KR102164260B1

KR102164260B1 - 메틸프레드니솔론 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102164260B1
Application number: KR1020180130610A
Authority: KR
Inventors: 유충헌; 임명훈
Original assignee: (주)유에이치에이; 대전보건대학 산학협력단
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2020-10-12
Also published as: KR20200048471A

Abstract

본 발명은 메틸프레드니솔론 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 메틸프레드니솔론은 1 내지 30 mg/kg의 양으로 복강 내 투여되고, 상기 줄기세포는 5×10⁵ 내지 2×10⁶ cells의 양으로 정맥 투여되어 다발성 경화증을 효과적으로 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

메틸프레드니솔론 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of multiple sclerosis comprising methylprednisolone and stem cells as an active ingredient}

본 발명은 메틸프레드니솔론 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)는 가장 흔한 CNS(central nervous system)의 탈수초 질환으로서, 단핵구세포 침윤 및 탈수초가 나타나는 특징이 있다 (Immunol Lett. 2005;96:11-26). 다발성 경화증의 동물모델인 EAE (Experimental autoimmune encephalomyelitis)는 많은 임상적 및 병리학적 특징에 있어 인간의 다발성 경화증과 유사한 부분이 있는 것으로 알려져 있다 (Expert Rev Neurother. 2006;6:1657-70).

다발성 경화증에 대한 발병 메커니즘에서 발병 초기에 자가-재활성의 T 세포에 의한다는 보고가 있다 (Int Rev Immunol. 2005;24:393-413). 유사하게, Th1 (CD4+ T helper 1) 및 Th2 (CD4+ T helper 2)가 다발성 경화증의 면역 발병기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주되고 있으며 (Immunology. 2008;125:161-9; Acta Neuropathol. 2011;122:601-14), 전-염증 및 항-염증 사이토카인 사이의 균형 역시 질병의 진행과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다 (Pharmacol Ther. 2005;106:163-77). 또한, CD4+CD25+Foxp3+ Treg 세포의 경우에는 EAE에서 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)-특이적인 T 세포를 억제한다는 보고도 있다 (Mult Scler Int. 2014;2014:285245).

최근, 다발성 경화증에 대한 치료제로는 IFN-β, glatiramer acetate, mitoxantrone, natalizumab 및 fingolimod와 같은 승인된 면역조절 물질이 사용되고 있으나(Lancet. 2002;360:2018-25; N Engl J Med. 2010;362:387-401; 및 N Engl J Med. 2006;354:899-910), 상기 물질은 다발성 경화증을 가진 환자에 대한 치료로서 여전히 만족스럽지 않는 것으로 보고되고 있다 (Neurology. 2002;58:169-78). 특히, IFN-β(Interferon-beta)의 경우, 강력한 항-염증 및 면역조절 활성을 가지고 있으나(J. Neuroimmunol. 76, 105-111), IFN-β의 반감기가 짧아 치료에 제한적이고, BBB(blood-brain barrier)를 통과하기가 어렵다는 문제점이 존재한다. 따라서, 다발성 경화증에 대한 더욱 효과적인 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-1455933호

