29

1 957 633/PT ser utilizada como um método para determinação da capacidade absoluta e relativa de uma determinada população de células estaminais da placenta para suprimir a função imunitária. Os parâmetros da MLR podem ser variados para proporcionar mais dados ou para melhor determinar a capacidade de uma amostra de células estaminais da placenta para imunossuprimir. Por exemplo, como a imunossupressão por células estaminais da placenta parece aumentar aproximadamente em proporção com número de células estaminais da placenta presentes no ensaio, a MLR pode ser realizada com, numa concretização, dois ou mais números de células estaminais da placenta, p. ex., lxlO3, 3χ103, lxlO4 e/ou 3xl04 células estaminais da placenta por reacção. 0 número de células estaminais da placenta relativamente ao número de células T no ensaio pode também ser variado. Por exemplo, as células estaminais da placenta e as células T no ensaio podem estar presentes em qualquer razão de, p. ex. cerca de 10:1 a cerca de 1:10, de preferência cerca de 1:5, apesar de poder ser utilizado um número relativamente maior de células estaminais da placenta ou células T. O ensaio de regressão pode ser utilizado de forma semelhante. São aqui divulgados métodos de utilização de células estaminais da placenta para modular uma resposta imunitária, ou a actividade de uma pluralidade de um ou mais tipos de células imunitárias, in vivo. Células estaminais da placenta e células imunitárias podem ser colocadas em contacto, p. ex., num indivíduo que seja um receptor de uma pluralidade de células estaminais da placenta. Quando o contacto é realizado num indivíduo, numa concretização, o contacto é entre células estaminais da placenta exógenas (isto é, células estaminais da placenta não derivadas do indivíduo) e uma pluralidade de células imunitárias endógenas ao indivíduo. Em concretizações específicas, as células imunitárias dentro do indivíduo são células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+, e/ou células NK.

Tal imunossupressão utilizando células estaminais da placenta seria vantajosa para qualquer condição causada ou agravada por, ou relacionada com, uma resposta imunitária 30 1 957 633/ΡΤ inapropriada ou indesejada. A imunomodulação mediada por células estaminais da placenta, p. ex., imunossupressão, seria, por exemplo, útil na supressão de uma resposta imunitária inadequada levantada pelo sistema imunitário do indivíduo contra um ou mais dos seus próprios tecidos. Em várias concretizações, portanto, é aqui divulgado um método de supressão de uma resposta imunitária, em que a resposta imunitária é uma doença auto-imune, p. ex., lúpus eritematoso, diabetes, artrite reumatóide, ou esclerose múltipla. 0 contacto da pluralidade de células estaminais da placenta com a pluralidade de um ou mais tipos de células imunitárias pode ocorrer in vivo no contexto de, ou como complemento a, por exemplo, enxerto ou transplante de um ou mais tipos de tecidos para um indivíduo receptor. Tais tecidos podem ser, por exemplo, medula óssea ou sangue; um órgão; um tecido específico (p. ex., enxerto de pele); enxerto de tecido composto (i.e., um enxerto compreendendo dois ou mais tipos de tecidos diferentes); etc. A este respeito, as células estaminais da placenta podem ser utilizadas para suprimir uma ou mais respostas imunitárias de uma ou mais células imunitárias contidas no indivíduo receptor, dentro do tecido transplantado ou enxerto, ou ambos. 0 contacto pode ocorrer antes, durante e/ou após o enxerto ou transplante. Por exemplo, as células estaminais da placenta podem ser administradas no momento do transplante ou enxerto. As células estaminais da placenta podem também, ou alternativamente, ser administradas antes do transplante ou enxerto, p. ex., cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias antes do transplante ou enxerto. As células estaminais da placenta podem também, ou alternativamente, ser administradas a um receptor de transplante ou enxerto após o transplante ou enxerto, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias após o transplante ou enxerto. De preferência, a pluralidade de células estaminais da placenta é colocada em contacto com a pluralidade de células estaminais da placenta antes de ser detectável qualquer sinal ou sintoma detectável de uma resposta imunitária, pelo indivíduo receptor ou pelo tecido transplantado ou enxerto, p. ex., um sinal ou sintoma detectável de doença de enxerto-versus-hospedeiro ou inflamação detectável. 31 1 957 633/ΡΤ

Noutra concretização, o contacto dentro de um individual é principalmente entre células estaminais da placenta exógenas e células progenitoras ou células estaminais exógenas, p. ex., células progenitoras ou células estaminais exógenas que se diferenciem em células imunitárias. Por exemplo, os indivíduos submetidos a imunoablação ou mieloablação parcial ou completa como complemento a terapia do cancro podem receber células estaminais da placenta em combinação com um ou mais outros tipos de células estaminais ou progenitoras. Por exemplo, as células estaminais da placenta podem ser combinadas com uma pluralidade de células CD34+, p. ex., células estaminais hematopoéticas CD34+. Tais células CD34+ podem ser, p. ex., células CD34+ de uma fonte de tecido tal como sangue periférico, sangue do cordão umbilical, sangue da placenta, ou medula óssea. As células CD34+ podem ser isoladas a partir de tais fontes de tecido, ou a fonte de tecido inteira (p. ex., unidades de sangue do cordão umbilical ou medula óssea) ou uma preparação parcialmente purificada a partir da fonte de tecido (p. ex., glóbulos brancos de sangue do cordão) podem ser combinadas com as células estaminais da placenta. Combinações de células estaminais da placenta e sangue do cordão, ou células estaminais de sangue do cordão, são descritas em Hariri, Publicação de Pedido U.S. No. 2003/0180269.

As células estaminais da placenta são administradas ao indivíduo de preferência numa razão, em relação ao número de células imunitárias conhecido ou esperado, p. ex., células T, no indivíduo, de cerca de 10:1 a cerca de 1:10, de preferência cerca de 1:5. No entanto, uma pluralidade de células estaminais da placenta pode ser administrada a um indivíduo numa razão de, em exemplos não limitantes, cerca de 10000:1, cerca de 1000:1, cerca de 100:1, cerca de 10:1, cerca de 1:1, cerca de 1:10, cerca de 1:100, cerca de 1:1000 ou cerca de 1:10000. Geralmente, cerca de lxlO5 a cerca de lxlO8 células estaminais da placenta por quilograma do receptor, de preferência cerca de lxlO6 a cerca de lxlO7 células estaminais da placenta por quilograma do receptor podem ser administradas para realizar a imunossupressão. Em várias concretizações, uma pluralidade de células estaminais da placenta administrada a um indivíduo ou sujeito compreende 32 1 957 633/ΡΤ pelo menos, cerca de, ou nao mais de, ΙχΙΟ5, 3χ105, lxlO6, 3 x 106, ΙχΙΟ7, 3χ107, ΙχΙΟ8, 3xl08, lxlO9, 3xl09 células estaminais da placenta, ou mais.

As células estaminais da placenta podem também ser administradas com um ou mais tipos secundários de células estaminais, p. ex., células estaminais mesenquimatosas de medula óssea. Tais células estaminais secundárias podem ser administradas a um indivíduo com células estaminais da placenta numa razão de, p. ex., cerca de 1:10 a cerca de 10:1.

Para facilitar o contacto das células estaminais da placenta com células imunitárias in vivo, as células estaminais da placenta podem ser administradas ao indivíduo através de qualquer via suficiente para colocar as células estaminais da placenta e células imunitárias em contacto umas com as outras. Por exemplo, as células estaminais da placenta podem ser administradas ao indivíduo, p. ex., por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou directamente num órgão, p. ex., pâncreas. Para administração in vivo, as células estaminais da placenta podem ser formuladas como composição farmacêutica, tal como descrito na Secção 5.6.1, abaixo. O método de imunossupressão pode compreender adicionalmente a adição de um ou mais agentes imunossupressores, particularmente no contexto in vivo. Numa concretização, a pluralidade de células estaminais da placenta é colocada em contacto com a pluralidade de células imunitárias in vivo num indivíduo, e uma composição compreendendo um agente imunossupressor é administrada ao indivíduo. Agentes imunossupressores são bem conhecidos na técnica e incluem, p. ex., anticorpos anti-receptor de células T (anticorpos monoclonais ou policlonais, ou fragmentos ou derivados destes), anticorpos anti-receptor de IL-2 (p. ex., Basiliximab (SIMULECT®) ou daclizumab (ZENAPAX)®) , anticorpos anti-receptor de células T (p. ex., Muromonab-CD3) , azatioprina, corticosteróides, ciclosporina, tacrolimus, mofetil-micofenolato, sirolimus, inibidores da calcineurina, e semelhantes. Numa concretização específica, o agente imunossupressor é um anticorpo neutralizante para a 33

1 957 633/PT proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1 ou MIP-1 . De preferência, o anticorpo anti-MIP-1 ou ΜΙΡ-lé administrado numa quantidade suficiente para causar uma redução detectável na quantidade de MIP-1 e/ou MIP-1 no referido indivíduo, p. ex., no momento do transplante.

5.2 CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA E POPULAÇÕES DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA

Os métodos de imunossupressão aqui divulgados utilizam células estaminais da placenta, isto é, células estaminais obteníveis a partir de uma placenta ou parte desta, que (1) aderem a um substrato de cultura de tecidos; (2) têm a capacidade para se diferenciar em tipos celulares não placentários; e (3) têm, em número suficiente, a capacidade para suprimir de forma detectável uma função imunitária, p. ex., proliferação de células estaminais CD4+ e/ou CD8+ num ensaio de reacção linfocitária mista. As células estaminais da placenta não são derivadas de sangue, p. ex., sangue placentário ou sangue do cordão umbilical. As células estaminais da placenta utilizadas nos métodos do presente invento têm a capacidade, e são seleccionadas quanto à sua capacidade, para suprimir o sistema imunitário de um indivíduo.

As células estaminais da placenta podem ser de origem fetal ou materna (isto é, podem ter o genótipo da mãe ou do feto). As populações de células estaminais da placenta, ou populações de células compreendendo células estaminais da placenta, podem compreender células estaminais da placenta que sejam exclusivamente de origem fetal ou materna, ou podem compreender uma população mista de células estaminais da placenta de origem tanto fetal como materna. As células estaminais da placenta, e populações de células compreendendo as células estaminais da placenta, podem ser identificadas e seleccionadas pelas características morfológicas, de marcadores e de cultura discutidas abaixo. 5.2.1 Características Físicas e Morfológicas

As células estaminais da placenta utilizadas no presente invento, quando cultivadas em culturas primárias ou em 34 1 957 633/ΡΤ cultura de células, aderem ao substrato da cultura de tecidos, p. ex., superfície do recipiente de cultura de tecidos (p. ex., plástico de cultura de tecidos). As células estaminais da placenta em cultura assumem uma aparência geralmente fibroblastóide, estrelada, com um número de processos citoplasmáticos prolongando-se a partir do corpo central da célula. As células estaminais da placenta são, no entanto, morfologicamente diferenciáveis de fibroblastos cultivados sob as mesmas condições, uma vez que as células estaminais da placenta exibem um maior número de tais processos que os fibroblastos. Morfologicamente, as células estaminais da placenta são também diferenciáveis das células estaminais hematopoéticas, que assumem geralmente uma morfologia em cultura mais arredondada, ou rectangular. 5.2.2 Superfície_Celular,_Marcadores

Moleculares e Genéticos

As células estaminais da placenta, e populações de células estaminais da placenta, úteis nos métodos do presente invento, expressam uma pluralidade de marcadores que podem ser utilizados para identificar e/ou isolar as células estaminais, ou populações de células que compreendam as células estaminais. As células estaminais da placenta, e as populações de células estaminais aqui divulgadas (isto é, duas ou mais células estaminais da placenta) incluem células estaminais e populações celulares contendo células estaminais obtidas directamente a partir da placenta, ou qualquer parte desta (p. ex., âmnio, córion, cotilédones placentários, e semelhantes). As populações de células estaminais da placenta incluem também populações de (isto é, duas ou mais) células estaminais da placenta em cultura, e uma população num recipiente, p. ex., um saco. As células estaminais da placenta não são, no entanto, trofoblastos.

As células estaminais da placenta expressam geralmente os marcadores CD73, CD105, CD200, HLA-G, e/ou OCT-4, e não expressam CD34, CD38, ou CD45. As células estaminais da placenta podem também expressar HLA-ABC (MHC-1) e HLA-DR. Estes marcadores podem ser utilizados para identificar células estaminais da placenta, e distinguir células estaminais da placenta de outros tipos de células estaminais. 35 1 957 633/ΡΤ

Como as células estaminais da placenta podem expressar CD73 e CD105, podem ter características semelhantes a células estaminais mesenquimatosas. No entanto, como as células estaminais da placenta podem expressar CD200 e HLA-G, um marcador especifico do feto, podem ser distinguidas das células estaminais mesenquimatosas, p. ex., células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea, que não expressam CD200 nem HLA-G. Da mesma forma, a falta de expressão de CD34, CD38 e/ou CD45 identifica as células estaminais da placenta como células estaminais não hematopoéticas.

Numa concretização, é aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras que são CD200+, HLA-G+, em que a referida pluralidade suprime de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização específica das populações isoladas, as referidas células estaminais são também CD73+ e CD105+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais são também CD34“, CD38~ ou CD45~. Numa concretização mais específica, as referidas células estaminais são também CD34~, CD38~, CD45~, CD73+ e CD105+. Noutra concretização, a referida população isolada produz um ou mais corpos semelhantes a embrióides quando cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização, é aqui divulgada uma população isolada de células compreendendo uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras que são CD73+, CD105+, CD200+, em que a referida pluralidade suprime de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização específica das referidas populações, as referidas células estaminais são HLA-G+. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~ e CD45~. Numa concretização mais específica, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~, CD45~, e HLA-G+. Noutra concretização específica, a referida população de células produz um ou mais corpos semelhantes a embrióides 36

1 957 633/PT quando cultivada sob condiçoes que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides. É aqui divulqada uma população isolada de células compreendendo uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras que são CD200+, 0CT-4+, em que a referida pluralidade suprime de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização especifica, as referidas células estaminais são CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são HLA-G+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são CD34~, CD38” e CD45”. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~, CD45”, CD73 + , CD105+ e HLA-G+. Noutra concretização especifica, a população produz um ou mais corpos semelhantes a embrióides quando cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides. É aqui divulqada uma população isolada de células compreendendo uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras que são CD73+, CD105+ e HLA-G+, em que a referida pluralidade suprime de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização especifica da pluralidade de cima, as referidas células estaminais são também CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são também CD34~, CD38~ e CD45“. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são também 0CT-4+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são também CD200+. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais são também CD34~, CD3 8~, CD45-, 0CT-4+ e CD200+. É aqui divulqada uma população de células isoladas compreendendo uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras que são células estaminais CD73+, CD105+, em que a referida pluralidade forma um ou mais corpos semelhantes a embrióides sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e em que a referida pluralidade suprime de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária 37 1 957 633/ΡΤ mista (MLR). Numa concretização especifica, as referidas células estaminais são também CD34”, CD38~ ou CD45~. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são também CD34~, CD38~ e CD45~. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são também 0CT-4+. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais são também 0CT-4 + , CD34~, CD38~ e CD45”. É aqui divulgada uma população de células isoladas compreendendo uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras que são células estaminais 0CT-4+, em que a referida população forma um ou mais corpos semelhantes a embrióides quando cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e em que a referida pluralidade suprime de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Em várias concretizações, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células isoladas da placenta são células estaminais OCT4+. Numa concretização especifica da populações de cima, as referidas células estaminais são CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são CD34^, CD38~, ou CD45”. Noutra concretização especifica, as referidas células estaminais são CD200+. Numa concretização mais especifica, as referidas células estaminais são CD73+, CD105+, CD200 + , CD34~, CD38”, e CD45”. Noutra concretização específica, a referida população foi expandida, por exemplo, passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes.

Noutra concretização, é aqui divulgada uma população de células isoladas compreendendo uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras que são CD29+, CD44 + , CD73 + , CD90 + , CD105 + , CD200 + , CD34~ e CD133”.

Numa concretização especifica das células estaminais da placenta acima mencionadas, as células estaminais da placenta segregam constitutivamente IL-6, IL-8 e a proteína quimioatractora de monócitos (MCP-1). 38 1 957 633/ΡΤ

Cada uma das pluralidades acima referenciadas de células estaminais da placenta pode compreender células estaminais da placenta obtidas e isoladas directamente a partir de uma placenta de mamífero, ou células estaminais da placenta que tenham sido cultivadas e passadas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 ou mais vezes, ou uma combinação destas.

As pluralidades imunossupressoras de células estaminais da placenta descritas acima podem compreender cerca de, pelo menos, ou não mais de, ΙχΙΟ5, 5χ105, ΙχΙΟ6, 5χ106, lxlO7, 5xl07, ΙχΙΟ8, 5χ 108, 1 x 109, 5xl09, lxlO10, 5xl010, lxlO11 ou mais células estaminais da placenta. 5.2.3 Selecção e Produção de Populações de Células Estaminais da Placenta

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de selecção de uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras a partir de uma pluralidade de células da placenta, compreendendo a selecção de uma população de células da placenta em que pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células são células estaminais da placenta CD200+, HLA-G+, e em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização específica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais que são também CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais que são também CD34~, CD38~ ou CD45". Noutra concretização específica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34~, CD38~, CD45~, CD73+ e CD105+. Noutra concretização específica, a referida selecção compreende também a selecção de uma pluralidade de células estaminais da placenta que forma um ou mais corpos semelhantes a embrióides quando cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides. 39 1 957 633/ΡΤ

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de selecção de uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras de uma pluralidade de células da placenta, compreendendo a selecção de uma pluralidade de células da placenta em que pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células são células estaminais da placenta CD73 + , CD105 + , CD200 + , e em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais que são também HLA-G+. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34”, CD38 ou CD45 . Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34“, CD3 8~ e CD45~. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34~, CD38”, CD45 , e HLA-G+. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende adicionalmente a selecção de uma população de células da placenta que produz um ou mais corpos semelhantes a embrióides quando a população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides.

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de selecção de uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras a partir de uma pluralidade de células da placenta, compreendendo a selecção de uma pluralidade de células da placenta em que pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células são células estaminais da placenta CD200+, OCT-4+, e em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD73+ e CD105+. Noutra concretização 40 1 957 633/ΡΤ específica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também HLA-G+. Noutra concretização específica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34”, CD38” e CD45“. Noutra concretização específica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34~, CD38“, CD45~, CD73 + , CD105+and HLA-G+.

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de selecção de uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras a partir de uma pluralidade de células da placenta, compreendendo a selecção de uma pluralidade de células da placenta em que pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células são células estaminais da placenta CD73+, CD105+ e HLA-G+, e em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR). Numa concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34“, CD38 ou CD45 . Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34“, CD38~ e CD45“. Noutra concretização específica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD200+. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34 , CD38 , CD45”, OCT-4+ e CD200+.

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de selecção de uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras a partir de uma pluralidade de células da placenta, compreendendo a selecção de uma pluralidade de células da placenta em que pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células são células estaminais da placenta CD73+, CD105+, e em que a referida pluralidade forma um ou mais corpos semelhantes a embrióides sob condições que 41

1 957 633/PT permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides. Numa concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD3 4_, CD38“ ou CD45~. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34~, CD38~ e CD45~. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também 0CT-4+. Numa concretização mais especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também 0CT-4+, CD34”, CD38” e CD45~.

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de selecção de uma pluralidade de células estaminais da placenta imunossupressoras a partir de uma pluralidade de células da placenta, compreendendo a selecção de uma pluralidade de células da placenta em que pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células da placenta isoladas são células estaminais OCT4+, e em que a referida pluralidade forma um ou mais corpos semelhantes a embrióides sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides. Numa concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD73+ e CD105+. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD34~, CD38~, ou CD45”. Noutra concretização especifica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD200+. Numa concretização mais específica, a referida selecção compreende a selecção de células estaminais da placenta que são também CD73+, CD105+, CD200 + , CD34“, CD38~, e CD45“. São aqui divulgados métodos de produção de populações imunossupressoras, ou pluralidades, de células estaminais da placenta. Por exemplo, é aqui divulgado um método de produção de uma população celular, compreendendo a selecção de qualquer uma das pluralidades de células estaminais da placenta descritas acima, e o isolamento de uma pluralidade de células estaminais da placenta a partir de outras células, 42 1 957 633/ΡΤ ρ. ex., outras células da placenta. Numa concretização específica, é aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células da placenta, em que as referidas células da placenta (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD200 e HLA-G, ou expressam CD73, CD105, e CD200, ou expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G, ou expressam CD73 e CD105 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende a célula estaminal, quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, ou expressam OCT-4 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende a célula estaminal, quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides; e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR (reacção linfocitária mista); e o isolamento das referidas células da placenta de outras células para formar uma população celular.