본 발명의 목적은 메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 또는 재대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 IFN-β(interferon beta)를 분비하는 줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 메틸프레드니솔론은 투여 개체에 1 내지 30 mg/kg의 양으로 투여되는 것일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 20 mg/kg의 양으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 메틸프레드니솔론은 복강 내 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 5×10⁵ 내지 2×10⁶ cells이 투여되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1×10⁶ cells이 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 정맥 투여되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 메틸프레드니솔론 및 줄기세포를 병행 처리함으로써 다발성 경화증에 대한 현저하게 상승된 치료 효과를 나타내는 것으로서, 특히, 메틸프레드니솔론의 경우 1 내지 30 mg/kg의 양으로 복강 내 투여되고, 줄기세포의 경우 5×10⁵ 내지 2×10⁶ cells의 양으로 정맥 투여됨으로써 다발성 경화증을 효과적으로 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 MP 처리 후 BM-MSCs의 안정성에 관한 결과로서, (A)는 BM-MSCs 및 성상세포에 다양한 농도의 MP를 처리한 후 MTT 어세이를 통해 생존율을 측정한 결과이고, (B)는 BM-MSCs에 MP를 처리한 후 FACS 를 통해 BM-MSCs의 표현형을 분석한 결과이며, (C)는 각각 Oil Red O, Alizarin Red S, 및 Alcian blue 염색을 통해 BM-MSCs의 다분화능을 확인한 결과이고 (Magnification: ×200), (D)는 anti-human nuclei antibody (red)에 의한 염색을 통해 이식된 BM-MSCs를 확인한 결과이다 (blue: DAPI staining; Scale bar: 20 μm).
도 2는 EAE 유도 후 14일째에 MP 및 BM-MSCs의 단독 또는 병행 처리한 후 효과를 분석한 결과로서, (A)는 각 그룹의 평균 일일 임상 점수를 면역 후 1일부터 50일 까지 평가한 결과이고, (B)는 각 그룹의 평균 임상 점수를 정량화한 결과이다 (** p<0.01 compared to PBS treatment group; ## p<0.01 compared to MP treatment group; && p<0.01 compared to BM-MSCs treatment group).
도 3은 면역 후 30일째에 EAE 마우스를 희생시킨 후, 각 그룹의 요추 척수 염색을 통해 탈수초 및 재수초를 확인하여 각 그룹에서의 효과를 분석한 결과로서, (A)는 척수 단면을 LFB로 염색한 이미지이고(Magnification: ×400), (B)는 탈수초 부위를 MetaMorph image analysis를 통해 정량화한 결과이며, (C)는 MBP antibody로 면역염색한 단면 이미지이고, (D)는 MBP antibody로 염색된 형광강도를 MetaMorph image analysis를 통해 정량화한 결과이다 (** p<0.01 compared to PBS treatment group; ## p<0.01 compared to MP treatment group; && p<0.01 compared to BM-MSCs treatment group).
도 4는 면역 후 30일째에 EAE 마우스를 희생시킨 후, EAE의 요추 척수에 염증세포 침윤 정도에 대한 각 그룹에서의 효과를 분석한 결과로서, (A)는 H&E 염색에 의한 척수 단면의 이미지이고 (Magnification: ×400), (B)는 MetaMorph image analysis를 통해 침윤된 세포수를 정량화한 결과이며, (C)는 anti-CD4 및 CD8 antibodies로 면역염색된 이미지이고 (Scale bar: 20 μm), (D)는 MetaMorph image analysis를 통해 anti-CD4 및 CD8 T 세포의 세포수를 정량화한 결과이다 (* p<0.05, ** p<0.01 compared to PBS treatment group; # p<0.05, ## p<0.01 compared to MP treatment group).
도 5는 면역 후 30일째에 EAE 마우스를 희생시킨 후, 각 그룹에서 분리된 비장세포를 7일 동안 MOG (10 μg/mL)로 활성화시키고, 비장세포의 배양 후 상층액에서 (A) 전-염증 사이토카인(IFN-γTNF-α, IL-17), 및 (B) 항-염증 사이토카인(IL-4, IL-10)의 양을 분석한 결과이다 (* p<0.05, ** p<0.01 compared to PBS treatment group; ## p<0.01 compared to MP treatment group; & p<0.05, && p<0.01 compared to BM-MSCs treatment group).
도 6은 면역 후 30일째에 EAE 마우스를 희생시킨 후, 각 그룹에서 분리된 비장세포를 분석 전 48시간 동안 MOG (10 μg/mL)로 활성화시키고, CD4⁺CD45⁺, CD8⁺, CD45R⁺, CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포의 퍼센트를 FACS에 의해 분석한 결과로서, (A)는 각 그룹에서 CD4⁺CD45⁺, CD8⁺ 및 CD45R⁺의 세포수를 퍼센트로 나타내는 FACS plots 결과이고, (B)는 각 그룹에서 CD4⁺CD45⁺, CD8⁺ 및 CD45R⁺의 세포수를 정량한 결과이며, (C)는 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포의 세포수를 퍼센트로 나타내는 FACS plots 결과이고, (D)는 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포의 세포수를 정량화한 결과이다 (** p<0.01 compared to PBS treatment group; ## p<0.01 compared to MP treatment group; && p<0.01 compared to BM-MSCs treatment group).
도 7은 면역 후 30일째에 EAE 마우스를 희생시킨 후, MOG에 의해 재활성화된 CD4⁺ T 세포를 FACS로 분류하고, CD4⁺ T 세포는 48시간 동안 MOG (10 μg/mL)가 존재한 상태에서 MP (20 μM) 및 BM-MSCs (3×10⁴ cells)의 단독 또는 병행 처리 후 세포증식 및 세포사멸에 관한 효과를 분석한 결과로서, (A)는 EZ-Cytox cell proliferation assay를 통한 세포증식에 대한 결과이고, (B)는 Caspase-Glo3/7 kit에 의한 세포사멸에 대한 결과이며, (C)는 Annexin V/PI assay에 의한 세포사멸에 대한 결과이다 (** p<0.01 compared to PBS treatment group; # p<0.05, ## p<0.01 compared to MP treatment group; & p<0.05, && p<0.01 compared to BM-MSCs treatment group).
도 8은 EAE 유도 후 14일째에 MSCs-GFP (1×10⁶ cells, i.v.), MSCs-IFNβ(1×10⁶ cells, i.v.) 및 MP (10 mg/kg, i.p.)의 단독 또는 병행 처리한 후, 이의 효과를 분석한 결과로서, (A)는 각 그룹의 평균 일일 임상 점수를 면역 후 1일부터 46일 까지 평가하고, 평균/최대 임상 점수를 정량화한 결과를 나타낸 것이고 (*P < 0.05; **P < 0.01), (B)는 EAE 마우스의 요추 척수에서 침윤된 염증세포의 양을 평가하기 위하여 H&E (upper panel) 및 Iba-1(bottom panel)의 염색 결과를 나타낸 것이며, (C)는 EAE 마우스의 요추 척수에서 재수초를 확인하기 위하여 LFB (upper panel) 및 MBP (bottom panel)의 염색 결과를 나타낸 것이다 (Scale bar: 50 μm).
도 9는 PBS, MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 및 MP의 단독 또는 병행 처리 후 16일째에 EAE 마우스에서 비장세포를 분리한 후, in vitro에서 7일 동안 MOG (10 μg/mL)를 처리하고, 세포의 배양 상층액에서 (A) 전-염증 사이토카인 (IFN-γTNF-α, IL-17, IL-12), 및 (B) 항-염증 사이토카인 (IL-4, IL-10)의 양을 ELISA를 통해 분석한 결과이다 (*P < 0.05; **P < 0.01).
도 10은 비장에서 분리된 단세포 부유액을 48시간 동안 MOG (10 μg/mL)로 재활성화시킨 후, CD4⁺CD45⁺, CD8⁺, CD45R⁺ 및 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포의 빈도를 FACS로 분석한 결과로서, (A)는 각 그룹에서의 CD4⁺CD45⁺, CD8⁺, CD45R⁺ T 세포의 빈도를 나타내는 FACS dots과 상기 세포의 퍼센트를 정량화한 결과이고, (B)는 CD25+Foxp3+ T 세포의 빈도를 나타내는 FACS dots과 CD4+CD25+Foxp3+ T 세포의 퍼센트를 정량화한 결과이다 (*P < 0.05; **P < 0.01).
도 11은 MSCs-GFP (1×10⁶ cells, i.v.), MSCs-IFNβ(1×10⁶ cells, i.v.) 및 MP (10 mg/kg, i.p.)의 단독 또는 병행 처리한 후, 7일째에 EB 양을 정량 분석하여 BBB 완전성을 확인한 결과로서, (A)는 4% EB dye를 정맥주사한 후, 5시간 후에 뇌(left)와 척수(right)에서의 EB dye의 혈관외유출을 fluorometer를 사용하여 620 nm에서 EB 강도를 측정한 결과이고 (*P < 0.05; **P < 0.01), (B)는 요추 척수에서 occludin의 면역형광 염색에 대한 결과 (upper panel, Scale bar: 50 μm)와 각 그룹에서의 occludin의 형광 강도를 통계적으로 분석한 결과 (bottom panel, **P < 0.01)를 나타낸 것이다.

본 발명의 용어, "메틸프레드니솔론(methylprednisolone, 이하 "MP"로 기재함)"은 면역 시스템을 억제하고 염증을 감소시키는데 사용되는 코르티코스테로이드 (corticosteroid) 약물이다.

본 발명의 용어, "EAE(experimental autoimmune encephalomyelitis) 마우스 모델"은 임상 및 조직병리학에서 인간의 다발성 경화증과 유사하다고 보고되어 다발성 경화증의 기작 및 치료 효과 등을 연구하기 위해 보편적으로 사용되는 동물모델이다.

본 발명의 용어, "BBB(blood brain barrier)"는 뇌척수액과 혈액을 분리시키는 장벽으로서, 높은 선택적 투과성에 의해 주요 조절중추를 세균 등과 같은 혈액으로 운반될 수 있는 병원체와 혈액 내의 잠재적인 위험물질로부터 격리시키는 역할을 한다.

본 발명에서의 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.

상기 용어, "성체줄기세포"는 분화된 조직에서 발생하는 줄기세포로 자가 재생산이 가능하며 유래 조직의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로 상기 성체줄기세포는 제대혈(탯줄혈액), 성인의 골수, 비장, 난소, 정소, 말초혈액, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간 또는 췌장으로부터 추출해 낼 수 있으며, 뼈와 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 예를 들어, 척수는 조혈모세포(Hematopoietic stem cell, HSC) 및 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell)를 가지는 것으로 보고되고 있으며 뇌로부터 유래한 줄기세포인 신경줄기세포(Neural stem cell)는 뇌실하 영역(subventricular zone), 뇌실 영역(ventricular zone) 및 CNS(central nervous system)의 해마(hippocampus)로부터 분리된다고 알려져 있다. 일반적으로 성체 줄기세포는 증식이 어려우나 쉽게 분화되는 경향이 강한 것으로 알려져 있어, 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.

본 발명에서의 용어, 줄기세포의 "증식"은 줄기세포의 분화(differentiation)와는 구분되는 개념으로서, 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "분화"란 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.

본 발명에서의 용어, "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.

본 발명에 따른 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 MP 및 BM-MSCs를 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 추가하여 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 다발성 경화증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 다발성 경화증의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있으며 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구로 투여되는 경우 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 중 세포의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1×10³내지 1×10¹² cells 이고, 바람직하게는 1×10⁵ 내지 1×10⁷ cells이고, 더욱 바람직하게는 5×10⁵ 내지 2×10⁶ cells이고, 더욱 바람직하게는 1×10⁶ cells이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 약학 조성물 중 화합물의 투여량은 바람직하게는 0.1 내지 1000 ㎎/kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있고, 더욱 바람직하게는 1 내지 30 mg/kg/day로 투여될 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 mg/kg/day로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 다발성 경화증을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험방법

1.1. 세포배양 및 IFN-β 발현

인간의 골수 유래 중간엽줄기세포(Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, 이하 "BM-MSCs" 또는 "MSCs"로 기재함)은 CIC(Catholic Institute of Cell Therapy, Seoul, Korea)에서 구입하였다 BM-MSCs는 20% FBS(fetal bovine serum, Wisent Bioproducts), penicillin 및 streptomycin(Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Wisent Bioproducts, St. Bruno, QC, Canada) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양되었고, passage 5 내지 8인 세포가 실험에 사용되었다.

EGFP (Ad-GFP) 및 마우스 IFN-β(Ad-IFN-β)를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터가 Ad-Easy vector system (Quantum Biotechnologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 제조되었다. MSCs는 공지된 방법에 따라 EGFP (Ad-GFP) 및 IFN-β(Ad-IFN-β)가 발현되도록 유도된 아데노바이러스 벡터로 형질도입되었다. 간단히, 인간의 BM-MSCs는 미리 혼합된 바이러스-Fe³⁺복합체가 37 ℃에서 4시간 동안 처리되었고, PBS로 2번 세척된 후, 배지에서 배양되었다.

1.2. BM-MSCs 생존율 및 특성

BM-MSCs 및 성상세포(astrocytes)는 96-well plate에 5×10³ cells/well로 분주되었다. 다음날, 배지가 제거되고, 세포는 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160 μM)의 메틸프레드니솔론(methylprednisolone, 이하 'MP'로 기재함, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 24시간 동안 처리되었다. 상기 MP는 PBS에서 녹여 필터링을 통한 멸균 후 사용되었다. 세포의 생존율은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) 어세이를 통해 결정되었다. 각 well의 OD(optical density) 값은 570 nm에서 Spectramax Plus 384 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 결정되었다. BM-MSCs의 표현형은 FACS(flow cytometry)를 사용하여 세포표면 마커 염색(cellsurface marker staining)에 의해 분석되었다. 항체는 mouse anti-human CD34 (8G12, ref. 348057; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), CD44 (515, ref. 550989; BD Biosciences), CD45 (HI30, ref. 555483; BD Biosciences), CD73 (AD2, ref. 550257; BD Biosciences), CD90 (5E10, ref. 555596; BD Biosciences) 및 HLA-DR (L243, ref. 347367; BD Biosciences)가 사용되었다.