Numa concretização mais especifica, é aqui divulqado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD200 e HLA-G, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8 + numa MLR (reacção linfocitária mista); e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização especifica, é aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73, CD105, e CD200, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização especifica, é aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD200 e OCT-4, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da placenta 43 1 957 633/ΡΤ de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização específica, é aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73 e CD105, (c) formam corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e (d) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8 + numa MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização especifica, é aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73, CD105, e HLA-G, e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8 + numa MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular. Um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células estaminais da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam OCT-4, (c) formam corpos semelhantes a embrióides quando cultivadas sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, e (d) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR; e o isolamento das referidas células estaminais da placenta de outras células para formar uma população celular.

Numa concretização especifica dos métodos de produção de uma população de células estaminais da placenta imunossupressoras, as referidas células T e as referidas células da placenta estão presentes na referida MLR a uma razão de cerca de 5:1. As células da placenta utilizadas no método podem ser derivadas da placenta inteira, ou principalmente do âmnio, ou âmnio e córion. Noutra concretização especifica, as células da placenta suprimem a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% na referida MLR em comparação com uma quantidade de proliferação de células T na referida MLR na ausência das referidas células da placenta. O método pode compreender adicionalmente a selecção e/ou produção de uma população de células estaminais da placenta capaz de imunomodulação, p. ex., supressão da 44 1 957 633/ΡΤ actividade de outras células imunitárias, p. ex., uma actividade de uma célula natural assassina (NK). 5.2.4 Crescimento em Cultura 0 crescimento das células estaminais da placenta aqui descrito, tal como para qualquer célula de mamífero, depende em parte do meio particular seleccionado para crescimento. Sob condições óptimas, as células estaminais da placenta duplicam tipicamente de número em 3-5 dias. Durante a cultura, as células estaminais da placenta do invento aderem a um substrato em cultura, p. ex. a superfície de um recipiente de cultura de tecidos (p. ex., o plástico de uma placa de cultura de tecidos, plástico revestido com fibronectina, e semelhantes) e forma uma monocamada.

As populações de células da placenta isoladas que compreendem as células estaminais da placenta aqui divulgadas, quando cultivadas sob condições apropriadas, formam corpos semelhantes a embrióides, isto é, grupos tridimensionais de células crescendo sobre a camada de células estaminais aderentes. As células dentro dos corpos semelhantes a embrióides expressam marcadores associados a células estaminais muito iniciais, p. ex., OCT-4, Nanog, SSEA3 e SSEA4. As células no interior dos corpos semelhantes a embrióides são tipicamente não aderentes ao substrato da cultura, tal como as células estaminais da placenta aqui descritas, mas permanecem ligadas às células aderentes durante a cultura. As células de corpos semelhantes a embrióides são dependentes das células estaminais da placenta aderentes para serem viáveis, os corpos semelhantes a embrióides não se formam na ausência das células estaminais aderentes. As células estaminais da placenta aderentes facilitam assim o crescimento de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta aderentes. Sem querer estar preso à teoria, pensa-se que as células dos corpos semelhantes a embrióides crescem nas células estaminais da placenta aderentes de forma muito parecida à do crescimento das células estaminais embrionárias numa camada celular alimentadora. As células estaminais mesenquimatosas, p. ex., células estaminais mesenquimatosas 45 1 957 633/ΡΤ derivadas da medula óssea, nao desenvolvem corpos semelhantes a embrióides em cultura. 5.2.5 Diferenciação

As células estaminais da placenta, úteis nos métodos do presente invento, são diferenciáveis em diferentes linhagens celulares comprometidas. Por exemplo, as células estaminais da placenta podem diferenciar-se em células de uma linhagem adipogénica, condrogénica, neurogénica, ou osteogénica. Tal diferenciação pode ser alcançada através de qualquer método conhecido na técnica para diferenciação, p. ex., células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea em linhagens celulares semelhantes.

5.3 MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA 5.3.1 Composição de Colheita de Células

Estaminais São aqui divulgados métodos de colheita e isolamento de células estaminais da placenta. Geralmente, as células estaminais são obtidas a partir de uma placenta de mamífero utilizando uma solução fisiologicamente aceitável, p. ex., uma composição de colheita de células estaminais. A composição de colheita de células estaminais é descrita em detalhe no Pedido Provisório U.S. No. 60/754969 relacionado, intitulado "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition" apresentado a 29 de Dezembro de 2005. A composição de colheita de células estaminais pode compreender quaisquer solução fisiologicamente aceitável para a colheita e/ou cultura de células estaminais, por exemplo, uma solução salina (p. ex., solução salina tamponada com fosfato, solução de Kreb, solução de Kreb modificada, solução de Eagle, NaCl a 0,9%, etc.), um meio de cultura (p. ex., DMEM, H.DMEM, etc.), e semelhantes. A composição de colheita de células estaminais pode compreender um ou mais componentes que tendem a conservar as 46

1 957 633/PT células estaminais da placenta, isto é, impede que as células estaminais da placenta sequem, ou atrasa a morte das células estaminais da placenta, reduz o número de células estaminais da placenta numa população de células que morre, ou semelhantes, desde o momento da colheita até ao momento de cultura. Tais componentes podem ser, p. ex., um inibidor da apoptose (p. ex., um inibidor de caspases ou inibidor de JNK); um vasodilatador (p. ex., sulfato de magnésio, um fármaco anti-hipertensivo, péptido natriurético atrial (ANP), adrenocorticotropina, hormona libertadora de corticotropina, nitroprussiato de sódio, hidralazina, adenosina-trifosfato, adenosina, indometacina ou sulfato de magnésio, um inibidor da fosfodiesterase, etc.); um inibidor de necrose (p. ex., 2-(lH-indol-3-il)-3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina, ou clonazepam) ; um inibidor de TNF- ; e/ou um perfluorocarbono de transporte de oxigénio (p. ex., brometo de perfluorooctilo, brometo de perfluorodecilo, etc.). A composição de colheita de células estaminais pode compreender uma ou mais enzimas de degradação de tecidos, p. ex., uma metaloprotease, uma serina-protease, uma protease neutra, uma ARNase, ou uma ADNase ou semelhante. Tais enzimas incluem, mas não se limitam a, colagenases (p. ex., colagenase I, II, III ou IV, uma colagenase de Clostridium histolyticum, etc.); dispase, termolisina, elastase, tripsina, LIBERASE, hialuronidase, e semelhantes. A composição de colheita de células estaminais pode compreender uma quantidade bactericida ou bacteriostática eficaz de um antibiótico. Em certas concretizações não limitativas, o antibiótico é um macrólido (p. ex., tobramicina), uma cefalosporina (p. ex., cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixime ou cefadroxilo), uma claritromicina, uma eritromicina, uma penicilina (p. ex., penicilina V) ou uma quinolona (p. ex., ofloxacina, ciprofloxacina ou norfloxacina) , uma tetraciclina, uma estreptomicina, etc. Numa concretização particular, o antibiótico é activo contra bactérias Gram(+) e/ou Gram(-), p. ex., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e semelhantes. 47 1 957 633/ΡΤ A composição de colheita de células estaminais pode também compreender um ou mais dos seguintes compostos: adenosina (cerca de 1 mM a cerca de 50 mM) ; D-glicose (cerca de 20 mM a cerca de 100 mM); iões de magnésio (cerca de 1 mM a cerca de 50 mM) ; uma macromolécula de peso molecular superior a 20000 daltons, numa concretização, presente numa quantidade suficiente para manter a integridade endotelial e a viabilidade celular (p. ex., um colóide sintético ou de ocorrência natural, um polissacárido tal como dextrano ou um polietilenoglicol presente a cerca de 25 g/1 a cerca de 100 g/1, ou de cerca de 40 g/1 a cerca de 60 g/1); um antioxidante (p. ex., hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, vitamina C ou vitamina E presente a cerca de 25 μΜ a cerca de 100 μΜ) ; um agente de redução (p. ex., N-acetilcisteina presente a cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM); um agente que impeça a entrada de cálcio nas células (p. ex., verapamil presente a cerca de 2 μΜ a cerca de 25 μΜ) ; nitroglicerina (p. ex., cerca de 0,05 g/1 a cerca de 0,2 g/1); um anticoagulante, numa concretização, presente numa quantidade suficiente para ajudar a prevenir a coagulação de sangue residual (p. ex., heparina ou hirudina presente a uma concentração de cerca de 1000 unidades/1 a cerca de 100000 unidades/1); ou um composto contendo amilorida (p. ex., amilorida, etil-isopropil-amilorida, hexametileno-amilorida, dimetil-amilorida ou isobutil-amilorida presente a cerca de 1,0 μΜ a cerca de 5 μΜ). 5.3.2 Colheita e Manuseamento da Placenta

Geralmente, uma placenta humana é recuperada logo após a sua expulsão após o nascimento. Numa concretização preferida, a placenta é recuperada de uma paciente após consentimento informado e após ser tomada uma história médica completa do paciente e ser associada à placenta. De preferência, a história médica continua após o parto. Tal história médica pode ser usada para coordenar a utilização subsequente da placenta ou das células estaminais colhidas da mesma. Por exemplo, células estaminais da placenta humanas podem ser utilizadas, à luz da história médica, para medicina personalizada para o bebé associado à placenta, ou para os pais, irmãos ou outros parentes do bebé. 48 1 957 633/ΡΤ

Antes da recuperação das células estaminais da placenta, o sangue do cordão umbilical e o sangue da placenta são removidos. Em certas concretizações, após o parto, o sangue do cordão na placenta é recuperado. A placenta pode ser submetida a um processo de recuperação de sangue do cordão convencional. Tipicamente, é utilizada uma agulha ou cânula, com a ajuda da gravidade, para sangrar a placenta (ver, p. ex., Anderson, Patente U.S. No. 5372581; Hessel et al., Patente U.S. No. 5415665). A agulha ou cânula é geralmente colocada na veia umbilical e a placenta pode ser gentilmente massajada para ajudar na drenagem de sangue do cordão a partir da placenta. Tal recuperação de sangue do cordão pode ser realizada comercialmente, p. ex., LifeBank Inc., Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry e Cryocell. De preferência, a placenta é drenada por gravidade sem mais manipulação, de modo a minimizar a destruição de tecidos durante a recuperação de sangue do cordão.

Tipicamente, uma placenta é transportada desde a sala de parto ou nascimento para outro local, p. ex., um laboratório, para a recuperação de sangue do cordão e colheita de células estaminais, p. ex., através de perfusão ou dissociação dos tecidos. A placenta é de preferência transportada num dispositivo de transporte estéril termicamente isolado (mantendo a temperatura da placenta entre 20-28°C), por exemplo, através de colocação da placenta, com o cordão umbilical proximal preso com mola, num saco de plástico estéril com fecho, que é então colocado num recipiente isolado. Noutra concretização, a placenta é transportada num estojo de colheita de sangue do cordão substancialmente tal como descrito no pedido de patente pendente dos Estados Unidos no. 11/230760, apresentado a 19 de Setembro de 2005. De preferência, a placenta é entregue no laboratório quatro a vinte e quatro horas após o parto. Em certas concretizações, o cordão umbilical proximal é preso com mola, de preferência dentro de 4-5 cm (centímetros) da inserção no disco placentário antes da recuperação do sangue do cordão. Noutras concretizações, o cordão umbilical proximal é preso com mola após a recuperação do sangue do cordão mas antes de posterior processamento da placenta. 49 1 957 633/ΡΤ A placenta, antes da colheita de células estaminais, pode ser armazenada sob condições de esterilidade e quer à temperatura ambiente quer a uma temperatura de 5 a 25 °C (centígrados). A placenta pode ser armazenada durante um período superior a quarenta e oito horas, e de preferência durante um período de quatro a vinte e quatro horas antes da perfusão da placenta para remover qualquer sangue de cordão residual. A placenta é de preferência armazenada numa solução anticoagulante a uma temperatura de 5 a 25°C (centígrados). Soluções anticoagulantes adequadas são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, pode ser utilizada uma solução de heparina ou varfarina sódica. Numa concretização preferida, a solução anticoagulante compreende uma solução de heparina (p. ex., 1% p/p em solução de 1:1000) . A placenta sangrada é de preferência armazenada durante não mais do que 36 horas antes das células estaminais da placenta serem colhidas. A placenta de mamífero ou uma parte desta, uma vez colhida e preparada geralmente tal como acima, pode ser tratada de qualquer modo conhecido na técnica, p. ex., pode ser perfundida ou destruída, p. ex., digerida com uma ou mais enzimas de ruptura de tecidos, para a obtenção de células estaminais. 5.3.3 Destruição Física e Digestão Enzimática de Tecido Placentário

Numa concretização, as células estaminais são colhidas a partir de uma placenta de mamífero através de destruição física, p. ex., digestão enzimática, do órgão. Por exemplo, a placenta, ou uma parte desta, pode ser, p. ex., esmagada, fragmentada, picada, cortada, macerada ou semelhante, enquanto em contacto com a composição de colheita de células estaminais aqui divulgada, e o tecido posteriormente digerido com uma ou mais enzimas. A placenta, ou uma porção desta, pode também ser fisicamente destruída e digerida com uma ou mais enzimas, e o material resultante imerso então, ou misturado, na composição de colheita de células estaminais aqui divulgada. Qualquer método de ruptura física pode ser usado, desde que o método de ruptura deixe uma pluralidade, de preferência uma maioria e, de maior preferência pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% das células no referido 50 1 957 633/ΡΤ órgão viáveis, tal como determinado por, p. ex., exclusão de azul tripano. A placenta pode ser dissecada em componentes antes da destruição física e/ou digestão enzimática e recuperação de células estaminais. Por exemplo, as células estaminais da placenta podem ser obtidas a partir da membrana amniótica, do córion, dos cotilédones placentários, ou de qualquer combinação destes. De preferência, as células estaminais da placenta são obtidas a partir de tecido placentário compreendendo âmnio e córion. Tipicamente, as células estaminais da placenta podem ser obtidas através de destruição de um pequeno bloco de tecido da placenta, p. ex., um bloco de tecido da placenta que tenha cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou cerca de 1000 milímetros cúbicos de volume.

Uma composição preferida de colheita de células estaminais compreende uma ou mais enzimas de ruptura de tecidos. A digestão enzimática utiliza de preferência uma combinação de enzimas, p. ex., uma combinação de uma metaloprotease de matriz e uma protease neutra, por exemplo, uma combinação de colagenase e dispase. Numa concretização, a digestão enzimática do tecido placentário utiliza uma combinação de uma metaloprotease de matriz, uma protease neutra, e uma enzima mucolítica para digestão de ácido hialurónico, tal como uma combinação de colagenase, dispase, e hialuronidase ou uma combinação de LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) e hialuronidase. Outras enzimas que podem ser usadas para destruir o tecido da placenta incluem papaína, desoxirribonucleases, serina-proteases, tais como tripsina, quimotripsina, ou elastase. As serina-proteases podem ser inibidas através de alfa 2-microglobulina em soro e, portanto, o meio utilizado para a digestão é geralmente isento de soro. EDTA e ADNase são vulgarmente utilizados em procedimentos de digestão enzimática para aumentar a eficiência de recuperação de células. O digerido é de preferência diluído de modo a evitar o aprisionamento de células estaminais na digestão viscosa. 51

1 957 633/PT

Qualquer combinação de enzimas de digestão de tecidos pode ser utilizada. Concentrações tipicas para enzimas de digestão de tecidos incluem, p. ex., 50-200 U/mL para colagenase I e colagenase IV, 1-10 U/mL para dispase, e 10-100 U/mL para elastase. As proteases podem ser utilizadas em combinação, isto é, duas ou mais proteases na mesma reacção de digestão, ou podem ser utilizadas sequencialmente para libertar as células estaminais da placenta. Por exemplo, numa concretização, uma placenta, ou parte desta, é digerida primeiro com uma quantidade apropriada de colagenase I a 2 mg/ml durante 30 minutos, seguido de digestão com tripsina, a 0,25%, durante 10 minutos, a 37°C. As serina-proteases são de preferência utilizadas consecutivamente após a utilização de outras enzimas.

Noutra concretização, o tecido pode ainda ser desfeito através da adição de um agente quelante, p. ex., ácido etilenoglicol-bis(éter 2-aminoetílico)-Ν,Ν,Ν'Ν'-tetraacético (EGTA) ou ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) à composição de colheita de células estaminais compreendendo as células estaminais, ou a uma solução em que o tecido é desfeito e/ou digerido antes do isolamento das células estaminais com a composição de colheita de células estaminais.

Será apreciado que quando toda a placenta, ou porção de uma placenta, compreende tanto células fetais como maternas (por exemplo, quando a porção da placenta compreende o córion ou os cotilédones), as células estaminais da placenta colhidas compreenderão uma mistura de células estaminais da placenta derivadas tanto de fontes fetais como maternas. Quando uma porção da placenta que não compreende, ou compreende um número desprezível de, células maternas (por exemplo, âmnio), as células estaminais da placenta colhidas compreenderão quase exclusivamente células estaminais da placenta fetais. 5.3.4 Perfusão da Placenta

As células estaminais da placenta podem também ser obtidas através de perfusão da placenta de mamífero. Métodos de perfusão da placenta de mamífero para obtenção de células 52

1 957 633/PT estaminais são divulgados, p. ex., em Hariri, Publicação de Pedido U.S. No. 2002/0123141, e no Pedido Provisório relacionado U.S. No. 60/754969, intitulado "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and methods of Using the Composition" apresentado a 29 de Dezembro de 2005.

As células estaminais da placenta podem ser colhidas através de perfusão, p. ex., através da vasculatura placentária, utilizando, p. ex., uma composição de colheita de células estaminais como solução de perfusão. Numa concretização, a placenta de mamífero é perfundida através de passagem de solução de perfusão através de uma ou ambas a artéria umbilical e a veia umbilical. O fluxo de solução de perfusão através da placenta pode ser alcançado utilizando, p. ex., fluxo por gravidade para a placenta. De preferência, a solução de perfusão é forçada através da placenta utilizando uma bomba, p. ex., uma bomba peristáltica. A veia umbilical pode ser, p. ex., canulada com uma cânula, p. ex., uma cânula de TEFLON (D ou plástico, que é ligada a um aparelho de ligação estéril, tal como tubagem esterilizada. O aparelho de ligação estéril é ligado a um colector de perfusão.

Na preparação para perfusão, a placenta é de preferência orientada (p. ex., suspensa), de modo a que a artéria umbilical e a veia umbilical estejam localizadas no ponto mais alto da placenta. A placenta pode ser perfundida através da passagem de um fluido de perfusão, p. ex., a composição de colheita de células estaminais aqui divulgada, através da vasculatura placentária, ou através da vasculatura placentária e tecido envolvente. Numa concretização, a artéria umbilical e a veia umbilical são ligadas simultaneamente a uma pipeta que é ligada através de uma ligação flexível a um reservatório da solução de perfusão. A solução de perfusão é passada para dentro da veia e da artéria umbilicais. A solução de perfusão exsuda e/ou passa através das paredes dos vasos sanguíneos para os tecidos circundantes da placenta, e é colhida num vaso adequado aberto a partir da superfície da placenta que estava ligado ao útero da mãe durante a gestação. A solução de perfusão pode também ser introduzida através da abertura do cordão 53 1 957 633/ΡΤ umbilical e deixada fluir ou infiltrar-se para fora das aberturas na parede da placenta, que fazem a interface com a parede do útero materno. Noutra concretização, a solução de perfusão é passada através das veias umbilicais e colhida a partir da artéria umbilical, ou é passada através da artéria umbilical e colhida a partir das veias umbilicais.