BM-MSCs에서 지방세포, 골세포 및 연골세포로의 분화 가능성을 분석하기 위하여, BM-MSCs는 12-well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주되었고, 다음날 wells은 각각 지방세포, 골세포 및 연골세포 분화 배지로 채워졌다. MP(5 μM)는 효과를 평가하기 위하여 96시간 동안 첨가되었다. 분화 배지는 1주일에 2번 교환되었고, 19일 후, 지방세포, 골세포 및 연골세포는 각각 0.3% Oil Red O (Sigma-Aldrich), 2% Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) 및 1% Alcian Blue (Sigma-Aldrich)를 사용하여 확인되었다. 분화되지 않은 BM-MSCs은 10% DMEM 배지에서 배양되었다. BM-MSCs의 pathotropism(특이적으로 pathological sites로 이동할 수 있는 능력)은 EAE 마우스의 요추 척수(lumbar spinal cord)에서 anti-human nuclei antibody를 사용하여 확인하였다.

1.3. IFN-β 발현 분석 및 MSC-GFP 및 MSC-IFNβ의 생존율

BM-MSCs는 24-well plate에 2x10⁴ cells/well 또는 96-well plate에 5x10³ cells/well로 분주되었다. IFN-β 발현을 확인하기 위하여, BM-MSCs는 공지된 방법에 따라 Ad-GFP 및 Ad-IFN-β으로 형질도입되었고, 24시간 후, 배지가 제거되고, MSC-GFP 세포에 MP(10 mM)가 처리되었다. IFN-β 발현은 배양 상층액에서 ELISA kit (R&D Systems, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정되었다. 세포의 생존율은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) assay를 통해 결정되었다. 각 well의 OD(optical density) 값은 570 nm에서 Spectramax Plus 384 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 결정되었다.

1.4. EAE 유도 및 처리

모든 동물 실험은 한국 가톨릭대학교(Permit Number; 2015-0147-01)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 동물은 무균 조건에서 사육되고, 가톨릭대학교 의과대학의 실험동물부의 가이드라인에 따라 유지되었다. EAE 유도는 9주령 암컷 C57BL/6 마우스 (Orient Bio Inc., Seongnam, Korea)에 Hooke Labs EAE induction kit (Hooke Labs, Lawrence, MA, USA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행되었다. 간단히, 6 mg/mL의 Mycobacterium tuberculosis를 포함하는 CFA (complete Freund's adjuvant)로 유화된 총 200 μL의 MOG 35-55 (myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55)가 마우스의 두 부위에 피하주사되었다. 주사 직후 및 24 시간 후, pertussis toxin (200 ng, 0.1 ml PBS)이 마우스의 복강 내로 주입되었다.

모든 처리는 모든 마우스가 EAE의 임상 증상을 보인 시점인 면역 후 14일에 시작되었다. 마우스는 다음과 같이 매일 관찰되었다: 0, no clinical signs; 0.5, partial tail paralysis; 1, complete tail paralysis; 1.5, hind limb weakness; 2, strong hind limb weakness; 2.5, partial hind limb paralysis; 3, complete hind limb paralysis; 3.5, partial front limb paralysis; 4, complete hind limb paralysis and front limb paralysis; 및 5, moribund or dead.

동물은 무작위적으로 4개의 그룹으로 나누었다 (각 그룹에서 n=10): (1) 정맥주사로 100 μL의 PBS가 주입된 PBS 그룹, (2) 20 mg/kg의 양으로 복강내 주사된 MP 그룹, (3) 정맥주사로 100 μL의 PBS에 1×10⁶ cells이 주입된 BM-MSCs 그룹, 및 (4) 복강 내 및 정맥 주사로 동일한 양의 MP 및 BM-MSCs가 주입된 MP+BM-MSCs 그룹(병용 처리).

또한, IFN-β가 도입된 실험에서는 동물은 다음과 같은 그룹으로 나누어 실험을 수행하였다(각 그룹에서 n = 9): (1) 정맥주사로 100 μL의 PBS가 주입된 PBS 그룹, (2) 정맥주사로 1×10⁶ cells이 주입된 MSC-GFP 그룹, (3) 정맥주사로 1×10⁶ cells이 주입된 MSC-IFNβ 그룹, (4) 10 mg/kg의 양으로 복강내 주사된 MP 그룹, 및 (5) 복강 내 및 정맥 주사로 동일한 양의 MP 및 MSC-IFNβ가 주입된 MP+MSC-IFNβ그룹(병용 처리).

1.5. 면역조직병리

각 그룹의 EAE 마우스는 면역 후 30일에 희생되었다. 마우스는 희생 전 zoletil (30 mg/kg)의 복강 내 주사에 의하여 마취되었다. 동물은 PBS로 심장내 살포되었고, 4% PFA(paraformaldehyde, Millipore, Billerica, MA, USA)로 고정되었다. 분리된 요추 척수는 4% PFA로 고정되었고, 차례로 15% 및 30% 수크로오즈에 24시간 동안 옮겨졌다. 고정된 척수는 OCT compound (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan)에 끼웠다. 조직은 슬라이드 위에 14 μm의 두께로 관상면으로 냉동절편되었고, 염색되기 전까지 초저온 냉동고에 보관되었다. 슬라이드는 염증세포 침윤 및 탈수초(demyelination)을 평가하기 위하여 H&E(hematoxylin-eosin) 및 LFB(luxol fast blue)로 각각 염색되었다. 모든 이미지는 MetaMorph software (Molecular Devices)로 평가되었다. 염증세포 침윤 및 재수초(remyelination)는 정제된 rat anti-mouse CD4/CD8 (BD Biosciences), polyclonal rabbit anti-Iba1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) 및 polyclonal rabbit anti-mouse MBP (myelin basic protein) monoclonal antibody (Millipore) 염색을 통해 각각 확인되었다. CD4 및 CD8 antibody 염색은 Cy3-conjugated streptavidin antibodies (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)으로 가시화되었다. MBP antibody 염색은 goat anti-mouse IgM heavy chain secondary antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 가시화되었다. 세포 핵의 대조염색은 각 슬라이드를 DAPI(4-6-diamidino-2-phenyindole, Roche, Penzberg, Germany)에 15분 동안 담금으로써 수행되었다. 형광 이미지는 LSM 700 confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 및 Zeiss software로 획득되었다.