Numa concretização, o cordão umbilical proximal é preso com mola durante a perfusão, e de maior preferência, é preso com mola dentro de 4-5 cm (centímetros) da inserção do cordão no disco placentário. A primeira colheita de fluido de perfusão de uma placenta de mamífero durante o processo de sangria é geralmente colorida com glóbulos vermelhos residuais do sangue do cordão umbilical e/ou sangue placentário. 0 fluido de perfusão torna-se mais incolor à medida que a perfusão prossegue e as células do sangue do cordão residual são lavadas da placenta. Geralmente, de 30 a 100 ml (mililitros) de fluido de perfusão são adequados para sangrar inicialmente a placenta, mas mais ou menos fluido de perfusão pode ser utilizado dependendo dos resultados observados. 0 volume de líquido de perfusão utilizado para colher as células estaminais da placenta pode variar dependendo do número de células estaminais a colher, do tamanho da placenta, do número de colheitas a realizar a partir de uma única placenta, etc. Em várias concretizações, o volume de líquido de perfusão pode ser de 50 ml a 5000 ml, 50 ml a 4000 ml, 50 ml a 3000 ml, 100 ml a 2000 ml, 250 ml a 2000 ml, 500 ml a 2000 ml, ou 750 ml a 2000 ml. Tipicamente, a placenta é perfundida com 700-800 ml de liquido de perfusão após sangria. A placenta pode ser perfundida uma pluralidade de vezes ao longo de várias horas ou vários dias. Quando a placenta é para ser perfundida uma pluralidade de vezes, pode ser mantida ou cultivada sob condições assépticas num recipiente ou outro vaso adequado, e perfundida com a composição de colheita de células estaminais, ou uma solução de perfusão padrão (p. ex., uma solução salina normal tal como solução salina tamponada com fosfato ("PBS")) com ou sem um 54 1 957 633/ΡΤ anticoagulante (p. ex., heparina, varfarina sódica, cumarina, bis-hidroxicumarina) , e/ou com ou sem um agente antimicrobiano (p. ex., -mercaptoetanol (0,1 mM);

antibióticos tais como estreptomicina Cp. ex., a 40-100 pg/ml), penicilina (p. ex., a 40 U/ml), anfotericina B (p. ex., a 0,5 yg/ml). Numa concretização, uma placenta isolada é mantida ou cultivada durante um periodo de tempo sem colheita do perfusato, de modo a que a placenta seja mantida ou cultivada durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 horas, ou 2 ou 3 ou mais dias antes da perfusão e colheita de perfusato. A placenta perfundida pode ser mantida durante um ou mais tempos adicionais, p . ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 O t—1 CJ') í—1 \—1 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, , 20, 21, 22, 23, 24 ou mais horas, e perfundida uma segunda vez com, p. ex., 700-800 ml de fluído de perfusão. A placenta pode ser perfundida 1, 2, 3, 4, 5 ou mais vezes, por exemplo, uma vez a cada 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Numa concretização preferida, a perfusão da placenta e a colheita da solução de perfusão, p. ex., composição de colheita de células estaminais, são repetidas até o número de células nucleadas recuperadas cair abaixo das 100 células/ml. Os perfusatos a diferentes momentos podem ser ainda processados individualmente para recuperar populações de células dependentes do tempo, p. ex., células estaminais. Os perfusatos de diferentes momentos podem também ser reunidos.

Sem desejar estar ligado a qualquer teoria, após a sangria e um tempo suficiente de perfusão da placenta, crê-se que as células estaminais da placenta migrem para a microcirculação sangrada e perfundida da placenta onde são colhidas, de preferência através de lavagem para um vaso de colheita através de perfusão. A perfusão da placenta isolada não serve apenas para remover o sangue do cordão residual como também proporciona a placenta com os nutrientes apropriados, incluindo oxigénio. A placenta pode ser cultivada e perfundida com uma solução semelhante que foi utilizada para remover as células do sangue do cordão residuais, de preferência sem a adição de agentes anticoagulantes. 55 1 957 633/ΡΤ A perfusão resulta na colheita de significativamente mais células estaminais da placenta que o número obtenível a partir de uma placenta de mamífero não perfundida com a referida solução, e não tratada de outro modo para obter células estaminais (p. ex., através de ruptura do tecido, p. ex., digestão enzimática). Neste contexto, "significativamente mais" significa pelo menos 10% mais. A perfusão rende significativamente mais células estaminais da placenta que, p. ex., o número de células estaminais da placenta obtenível a partir do meio de cultura em que a placenta, ou porção desta, foi cultivada.

As células estaminais podem ser isoladas a partir da placenta através de perfusão com uma solução compreendendo uma ou mais proteases ou outras enzimas de ruptura de tecidos. Numa concretização específica, uma placenta ou porção desta (p. ex., membrana amniótica, âmnio e córion, lóbulo da placenta ou cotilédone, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores) é levada para 25-37°C, e é incubada com uma ou mais enzimas de ruptura de tecidos em 200 ml de um meio de cultura durante 30 minutos. As células do perfusato são colhidas, levadas até 4°C, e lavadas com uma mistura inibidora fria compreendendo EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM e beta-mercaptoetanol 2 mM. As células estaminais são lavadas após vários minutos com uma composição de colheita de células estaminais fria (p. ex., 4°C) aqui divulgada.

Será apreciado que a perfusão utilizando o método de forma, isto é, através do qual o perfusato é colhido após ter sido exsudado a partir do lado materno da placenta, resulta numa mistura de células fetais e maternas. Como resultado, as células colhidas através deste método compreendem uma população mista de células estaminais da placenta tanto de origem fetal como materna. Em contraste, a perfusão apenas através da vasculatura da placenta, pelo qual o fluido de perfusão é passado através de um ou dois vasos placentários e é colhido unicamente através do ou dos vasos restantes, resulta na colheita de uma população de células estaminais da placenta quase exclusivamente de origem fetal. 56 1 957 633/ΡΤ 5.3.5 Isolamento, Separação, e Caracterização de Células Estaminais da Placenta

As células estaminais da placenta de mamífero, quer obtidas através de perfusão ou digestão enzimática, podem ser inicialmente purificadas a partir de (i.e., ser isoladas de) outra células através de centrifugação em gradiente de Ficoll. Tal centrifugação pode seguir qualquer protocolo padrão para velocidade de centrifugação, etc. Numa concretização, por exemplo, as células colhidas a partir da placenta são recuperadas a partir do perfusato através de centrifugação a 5000 xg durante 15 minutos à temperatura ambiente, que separa as células de, p. ex., restos contaminantes e plaquetas. Noutra concretização, o perfusato placentário é concentrado a cerca de 200 ml, vertido suavemente sobre Ficoll, e centrifugado a cerca de 1100 xg durante 20 minutos a 22°C, e a camada de interface de baixa densidade de células é colhida para mais processamento.

Os sedimentos celulares podem ser ressuspensos em composição de colheita de células estaminais fresca, ou um meio adequado para manutenção de células estaminais, p. ex., meio IMDM isento de soro contendo heparina a 2 U/ml e EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY). A fracção de células mononucleares totais pode ser isolada, p. ex., utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante.

Tal como aqui utilizado, "isolamento" de células estaminais da placenta significa remover pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% das células com as quais as células estaminais estão normalmente associadas na placenta de mamífero intacta. Uma célula estaminal de um órgão é "isolada" quando está presente numa população de células que compreende menos de 50% das células com as quais a célula estaminal está normalmente associada no órgão intacto.

As células da placenta obtidas através de perfusão ou digestão podem, por exemplo, ser ainda, ou inicialmente, isoladas através de tripsinização diferencial utilizando, p. ex., uma solução de tripsina a 0,05% com EDTA a 0,2% (Sigma, 57 1 957 633/ΡΤ

St. Louis MO). A tripsinização diferencial é possível porque as células estaminais da placenta separam-se tipicamente de superfícies de plástico dentro de cerca de cinco minutos enquanto outras populações aderentes requerem normalmente mais do que 20-30 minutos de incubação. As células estaminais da placenta desprendidas podem ser colhidas após tripsinização e neutralização de tripsina, utilizando, p. ex., Solução de Neutralização de Tripsina (TNS, Cambrex). Numa concretização de isolamento de células aderentes, alíquotas de, por exemplo, cerca de 5-10xl06 células são colocadas em cada um de vários frascos T-75, de preferência frascos T75 revestidos com fibronectina. Numa tal concretização, as células podem ser cultivadas com Meio de Crescimento de Células Estaminais Mesenquimatosas comercialmente disponível (MSCGM) (Cambrex), e colocadas numa incubadora de cultura de tecidos (37°C, C02 a 5%). Após 10 a 15 dias, as células não aderentes são removidas dos frascos através de lavagem com PBS. 0 PBS é então substituído por MSCGM. Os frascos são de preferência examinados diariamente quanto à presença de vários tipos de células aderentes e em particular, para identificação e expansão de aglomerados de células fibroblastóides. O número e tipo de células colhidas a partir de uma placenta de mamífero podem ser monitorizados, por exemplo, através da medição de alterações na morfologia e marcadores da superfície celular utilizando técnicas de detecção de células padrão, tais como citometria de fluxo, separação de células, imunocitoquímica (p. ex., coloração com anticorpos específicos de tecido ou específicos de marcadores celulares), separação de células activadas por fluorescência (FACS), separação magnética de células activadas (MACS), através de examinação da morfologia de células utilizando microscopia óptica ou confocal, e/ou através da medição de alterações na expressão génica usando técnicas bem conhecidas na arte, tais como PCR e perfis de expressão génica. Estas técnicas podem ser utilizadas, também, para identificar células que sejam positivas para um ou mais marcadores particulares. Por exemplo, utilizando anticorpos para CD34, pode-se determinar, utilizando as técnicas acima, se uma célula compreende uma quantidade detectável de CD34; em caso afirmativo, a célula é CD34+. Da mesma forma, se uma célula 58 1 957 633/ΡΤ produz suficiente ARN de OCT-4 para ser detectável através de RT-PCR, ou significativamente mais ARN de OCT-4 que uma célula de adulto, a célula é 0CT-4+. Anticorpos para marcadores da superfície celular (p. ex., marcadores CD tais como CD34) e a sequência de genes específicos de células estaminais, tais como OCT-4, são bem conhecidos na técnica.

As células da placenta, particularmente as células que foram isoladas através de separação em Ficoll, aderência diferencial, ou uma combinação de ambas, podem ser separadas utilizando um separador de células activadas por fluorescência (FACS). A separação de células activadas por fluorescência (FACS) é um método bem conhecido para separação de partículas, incluindo células, com base nas propriedades fluorescentes das partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol., 151: 150-165). A excitação por laser de porções fluorescentes nas partículas individuais resulta numa pequena carga eléctrica, permitindo a separação electromagnética de partículas positivas e negativas a partir de uma mistura. Numa concretização, os anticorpos ou ligandos específicos de marcadores da superfície celular são marcados com marcadores fluorescentes distintos. As células são processadas através de um separador de células, permitindo a separação de células com base na sua capacidade para se ligarem aos anticorpos utilizados. As partículas separadas por FACS podem ser directamente depositadas em poços individuais de placas de 96 poços ou de 384 poços para facilitar a separação e clonagem.

Num esquema de separação, as células estaminais da placenta são separadas com base na expressão dos marcadores CD34, CD38, CD4 4, CD45, CD73, CD105, OCT-4 e/ou HLA-G. Isto pode ser alcançado em ligação com procedimentos para seleccionar células estaminais com base nas suas propriedades de aderência em cultura. Por exemplo, uma selecção de aderência pode ser alcançada antes ou após a separação com base na expressão do marcador. Numa concretização, por exemplo, as células são separadas primeiro com base na sua expressão de CD34; as células CD34~ são mantidas, e as células que são CD200+HLA-G+, são separadas de todas as outras células CD34~. Noutra concretização, as células da placenta são baseadas na sua expressão do marcador CD200 e/ou HLA-G; por exemplo, células apresentando um desses marcadores 59 1 957 633/ΡΤ são isoladas para posterior utilização. As células que expressam, p. ex., CD200 e/ou HLA-G podem, numa concretização especifica, ser ainda separadas com base na sua expressão de CD73 e/ou CD105, ou epitopos reconhecidos pelos anticorpos SH2, SH3 ou SH4, ou falta de expressão de CD34, CD38 ou CD45. Por exemplo, numa concretização, as células placentárias são separadas através da expressão, ou falta desta, de CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 e CD45, e as células da placenta que são CD200 + , HLA-G+, CD73 + , CD105 + , CD34“, CD38~ e CD45~ são isoladas de outras células da placenta para posterior utilização.

Noutra concretização, contas magnéticas podem ser utilizadas para separar as células. As células podem ser separadas utilizando uma técnica de separação magnética de células activadas (MACS), um método para separação de partículas com base na sua capacidade para se ligarem a contas magnéticas (0,5-100 pm de diâmetro). Uma variedade de modificações úteis pode ser realizada nas microesferas magnéticas, incluindo a adição covalente de anticorpo que reconhece especificamente uma determinada molécula da superfície celular ou hapteno. As contas são então misturadas com as células para permitir a ligação. As células são então passadas através de um campo magnético para separar as células possuindo o marcador da superfície celular específico. Numa concretização, estas células podem então ser isoladas e remisturadas com contas magnéticas ligadas a um anticorpo contra marcadores da superfície celular adicionais. As células são novamente passadas através de um campo magnético, isolando as células que se ligam aos anticorpos. Tais células podem então ser diluídas em caixas separadas, tais como caixas de microtitulação para isolamento clonal.

As células estaminais da placenta podem também ser caracterizadas e/ou separadas com base na morfologia celular e características de crescimento. Por exemplo, as células estaminais da placenta podem ser caracterizadas como possuindo, e/ou seleccionadas com base em, p. ex., uma aparência fibroblastóide em cultura. As células estaminais da placenta podem também ser caracterizadas como possuindo, e/ou ser seleccionadas com base na sua capacidade de formar corpos semelhantes a embrióides. Numa concretização, por exemplo, as 60 1 957 633/ΡΤ células da placenta que têm a forma fibroblastóide, expressam CD73 e CD105, e produzem um ou mais corpos semelhantes a embrióides em cultura são isoladas de outras células da placenta. Noutra concretização, as células da placenta OCT-4+ que produzem um ou mais corpos semelhantes a embrióides em cultura são isoladas das outras células da placenta.

Noutra concretização, as células estaminais da placenta podem ser identificadas e caracterizadas através de um ensaio de unidades formadoras de colónias. Os ensaios de unidades formadoras de colónias são vulgarmente conhecidos na técnica, tais como o meio Mesen Cult™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia).

As células estaminais da placenta podem ser avaliadas quanto à viabilidade, ao potencial de proliferação, e à longevidade utilizando técnicas padrão conhecidas na arte, tais como o ensaio de exclusão de azul tripano, ensaio de incorporação de diacetato de fluoresceina, ensaio de incorporação de iodeto de propídio (para avaliação da viabilidade); e ensaio de incorporação de timidina, ensaio de proliferação celular MTT (para avaliar a proliferação). A longevidade pode ser determinada através de métodos bem conhecidos na técnica, tais como através da determinação do número máximo de duplicação da população numa cultura prolongada.

As células estaminais da placenta podem também ser separadas de outras células da placenta utilizando outras técnicas conhecidas na arte, p. ex., crescimento selectivo de células desejadas (selecção positiva), destruição selectiva de células indesejadas (selecção negativa); separação com base na capacidade de aglutinação diferencial das células na população mista tal como, por exemplo, com aglutinina de soja; procedimentos de congelação-descongelação; filtração; centrifugação convencional e zonal; elutriação centrífuga (centrifugação contracorrente); separação unitária por gravidade; distribuição contracorrente; electroforese; e semelhantes. 61 1 957 633/ΡΤ 5.4 CULTURA DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA 5.4.1 Meio de Cultura

As células estaminais da placenta isoladas, ou população de células estaminais da placenta, ou células ou tecido placentário dos quais as células estaminais da placenta crescem, podem ser utilizadas para iniciar, ou semear, culturas de células. As células são geralmente transferidas para vasos estéreis de cultura de tecidos quer não revestidos quer revestidos com matriz extracelular ou ligandos tais como laminina, colagénio (p. ex., nativo ou desnaturado), gelatina, fibronectina, orinitina, vitronectina, e proteína da membrana extracelular (p. ex., MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).

As células estaminais da placenta podem ser cultivadas em qualquer meio, e sob quaisquer condições, reconhecidas na técnica como aceitáveis para a cultura de células estaminais.

De preferência, o meio de cultura compreende soro. As células estaminais da placenta podem ser cultivadas em, por exemplo, DMEM-LG (Meio Essencial Modificado por Dulbecco, pobre em glicose)/MCDB 201 (meio basal de fibroblastos de galinha) contendo ITS (insulina-transferrina-selénio), LA+BSA (ácido linoleico-albumina de soro bovino), dextrose, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, IGF-1, e penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (rico em glicose) compreendendo soro fetal bovino a 10% (FBS); DMEM-HG compreendendo FBS a 15%; IMDM (Meio de Dulbecco modificado por Iscove) compreendendo FBS a 10%, soro de cavalo a 10%, e hidrocortisona; M199 compreendendo FBS a 10%, EGF, e heparina; -MEM (meio essencial mínimo) compreendendo FBS a 10%, GlutaMAX™ e gentamicina; DMEM compreendendo FBS a 10%, GlutaMAX™ e gentamicina, etc. Um meio preferido é DMEM-LG/MCDB-201 compreendendo FBS a 2%, ITS, LA+BSA, dextrose, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, e penicilina/estreptomicina.

Outros meios que podem ser utilizados para cultura de células estaminais da placenta incluem DMEM (rico ou pobre em glicose), meio basal de Eagle, meio F10 de Ham (F10), meio F-12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, Meio de Crescimento de Células Estaminais Mesenquimatosas (MSCGM), 62 1 957 633/ΡΤ meio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMIEM/F12, RPMI 1640, DMEM avançado (Gibco), DMEM/MCDB2 01 (Sigma), e CELL-GRO FREE. O meio de cultura pode ser suplementado com um ou mais componentes incluindo, por exemplo, soro (p. ex., soro fetal bovino (FBS), de preferência cerca de 2-15% (v/v); soro equino (cavalo) (ES); soro humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), de preferência cerca de 0,001% (v/v); um ou mais factores de crescimento, por exemplo, factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), factor de crescimento semelhante a insulina-1 (IGF-1), factor inibidor da leucemia (LIF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e eritropoetina (EPO); aminoácidos, incluindo L-valina; e um ou mais antibióticos e/ou agentes antimicóticos para controlar a contaminação microbiana, tais como, por exemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina, e nistatina, isoladamente ou em combinação. 5.4.2 Expansão e Proliferação de Células Estaminais da Placenta

Uma vez isolada uma célula estaminal placentária, ou isolada a população de células estaminais (p. ex., uma célula estaminal ou uma população de células estaminais separadas de pelo menos 50% das células da placenta, com as quais a célula estaminal ou população de células estaminais estão normalmente associadas in vivo), a célula estaminal ou população de células estaminais pode ser proliferada e expandida in vitro. Por exemplo, uma população de células estaminais da placenta pode ser cultivada em recipientes de cultura de tecidos, p. ex., caixas, frascos, placas de múltiplos poços, ou semelhantes, durante um tempo suficiente para que as células estaminais proliferem até 70-90% de confluência, isto é, até as células estaminais e a sua descendência ocupar 70-90% da área da superfície de cultura do recipiente de cultura de tecidos.

As células estaminais da placenta podem ser semeadas em vasos de cultura a uma densidade que permita o crescimento celular. Por exemplo, as células podem ser semeadas a baixa 63

1 957 633/PT densidade (p. ex., cerca de 1000 a cerca de 5000 células/cm2) até alta densidade (p. ex., cerca de 50000 ou mais células/cm2). Numa concretização preferida, as células são cultivadas a de cerca de 0 a cerca de 5 porcento por volume de C02 no ar. Nalgumas concretizações preferidas, as células são cultivadas a de cerca de 2 a cerca de 25 porcento de 02 no ar, de preferência de cerca de 5 a cerca de 20 porcento de 02 no ar. As células são de preferência cultivadas a de cerca de 25°C a cerca de 40°C, de preferência 37°C. As células são de preferência cultivadas numa incubadora. O meio de cultura pode ser estático ou agitado, por exemplo utilizando um biorreactor. As células estaminais da placenta são de preferência criadas sob baixo stress oxidativo (p. ex., com adição de glutationa, ácido ascórbico, catalase, tocoferol, N-acetilcisteína, ou semelhante).

Uma vez obtida uma confluência de 70%-90%, as células podem ser passadas. Por exemplo, as células podem ser tratadas enzimaticamente, p. ex., tratadas com tripsina, utilizando técnicas bem conhecidas na arte, para as separar da superfície da cultura de tecidos. Após remoção das células através de pipetagem e contagem das células, cerca de 20000-100000 células estaminais, de preferência cerca de 50000 células estaminais, são passadas para um novo recipiente de cultura contendo meio de cultura fresco. Tipicamente, o novo meio é o mesmo tipo de meio a partir do qual foram removidas as células estaminais. São aqui divulgadas populações de células estaminais da placenta que foram passadas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20 vezes, ou mais. 5.4.3 Populações de Células Estaminais da

Placenta São aqui divulgadas populações de células estaminais da placenta. A população de células estaminais da placenta pode ser isolada directamente a partir de uma ou mais placentas; isto é, a população de células estaminais da placenta pode ser uma população de células da placenta, compreendendo células estaminais da placenta, obtidas a partir de, ou contidas no, perfusato, ou obtidas a partir de, ou contidas na, digestão (isto é, a colheita de células obtidas através 64 1 957 633/ΡΤ de digestão enzimática de uma placenta ou parte desta). As células estaminais da placenta isoladas do invento podem também ser cultivadas e expandidas para produzir populações de células estaminais da placenta. As populações de células da placenta compreendendo células estaminais da placenta podem também ser cultivadas e expandidas para produzir populações de células estaminais da placenta.

As populações de células estaminais da placenta aqui divulgadas compreendem células estaminais da placenta, por exemplo, células estaminais da placenta tal como aqui descritas. Em várias concretizações, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% das células numa população de células estaminais da placenta isoladas são células estaminais da placenta. Isto é, uma população de células estaminais da placenta pode compreender, p. ex., tanto como 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de células não estaminais. São aqui divulgados métodos de produção de uma população isolada de células estaminais da placenta através, p. ex., da selecção células estaminais da placenta, quer derivadas de digestão enzimática ou perfusão, que expressem determinados marcadores e/ou determinadas caracteristicas da cultura ou morfológicas. Numa concretização, por exemplo, é aqui divulgado um método de produção de uma população celular compreendendo a selecção de células da placenta que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD200 e HLA-G; e do isolamento das referidas células de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização, o método de produção de uma população celular compreende a selecção de células da placenta que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD73, CD105, e CD200; e o isolamento das referidas células de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização, o método de produção de uma população celular compreende a selecção de células da placenta que (a) aderem a um substrato e (b) expressam CD200 e OCT-4; e o isolamento das referidas células de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização, o método de produção de uma população celular compreende a selecção de células da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73 e CD105, e (c) facilitam a formação de um ou 65 1 957 633/ΡΤ mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta compreendendo a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de um corpo semelhante a embrióide; e o isolamento das referidas células de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização, o método de produção de uma população celular compreende a selecção de células da placenta que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD73, CD105 e HLA-G; e o isolamento das referidas células de outras células para formar uma população celular. Noutra concretização, o método de produção de uma população celular compreende a selecção de células da placenta que (a) aderem a um substrato, (b) expressam OCT-4, e (c) facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta compreendendo a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de um corpo semelhante a embrióide; e o isolamento das referidas células de outras células para formar uma população celular. Em qualquer uma das concretizações de cima, o método pode compreender adicionalmente a selecção de células da placenta que expressam ABC-p (uma proteína transportadora de ABC específica da placenta; ver, p. ex., Allikmets et al., Câncer Res. 58 (23): 5337-9 (1998)). 0 método pode também compreender a selecção de células exibindo pelo menos uma característica específica de, p. ex., uma célula estaminal mesenquimatosa, por exemplo, expressão de CD29, expressão de CD44, expressão de CD90, ou expressão de uma combinação das anteriores.

Nas concretizações de cima, o substrato pode ser qualquer superfície em que a cultura e/ou selecção de células, p. ex., células estaminais da placenta, possa ser alcançada. Tipicamente, o substrato é plástico, p. ex., o plástico de uma caixa de cultura de tecidos ou placa de múltiplos poços. 0 plástico de cultura de tecidos pode ser revestido com uma biomolécula, p. ex., laminina ou fibronectina.

As células, p. ex., células estaminais da placenta, podem ser seleccionadas para uma população de células estaminais da placenta através de qualquer meio conhecido na técnica de selecção de células. Por exemplo, as células podem 66 1 957 633/ΡΤ ser seleccionadas utilizando um anticorpo ou anticorpos para um ou mais marcadores da superfície celular, por exemplo, em citometria de fluxo ou FACS. A selecção pode ser alcançada utilizando anticorpos em conjunto com contas magnéticas. Os anticorpos que são específicos para certos marcadores relacionados com células estaminais são conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos para OCT-4 (Abcam, Cambridge, MA), CD200 (Abcam), HLA-G (Abcam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) , CD105 (Abcam; BioDesign International, Saco, ME), etc. Anticorpos para outros marcadores estão também disponíveis comercialmente, p. ex., CD34, CD38 e CD45 estão disponíveis em, p. ex., StemCell Technologies ou BioDesign International. A população isolada de células estaminais da placenta pode compreender células da placenta que não sejam células estaminais, ou células que não sejam células da placenta.

As populações isoladas de células estaminais da placenta podem ser combinadas com uma ou mais populações de células não estaminais ou células não placentárias. Por exemplo, uma população isolada de células estaminais da placenta pode ser combinada com sangue (p. ex., sangue da placenta ou sangue do cordão umbilical), células estaminais derivadas de sangue (p. ex., células estaminais derivadas de sangue da placenta ou de sangue do cordão umbilical), populações de células nucleadas derivadas do sangue, células mesenquimatosas derivadas da medula óssea, populações de células estaminais derivadas de osso, medula óssea em bruto, células estaminais do adulto (somáticas), populações de células estaminais contidas dentro de tecido, células estaminais em cultura, populações de células totalmente diferenciadas (p. ex., condrócitos, fibroblastos, células amnióticas, osteoblastos, células musculares, células cardíacas, etc.) e semelhantes. As células numa população isolada de células estaminais da placenta podem ser combinadas com uma pluralidade de células de outro tipo em razões de cerca de 100000000:1, 50000000:1, 20000000:1, 10000000:1, 5000000:1; 2000000:1, 1000000:1, 500000:1, 200000:1, 100000:1, 50000:1, 20000:1, 10000:1, 5000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2: 1, 1: 1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1 :200; 1:500; 1:1000; 1:2000; 1:5000; 1:10000; 1:20000; 1:50000; 1:100000; 67 1 957 633/ΡΤ 1:500000; 1:1000000; 1:2000000; 1:5000000; 1:10000000; 1:20000000; 1:50000000; ou cerca de 1:100000000, comparando o número total de células nucleadas em cada população. As células numa população isolada de células estaminais da placenta podem também ser combinadas com uma pluralidade de células de uma pluralidade de tipos celulares.

Numa, uma população isolada de células estaminais da placenta é combinada com uma pluralidade de células estaminais hematopoéticas. Tais células estaminais hematopoéticas podem estar, por exemplo, contidas dentro de placenta não processada, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico; em células nucleadas totais a partir de sangue da placenta, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico; numa população isolada de células CD34+ de sangue da placenta, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico; em medula óssea não processada; em células nucleadas totais da medula óssea; numa população isolada de células CD34+ de medula óssea, ou semelhante.

5.5 CONSERVAÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA

As células estaminais da placenta podem ser conservadas, isto é, colocadas sob condições que permitam o armazenamento a longo prazo, ou condições que inibam a morte celular através, p. ex., de apoptose ou necrose.

As células estaminais da placenta podem ser conservadas utilizando, p. ex., uma composição compreendendo um inibidor de apoptose, inibidor de necrose e/ou um perfluorocarbono de transporte de oxigénio, tal como descrito no Pedido Provisório U.S. No. 60/754969 relacionado, intitulado "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition" apresentado a 25 de Dezembro de 2005. Numa concretização, é aqui divulgado um método de conservação de uma população de células estaminais compreendendo o contacto da referida população de células estaminais com uma composição de colheita de células estaminais compreendendo um inibidor de apoptose e um perfluorocarbono de transporte de oxigénio, em que o referido inibidor de apoptose está presente numa quantidade e durante um tempo suficiente para reduzir ou 68 1 957 633/ΡΤ prevenir apoptose na população de células estaminais, tal como em comparação com uma população de células estaminais não colocada em contacto com o inibidor de apoptose. Numa concretização especifica, o referido inibidor de apoptose é um inibidor de caspases. Noutra concretização especifica, o referido inibidor de apoptose é um inibidor de JNK. Numa concretização mais especifica, o referido inibidor de JNK não modula a diferenciação ou proliferação das referidas células estaminais. Noutra concretização, a referida composição de colheita de células estaminais compreende o referido inibidor de apoptose e o referido perfluorocarbono de transporte de oxigénio em fases separadas. Noutra concretização, a referida composição de colheita de células estaminais compreende o referido inibidor de apoptose e o referido perfluorocarbono de transporte de oxigénio numa emulsão. Noutra concretização, a composição de colheita de células estaminais compreende adicionalmente um emulsionante, p. ex., lecitina. Noutra concretização, o referido inibidor de apoptose e o referido perfluorocarbono estão entre cerca de 0°C e cerca de 25°C no momento de contacto com as células estaminais. Noutra concretização mais especifica, o referido inibidor de apoptose e o referido perfluorocarbono estão entre cerca de 2°C e 10°C, ou entre cerca de 2°C e cerca de 5°C, no momento de contacto com as células estaminais. Noutra concretização mais especifica, o referido contacto é realizado durante o transporte da referida população de células estaminais. Noutra concretização mais especifica, o referido contacto é realizado durante a congelação e descongelação da referida população de células estaminais.

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de conservação de uma população de células estaminais da placenta compreendendo o contacto da referida população de células estaminais com um inibidor de apoptose e um composto de conservação de órgãos, em que o referido inibidor de apoptose está presente numa quantidade e durante um tempo suficiente para reduzir ou prevenir apoptose na população de células estaminais, em comparação com uma população de células estaminais não colocada em contacto com o inibidor de apoptose. Numa concretização especifica, o composto de conservação de órgãos é solução UW (descrita na Patente U.S. No. 4798824; também conhecida como ViaSpan; ver também 69 1 957 633/ΡΤ

Southard et al., Transplantation 49(2): 251-257 (1990)) ou uma solução descrita em Stem et al., Patente U.S. No. 5552267. Noutra concretização, o referido composto de conservação de órgãos é amido de hidroxietilo, ácido lactobiónico, rafinose, ou uma combinação destes. Noutra concretização, a composição de colheita de células estaminais compreende adicionalmente um perfluorocarbono de transporte de oxigénio, quer em duas fases quer como uma emulsão.

Noutra concretização do método, as células estaminais da placenta são colocadas em contacto com uma composição de colheita de células estaminais compreendendo um inibidor de apoptose e perfluorocarbono de transporte de oxigénio, composto de preservação de órgãos, ou combinação destes, durante a perfusão. Noutra concretização, as referidas células estaminais são colocadas em contacto durante um processo de ruptura de tecidos, p. ex., digestão enzimática. Noutra concretização, as células estaminais da placenta são colocadas em contacto com o referido composto de colheita de células estaminais após colheita através de perfusão, ou após colheita através de ruptura dos tecidos, p. ex., digestão enzimática.

Tipicamente, durante a colheita, o enriquecimento e o isolamento de células da placenta, é preferível minimizar ou eliminar o stress celular devido a hipóxia e stress mecânico. Noutra concretização do método, portanto, uma célula estaminal, ou população de células estaminais, é exposta a uma condição hipóxica durante a colheita, o enriquecimento ou o isolamento durante menos de seis horas durante a referida conservação, em que uma condição hipóxica é uma concentração de oxigénio que é inferior à concentração normal de oxigénio no sangue. Numa concretização mais específica, a referida população de células estaminais é exposta à referida condição hipóxica durante menos de duas horas durante a referida conservação. Noutra concretização mais específica, a referida população de células estaminais é exposta à referida condição hipóxica durante menos de uma hora, ou menos de trinta minutos, ou não é exposta a uma condição hipóxica, durante a colheita, o enriquecimento ou o isolamento. Noutra concretização específica, a referida população de células 70 1 957 633/ΡΤ estaminais nao é exposta a forças de cisalhamento durante a colheita, o enriquecimento ou o isolamento.

As células estaminais da placenta do invento podem ser criopreservadas, p. ex., em meio de criopreservação em pequenos recipientes, p. ex., ampolas. 0 meio de criopreservação adequado inclui, mas não se limita a, meio de cultura incluindo, p. ex., meio de cultura, ou meio de congelação de células, por exemplo meio de congelação de células comercialmente disponível, p. ex., C2695, C2639 ou C6039 (Sigma). O meio de criopreservação compreende de preferência DMSO (dimetilsulfóxido), a uma concentração de, p. ex., cerca de 10% (v/v) . O meio de criopreservação pode compreender agentes adicionais, por exemplo, metilcelulose e/ou glicerol. As células estaminais da placenta são de preferência arrefecidas até cerca de l°C/min durante a criopreservação. Uma temperatura de criopreservação preferida é de cerca de -80°C a cerca de -180°C, de preferência de cerca de -125°C a cerca de -140°C. As células criopreservadas podem ser transferidas para azoto liquido antes da descongelação para utilização. Nalgumas concretizações, por exemplo, quando as ampolas atingem cerca de -90°C, são transferidas para uma área de armazenamento em azoto liquido. As células criopreservadas são de preferência descongeladas a uma temperatura de cerca de 25°C a cerca de 40°C, de preferência a uma temperatura de cerca de 37°C.

5.6 UTILIZAÇÕES DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA 5.6.1 Composições_Compreendendo_Células

Estaminais da Placenta

Os métodos de imunossupressão do presente invento podem utilizar composições compreendendo células estaminais da placenta, ou biomoléculas destas. Da mesma forma, as pluralidades e populações de células estaminais da placenta do presente invento podem ser combinadas com qualquer composto, composição ou dispositivo fisiologicamente aceitável ou medicamente aceitável para utilização em, p. ex., pesquisa ou agentes terapêuticos. 71 1 957 633/ΡΤ 5.6.1.1 Células Estaminais da Placenta Criopreservadas

As populações de células estaminais da placenta imunossupressoras do invento podem ser preservadas, por exemplo, criopreservadas para posterior utilização. Os métodos para criopreservação de células, tais como células estaminais, são bem conhecidos na técnica. As populações de células estaminais da placenta podem ser preparadas numa forma que seja facilmente administrável a um indivíduo. Por exemplo, é aqui divulgada uma população de células estaminais da placenta que está contida dentro de um recipiente que é adequado para utilização médica. Um tal recipiente pode ser, por exemplo, um saco, frasco, jarro, ou outro recipiente de plástico estéril a partir do qual a população de células estaminais da placenta possa ser facilmente dispensada. Por exemplo, o recipiente pode ser um saco de sangue ou outro saco de plástico medicamente aceitável adequado para a administração intravenosa de um líquido a um receptor. 0 recipiente é de preferência um que permita a criopreservação da população de células estaminais combinadas.

As populações de células estaminais da placenta imunossupressoras criopreservadas podem compreender células estaminais da placenta derivadas de um único dador, ou de múltiplos dadores. A população de células estaminais da placenta pode ser completamente compatível em HLA para um receptor pretendido, ou parcialmente ou completamente incompatível em HLA.

Assim, numa concretização, é aqui divulgada uma composição compreendendo uma população de células estaminais da placenta imunossupressora num recipiente. Numa concretização específica, a população de células estaminais é criopreservada. Noutra concretização específica, o recipiente é um saco, frasco, ou jarro. Numa concretização mais específica, o referido saco é um saco de plástico estéril. Numa concretização mais específica, o referido saco é adequado para, permite ou facilita a administração intravenosa da referida população de células estaminais da placenta. 0 saco pode compreender múltiplos lúmens ou compartimentos que são interligados para permitir a mistura 72 1 957 633/ΡΤ das células estaminais da placenta e uma ou mais outras soluções, p. ex., um fármaco, antes de, ou durante, a administração. Noutra concretização específica, a composição compreende um ou mais compostos que facilitem a criopreservação da população de células estaminais combinada. Noutra concretização especifica, a referida população de células estaminais da placenta está contida dentro de uma solução aquosa fisiologicamente aceitável. Numa concretização mais específica, a referida solução aquosa fisiologicamente aceitável é uma solução de NaCl a 0,9%. Noutra concretização específica, a referida população de células estaminais da placenta compreende células da placenta que são compatíveis em HLA com um receptor da referida população de células estaminais. Noutra concretização específica, a referida população de células estaminais combinada compreende células da placenta que são pelo menos parcialmente incompatíveis em HLA com um receptor da referida população de células estaminais. Noutra concretização específica, as referidas células estaminais da placenta são derivadas de uma pluralidade de dadores. 5.6.1.2 Composições Farmacêuticas

As populações imunossupressoras de células estaminais da placenta, ou populações de células compreendendo células estaminais da placenta, podem ser formuladas em composições farmacêuticas para utilização in vivo. Tais composições farmacêuticas compreendem uma população de células estaminais da placenta, ou uma população de células compreendendo células estaminais da placenta, num transportador farmaceuticamente aceitável, p. ex., uma solução salina ou outra solução fisiologicamente aceitável aceite para administração in vivo. As composições farmacêuticas aqui divulgadas podem compreender qualquer uma das populações de células estaminais da placenta, ou tipos de células estaminais da placenta, aqui descritos noutro local. As composições farmacêuticas podem compreender células estaminais da placenta fetais, maternas, ou tanto fetais como maternas. As composições farmacêuticas aqui divulgadas podem ainda compreender células estaminais da placenta obtidas a partir de um único indivíduo ou placenta, ou de uma pluralidade de indivíduos ou placentas. 73 1 957 633/ΡΤ

As composições farmacêuticas aqui divulgadas podem compreender qualquer número de células estaminais da placenta imunossupressoras. Por exemplo, uma única dose unitária de células estaminais da placenta pode compreender, em várias concretizações, cerca de, pelo menos, ou não mais de lxlO5, 5xl05, lxlO6, 5χ106, ΙχΙΟ7, 5χ107, lxlO8, 5χ108, lxlO9, 5xl09, lxlO10, 5χ1010, lxlO11 ou mais células estaminais da placenta.

As composições farmacêuticas aqui divulgadas compreendem populações de células que compreendem 50% de células viáveis ou mais (isto é, pelo menos 50% das células na população são funcionais ou vivas). De preferência, pelo menos 60% das células da população são viáveis. De maior preferência, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% das células na população da composição farmacêutica são viáveis.

As composições farmacêuticas aqui divulgadas podem compreender um ou mais compostos que, p. ex., facilitem o enxerto (p. ex., anticorpos anti-receptor de células T, um imunossupressor, ou semelhante); estabilizadores tais como albumina, dextrano 40, gelatina, amido de hidroxietilo, e semelhantes. 5.6.1.3 Meio Condicionado de Células

Estaminais da Placenta

As células estaminais da placenta do invento podem ser utilizadas para produzir meio condicionado que seja imunossupressor, isto é, meio compreendendo uma ou mais biomoléculas segregadas ou excretadas pelas células estaminais que têm um efeito imunossupressor detectável numa pluralidade de um ou mais tipos de células imunitárias. Em várias concretizações, o meio condicionado compreende meio em que as células estaminais da placenta foram cultivadas durante, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14 ou mais dias. Noutras concretizações, o meio condicionado compreende meio em que as células estaminais da placenta cresceram até, pelo menos, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de confluência, ou até 100% de confluência. Tal meio condicionado pode ser usado para suportar a cultura de uma população separada de células estaminais da placenta, ou 74 1 957 633/ΡΤ células estaminais de outro tipo. Noutra concretização, o meio condicionado compreende meio no qual as células estaminais da placenta foram diferenciadas num tipo celular de adulto. Noutra concretização, o meio condicionado aqui divulgado compreende meio no qual as células estaminais da placenta e células não estaminais da placenta foram cultivadas.

Assim, numa concretização, é aqui divulgada uma composição compreendendo meio de cultura de uma cultura de células estaminais da placenta, em que as referidas células estaminais da placenta (a) aderem a um substrato; (b) expressam CD200 e HLA-G, ou expressam CD73, CD105, e CD200, ou expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G, ou expressam CD73 e CD105 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende as células estaminais da placenta, quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides, ou expressam OCT-4 e facilitam a formação de um ou mais corpos semelhantes a embrióides numa população de células da placenta que compreende células estaminais da placenta quando a referida população é cultivada sob condições que permitam a formação de corpos semelhantes a embrióides; e (c) suprimem de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ numa MLR (reacção linfocitária mista), em que a referida cultura de células estaminais da placenta foi cultivada no referido meio durante 24 horas ou mais. Numa concretização especifica, a composição compreende ainda uma pluralidade das referidas células estaminais da placenta. Noutra concretização especifica, a composição compreende uma pluralidade de células não placentárias. Numa concretização mais especifica, as referidas células não placentárias compreendem células CD34+, p. ex., células progenitoras hematopoéticas, tais como células progenitoras hematopoéticas do sangue periférico, células progenitoras hematopoéticas do sangue do cordão, ou células progenitoras hematopoéticas de sangue da placenta. As células não placentárias podem também compreender outras células estaminais, tais como células estaminais mesenquimatosas, p. ex., células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea. As células não placentárias podem também ser de um ou 75 1 957 633/ΡΤ mais tipos de células ou linhas celulares de adulto. Noutra concretização especifica, a composição compreende um agente anti-proliferativo, p. ex., um anticorpo anti-MIP-1 ou anti-MIP-1 5.6.1.4 Matrizes_Compreendendo_Células

Estaminais da Placenta São aqui divulgadas também matrizes, hidrogéis, armações e semelhantes que compreendem uma população imunossupressora de células estaminais da placenta.