1.6. 비장세포(splenocyte)의 분리

비장은 면역 후 30일에 각 그룹에서 분리되었다. 마우스는 희생 전 zoletil (30 mg/kg)의 복강 내 주사에 의하여 마취되었다. 단세포 부유액은 70 μm의 nylon cell strainer (BD Biosciences)에 비장을 통과시켜 획득되었다. 단세포 부유액은 PBS에서 세척되고, RBC(red blood cell)를 제거하기 위하여 RBC lysis buffer에서 재부유되었다. 최종적으로, 부유된 세포는 40 μm의 cell strainer (BD Biosciences)에서 필터되었다. 비장세포는 10% FBS, penicillin 및 streptomycin (Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배지 (Gibco)에서 배양되었다.

1.7. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

전염증 사이토카인 및 항염증 사이토카인의 균형을 확인하기 위하여, 분리된 비장세포(1 x10⁶ 내지 2x10⁶ cells)는 24-well plate에서 7일 동안 MOG (10 μg/mL) (Sigma-Aldrich)에서 배양되었고, 배양 상층액은 ELISA 분석에 사용되었다. IFN-γTNF-α, IL-12, IL-4 및 IL-10의 농도는 Quantikine immunoassay kit (R&D Systems, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정되었다. 각 well의 OD는 450 nm에서 Spectramax Plus 384 Microplate Reader (Molecular Devices)를 사용하여 측정되었다.

1.8. FACS 분석

CD4CD45, CD8, CD45R 및 Treg 양성 세포의 퍼센트를 정량하기 위하여, 각 그룹의 비장세포는 MOG (10 μg/mL)가 처리되었고, 48시간 후, 비장세포는 PBS로 세척되고, 형광색소로 표지된 관련 항체들과 RT에서 20분 동안 반응되었다. CD4, CD45, CD8, CD45R 및 Treg 세포가 분석되었으며, Treg 세포는 CD4로 분석되었다. 사용된 항체는 다음과 같다: CD4 (RM4-5, ref. 06122-60-100; Peprotech), CD45 (30-F11, ref. 07512-50-100; Peprotech), CD8 (2.43, ref. 10112-60-100; Peprotech), CD45R (B220) (RA3-6B2, ref. 07131-50-100; Peprotech), CD25 (PC61.5, ref. 07312-80-100; Peprotech), Foxp3 (3G3, ref. 83412-60-100; Peprotech) 및 CD4 (RM4-5, ref. 06122-50-100; Peprotech). 염색된 세포는 MoFlo XDP의 FACS와 Summit software (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)에 의해 분석되었다.

1.9. 세포사멸의 결정

CD4+ T 세포 서브세트는 FACS를 사용하여 비장세포로부터 분리되었다. 간단히, PBS 처리 그룹에서 분리된 비장세포는 48시간 동안 MOG (10 μg/ml)가 처리되었다. PE-CD4로 염색된 비장세포는 FACS로 분류되었고, 분리된 CD4 T 세포는 MOG (10 μg/ml)와 함께 MP (20 μM) 또는 BM-MSCs (3 x 10⁴ cells)이 각각 또는 함께 공동 배양되었다. 활성화된 CD4 T 세포의 세포사멸 수준은 Caspase-Glo3/7 reagent (Promega, Madison, WI, USA) 및 FITC Annexin V Apoptosis Dectection Kit (BD Biosciences)으로 결정되었다. 활성화된 비장세포에는 3시간 동안 Caspase-Glo3/7 reagent가 1:1 비율로 처리되었다. 각 샘플에서 Caspase3/7 활성은 SpectraMax L luminometer (Molecular Devices)로 측정되었다. 또한, 세포는 제조사의 지시에 따라, PI (propiduim) 및 annexin V로 염색되었다. 세포사멸된 세포의 퍼센트는 MoFlo XDP의 FACS와 Summit software (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)에 의해 분석되었다.

1.10. EB (Evans blue dye)의 형광

뇌와 척수 조직으로의 순환에 대한 추적 마커인 EB (Evans blue dye, Sigma-Aldrich)의 흡수는 spectrophotometer로 측정되었다. 간단히, 4% EB는 각 그룹 동물의 꼬리 정맥으로 주사되었고, 4시간 후, 마우스가 희생되었다. 척수가 제거되었고, 0.5% Triton X-100으로 균질화되었다. 상층액을 96-well plate에 넣은 후, microplate fluorescence reader (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)를 이용하여 excitation: 620 nm, emission: 680 nm으로 형광을 측정하였다. 값은 형광강도로 표시하였고, 그룹 당 최소 3마리의 마우스에 대한 평균값으로 나타내었다.

1.11. 통계분석

정량은 각 동물의 처리 상태를 모르는 실험자에 의해 수행되었다. 모든 데이터는 SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하여 평균 ± SD로 나타내었다. 임상점수의 통계적 유의성은 Kruskal-Wallis test에 의해 분석되었다. 이외의 다중 샘플은 Fisher's Least Significant Different (LSD) post hoc test 와 함께 one-way ANOVA test 로 비교되었다. 0.05 미만의 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 2. MP는 BM-MSCs의 생존율, 표현형, 분화 또는 pathotropism에 영향이 주지 않는다

본 발명자들은 in vitro에서 MP(methylprednisolone)가 생존율, 표현형, 다분화능 및 pathotropism를 포함하는 BM-MSCs의 특성에 영향을 주지는 확인하는 실험을 수행하였다. MTT 분석 결과, BM-MSCs는 MP에 의한 영향을 받지 않았다(도 1A). 표현형에 대한 FACS 분석 결과, BM-MSCs 및 MP-처리된 BM-MSCs는 CD34, CD45 및 HLA-DR에 음성이고, CD44, CD73 및 CD90에 양성이었음을 확인하였다 (도 1B). 또한, BM-MSCs의 다분화능은 MP에 의해 영향을 받지 않았다((도 1C). 주입된 BM-MSCs는 요추 척수 내 염증 부위에서 관찰되었다(도 1D).

따라서, BM-MSCs는 EAE에 병용 처리되는 MP에 의해 영향을 받지 않음을 확인하였다.

실시예 3. EAE 마우스에서 MP 및 BM-MSCs의 병용 처리에 의한 임상 증상의 약화 효과

본 발명자들은 EAE 마우스에서 MP 및 BM-MSCs의 병용 처리에 대한 효과를 실험하기 위하여, 면역 후 14일째에 PBS, MP (20 mg/kg, i.p.), BM-MSCs (1×10⁶ cells, i.v.), 또는 MP+BM-MSCs 을 마우스에 주입하였다 (n = 10/group).

그 결과, MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹은 PBS 처리 그룹에 비해 EAE에 대한 임상 점수가 현저히 감소되었다 (p < 0.01). 또한, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP나 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 임상 점수가 현저하게 감소되었다 (p < 0.01, 도 2A). 평균 임상 점수에 있어서도, MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 현저히 낮았다 (p < 0.01). 또한, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP나 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 평균 임상 점수가 현저하게 감소됨을 확인하였다 (p < 0.01, 도 2B).

따라서, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리는 EAE 마우스에서 질병의 진행을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. EAE 마우스에서 MP 및 BM-MSCs의 병용 치료에 의한 조직 결과 향상 효과

EAE의 질병 증상은 CNS에서의 염증과 관련성이 높은 것으로 알려져 있다 (Nat Rev Immunol. 2009;9:393-407). 이에 본 발명자들은 EAE 마우스에서 MP 및 BM-MSCs의 병용 처리가 조직 손상을 감소시키는지 확인하기 위하여, LFB 및 mouse anti-MBP 염색을 수행하여 요추 척수에서 탈수초 및 재수초를 각각 평가하였다.

그 결과, MP 또는 BM-MSCs의 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 탈수초가 현저히 감소되었다 (p < 0.01). 또한, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 처리 그룹에 비해 각각 탈수초가 현저히 감소되었음을 확인하였다(p < 0.01, 도 3A, B). 반대로, MP 또는 BM-MSCs의 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 재수초가 현저하게 증가되었다 (p < 0.01). MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 각각 재수초가 현저하게 증가되었음을 확인하였다(p < 0.01, 도 3C, D).

본 발명자들은 척수에서의 염증세포 침윤을 확인하기 위하여, EAE 마우스의 요추 척수 단면을 조사하였다. 척수에서의 세포 침윤은 PBS 그룹에 비해 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에서 현저히 감소되었다 (p < 0.05, MP 처리 그룹; 및 p < 0.01, BM-MSCs 처리 그룹). 또한, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 각각 현저하게 감소된 세포 침윤이 나타남을 확인하였다 (도 4A, B).

또한, MP 또는 BM-MSCs 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 척수에서 침윤된 CD4 및 CD8 T 세포의 수가 현저히 감소되었다 (p < 0.05, MP 처리 그룹; 및 p < 0.01, BM-MSCs 처리 그룹). 더욱이, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 처리 그룹에 비해 CD4 및 CD8 T 세포수가 현저하게 감소됨을 확인하였다 (p < 0.01, 도 4C, D).

따라서, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리는 EAE 척수에서 염증세포 침윤을 억제함으로써 탈수초를 감소시킴을 확인하였다.

실시예 5. EAE 마우스에서 MP 및 BM-MSCs의 병용 치료에 의한 전/항-염증 사이토카인의 발현 조절 효과

전/항-염증 사이토카인의 균형은 자가면역질환에서 중요한 것으로 알려져 있다(Science. 1994;265:1237-40). 이에 본 발명자들은 MP 및 BM-MSCs의 병용 처리가 면역조절 활성을 향상시키는지 확인하기 위하여, MOG에 의해 재활성화된 비장세포의 배양 상층액에서 전-염증 사이토카인 (IFN-γ, TNF-α, IL-17) 및 항-염증 사이토카인 (IL-4, IL-10)의 발현 수준을 측정하였다.

그 결과, MP 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 전-염증 사이토카인이 현저하게 감소되었다 (p < 0.01). 또한, BM-MSCs 단독 처리 그룹에서도 PBS 처리 그룹에 비해 TNF-α 및 IL-17 사이토카인의 발현이 현저히 감소되었다 (p < 0.05, IL-17; 및 p < 0.01, TNF-a). 다만, IFN-γ의 발현은 BM-MSCs 처리 그룹에서 현저히 감소되지는 않았다. 더욱이, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 전-염증 사이토카인의 발현이 각각 현저히 감소되었음을 확인하였다 (p < 0.01, 도 5A).