As células estaminais da placenta do invento podem ser semeadas numa matriz natural, p. ex., um biomaterial da placenta, tal como um material da membrana amniótica. Tal material da membrana amniótica pode ser, p. ex., membrana amniótica dissecada directamente a partir de uma placenta de mamífero; membrana amniótica fixada ou tratada termicamente, membrana amniótica substancialmente seca (i.e., <20% de H2O) , membrana coriónica, membrana coriónica substancialmente seca, membrana amniótica e coriónica substancialmente seca, e semelhantes. Biomateriais placentários preferidos nos quais as células estaminais da placenta podem ser semeadas são descritos em Hariri, Publicação de Pedido U.S. No. 2004/0048796.

As células estaminais da placenta do invento podem ser suspensas numa solução de hidrogel adequada para, p. ex., injecção. Hidrogéis adequados para tais composições incluem péptidos de auto-montagem, tais como RAD16. Numa concretização, uma solução de hidrogel compreendendo as células pode ser deixada endurecer, por exemplo, num molde, para formar uma matriz possuindo células aí dispersas para implantação. As células estaminais da placenta numa tal matriz podem também ser cultivadas de modo a que as células sejam mitoticamente expandidas antes da implantação. O hidrogel é, p. ex., um polímero orgânico (natural ou sintético), que é reticulado através de ligações covalentes, iónicas, ou pontes de hidrogénio para criar uma estrutura tridimensional de treliça aberta que aprisiona moléculas de água para formar um gel. Materiais formadores de hidrogel incluem polissacáridos tais como alginato e sais destes, 76 1 957 633/ΡΤ péptidos, polifosfazinas, e poliacrilatos, que são reticulados ionicamente, ou polímeros de blocos tais como copolímeros de blocos de óxido de polietileno-polipropilenoglicol que são reticulados através de temperatura ou pH, respectivamente. Nalgumas concretizações, o hidrogel ou matriz aqui divulgado é biodegradável.

De acordo com a presente divulgação, a formulação compreende um gel polimerizável in situ (ver, p. ex., Publicação de Pedido de Patente U.S. 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et ai., Biomaterials, 24(22): 3969-80 (2003).

Em algumas concretizações, os polímeros são pelo menos parcialmente solúveis em soluções aquosas, tais como água, soluções salinas tamponadas, ou soluções alcoólicas aquosas, que têm grupos laterais com carga, ou um sal iónico monovalente destes. Exemplos de polímeros possuindo grupos laterais ácidos que podem reagir com catiões são poli(fosfazenos) , poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico e ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo), e polímeros sulfonados, tais como poliestireno sulfonado. Copolímeros possuindo grupos laterais ácidos formados através de reacção de ácido acrílico ou metacrílico e monómeros ou polímeros de éter vinílico podem também ser utilizados. Exemplos de grupos ácidos são grupos de ácido carboxílico, grupos de ácido sulfónico, grupos de álcool halogenado (de preferência fluorado), grupos OH fenólicos, e grupos OH ácidos.

As células estaminais da placenta do invento ou co-culturas destas podem ser semeadas numa estrutura ou armação tridimensional e implantadas in vivo. Tal estrutura pode ser implantada em combinação com qualquer um ou mais dos factores de crescimento, células, fármacos ou outros componentes que estimulem a formação de tecido ou de outro modo aumentem ou melhorem a prática do invento.

Exemplos de armações que podem ser utilizadas incluem esteiras não tecidas, espumas porosas, ou péptidos de automontagem. Esteiras não tecidas podem ser formadas utilizando fibras constituídas por um copolímero absorvível 77 1 957 633/ΡΤ sintético de ácidos glicólico e láctico (p. ex., PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, NJ) . Espumas, compostas por, p. ex., copolímero de poli( -caprolactona)/poli(ácido glicólico) (PCL/PGA), formado através de processos tais como secagem por congelação, ou liofilização (ver, p. ex., Pat. U.S. No. 6355699), podem também ser utilizadas como armações.

As células estaminais da placenta do invento podem também ser semeadas em, ou colocadas em contacto com, um material cerâmico fisiologicamente aceitável material incluindo, mas não se limitando a, fosfato de mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri-, e tetra-cálcio, hidroxiapatite, fluoroapatites, sulfatos de cálcio, fluoretos de cálcio, óxidos de cálcio, carbonatos de cálcio, fosfatos de magnésio-cálcio, vidros biologicamente activos tais como BIOGLASS®, e mistura destes. Materiais cerâmicos porosos biocompatíveis comercialmente disponíveis actualmente incluem SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canadá), ENDOBON® (Merck Biomaterial França, França), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Suíça), e produtos de enxerto de osso de colagénio mineralizado tais como HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) e VITOSS®, RHAKOSS™, e CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). A estrutura pode ser uma mistura, combinação ou composição de materiais naturais e/ou sintéticos.

Noutra concretização, as células estaminais da placenta podem ser semeadas em, ou colocadas em contacto com, um feltro, que pode ser, p. ex., composto por um fio multifilamentos feito de um material bioabsorvível, tal como copolímeros ou misturas de PGA, PLA, PCL, ou ácido hialurónico.

As células estaminais da placenta do invento podem, noutra concretização, ser semeadas sobre armações de espuma que podem ser estruturas compósitas. Tais armações de espuma podem ser moldadas numa forma útil, de modo a que uma porção de uma estrutura específica no corpo seja reparada, substituída ou aumentada. Nalgumas concretizações, a estrutura é tratada, p. ex., com ácido acético 0,1 M seguido de incubação em polilisina, PBS, e/ou colagénio, antes da inoculação das células aqui divulgadas, para melhorar a fixação celular. As superfícies externas de uma matriz podem 78 1 957 633/ΡΤ ser modificadas para melhorar a fixação ou o crescimento das células e a diferenciação do tecido, tal como através de revestimento da matriz com plasma, ou adição de uma ou mais proteínas (p. ex., colagénios, fibras elásticas, fibras reticularas), glicoproteínas, glicosaminoglicanos (p. ex., sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatano, sulfato de queratina, etc.), uma matriz celular, e/ou outros materiais tais como, mas não limitados a, gelatina, alginatos, agar, agarose, e gomas vegetais, e semelhantes.

Em algumas concretizações, a armação compreende, ou é tratada com, materiais que a tornam não trombogénica. Estes tratamentos e materiais podem também promover e sustentar o crescimento endotelial, a migração e a deposição de matriz extracelular. Exemplos destes materiais e tratamentos incluem, mas não estão limitados a materiais naturais, tais como proteínas da membrana basal tais como laminina e colagénio Tipo IV, materiais sintéticos tais como EPTFE, e silicones de poliuretanoureia segmentados, tais como PURSPAN™ (The Polimer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.). A armação pode também compreender agentes anti-trombóticos tais como heparina; as armações podem também ser tratadas para alterar a carga da superfície (p. ex., revestimento com plasma) antes de serem semeadas com células estaminais da placenta. 5.6.2 Linhas de Células Estaminais da Placenta Imortalizadas

As células da placenta de mamífero podem ser condicionalmente imortalizadas através de transfecção com qualquer vector adequado contendo um gene de promoção do crescimento, isto é, um gene codificando uma proteína que, sob condições apropriadas, promove o crescimento da célula transfectada, de modo a que a produção e/ou actividade da proteína de promoção do crescimento seja regulável por um factor externo. Numa concretização preferida, o gene promotor de crescimento é um oncogene, tal como, mas não limitado a, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antigénio T grande de SV40, antigénio T grande de polioma, adenovírus de Ela ou proteína E7 de papilomavírus humano. 79 1 957 633/ΡΤ A regulação externa da proteína promotora do crescimento pode ser alcançada através da substituição do gene promotor de crescimento, sob o controlo de um promotor externamente regulável, p. ex., um promotor cuja actividade possa ser controlada por, por exemplo, modificação da temperatura das células transfectadas ou da composição do meio em contacto com as células. Numa concretização, um sistema de expressão génica controlado por tetraciclina (tet) pode ser empregue (ver Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 1518-1523, 1996). Na ausência de tet, um transactivador controlado por tet (tTA) dentro deste vector activa fortemente a transcrição a partir de phCjw*-i/· um promotor mínimo de citomegalovírus humano fundido com sequências de operador tet. tTA é uma proteína de fusão do repressor (tetR) do operão de resistência a tet derivado do transposão-10 de

Escherichia coli e o domínio acidico de VP16 do vírus de herpes simplex. Concentrações baixas e não tóxicas de tet (p. ex., 0,01-1,0 mg/ml) suprimem quase completamente a transactivação através de tTA.

Numa concretização, o vector contém ainda um gene codificando um marcador seleccionável, p. ex., uma proteína que confere resistência a um fármaco. O gene bacteriano de resistência a neomicina (neoR) é um tal marcador que pode ser empregue no âmbito da presente divulgação. As células possuindo neoR podem ser seleccionadas através de meios conhecidos dos vulgares peritos na técnica, tais como a adição de, p. ex., G418 a 100-200 g/ml ao meio de crescimento. A transfecção pode ser conseguida através de qualquer um de uma variedade de meios conhecidos dos peritos na técnica incluindo, mas não se limitando a, infecção retroviral. Em geral, uma cultura de células pode ser transfectada através de incubação com uma mistura de meio condicionado colhido a partir da linha celular produtora para o vector e DMEM/F12 contendo suplementos N2. Por exemplo, uma cultura de células da placenta preparada tal como descrito acima pode ser infectada após, p. ex., cinco dias in vitro através de incubação durante cerca de 20 horas num volume de meio 80 1 957 633/ΡΤ condicionado e dois volumes de DMEM/F12 contendo suplementos N2. As células transfectadas possuindo um marcador seleccionável podem então ser seleccionadas tal como descrito acima.

Após transfecção, as culturas são passadas sobre uma superfície que permite a proliferação, p. ex., permite que pelo menos 30% das células dupliquem num período de 24 horas.

De preferência, o substrato é um substrato de poliornitina/laminina, consistindo em plástico de cultura de tecidos revestido com poliornitina (10 g/ml) e/ou laminina (10 g/ml), um substrato de polilisina/laminina ou uma superfície tratada com fibronectina. As culturas são então alimentadas a cada 3-4 dias com meio de cultura que pode ou não ser suplementado com um ou mais factores estimuladores da proliferação. Os factores estimuladores da proliferação podem ser adicionados ao meio de crescimento quando as culturas são menos de 50% confluentes.

As linhas de células estaminais da placenta condicionalmente imortalizadas podem ser passadas utilizando técnicas padrão, tais como através de tripsinização, quando 80-95% confluentes. Até aproximadamente à vigésima passagem, é, nalgumas concretizações, benéfico manter a selecção (através de, por exemplo, adição de G418 para células contendo um gene de resistência à neomicina). As células podem também ser congeladas em azoto líquido para armazenamento de longo prazo.

Linhas celulares clonais podem ser isoladas a partir de uma linha de células estaminais de placenta humana imortalizadas condicionalmente preparada tal como descrito acima. Em geral, tais linhas celulares clonais podem ser isoladas utilizando técnicas padrão, tais como através de diluição limite ou utilização de anéis de clonagem, e expandidas. As linhas celulares clonais podem ser geralmente alimentadas e passadas tal como descrito acima.

As linhas de células estaminais de placenta humana imortalizadas condicionalmente que podem ser, mas não necessariamente, clonais, podem ser geralmente induzidas para se diferenciarem através de supressão da produção e/ou 81 1 957 633/ΡΤ actividade da proteína de promoção do crescimento em condições de cultura que facilitem a diferenciação. Por exemplo, se o gene codificando a proteína de promoção do crescimento estiver sob o controlo de um promotor regulável externamente, as condições, p. ex., temperatura ou composição do meio, podem ser modificadas para suprimir a transcrição do gene promotor de crescimento. Para o sistema de expressão génica controlado por tetraciclina discutido acima, a diferenciação pode ser conseguida através da adição de tetraciclina para suprimir a transcrição do gene promotor de crescimento. Em geral, tetraciclina a 1 mg/ml durante 4-5 dias é suficiente para iniciar a diferenciação. Para promover ainda mais a diferenciação, agentes adicionais podem ser incluídos no meio de crescimento. 5.6.3 Ensaios

As células estaminais da placenta para o presente invento podem ser utilizadas em ensaios para determinar a influência das condições de cultura, dos factores ambientais, de moléculas (p. ex., biomoléculas, pequenas moléculas inorgânicas, etc.) e semelhantes, na proliferação, expansão, e/ou diferenciação das células estaminais, em comparação com células estaminais da placenta não expostas a tais condições.

Numa concretização preferida, as células estaminais da placenta do presente invento são ensaiadas quanto a alterações na proliferação, expansão ou diferenciação após contacto com uma molécula. Numa concretização, por exemplo, é aqui divulgado um método de identificação de um composto que modula a proliferação de uma pluralidade de células estaminais da placenta, compreendendo o contacto da referida pluralidade de células estaminais com o referido composto sob condições que permitam a proliferação, em que se o referido composto causar uma alteração detectável na proliferação da referida pluralidade de células estaminais em comparação com uma pluralidade de células estaminais não colocada em contacto com o referido composto, o referido composto é identificado como um composto que modula a proliferação de células estaminais da placenta. Numa concretização especifica, o referido composto é identificado como um inibidor de proliferação. Noutra concretização específica, o 82 1 957 633/ΡΤ referido composto é identificado como um estimulador de proliferação.

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de identificação de um composto que modula a expansão de uma pluralidade de células estaminais da placenta, compreendendo o contacto da referida pluralidade de células estaminais com o referido composto sob condições que permitam a expansão, em que se o referido composto causar uma alteração detectável na expansão da referida pluralidade de células estaminais em comparação com uma pluralidade de células estaminais não colocada em contacto com o referido composto, o referido composto é identificado como um composto que modula a expansão de células estaminais da placenta. Numa concretização específica, o referido composto é identificado como um inibidor de expansão. Noutra concretização específica, o referido composto é identificado como um promotor de expansão.

Noutra concretização, é aqui divulgado um método de identificação de um composto que modula a diferenciação de uma célula estaminal da placenta, compreendendo o contacto das referidas células estaminais com o referido composto sob condições que permitam a diferenciação, em que se o referido composto causar uma alteração detectável na diferenciação das referidas células estaminais em comparação com uma célula estaminal não colocada em contacto com o referido composto, o referido composto é identificado como um composto que modula a proliferação de células estaminais da placenta. Numa concretização específica, o referido composto é identificado como um inibidor de diferenciação. Noutra concretização especifica, o referido composto é identificado como um promotor de diferenciação. 5.6.4 Banco de Células Estaminais da Placenta

As células estaminais de placentas pós-parto podem ser cultivadas de várias maneiras diferentes para produzir um conjunto de lotes, p. ex., um conjunto de doses administráveis individualmente, de células estaminais da placenta. Tais lotes podem, por exemplo, ser obtidos a partir de células estaminais de perfusato da placenta ou de tecido 83 1 957 633/ΡΤ placentário digerido com enzimas. Conjuntos de lotes de células estaminais da placenta, obtidos a partir de uma pluralidade de placentas, podem ser dispostos num banco de células estaminais da placenta para, p. ex., armazenamento a longo prazo. Geralmente, células estaminais aderentes são obtidas a partir de uma cultura inicial de material placentário para formar uma cultura de sementes, que é expandida sob condições controladas para formar populações de células a partir de números aproximadamente equivalentes de duplicações. Os lotes são de preferência derivados do tecido de uma única placenta, mas podem ser derivados do tecido de uma pluralidade de placentas.

Numa concretização, os lotes de células estaminais são obtidos como se segue. 0 tecido placentário é primeiro desfeito, p. ex., através de moagem, digerido com uma enzima adequada, p. ex., colagenase (ver Secção 5.2.3, acima). 0 tecido placentário compreende de preferência, p. ex., o âmnio inteiro, o córion inteiro, ou ambos, de uma única placenta, mas pode compreender apenas uma parte do âmnio ou do córion. 0 tecido digerido é cultivado, p. ex., durante cerca de 1-3 semanas, de preferência cerca de 2 semanas. Após remoção das células não aderentes, as colónias de elevada densidade que se formam são colhidas, p. ex., através de tripsinização. Estas células são colhidas e ressuspensas num volume conveniente de meio de cultura, e definidas como células da Passagem 0.

As células da Passagem 0 são então utilizadas para semear culturas de expansão. As culturas de expansão podem ser qualquer disposição de aparelhos de cultura de células separados, p. ex., uma Cell Factory de NUNC™. As células da cultura de Passagem 0 podem ser subdivididas em qualquer grau de modo a semear culturas de expansão com, p. ex., 1x10 2χ103, 3χ1θ\ 4χ103, 5xl03, 6χ103, 7xl03, 8xl03, 9xl03, 1x10 lxlO4, 2χ104, 3χ104, 4xl04, 5χ104, 6xl04, 7χ 104, 8xl04, 9x10 ou ΙΟχΙΟ4 células estaminais. De preferência, são utilizadas de cerca de 2xl04 a cerca de 3xl04 células de Passagem 0 para semear cada cultura de expansão. O número de culturas de expansão pode depender do número de células da Passagem 0, e pode ser maior ou menor em número dependendo da ou das 84 1 957 633/ΡΤ placentas particulares a partir das quais as células estaminais são obtidas.

As culturas de expansão são cultivadas até que a densidade de células na cultura alcance um determinado valor, p. ex., cerca de lxlO5 células/cm2. As células podem ser colhidas e criopreservadas neste ponto, ou passadas para novas culturas de expansão tal como descrito acima. As células podem ser passadas, p. ex., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 vezes antes da utilização. Um registo do número acumulado de duplicações da população é de preferência mantido durante a ou as culturas de expansão. As células de uma cultura da Passagem 0 podem ser expandidas durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40 duplicações, ou até 60 duplicações. De preferência, no entanto, o número de duplicações da população, antes da divisão da população de células em doses individuais, está entre cerca de 15 e cerca de 30, de preferência cerca de 20 duplicações. As células podem estar em cultura continuamente através do processo de expansão, ou podem ser congeladas num ou mais pontos durante a expansão.

As células a utilizar para doses individuais podem ser congeladas, p. ex., criopreservadas para posterior utilização. As doses individuais podem compreender, p. ex., cerca de 1 milhão a cerca de 100 milhões de células por ml, e podem compreender entre cerca de 106 e cerca de 109 células no total.

Numa concretização especifica do método, as células de Passagem 0 são cultivadas durante aproximadamente 4 duplicações, depois congeladas num primeiro banco de células. As células do primeiro banco de células são congeladas e utilizadas para semear um segundo banco de células, cujas células são expandidas durante mais cerca de oito duplicações. As células nesta fase são colhidas e congeladas e utilizadas para semear novas culturas de expansão que são deixadas prosseguir durante cerca de mais oito duplicações, levando o número cumulativo de duplicações celulares para cerca de 20. As células nos pontos intermédios na passagem podem ser congeladas em unidades de cerca de 100000 a cerca 85 1 957 633/ΡΤ de 10 milhões de células por ml, de preferência cerca de 1 milhão de células por ml para utilização em subsequente cultura de expansão. As células a cerca de 20 duplicações podem ser congeladas em doses individuais de entre cerca de 1 milhão a cerca de 100 milhões de células por ml para administração ou utilização na realização de uma composição contendo células estaminais.

Numa concretização preferida, a dadora a partir da qual a placenta é obtida (p. ex., a mãe) é testada para pelo menos um patogénio. Se a mãe testar positiva para um patogénio testado, todo o lote da placenta é descartado. Tal teste pode ser realizado em qualquer momento durante a produção de lotes de células estaminais da placenta, incluindo antes ou após o estabelecimento das células de Passagem 0, ou durante a cultura de expansão. Patogénios para os quais a presença é testada podem incluir, sem limitação, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E, vírus de imunodeficiência humana (tipos I e II), citomegalovírus, herpesvírus, e semelhantes. 5.6.5 Tratamento de Esclerose Múltipla

Noutro aspecto, é aqui divulgado um método de tratamento de um indivíduo possuindo esclerose múltipla, ou um sintoma associado a esclerose múltipla, compreendendo a administração ao indivíduo de uma pluralidade de células estaminais da placenta numa quantidade e durante um tempo suficientes para modular de forma detectável, p. ex., suprimir, uma resposta imunitária no indivíduo. A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crónica e recorrente do sistema nervoso central. A doença resulta em lesão das bainhas de mielina que envolvem os axónios, dos oligodendrócitos e das próprias células nervosas do SNC e SNP. A doença é mediada por células T auto-reactivas, particularmente células T CD4+, que proliferam, através da barreira hematoencefálica, e que entram no SNC sob a influência de moléculas de adesão celular e citocinas pró-inflamatórias. Os sintomas de EM incluem distúrbios sensoriais nos membros, disfunção do nervo óptico, disfunção 86 1 957 633/ΡΤ do trato piramidal, disfunção da bexiga, disfunção intestinal, disfunção sexual, ataxia e diplopia.