항-염증 사이토카인의 발현의 경우, MP 처리 그룹에서는 현저한 변화가 없었으나, BM-MSCs 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 현저히 증가된 항-염증 사이토카인의 발현이 확인되었다 (p < 0.01). 또한, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 처리 그룹에 비해 항-염증 사이토카인의 발현이 현저하게 증가되었고 (p < 0.01), BM-MSCs 처리 그룹에 비해서는 더욱 현저하게 증가된 발현을 보였다 (p < 0.05, IL-4; 및 p < 0.01, IL-10, 도 5B).

따라서, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리에 의한 면역조절 효과는 MOG에 의해 재활성화된 림프구로부터 사이토카인의 생산에 의해 매개된 것으로 파악되었다.

실시예 6. EAE 마우스에서 MP 및 BM-MSCs의 병용 치료에 의한 MOG에 의해 재활성화된 T 세포의 생산 조절 효과

자기 항원은 EAE 마우스에서 뇌염 유발성의 T 세포 반응을 초기화하는 것으로 보고되었다 (Brain. 2006;129:1953-71). 이에 본 발명자들은 FACS 분석에 의하여 MOG에 의해 재활성화된 T 세포를 평가하였다. 관련 마커에 의한 표면 염색에 있어서, MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD4⁺CD45⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 세포군이 현저하게 감소되었다 (p < 0.01). 더욱이, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD4⁺CD45⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 세포군이 각각 현저하게 감소되었다 (p < 0.01). CD45R는 B 세포의 표면 마커이다 (J Biol Chem. 2012;287:28656-65). BM-MSCs 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD45R⁺ B 세포의 세포군이 현저하게 감소되었더라도, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에 비해 통계적으로 차이가 나지 않았다. MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 CD45R⁺ B 세포의 세포군이 현저하게 감소되었다 (도 6A, B).

최근에는 Treg 세포가 CD4 및 CD8 T 세포를 포함한 다중 면역세포 서브세트의 기능을 억제하는 것으로 보고되었다 (Immunol Rev. 2012;248:156-69). MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포의 세포군이 증가되었다. 더욱이, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포의 세포군이 각각 현저하게 증가되었음을 확인하였다 (p < 0.01, 도 6C, D).

따라서, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리는 MOG에 의해 재활성화된 Treg 세포가 증가됨으로써 MOG에 의해 재활성화된 림프구가 조절됨을 확인하였다.

실시예 7. EAE 마우스에서 MP 및 BM-MSCs의 병용 치료에 의한 MOG에 의해 재활성화된 CD4 ⁺ T 세포의 증식 억제 및 사멸 촉진 효과

EAE 에서 활성화된 T 세포는 Fas 및 Bcl-2 중재의 세포사멸 경로에 의해 제거된다고 알려져 있다 (Science. 1998;281:1305-8; 및 Int Immunol. 1998;10:1807-17). 이에 본 발명자들은 MP 및 BM-MSCs의 병용 처리에 의해 MOG에 의해 재활성화된 CD4 T 세포의 증식 및 사멸을 조절할 수 있는지 여부를 조사하였다.

그 결과, MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에서는 MOG에 의해 재활성화된 CD4 T 세포의 증식에 유의적인 변화가 없음을 확인하였다. 그러나, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 세포의 증식이 현저하게 감소됨을 확인하였다 (p < 0.05, 도 7A).

또한, MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 caspase3/7 활성이 현저하게 증가되었다 (p < 0.01). 더욱이, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리 그룹에서는 MP 또는 BM-MSCs 단독 처리 그룹에 비해 caspase3/7 활성이 현저하게 증가되었다 (p < 0.01, 도 7B). Annexin V/PI 분석에서도 같은 결과가 나타났다 (도 7C).

따라서, MP 및 BM-MSCs의 병용 처리는 세포증식을 억제하고 세포사멸을 향상시킴으로써 MOG에 의해 재활성화된 T 세포를 감소시킴을 확인하였다.

실시예 8. EAE 마우스에서 MP 및 MSC-IFNβ의 병용 치료에 의한 임상 심각성 및 조직학적 결과의 완화 효과

본 발명자들은 MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리에 의한 치료적 효과를 확인하기 위하여, 면역 후 14일 째에 마우스에 처리를 시작하였다. PBS 처리 그룹에서는 면역 후 7 내지 14 일에 질병 증상이 발달하였고, MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 처리 그룹에서는 약간 변경된 질병 증상이 나타났다. 그러나, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 질병의 심각성이 감소됨을 확인하였다.

본 발명자들은 면역 후 0일부터 46일까지 각 동물에 의한 임상점수를 평가하였다. EAE의 평균(mean)/최대(maximum) 임상점수(clinical score)에 있어서, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP의 단독 처리 그룹에 비해 현저하게 감소되었다 (Maximum clinical score, PBS: 4.1 ± 0.5; MSCs-GFP: 3.6 ± 0.3; MSCs-IFNβ: 2.9 ± 0.2; MP: 3.1 ± 0.2; Combination: 2.1 ± 0.1, P < 0.01; Mean clinical score, PBS: 3.4 ± 0.1; MSCs-GFP: 2.9 ± 0.4; MSCs-IFNβ: 2.5 ± 0.2; MP: 2.7 ± 0.4; Combination: 1.5 ± 0.3, P < 0.05 or P < 0.01, 도 8A).

또한, 본 발명자들은 EAE 마우스의 척수에서 염증세포 침윤 및 재수초의 양을 확인하기 위하여, H&E, Iba-1, LFB 및 MBP 염색을 수행하였다. 그 결과, 침윤된 단핵구 및 활성화된 미세교 세포는 특히 요추 척수의 백질에서 확연히 나타났다. 그런데, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리한 경우 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리한 경우에 비해 침윤된 염증세포의 양이 감소됨을 확인하였다 (도 8B). 유사하게, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리한 경우 EAE 마우스의 요추 척수의 백질에서 재수초 및 MBP 발현도 증가되었다 (도 8C).