Foram identificados quatro tipos ou cursos clinicos diferentes de EM. 0 primeiro, EM recidivante/remitente (EMRR) é caracterizado por ataques auto-limitantes de disfunção neurológica que se manifestam de forma aguda, ao longo de um periodo de dias a semanas, seguido de um período de recuperação, por vezes incompleto, ao longo de vários meses. 0 segundo tipo, EM secundária progressiva (EMSP), começa como EMRR mas altera-se de modo a que o curso clínico se torna caracterizado por uma deterioração constante na função não relacionada com ataques agudos. 0 terceiro, EM progressiva primária (EMPP), é caracterizado por um declínio constante na função desde o início, sem ataques agudos. 0 quarto tipo, EM progressiva/recidivante (EMPR), também começa com um curso progressivo, com ataques ocasionais sobrepostos ao declínio progressivo da função.

As pessoas possuindo EM são geralmente avaliadas utilizando uma avaliação das capacidades motoras, opcionalmente com uma IRM. Por exemplo, uma avaliação de capacidades motoras, a escala do estado de incapacidade expandida, pontua gradações nas capacidades de um indivíduo afectado, como se segue: 0,0 Exame neurológico normal

1.0 Ausência de incapacidade, sinais mínimos num SF 1.5 Ausência de incapacidade, sinais mínimos em mais de

um SF

2.0 Incapacidade mínima num SF

2.5 Incapacidade leve num SF ou incapacidade mínima em dois SF 3.0 Incapacidade moderada num SF, ou incapacidade leve em três ou quatro SF. Totalmente em ambulatório. 3.5 Totalmente em ambulatório, mas com incapacidade moderada num SF e mais do que incapacidade mínima em vários outros 4,0

Totalmente em ambulatório sem ajuda, auto-suficiente até e cerca de umas 12 horas por dia, apesar da incapacidade relativamente grave; capaz de andar sem ajuda ou descanso cerca de 500 metros 87 1 957 633/ΡΤ 4.5 Totalmente em ambulatório sem ajuda até e cerca da maior parte do dia, capaz de trabalhar um dia inteiro, pode de outro modo ter alguma limitação da actividade total ou precisar de assistência mínima; caracterizado por incapacidade relativamente grave; capaz de andar sem ajuda ou descanso cerca de 300 metros 5.0 Ambulatório sem ajuda ou descanso durante cerca de 200 metros; incapacidade grave o suficiente para prejudicar as actividades diárias completas (trabalhar um dia inteiro sem disposições especiais) 5.5 Ambulatório sem ajuda ou descanso durante cerca de 100 metros; incapacidade grave o suficiente para impedir as actividades diárias completas 6.0 Assistência constante intermitente ou unilateral (bengala, muleta, aparelho) necessária para andar cerca de 100 metros, com ou sem descanso 6.5 Assistência bilateral constante (bengalas, muletas, aparelhos) necessária para andar cerca de 20 metros sem descansar 7.0 Incapaz de andar mais de aproximadamente cinco metros, mesmo com ajuda, essencialmente restringido a cadeira de rodas; roda sozinho em cadeira de rodas padrão e transfere-se sozinho; está e roda em cadeira de rodas cerca de 12 horas por dia. 7.5 Incapaz de dar mais do que alguns passos; restringido a cadeira de rodas; pode precisar de ajuda na transferência; roda sozinho, mas não pode continuar em cadeira de rodas padrão um dia inteiro; pode precisar de cadeira de rodas motorizada 8.0 Essencialmente restringido à cama ou a uma cadeira ou transportado em cadeias de rodas, mas pode estar fora da cama sozinho a maior parte do dia; mantém muitas funções de cuidados próprios; geralmente tem uso eficaz dos braços 8.5 Essencialmente restringido à cama a maior parte do dia; tem algum uso eficaz dos braços; mantém algumas das funções de cuidados próprios 9.0 Confinado à cama; pode ainda comunicar e comer 88 1 957 633/ΡΤ 9,5 Paciente acamado totalmente indefeso; incapaz de comunicar de forma eficaz ou comer/engolir

10,0 Morte por EM

No sistema de pontuação acima, "SF" refere-se aos oito sistemas funcionais medidos, incluindo piramidal, do cerebelo, tronco cerebral, sensorial, dos intestinos e da bexiga, visual, cerebral e outros sistemas. São conhecidos outros sistemas de pontuação semelhantes, incluindo a escala de classificação neurológica de Scripps, o índice ambulatório, e a pontuação composta funcional de esclerose múltipla (MSFC). O progresso da EM tem também sido avaliado através de uma determinação da frequência dos ataques. O progresso da EM tem também sido avaliado através de imagiologia de ressonância magnética, que pode detectar lesões neurais associadas a EM (p. ex., novas lesões, lesões a aumentar ou lesões activas únicas combinadas).

Assim, numa concretização, é aqui divulgado um método de tratamento de um indivíduo possuindo EM, p. ex., um indivíduo a quem foi diagnosticado EM, compreendendo a administração ao indivíduo de uma pluralidade de células estaminais da placenta suficiente para suprimir uma resposta imunitária no indivíduo. Numa concretização específica, a administração melhora de forma detectável um ou mais sintomas de EM no indivíduo. Em mais concretizações específicas, o sintoma é, p. ex., uma ou mais de uma perturbação sensorial nos membros, uma disfunção do nervo óptico, uma disfunção do tracto piramidal, uma disfunção da bexiga, uma disfunção intestinal, uma disfunção sexual, ataxia, ou diplopia. Numa outra concretização específica, a referida administração resulta numa melhoria na escala de EDSS de pelo menos meio ponto. Noutra concretização específica, a referida administração resulta numa melhoria na escala de EDSS de pelo menos um ponto. Noutra concretização especifica, a referida administração resulta numa melhoria na escala de EDSS de pelo menos dois pontos. Noutras concretizações específicas, a 89 1 957 633/ΡΤ referida administração resulta numa melhoria detectável numa escala de avaliação de esclerose múltipla ou numa IRM. A EM tem sido tratada com outros agentes terapêuticos, por exemplo agentes imunomoduladores ou imunossupressores, p. ex., interferão beta (IFN ), incluindo IFNla e IFN-lb; acetato de gliatriamero (COPAXONE®) ; ciclofosfamida; metotrexato; azatioprina (IMURAN®); cladribina (LEUSTATIN®) ; ciclosporina; mitoxantrona; e semelhantes. A EM tem também sido tratada com agentes terapêuticos anti-inflamatórios, tais como glucocorticóides, incluindo hormona adrenocorticotrópica (ACTH), metilprednisolona, dexametasona, e semelhantes. A EM tem também sido tratada com outros tipos de agentes terapêuticos, tais como imunoglobulina intravenosa, troca de plasma, ou sulfassalazina.

Assim, é aqui revelado o tratamento de um indivíduo possuindo EM, p. ex., um indivíduo a quem foi diagnosticado EM, compreendendo a administração ao indivíduo de uma pluralidade de células estaminais da placenta suficiente para suprimir uma resposta imunitária no indivíduo, em que a administração detectável melhora um ou mais sintomas de EM no indivíduo, e um ou mais agentes terapêuticos. Numa concretização, o agente terapêutico é um glucocorticóide. Em concretizações específicas, o glucocorticóide é hormona adrenocorticotrópica (ACTH), metilprednisolona, ou dexametasona. Noutra concretização, o agente terapêutico é um agente imunomodulador ou imunossupressor. Em várias concretizações específicas, o agente imunomodulador ou imunossupressor é IFN -la, IFN-lb, acetato de gliatriamero, ciclofosfamida, metotrexato, azatioprina, cladribina, ciclosporina ou mitoxantrona. Noutras concretizações, o agente terapêutico é imunoglobulina intravenosa, troca de plasma, ou sulfasalazina. Numa outra concretização, é administrado ao indivíduo qualquer combinação dos agentes terapêuticos anteriores.

Um indivíduo possuindo EM, p. ex., um indivíduo diagnosticado com EM, pode ser tratado com uma pluralidade de células estaminais da placenta, e, opcionalmente, um ou mais agentes terapêuticos, a qualquer momento durante a progressão da doença. Por exemplo, o indivíduo pode ser tratado 90 1 957 633/ΡΤ imediatamente após o diagnóstico, ou dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6 dias do diagnóstico, ou dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais semanas, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos após o diagnóstico. O indivíduo pode ser tratado uma vez, ou múltiplas vezes durante o curso clinico da doença. 0 indivíduo pode ser tratado, conforme apropriado, durante um ataque agudo, durante remissão, ou durante uma fase degenerativa crónica. Numa outra concretização, as células estaminais da placenta são administradas a uma mulher possuindo EM, pós-parto, para manter o estado de remissão ou de reduzida ocorrência de recaída experimentado durante a gravidez.

Numa concretização, é administrado ao indivíduo uma dose de cerca de 300 milhões de células estaminais da placenta. A dosagem, no entanto, pode variar de acordo com as características físicas do indivíduo, p. ex., peso, e pode variar de 1 milhão a 10 mil milhões de células estaminais da placenta por dose, de preferência entre 10 milhões e mil milhões por dose, ou entre 100 milhões e 50 milhões de células estaminais da placenta por dose. A administração é de preferência intravenosa, mas pode ser através de qualquer via aceite na técnica para a administração de células vivas. Numa concretização, as células estaminais da placenta são de um banco de células.

6. EXEMPLOS

6.1 EXEMPLO 1: CULTURA DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA

PLACENTA

As células estaminais da placenta são obtidas a partir de uma placenta de mamífero pós-parto através de perfusão ou através de ruptura física, p. ex., digestão enzimática. As células são cultivadas num meio de cultura compreendendo 60% de DMEM-LG (Gibco), 40% de MCDB-201 (Sigma), 2% de soro fetal de vitelo (FCS) (Hyclone Laboratories), insulina-transferrina-selénio (ITS) lx, ácido lenolénico-albumina de soro bovino (LA-BSA) lx, dexametasona 10~9 M (Sigma), ácido ascórbico-2-fosfato 10~4 M (Sigma), factor de crescimento epidérmico (EGF) a 10 ng/ml (R&D Systems), factor de 91

1 957 633/PT crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) a 10 ng/ml (R&D Systems), e 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina. O frasco de cultura em que as células são cultivadas é preparado como se segue. Frascos T75 são revestidos com fibronectina (FN), através da adição de 5 ml de PBS contendo 5 ng/ml de FN humana (Sigma F0895) ao frasco. Os frascos com solução de FN são deixados a 37°C durante 30 min. A solução de FN é então removida antes da cultura das células. Não é necessário secar os frascos após o tratamento. Alternativamente, os frascos são deixados em contacto com a solução de FN a 4°C de um dia para o outro ou mais; antes da cultura, os frascos são aquecidos e a solução de FN é removida. Células Estaminais da Placenta Isoladas Através de Perfusão

As culturas de células estaminais da placenta a partir de perfusato placentário são estabelecidas como se segue. Células a partir de um gradiente de Ficoll são semeadas em frascos T75 revestidos com FN, preparados tal como acima, a 50-100χ106 células/f rasco em 15 ml de meio de cultura. Tipicamente, são semeados 5 a 10 frascos. Os frascos são incubados a 37°C durante 12-18 h para permitir a fixação das células aderentes. 10 ml de PBS morno são adicionados a cada frasco para remover as células em suspensão, e suavemente misturados. 15 ml do meio são então removidos e substituídos com 15 ml de meio de cultura. Todo o meio é mudado 3-4 dias após o início da cultura. São realizadas mudanças de meio de cultura subsequentes, durante as quais são removidos 50% ou 7,5 ml do meio.

Começando cerca do dia 12, a cultura é verificada ao microscópio para analisar o crescimento das colónias de células aderentes. Quando as culturas de células se tornam aproximadamente 80% confluentes, tipicamente entre o dia 13 e o dia 18 após o início da cultura, as células aderentes são colhidas através de digestão com tripsina. As células colhidas a partir destas culturas primárias são designadas passagem 0 (zero). 92 1 957 633/ΡΤ Células Estaminais da Placenta Isoladas através de Ruptura Física e Digestão Enzimática

As culturas de células estaminais da placenta são estabelecidas a partir de tecido placentário digerido como se segue. A placenta perfundida é colocada sobre uma folha de papel estéril com o lado materno para cima. Aproximadamente 0,5 cm da camada superficial no lado materno da placenta são raspados com uma lâmina, e a lâmina é utilizada para remover um bloco de tecido placentário medindo aproximadamente 1x2x1 cm. Este tecido placentário é então triturado em pedaços de cerca de 1 mm3. Estes pedaços são colhidos num tubo Falcon de 50 ml e digeridos com colagenase IA (2 mg/ml, Sigma) durante 30 minutos, seguido de tripsina-EDTA (0,25%, GIBCO BRL) durante 10 minutos, a 37°C em banho-maria. A solução resultante é centrifugada a 400 g durante 10 minutos à temperatura ambiente, e a solução de digestão é removida. O sedimento é ressuspenso a aproximadamente 10 volumes com PBS (por exemplo, um sedimento de 5 ml é ressuspenso com 45 ml de PBS), e os tubos são centrifugados a 400 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento de tecido/células é ressuspenso em 130 ml de meio de cultura, e as células são semeadas a 13 ml por frasco T-75 revestido com fibronectina. As células são incubadas a 37°C com uma atmosfera húmida com CO2 a 5%. As Células Estaminais da Placenta são opcionalmente criopreservadas nesta fase.

Subcultura e Expansão de Células Estaminais da Placenta

As células criopreservadas são rapidamente descongeladas num banho-maria a 37°C. As células estaminais da placenta são imediatamente removidas do criotubo com 10 ml de meio morno e transferidas para um tubo de 15 ml estéril. As células são centrifugadas a 400 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células são cuidadosamente ressuspensas em 10 ml de meio de cultura morno através de pipetagem, e as contagens de células viáveis são determinadas através de exclusão de Azul tripano. As células são então semeadas a cerca de 6000-7000 células por cm2 em frascos revestidos com FN, preparados tal como acima (aproximadamente 5xl05 células por frasco T-75) . As células são incubadas a 37°C, C02 a 5% e humidade a 90%. Quando as células alcançam 75-95% de confluência, todo o 93 1 957 633/ΡΤ meio gasto é removido assepticamente dos frascos e descartado. 3 ml de solução de tripsina/EDTA a 0,25% (p/v) são adicionados para cobrir a camada celular, e as células são incubadas a 37°C, C02 a 5% e humidade a 90% durante 5 minutos. O frasco é batido uma vez ou duas vezes para agilizar o desprendimento das células. Uma vez >95% das células arredondadas e desprendidas, são adicionados 7 ml de meio de cultura morno a cada frasco T-75, e a solução é dispersa através de pipetagem sobre a superfície da camada celular várias vezes.

Após contagem das células e determinação da viabilidade tal como acima, as células são centrifugadas a 1000 RPM durante 5 minutos à temperatura ambiente. As células são passadas através de ressuspensão suave do sedimento celular de um frasco T-75 com meio de cultura, e plaqueamento de forma uniforme das células em dois frascos T-75 revestidos com FN.

Utilizando os métodos acima, são identificadas populações de células estaminais da placenta aderentes que expressam os marcadores CD105, CD117, CD33, CD73, CD29, CD44, CD10, CD90 e CD133. Esta população de células não expressou CD3 4 ou CD45. Algumas, mas não todas as culturas destas células estaminais da placenta expressaram HLA-ABC e/ou HLA-DR.

6.2 EXEMPLO 2: ISOLAMENTO DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA A PARTIR DE ESTRUTURAS PLACENTÁRIAS 6.2.1 Materiais & Métodos 6.2.1.1 Isolamento do Fenótipo de Interesse

Cinco populações distintas de células da placenta foram obtidas a partir das placentas de gravidezes normais, de termo. Todas as dadoras forneceram consentimento completo por escrito para a utilização das suas placentas para fins de investigação. Cinco populações de células foram examinadas: células da placenta de (1) perfusato placentário (de perfusão da vasculatura placentária) ; e digestões enzimáticas de (2) âmnio, (3) córion, (4) placa cório-amniótica e (5) células do 94 1 957 633/ΡΤ cordão umbilical de digestão enzimática. Os vários tecidos foram limpos em PBS estéril (Gibco-Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) e colocados em caixas de Petri estéreis separadas. Os vários tecidos foram picados utilizando um bisturi cirúrgico estéril e colocados em tubos cónicos Falcon de 50 ml. Os tecidos picados foram digeridos com Colagenase lx (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 20 minutos num banho-maria a 37°C, centrifugados e, em seguida, digeridos com tripsina-EDTA a 0,25% (Gibco-Invitrogen Corp.) durante 10 minutos num banho-maria a 37°C. Os vários tecidos foram centrifugados após digestão e lavados uma vez com PBS estéril (Gibco-Invitrogen Corp.). As células reconstituídas foram então filtradas duas vezes, uma vez com filtros celulares de 100 pm e uma vez com filtros de separação de 30 pm, para remover qualquer matriz extracelular residual ou restos celulares. 6.2.1.2 Avaliação da Viabilidade Celular e Contagens de Células O método manual de exclusão de azul tripano foi empregue após digestão para calcular as contagens de células e avaliar a viabilidade celular. As células foram misturadas com Corante Azul Tripano (Sigma-Aldrich) a uma razão de 1:1, e as células foram lidas num hemacitómetro. 6.2.1.3 Caracterização dos Marcadores da Superfície Celular

As células que eram HLA ABC~/CD45~/CD34~/CD133+ foram seleccionadas para caracterização. As células possuindo este fenótipo foram identificadas, quantificadas, e caracterizadas através de dois citómetros de fluxo Becton-Dickinson, o FACSCalibur e o FACS Aria (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). AS várias células da placenta foram coradas, a uma razão de cerca de 10 pL de anticorpo por 1 milhão de células, durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador. Foram utilizados os seguintes anticorpos anti-humano: anticorpos monoclonais conjugados com Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) contra HLA-G (Serotec, Raleigh, NC) , CD10 (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) , CD44 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA) e CD105 (R&D Systems Inc., 95 1 957 633/ΡΤ

Minneapolis, MN); anticorpos monoclonais conjugados com Ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117 e CD13 (BD Biosciences Pharmingen); Estreptavidina e anticorpos

monoclonais conjugados com Ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) contra CD117 (BD Biosciences Pharmingen); anticorpos monoclonais conjugados com Ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 e CD10 (BD Biosciences); estreptavidina e anticorpos monoclonais conjugados com Aloficocianina (APC) contra CD38 (BD

Biosciences Pharmingen); e CD90 Biotinilada (BD Biosciences Pharmingen). Após incubação, as células foram lavadas uma vez para remover os anticorpos não ligados e foram fixadas de um dia para o outro com paraformaldeido a 4% (USB, Cleveland, OH) a 4°C. No dia seguinte, as células foram lavadas duas vezes, filtradas através de um filtro de separação de 30 pm, e foram corridas no ou nos citómetros de fluxo.

As amostras que foram coradas com anticorpos anti-IgG de ratinho (BD Biosciences Pharmingen) foram utilizadas como controlos negativos e foram utilizadas para ajustar os Tubos Fotomultiplicadores (PMT). As amostras que foram coradas apenas com anticorpos anti-humano foram utilizadas como controlos positivos e foram utilizadas para ajustar sobreposições/compensações espectrais. 6.2.1.4 Separação de Células e Cultura

Um conjunto de células da placenta (do perfusato, âmnio, ou córion) foi corado com 7-Amino-Actinomicina D (7AAD; BD Biosciences Pharmingen) e anticorpos monoclonais específicos para o fenótipo de interesse. As células foram coradas a uma razão de 10 1 de anticorpo por 1 milhão de células, e foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador. Estas células foram então separadas de forma positiva para células vivas expressando o fenótipo de interesse no BD FACS Aria e plaqueadas em cultura. As populações de células placentárias separadas (população de interesse) e "Todas" (não separadas) foram plaqueadas para comparações. As células foram plaqueadas sobre uma placa de 96 poços revestidos com fibronectina (Sigma-Aldrich) nas densidades celulares listadas na Tabela 1 (células/cm2) . A densidade celular, e se o tipo celular era plaqueado em 96 1 957 633/ΡΤ duplicado ou triplicado, foi determinado e governado pelo número de células expressando o fenótipo de interesse.

Tabela I: Densidades de plaqueamento das células

Cultura em Placas de 96 Poços Densidade de Células Plaqueadas Condições Separadas Todas Todas Densidade Max. Fonte Celular A Conjunto #1 40,6 K/cm2 40,6 K/cm2 93,8 K/cm2 Conjunto #2 40,6 K/cm2 40,6 K/cm2 93,8 K/cm2 Conjunto #3 40,6 K/cm2 40,6 K/cm2 93,8 K/cm2 Fonte Celular B Conjunto #1 6,3 K/cm2 6,3 K/cm2 62,5 K/cm2 Conjunto #2 6,3 K/cm2 6,3 K/cm2 62,5 K/cm2 Fonte Celular C Conjunto #1 6,3 K/cm2 6,3 K/cm2 62,5 K/cm2 Conjunto #2 6,3 K/cm2 6,3 K/cm2 62,5 K/cm2 0 meio completo (DMEM-LG a 60% (Gibco) e MCDB-201 a 40% (Sigma); soro fetal de vitelo a 2% (Hyclone Labs.); insulina-transferrina-selénio (ITS) lx; ácido linoleico-albumina de soro bovino (LA-BSA) lx; dexametasona 10~9 M (Sigma); ácido ascórbico-2-fosfato 10“4 M (Sigma); factor de crescimento epidérmico a 10 ng/ml (R&D Systems); e factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) a 10 ng/ml (R&D Systems)) foi adicionado a cada poço da placa de 96 poços e a placa foi colocada numa incubadora com CO2 a 5%/37°C. No dia 7, 100 μΐ de meio completo foi adicionado a cada um dos poços. A placa de 96 poços foi monitorizada durante cerca de duas semanas e uma avaliação final da cultura foi concluída no dia 12. 6.2.1.5 Análise dos Dados

Os dados de FACSCalibur foram analisados em FlowJo (Tree star, Inc) utilizando técnicas de portões padrão. Os dados de BD FACS Aria foram analisados utilizando o suporte lógico FACSDiva (Becton-Dickinson) . Os dados de FACS Aria foram analisados utilizando portões de discriminação de dupleto para minimizar dupletos, bem como, técnicas de portões padrão. Todos os resultados foram compilados em Microsoft 97 1 957 633/ΡΤ

Excel e todos os valores, aqui, são representados como média ± desvio padrão (número, erro padrão da média). 6.2.2 Resultados 6.2.2.1 Viabilidade Celular A viabilidade pós-digestão foi avaliada utilizando o método manual de exclusão de azul tripano (FIG. 1). A viabilidade média das células obtidas da maioria do tecido digerido (do âmnio, córion ou placa cório-amniótica) foi de cerca de 70%. As células do âmnio tinham uma viabilidade média de 74,35% ± 10,31% (n=6, EPM=4,21), do córion tinham uma viabilidade média de 78,18% ± 12,65% (n=4, EPM=6,32), da placa cório-amniótica tinham uma viabilidade média de 69,05% ± 10,80% (n=4, EPM=5,40), e do cordão umbilical tinham uma viabilidade média de 63,30% ± 20,13% (n=4, EPM=10,06). As células de perfusão, que não foram submetidas a digestão, mantiveram a viabilidade média mais elevada, 89,98 ± 6,39% (n=5, EPM=2,86). 6.2.2.2 Quantificaçao Celular

As cinco populações distintas de células derivadas da placenta foram analisadas para determinar o número de células HLA ABC /CD45 /CD34-/CD133 +. A partir da análise dos dados de BD FACSCalibur, observou-se que o âmnio, perfusato, e córion continham o maior número total destas células, 30,72 ± 21,80 células (n=4, EPM=10,90), 26,92 ± 22,56 células (n=3, EPM=13,02), e 18,3916,44 células (n=2, EPM=4,55), respectivamente (dados não mostrados). A placa cório-amniótica e o cordão umbilical continham o menor número total de células expressando o fenótipo de interesse, 4,72 ± 4,16 células (n=3, EPM=2,40) e 3,94 ± 2,58 células (n=3, EPM=1,49), respectivamente (dados não mostrados).

De forma semelhante, quando foi analisada a percentagem de células totais expressando o fenótipo de interesse, observou-se que o âmnio e o perfusato placentário continham as percentagens mais elevadas de células expressando este fenótipo (0,0319% ± 0,0202% (n=4, EPM=0,0101) e 0,0269% ± 0,0226% (n=3, EPM=0,0130), respectivamente (FIG. 2). Embora o 98

1 957 633/PT cordão umbilical contivesse um pequeno número de células expressando o fenótipo de interesse (FIG. 2), continha a terceira percentagem mais elevada de células expressando o fenótipo de interesse, 0,020 ± 0,0226% (n=3, EPM=0,0131) (FIG. 2) . O córion e a placa cório-amniótica continham as menores percentagens de células expressando o fenótipo de interesse, 0,0184 ± 0,0064% (n=2, EPM=0,0046) e 0,0177 ± 0,0173% (n=3, EPM=0,010), respectivamente (FIG. 2).

Consistentes com os resultados da análise de BD FACSCalibur, os dados de BD FACS Aria identificaram também âmnio, perfusato, e córion como proporcionando um número mais elevado de células HLA ABC~ /CD45~/CD34~/CD133+ células que as restantes fontes. O número total médio de células expressando o fenótipo de interesse entre âmnio, perfusato, e córion foi de 126,47 ± 55,61 células (n=15, EPM=14,36), 81,65 ± 34,64 células (n=20, EPM=7,75), e 51,47 ± 32,41 células (n=15, EPM=8,37), respectivamente (dados não mostrados). A placa cório-amniótica e o cordão umbilical continham o menor número total de células expressando o fenótipo de interesse, 44,89 ± 37,43 células (n=9, EPM=12,48) e 11,00 ± 4,03 células (n=9, EPM=1,34), respectivamente (dados não mostrados).

Os dados de BD FACS Aria revelaram que as fontes de células B e A continham as percentagens mais elevadas de células HLA ABCVCD45“/CD34~/CD133 + , 0,1523 ± 0, 0227% (n=15, EPM=0,0059) e 0,0929 ± 0,0419% (n=20, EPM=0,0094), respectivamente (FIG. 3). A fonte de células D continha a terceira percentagem mais elevada de células expressando o fenótipo de interesse, 0,0632 ± 0,0333% (n=9, EPM=0,0111) (FIG. 3) . As fontes de células C e E continham as percentagens mais baixas de células expressando o fenótipo de interesse, 0,0623 ± 0,0249% (n=15, EPM=0,0064) e 0,0457 ± 0,0055% (n=9, EPM=0,0018), respectivamente (FIG. 3).

Após as células HLA ABC~/CD45”/CD34~/CD133+ serem identificadas e quantificadas a partir de cada fonte celular, as suas células foram ainda analisadas e caracterizadas quanto à sua expressão dos marcadores da superfície celular HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200, e CD105. 99 1 957 633/ΡΤ 6.2.2.3 Células Derivadas de Perfusato de

Placenta

As células derivadas de perfusato foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, e CD13 (FIG. 4) . A expressão média de cada marcador para as células derivadas de perfusato foi a seguinte: 37,15% ± 38,55% (n=4, EPM=19,28) das células expressaram HLA-G; 36,37% ± 21,98% (n=7, EPM=8,31) das células expressaram CD33; 39,39% ± 39,91% (n=4, EPM=19,96) das células expressaram CD117; 54,97% ± 33,08% (n=4, EPM=16,54) das células expressaram CD10; 36,79% ± 11,42% (n=4, EPM=5,71) das células expressaram CD44; 41,83% ± 19,42% (n=3, EPM=11,21) das células expressaram CD200; 74,25% ± 26,74% (n=3, EPM=15,44) das células expressaram CD90; 35,10% ± 23,10% (n=3, EPM=13,34) das células expressaram CD38; 22,87% ± 6,87% (n=3, EPM=3,97) das células expressaram CD105; e 25,49% ± 9,84% (n=3, EPM=5,68) das células expressaram CD13. 6.2.2.4 Células Derivadas de Âmnio

As células derivadas de âmnio foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD 117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, e CD13 (FIG. 5). A expressão média de cada marcador para as derivadas de âmnio foi a seguinte: 57,27% ± 41,11% (n=3, EPM=23,73) das células expressaram HLA-G; 16,23% ± 15,81% (n=6, EPM=6,46) das células expressaram CD33; 62,32% ± 37,89% (n=3, EPM=21,87) das células expressaram CD117; 9,71% ± 13,73% (n=3, EPM=7,92) das células expressaram CD10; 27,03% ± 22,65% (n=3, EPM=13,08) das células expressaram CD44; 6,42% ± 0,88% (n=2, EPM=0,62) das células expressaram CD200; 57,61% ± 22,10% (n=2, EPM=15,63) das células expressaram CD90; 63,76% ± 4,40% (n=2, EPM=3,11) das células expressaram CD38; 20,27% ± 5,88% (n=2, EPM=4,16) das células expressaram CD105; e 54,37% ± 13,29% (n=2, EPM=9,40) das células expressaram CD13. 6.2.2.5 Células Derivadas do Córion

As células derivadas de córion foram consistentemente positivas para HLA-G, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, e 100 1 957 633/ΡΤ CD13, enquanto a expressão de CD33, e CD105 variou (FIG. 6). A expressão média de cada marcador para as células de córion foi a seguinte: 53,25% ± 32,87% (n=3, EPM=18,98) das células expressaram HLA-G; 15,44% ± 11,17% (n=6, EPM=4,56) das células expressaram CD33; 70,76% ± 11,87% (n=3, EPM=6,86) das células expressaram CD117; 35,84% ± 25,96% (n=3, EPM=14,99) das células expressaram CD10; 28,76% ± 6,09% (n=3, EPM=3,52) das células expressaram CD44; 29,20% ± 9,47% (n=2, EPM=6,70) das células expressaram CD200; 54,88% ± 0,17% (n=2, EPM=0,12) das células expressaram CD90; 68,63% ± 44,37% (n=2, EPM=31,37) das células expressaram CD38; 23,81% ± 33,67% (n=2, EPM=23,81) das células expressaram CD105; e 53,16% ± 62,70% (n=2, EPM=44,34) das células expressaram CD13. 6.2.2.6 Células da Placenta da Placa Cório- amniótica

As células da placa cório-amniótica foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, e CD13 (FIG. 7) . A expressão média de cada marcador para as células derivadas da placa cório-amniótica foi a seguinte: 78,52% ± 13,13% (n=2, EPM=9,29) das células expressaram HLA-G; 38,33% ± 15,74% (n=5, EPM=7,04) das células expressaram CD33; 69,56% ± 26,41% (n=2, EPM=18,67) das células expressaram CD117; 42,44% ± 53,12% (n=2, EPM=37,56) das células expressaram CD10; 32,47% + 31,78% (n=2, EPM=22,47) das células expressaram CD44; 5,56% (n=l) das células expressaram CD200; 83,33% (n=l) das células expressaram CD90; 83,52% (n=l) das células expressaram CD38; 7,25% (n=l) das células expressaram CD105; e 81,16% (n=l) das células expressaram CD13. 6.2.2.7 Células_Derivadas_do_Cordão

Umbilical

As células derivadas do cordão umbilical foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD90, CD38, CD105, e CD13, enquanto a expressão de CD117, CD10, CD44, e CD200 variou (FIG. 8) . A expressão média de cada marcador para as células derivadas do cordão umbilical foi a seguinte: 62,50% ± 53,03% (n=2, EPM=37,50) das células expressaram HLA-G; 25,67% ± 11,28% (n=5, EPM=5,04) das células expressaram 101 1 957 633/ΡΤ CD33; 44,45% ± 62,85% (η=2, ΕΡΜ=44,45) das células expressaram CD117; 8,33% ± 11,79% (η=2, ΕΡΜ=8,33) das células expressaram CD10; 21,43% ± 30,30% (n=2, EPM=21,43) das células expressaram CD44; 0,0% (n=l) das células expressaram CD200; 81,25% (n=l) das células expressaram CD90; 64,29% (n=l) das células expressaram CD38; 6,25% (n=l) das células expressaram CD105; e 50,0% (n=l) das células expressaram CD13 .

Um resumo de todas as médias de expressão dos marcadores é mostrado na FIG. 9.

6.2.2.8 Relatório de Separação por BD FACS

Ar ia

As três populações distintas de células da placenta que expressaram as percentagens mais elevadas de HLA ABC, CD45, CD34 e CD133 (células derivadas de perfusato, âmnio e córion) foram coradas com 7AAD e os anticorpos para estes marcadores. As três populações foram separadas de forma positiva para células vivas expressando o fenótipo de interesse. Os resultados da separação por BD FACS Aria estão listados na Tabela 2.

Tabela 2:

Relatório de Separação por BD FACS Aria Fonte Celular Eventos Processados Eventos Separados (Fenótipo de Interesse) % do Total Perfusato 135540110 51215 0,037786 Âmnio 7385933 4019 0,054414 Córion 108498122 4016 0,003701

As três populações distintas de células separadas positivamente ("separadas") e suas células não separadas correspondentes foram plaqueadas e os resultados da cultura foram avaliados no dia 12 (Tabela 3). As células derivadas de perfusato separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 40600/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. Dois dos três conjuntos de células derivadas de 102 1 957 633/ΡΤ perfusato não separadas, cada um plaqueado a uma densidade celular de 40600/cm2, resultaram principalmente em células pequenas, redondas não aderentes com várias células aderentes localizadas em redor da periferia do poço. As células derivadas de perfusato não separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 93800/cm2, resultaram principalmente em células pequenas, redondas, não aderentes com várias células aderentes localizadas em torno das periferias dos poços.

As células derivadas de âmnio separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de âmnio não separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de âmnio não separadas plaqueadas a uma densidade celular de 62500/cm2 resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes.

As células derivadas de córion separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de córion não separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de córion não separadas plaqueadas a uma densidade celular de 62500/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes.

6.3 EXEMPLO 3: DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA

As células estaminais da placenta aderentes foram diferenciadas em várias linhagens celulares diferentes. As células estaminais da placenta aderentes foram isoladas a partir da placenta através de ruptura física do tecido de locais anatómicos dentro da placenta, incluindo a membrana amniótica, o córion, os cotilédones placentários, ou qualquer combinação destes, e as células estaminais do cordão umbilical foram obtidas através de ruptura física do tecido do cordão umbilical.

As células estaminais da placenta e as células estaminais do cordão umbilical foram estabelecidas num meio 103 1 957 633/ΡΤ contendo baixas concentrações de soro fetal de vitelo e factores de crescimento limitados. A análise de citometria de fluxo mostrou que as células estaminais da placenta exibiam tipicamente um fenótipo CD200+ CD105+ CD73+ CD34~ CD45~ em percentagens >70%. Verificou-se que as células estaminais da placenta se diferenciavam em linhagens de adipócitos, condrócitos e osteócitos.

Num meio de indução contendo IBMX, insulina, dexametasona e indometacina, as células estaminais da placenta tornavam-se adipócitos carregados de gordura em 3 a 5 semanas. Sob condições de cultura de indução osteogénica, verificou-se que a células estaminais da placenta formavam nódulos ósseos e têm deposições de cálcio na sua matriz extracelular. A diferenciação condrogénica de PDAC foi realizada em microssedimentos e foi confirmada através da formação de glicosaminoglicanos nos agregados de tecido.

6.4 EXEMPLO 4: IMUNOMODULAÇÃO UTILIZANDO CÉLULAS

ESTAMINAIS DA PLACENTA

As células estaminais da placenta possuem um efeito imunomodulador, incluindo supressão da proliferação de células T e células assassinas naturais. As seguintes experiências demonstram que as células estaminais da placenta têm a capacidade de modular a resposta de células T para estimulação em dois ensaios, o ensaio de reacção linfocitária mista e o ensaio de regressão. 6.4.1 Ensaios de Reacção Linfocitária Mista A MLR mede a reacção de uma população efectora contra uma população alvo. Os efectores podem ser linfócitos ou subpopulações purificadas, tais como células T CD8+ ou células NK. A população alvo são PBMC irradiados alogénicos, ou tal como nos presentes estudos, DC maduras. A população que responde consiste em células alo-específicas, estimadas a 20% das células T totais. A MLR de células estaminais da placenta modificada utiliza células estaminais da placenta na reacção. 104 1 957 633/ΡΤ

As células estaminais da placenta foram plaqueadas em placas de 96 poços, e foi adicionada a população efectora. Células estaminais da placenta e efectoras coradas com éster IV-succinimidil de diacetato de 5 (6)-carboxifluoresceina (CFSE) foram pré-incubadas durante 24 horas antes das DC alvo, maduras, serem adicionadas. Após seis dias, os sobrenadantes e as células não aderentes foram colhidas. Os sobrenadantes foram analisados através de análise de contas Luminex, e as células foram analisadas através de citometria de fluxo.

Classicamente, a MLR produz uma resposta proliferativa tanto no compartimento das células T CD8+ como de CD4+. Esta resposta é uma resposta de células T ingénuas, uma vez que os dois dadores alogeneicos nunca se encontraram antes. Tanto as as células T CD4+ como CD8+ proliferaram vigorosamente na MLR padrão. Quando as células estaminais da placenta foram adicionadas à MLR, a proliferação de células T CD4 e CD8, medida através da percentagem de células respondedoras CFSEBaixo, foi atenuada. O efeito de adição de células estaminais da placenta a uma MLR (PMLR) pode ser observado nas FIGS. 10A e 10B (gráfico de PMLR) e FIG. 11. Os resultados foram semelhantes quer apenas células T CD4+ ou CD8+ fossem utilizadas individualmente, quer fossem utilizadas as mesmas quantidades de células T CD4+ e CD8+ juntas. As células estaminais da placenta obtidas a partir do estroma do córion-âmnio ou de cordão umbilical suprimiram a MLR em extensões semelhantes, e não foi observada diferença na supressão entre células T CD4+ e células T CD8+. Isto foi também verdade para as reacções de células T em bruto.

Uma MLR separada foi realizada utilizando células T CD4 + , células T CD8 + , ou células T CD4+ e CD8 + , e células dendriticas alogénicas (DC) . As células estaminais da placenta foram adicionadas à MLR e o grau de proliferação das células T foi avaliado, utilizando uma MLR sem células estaminais da placenta como controlo. Células T CD4+ e CD8+, e monócitos CD14+, foram isolados a partir de camadas leuco-plaquetárias utilizando colunas 105 1 957 633/ΡΤ

Miltenyi MACS e contas, utilizadas de acordo com as instruções do fabricante. As células dendriticas foram obtidas através de uma cultura de monócitos de seis dias em RPMI 1640 suplementada com plasma do dador a 1%, IL-4, e GM- CSF, e uma cultura de dois dias em RPMI 1640 suplementada com IL-1 , TNF- , e IL-6. Células T alogeneicas e DC na razão T: DC de 10:1 foram incubadas para produzir uma MLR clássica de 6 dias. A proliferação de células T foi avaliada através da coloração de células T com CFSE (Diacetato de carboxi-fluoresceina, éster succinimidil) antes de serem adicionadas ao ensaio. CSFE é utilizado para avaliar o grau de proliferação através da medição da diluição da mancha entre populações de células filhas.

Para este ensaio, as células estaminais da placenta (PSC) foram adicionadas na razão T:DC:PSC de 10:1:2. A reacção foi montada numa placa de 96 poços num volume final de 200 1 de RPMI 1640 suplementado com soro humano reunido a 5% (R5) . Após seis dias, as células não aderentes foram

brevemente ressuspensas e transferidas para um tubo de 5 ml lavado com RPMI, e coradas com anticorpo CD4 e CD8. A proliferação do compartimento de CD4 e CD8 foi avaliada num BD FACS Calibur. Células estaminais da placenta. As células estaminais da placenta foram obtidas tal como descrito nos Exemplos 1 e 2, acima. As células estaminais da placenta foram obtidas a partir dos seguintes tecidos placentários: âmnio (AM), ou âmnio/córion (AC). As células estaminais do cordão umbilical foram obtidas a partir da digestão do cordão umbilical (CU).

Os fibroblastos (FB) e as células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea (MSC) foram adicionadas como controlos.

Resultados. Quando as células estaminais da placenta são adicionadas à MLR, a proliferação de células T é diminuída (FIG. 11). As células estaminais da placenta utilizadas nas experiências reflectidas na FIG. 12 foram derivadas de uma placenta, designada 61665. Para todas as células estaminais da placenta testadas, quando células T CD4+ e CD8+ mas não ambas foram utilizadas, o compartimento de CD4+ foi suprimido numa maior grau que o compartimento de CD8+ (FIG. 12A) . A 106 1 957 633/ΡΤ supressão através de células estaminais da placenta AM e CU da activação de CD4+ foi mais ou menos equivalente à supressão mediada por MSC, com uma supressão de cerca de 60%-75%. Quando a MLR foi corrida utilizando células T tanto CD4+ como CD8+, as células estaminais da placenta suprimiram a proliferação no compartimento de CD4+ numa grau muito maior que no compartimento de CD8+ (FIG. 12B) . Em particular, a supressão da proliferação de células T CD4+ através de células estaminais da placenta AM aproximou-se de 90%, excedendo a supressão mostrada pelas MSC. A diferença na supressão entre estes dois compartimentos foi mais notável para as células estaminais da placenta AM e CA.

As células estaminais da placenta de diferentes dadores suprimem a proliferação de células T na MLR num grau diferente (FIG. 13). As células estaminais da placenta de uma placenta diferente, designada 65450, suprimiram a proliferação de células T CD4+ e CD8+ na MLR de forma diferente das células estaminais da placenta da placenta 61665. Surpreendentemente, as PSC CA e CU da placenta 65450 suprimiram a proliferação de células T de 80% a 95%, excedendo a supressão neste ensaio pelas MSC. As células estaminais da placenta CA da placenta 65450, no entanto, não suprimiram a proliferação de células T a um grau apreciável (comparar a supressão de células estaminais da placenta AM na FIG. 12A).

As células estaminais da placenta suprimiram também a actividade das células Assassinas Naturais (NK) na MLR. 6.4.2 Ensaio de Regressão

Mostrou-se que as células estaminais da placenta num ensaio de regressão suprimem uma resposta de células T a uma linha celular B expressando antigénios do virus de Epstein-Barr (EBV) . 0 ensaio de regressão é um ensaio de recordação que mede os mecanismos de células T efectoras trazidos pela apresentação de péptidos de antigénios de EBV em células B transformadas por EBV de MHC de classe I e II. 0 ensaio é realizado através da mistura de células T com uma linha de células B transformada criada artificialmente, a linha de células linfoblastóides (LCL) do mesmo dador. A LCL expressa 107 1 957 633/ΡΤ nove antigénios do vírus de Epstein-Barr que desencadeiam entre eles uma variedade de respostas adaptativas de células T e B, embora no ensaio de regressão clássico apenas sejam medidos os mecanismos efectores de células T. O ensaio de regressão oferece um modo conveniente de medição da citotoxicidade para alvos infectados com um patogénio de ocorrência natural, por a LCL expressar o marcador de células B activadas, CD23. Portanto, a contagem de células expressando CD23 é uma medida do número de LCL que sobrevivem no ensaio. 0 ensaio de regressão clássico de dezassete dias deu resultados semelhantes aos observados no primeiro conjunto de barras na FIG. 14. Não foram detectadas células CD23+, uma vez que foram todas mortas por células T CD4+ e CD8+. Com a adição de células estaminais da placenta, observada nos dois conjuntos de barras seguintes, a sobrevivência das células CD23+ foi aumentada. Sem pretender estar preso à teoria, podem ser dadas para duas explicações para o efeito observado. Ou as células T tinham morrido, e deixado para trás a LCL a expandir-se livremente, ou as células estaminais da placenta aumentaram principalmente a longevidade da LCL, tendo tido um menor efeito sobre as células T.

Num ensaio de regressão separado, as células T e as células dendríticas foram obtidas a partir de dadores de laboratório. As linhas de células B transformadas com vírus de Epstein-Barr, LCL, foram obtidas através da incubação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) com sobrenadante de uma linha lítica de EBV, B95.8, e ciclosporina A durante duas semanas. A LCL expressava 9 antigénios de EBV. A linha LCL que cresceu mais é mantida em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitelo a 10%. O ensaio de regressão foi realizado através da mistura de células T CD4+ ou CD8+ com LCL autólogas numa razão T:LCL de 10:1. O ensaio foi realizado numa placa de 96 poços em 200 1 de RPMI 1640 suplementado com soro humano reunido a 5% (R5) . Para este ensaio, as células estaminais da placenta são adicionadas numa razão T:LCL:PSC de 10:1:2. O ensaio foi executado durante 6, 10 ou 17 dias. 108 1 957 633/ΡΤ

Um ensaio de regressão de seis dias foi realizado utilizando células T marcadas com CSFE. As células estaminais da placenta da placenta 63450 suprimiram a proliferação de células T no ensaio de regressão em de cerca de 65% a cerca de 97%, um resultado que corresponde aos resultados para estas PSC na MLR (FIG. 12) . Novamente, as linhas CU e AC da placenta 63450 suprimiram significativamente a proliferação de células T, enquanto as PSC AM de 65450 não suprimiram a proliferação.

Numa experiência separada, foi determinado que também células assassinas naturais eram suprimidas na MLR e no ensaio de regressão. Nas células NK, quando a MLR ou o ensaio de regressão foi executado, incluindo IL-2 a 50 U/ml, o efeito supressor foi de cerca de 45% (intervalo de cerca de 40% a cerca de 65%, EPM 5%) .

As células estaminais da placenta não são imunogénicas. Em nenhum caso foi observado mais de 5% de proliferação de células T de fundo contra células estaminais da placenta de qualquer dador ou qualquer local anatómico da placenta.

Requisito para contacto célula-a-célula. O efeito citotóxico no ensaio de regressão, e o alo-reconhecimento na MLR, dependem ambos das interacções TCR (receptor de células T) :MHC entre células alvo e efectoras. Os requisitos para contacto célula-a-célula na supressão mediada por células estaminais da placenta foram avaliados utilizando um ensaio transwell. No ensaio, foi realizada uma MLR em que as células T e as células estaminais da placenta foram separadas por uma membrana. Tal como pode ser visto na FIG. 16, quanto mais elevado o número de células estaminais da placenta utilizado na MLR, maior a redução da supressão, indicando que, particularmente a densidades mais elevadas, as células estaminais da placenta (CU) requerem um contacto significativo com as células T para suprimir a proliferação de células T.

Um ensaio separado confirmou que a imunossupressão de células T por células estaminais da placenta parece envolver, pelo menos parcialmente, um factor solúvel. Para determinar se a imunossupressão mediada pelas células estaminais da 109 1 957 633/ΡΤ placenta é dependente do contacto célula a célula, foram realizados ensaios transwell em que as células estaminais da placenta foram colocadas numa inserção no fundo da qual uma membrana permitia a passagem apenas de factores solúveis. No fundo do poço, separado das células estaminais da placenta, estavam a MLR ou as células T sozinhas. Para determinar se um efeito observado dependia da dose relativa de células estaminais da placenta, as células estaminais foram adicionadas em diferentes densidades relativas às células T e DC. Quando as células estaminais da placenta do cordão umbilical eram separadas da MLR, o efeito supressor foi parcialmente abolido. Quando as células estaminais da placenta foram utilizadas a densidades semelhantes às usadas na FIG. 11, a supressão da MLR foi abolida a 75% para células T CD4 + , e a 85% para células T CD8+ (Fig. 17, FIG. 18) . O efeito supressor foi ainda a 66% quando foi utilizado apenas um quarto da dose de células estaminais da placenta (CU OP 25), e caiu para níveis de fundo quando foram adicionadas 12500 células estaminais da placenta CU. Não foi observada qualquer mudança na supressão com separação utilizando uma inserção (Fig. 17). A 25000 células estaminais da placenta, não obstante o efeito supressor ainda vigoroso, foi observada a menor queda relativa na supressão na introdução da inserção (Fig. 18).

6.5 EXEMPLO 5: A DEPENDÊNCIA DE CONTACTO DA IMUNOSSUPRESSÃO POR CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA DIFERE DA DAS CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA

Numa experiência para determinar o grau de dependência de contacto na imunomodulação, as células estaminais do cordão umbilical mostraram um requisito acentuadamente diferente do contacto célula-a-célula para imunomodulação do das células estaminais derivadas de medula óssea. Em particular, as células estaminais da placenta dependiam mais do contacto célula-a-célula para realizar imunomodulação, particularmente a um número mais elevado de células estaminais da placenta ou mesenquimatosas.

As células estaminais derivadas da medula óssea (BMSC) e as células estaminais do cordão umbilical (CU) têm diferentes 110 1 957 633/ΡΤ requisitos de contacto célula-a-célula, dependendo da razão de células aderentes para células T num ensaio de reacção leucocitária mista (MLR). Numa experiência transwell, em que células estaminais da placenta foram separadas das células T e das células dendríticas (DC) na MLR, a supressão variou entre os dois tipos de células aderentes. A FIG. 15 mostra os resultados do poço aberto e do transwell lado a lado. Quando foram utilizados aproximadamente 100000 ou 75000 CU ou BMSC no formato de poço aberto, foi observada uma supressão semelhante. No entanto, no formato de transwell, as CU suprimem a MLR num menor grau que as BMSC, indicando uma maior dependência de contacto a estas razões mais elevadas de células estaminais da placenta/células T. Quando foram utilizadas razões menores de células da placenta para células T, as células estaminais da placenta foram mais supressivas célula a célula. A partir dos dados de supressão, foi calculado o grau de dependência de contacto. A FIG. 19 mostra a dependência de contacto das MLR de CU e BMSC. Células derivadas da medula óssea são menos dependentes de contacto a razões mais elevadas de BM/células T que as CU. Por outras palavras, as células estaminais da placenta CU e as BMSC comportam-se diferentemente em relação a um importante parâmetro mecanicista, a necessidade de contacto célula-a-célula.

As células T reguladoras (Tregs) são necessárias para a supressão de células T mediada por BMSC. Ver Aggarwal & Pittenger, "Human Mesenchymal Stem Cell Modulate Allogeneic Immune Cell Responses", Blood 105(4): 1815-1822 (2004). As Tregs CD4+CD25+ foram esgotadas de dadores de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), e foi realizado um ensaio de regressão usando células autólogas transformadas com EBV (virus de Epstein-Barr) . As CU foram adicionadas a algumas condições. Tal como pode ser observado na FIG. 20, não há diferenças nas supressão da resposta de células T mediada por células estaminais da placenta no ensaio de regressão estejam ou não presentes Tregs. Assim, enquanto as células T reguladoras são supostamente necessárias para a supressão de células T mediada por BMSC, as células T reguladoras não parecem desempenhar um papel na imunossupressão mediada por células estaminais da placenta. 111 1 957 633/ΡΤ

Foi realizada uma MLR em que as células T foram tomadas de uma MLR suprimida por células estaminais da placenta, e as células dendriticas foram adicionadas frescas. As células T foram coradas com CFSE, que é distribuído de forma igual pelas células filhas durante a proliferação. As células CFSEe1 são células T que não proliferaram (p. ex., os picos mais à esquerda nos painéis na FIG. 21) . Esta população foi obtida através de separação das células T coradas num FACS Aria. Estas células foram utilizadas numa segunda MLR com células dendriticas frescas. Tal como pode ser observado na FIG. 22, não se observou supressão duradoura, uma vez que as células anteriormente suprimidas proliferam bem contra as DC. É improvável que as células CFSEBa (isto é, células-filhas) tivessem sido responsáveis pela supressão, uma vez que estas células proliferaram posteriormente. A populaçao CFSE e constituída por células não alo-especificas que não teriam proliferado contra este dador de DC, bem como as células T suprimidas por células estaminais da placenta. Uma vez removidas as células estaminais da placenta, as células suprimidas proliferaram.

Uma MLR é suprimida pelas BMSC quando aproximadamente 10% do sobrenadante é substituído pelo sobrenadante de uma MLR de BMSC. Em nítido contraste, não foi observada nenhuma alteração na proliferação de células T quando o sobrenadante foi substituído por sobrenadante de uma MLR compreendendo células estaminais da placenta, mesmo quando 75% do meio foi substituído (FIG. 23). É possível que as DC ou células T em repouso sejam afectadas pela incubação com células estaminais da placenta durante períodos de tempo diferentes antes de se iniciar a MLR. Isto foi testado através da incubação das células estaminais da placenta ou BMSC com células T (FIG. 24A) ou DC (FIG. 24B) durante vários períodos de tempo antes de se iniciar o ensaio. A pré-incubação de células T e células estaminais da placenta não altera apreciavelmente o fenótipo supressivo (FIG. 24A). No entanto, a supressão de células T por BMSC muda dependendo da duração da pré-incubação de DC/PDAC. Tal como mostrado na FIG. 24B, a supressão através de BMSC é mais forte quando as DC são adicionadas um dia 112 1 957 633/ΡΤ depois das células T. Uma supressão muito menor surge, no entanto, quando as DC são adicionadas ao mesmo tempo que as células T. A incubação das DC mais tempo com as BMSC pode inverter esta perda de supressão. Em dois dias de pré-incubação, a supressão aproxima-se do cenário em que as DC são adicionadas um dia depois das células T (+1 dia) . Não é observada nenhuma tendência semelhante com a supressão mediada por células estaminais da placenta.

6.6 EXEMPLO 6: PERFIL DE CITOCINAS DE CÉLULAS ESTAMINAIS DA PLACENTA E CÉLULAS ESTAMINAIS DO CORDÃO UMBILICAL NA MLR E NO ENSAIO DE REGRESSÃO

Foi determinado que as células estaminais do cordão umbilical (CU) e as células estaminais da placenta da placa cório-amniótica (CA) segregam certas citocinas para o meio da MLR.

Nalguns ensaios, foi utilizada uma série de citocinas para medir os níveis de citocinas e quimocinas nos sobrenadantes. Verificou-se que vários factores eram segregados para os sobrenadantes, sendo o mais relevante para a MLR e o ensaio de regressão a proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1 e MIP-1 . Ambos estes quimioatractores atraem células T, e são segregados por células T CD8+ em resposta a infecção de vírus de imunodeficiência humana (VIH) . Quando ensaiados na MLR, a secreção destes quimioatractores correlaciona-se inversamente com as células estaminais da placenta e a supressão de MSC da MLR (FIG. 25).

Nem as células estaminais da placenta nem as MSC segregaram MIP-1 e MIP—1

Noutro estudo, verificou-se uma correlação na secreção de MCP-1 e IL-6, ambas as quais são importantes imunorreguladores (FIG. 26 e FIG. 27; comparar com a FIG. 11). Embora as células estaminais da placenta isoladamente não segreguem IL-6 ou MCP-1, as linhas CU e CA, as quais suprimem ambas a MLR e a proliferação de células T no ensaio de regressão (FIG. 11), segregam MCP-1 e IL-6 (FIG. 26 e FIG. 27). Embora IL-6 seja principalmente associada a acções pro-inflamatórias (ver, p. ex., Kishimoto et al., Annu. Rev. Immunol. 23: 1-21 (2005)), também tem outras funções, tais 113

1 957 633/PT como um papel protector durante lesão hepática em ratinhos (ver, p. ex., Klein et al., J. Clin. Invest. 115: 860-869 (2005)).

Num estudo separado, as CA utilizadas numa MLR ou ensaio de regressão foram analisadas quanto à secreção de citocinas. As citocinas foram medidas num sistema Luminex em sobrenadantes de culturas de 6 dias de células estaminais, de MLR de células estaminais ou de ensaios de regressão de células estaminais. As MLR incluíram as células estaminais, células dendríticas (DC), e células T numa razão de 2/1/10. Os ensaios de regressão de vírus de Epstein-Barr (EBV) incluíram células estaminais, células de tumor de EBV (Ts), e células T a uma razão Ts:células estaminais:T de 2:1:10.

Verificou-se que os níveis de IL-6 (11 ng/ml) e IL-8 (16 ng/ml) se mantinham constantes em culturas de apenas células estaminais, MLR, e ensaios de regressão. A concentração de MCP-1 foi determinada ser de cerca de 2 ng/ml em culturas de apenas células estaminais e MLR de células aderentes de controlo não supressoras e ensaios de regressão, mas aumentou para cerca de 10 ng/ml em MLR de células estaminais suprimidas e ensaios de regressão de células estaminais. Estes valores caem dentro dos níveis séricos registados para MCP-1. A interleucina-2 (IL-2) é ao mesmo tempo um factor de sobrevivência de células T e um factor obrigatório para células T reguladoras CD4+CD25+. Este subconjunto de células T não é necessário para supressão de células T através de células estaminais CA, mas os níveis de IL-2 diminuem de forma consistente durante a supressão de MLR através de células estaminais CA. Os sobrenadantes da MLR na ausência de células estaminais CA continham cerca de 35 pg/ml de IL-2, enquanto as MLR que incluíram células estaminais CA continham até 440 pg/ml de IL-2.

As concentrações de IL-2 correlacionaram-se com supressão. Por exemplo, uma MLR de células T CD4+ mostrando 85% de supressão continha 330 pg/ml de IL-2, e uma MLR de células T CD8+ mostrando 85% de supressão, utilizando células estaminais CA, continha 66 pg/ml de IL-2. Estes resultados 114 1 957 633/ΡΤ indicam que IL-2 e MCP-1, tradicionalmente conhecidos como estimuladores da resposta imunitária, podem ter um papel na imunossupressão.

Lisboa, 2014-03-17

Claims (24)

1 957 633/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Células estaminais da placenta para utilização num método para supressão de uma resposta imunitária, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T estimulada por células B de apresentação do antigénio do virus de Epstein-Barr, em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos, e em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4; ou expressam CD73, CD105, e HLA-G; e em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária contra um aloenxerto, uma doença auto-imune, diabetes, lúpus eritematoso, artrite reumatóide, ou esclerose múltipla.

2. Células estaminais da placenta para a utilização da reivindicação 1, em que as referidas células T são células T CD4+ ou células T CD8+.

3. Células estaminais da placenta para utilização da reivindicação 1, em que o referido método compreende adicionalmente a utilização de uma proteína inflamatória anti-macrófagos (MIP)-l ou anticorpo anti-MIP-1 , em que o referido anticorpo está presente numa quantidade suficiente para causar uma queda detectável na quantidade de MIP-1 ou anti-MIP-1 no sangue de um sujeito recebendo o referido medicamento.

4. Células estaminais da placenta para a utilização da reivindicação 1, em que o referido método compreende ainda a utilização de células CD34+, ou células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea.

5. Células estaminais da placenta para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que os referidos pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta são OCT-4+. 1 957 633/ΡΤ 2/4

6. Células estaminais da placenta para a utilização da reivindicação 1, em que os referidos pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD73, CD105, e CD200.

7. Células estaminais da placenta para a utilização da reivindicação 1, em que os referidos pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e OCT-4.

8. Células estaminais da placenta para a utilização da reivindicação 1-7 em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária contra esclerose múltipla.

9. Método de produção de uma população de células estaminais da placenta in vitro compreendendo: (a) ensaio de uma pluralidade de células da placenta num ensaio de reacção linfocitária mista (MLR); e (b) selecção da referida pluralidade de células estaminais da placenta se a referida pluralidade de células estaminais da placenta suprimir de forma detectável a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ estimulada por células B de apresentação do antigénio do virus de Epstein-Barr, em que as referidas células estaminais da placenta aderem a um substrato; em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos; e em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4; ou expressam CD73, CD105, e HLA-G.

10. Método da reivindicação 9, em que as referidas células estaminais da placenta são derivadas de âmnio, ou âmnio e córion.

11. Método da reivindicação 9, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, em pelo menos 90%, ou em pelo menos 95% em comparação com uma 1 957 633/ΡΤ 3/4 quantidade de proliferação de células T na ausência das referidas células estaminais da placenta.

12. Método da reivindicação 9, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável uma actividade de células assassinas naturais (NK).

13. População isolada de células estaminais da placenta produzida de acordo com o método da reivindicação 9.

14. População isolada de células estaminais da placenta, em que as referidas células estaminais da placenta não são trofoblastos, em que pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105, e CD200; expressam CD200 e OCT-4, ou expressam CD73, CD105, e HLA-G, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem de forma detectável a proliferação de células T estimulada por células B de apresentação do antigénio do virus de Epstein-Barr.

15. População isolada de células estaminais da placenta da reivindicação 14, em que os referidos pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta são OCT-4+.

16. População isolada de células estaminais da placenta da reivindicação 14, em que os referidos pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD73, CD105, e CD200.

17. População isolada de células estaminais da placenta da reivindicação 14, em que os referidos pelo menos 80% das referidas células estaminais da placenta expressam CD200 e OCT-4.

18. População isolada de células estaminais da placenta da reivindicação 14, em que as referidas células estaminais da placenta suprimem uma resposta imunitária. 1 957 633/PT 4/4

19. População isolada de da reivindicação 18, em que a uma resposta imunitária contra

20. População isolada de da reivindicação 18, em que a uma doença auto-imune.

21. População isolada de da reivindicação 20, em que c diabetes.

22. População isolada de da reivindicação 20, em que í lúpus eritematoso.

23. População isolada de da reivindicação 20, em que í artrite reumatóide.

24. População isolada de da reivindicação 20, em que í esclerose múltipla. células estaminais da placenta referida resposta imunitária é um aloenxerto. células estaminais da placenta referida resposta imunitária é células estaminais da placenta referida doença auto-imune é células estaminais da placenta referida doença auto-imune é células estaminais da placenta referida doença auto-imune é células estaminais da placenta referida doença auto-imune é Lisboa, 2014-03-17