따라서, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리에 의한 경우 EAE 마우스에서 염증세포 침윤이 감소되고 재수초가 증가됨으로써 임상 심각성이 감소됨을 확인하였다.

실시예 9. EAE 마우스에서 MP 및 MSC-IFNβ의 병용 치료에 의한 Th1 및 Th2 사이토카인 수준의 조절 효과

염증 사이토카인은 EAE 동안 면역 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Int. J. Mol. Sci. 13, 13438-13460). 본 발명자들은 EAE에서 MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리에 의하여 면역조절 반응이 변화되는지 확인하기 위하여, 처리 후 16일째에 EAE 마우스에서 얻은 비장의 림프구에서 Th1 사이토카인 (IFN-γTNF-α, IL-17 및 IL-12) 및 Th2 사이토카인 (IL-4 및 IL-10)의 수준을 측정하였다.

그 결과, MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 IFN-γ, TNF-α 및 IL-17의 수준이 감소되었다. 또한, MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에 비해 IFN-γ, TNF-α 및 IL-17의 수준이 현저하게 감소됨을 확인하였다 (IFN-γ, PBS: 571.9 ± 11.3 pg/ml; MSCs-GFP: 490 ± 28.2 pg/ml; MSCs-IFNβ: 386.5 ± 36.5 pg/ml; MP: 417.1 ± 21.6 pg/ml; Combination: 216.8 ± 8.7 pg/ml, P < 0.05 or P < 0.01; TNF-α, PBS: 160.7 ± 4.8 pg/ml; MSCs-GFP: 123 ± 7 pg/ml; MSCs-IFNβ: 96.4 ± 1.6 pg/ml; MP: 88 ± 9.3 pg/ml; Combination: 54.8 ± 5.8 pg/ml, P < 0.05 or P < 0.01; IL-17, PBS: 363 ± 30.8 pg/ml; MSCs-GFP: 237.5 ± 24.7 pg/ml; MSCs-IFNβ: 194.4 ± 12.6 pg/ml; MP: 270 ± 27.3 pg/ml; Combination: 66.5 ± 21.4 pg/ml, P < 0.05 or P < 0.01, 도 9A).

반대로, MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 IL-4 및 IL-10의 수준이 증가되었다. 또한, MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에 비해 Th2 사이토카인의 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다 (IL-4, PBS: 4.7 ± 0.4 pg/ml; MSCs-GFP: 17.5 ± 3.5 pg/ml; MSCs-IFNβ: 27.6 ± 7 pg/ml; MP: 13.1 ± 3.3 pg/ml; Combination: 50.4 ± 7.7 pg/ml, P < 0.01; IL-10, PBS: 78.1 ± 9.6 pg/ml; MSCs-GFP: 292.5 ± 17.6 pg/ml; MSCs-IFNβ: 362.9 ± 17.6 pg/ml; MP: 188.6 ± 47.5 pg/ml; Combination: 761.5 ± 175.8 pg/ml, P < 0.05 or P < 0.01, 도 9B).

따라서, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리에 의한 경우 EAE 마우스에서 Th1 및 Th2 사이토카인이 체계적으로 조절됨을 확인하였다.

실시예 10. EAE 마우스에서 MP 및 MSC-IFNβ의 병용 치료에 의한 비장의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 세포군의 감소 효과

EAE는 말초신경에서 활성화되고 CNS(중추신경)로 이동하는 미엘린-특이적인 T 세포에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다 (Br. J. Pharmacol. 164, 1079-1106). 이에 본 발명자들은 MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리에 의해 EAE 마우스의 비장에서 MOG에 의해 재활성화된 T 세포의 세포군에 변화를 주는지 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD4+CD45+ 및 CD8+ T 세포의 세포군이 감소되었다. 또한, MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에 비해 CD4+CD45+ 및 CD8+ T 세포의 세포군이 현저하게 감소됨을 확인하였다 (CD4+CD45+, PBS: 52.9 ± 5.62; MSCs-GFP: 49.5 ± 1.95; MSCs-IFNβ: 43.6 ± 1.74; MP: 48.7 ±± 1.53; Combination: 35 ± 3.68, P < 0.05 or P < 0.01; CD8+, PBS: 42.5 ± 2.12; MSCs-GFP: 39 ± 1.41; MSCs-IFNβ: 32.5 ± 2.12; MP: 31.5 ± 0.7; Combination: 24 ± 1.41, P < 0.05 or P < 0.01, 도 10A).

CD4+CD25+ Treg 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 조절함으로써 면역 균형을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 보고되었다 (Immunol. Rev. 248, 156-169). 이에 본 발명자들은 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에서 PBS 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 세포의 세포군이 증가됨을 확인하였다. 또한, MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 Treg 세포의 세포군이 현저하게 증가됨을 확인하였다 (CD4+CD25+, PBS: 1.7 ± 0.74; MSCs-GFP: 2.6 ± 0.23; MSCs-IFNβ: 3.8 ± 0.07; MP: 3.2 ± 0.23; Combination: 7.2 ± 0.48, P < 0.05 or P < 0.01, 도 10B).

더욱이, MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에 비해 MOG에 의해 재활성화된 CD4+ T 세포에서 caspase3/7 활성이 증가됨을 확인하였다 (Caspase 3/7 activity, PBS: 114,158.5 ± 3947.7; MSCs-GFP: 147,500 ± 3535.5; MSCs-IFNβ: 164,904.5 ± 1679.3; MP: 131,862.5 ± 9700.7; Combination: 183,310.5 ± 6095.9, 도 3C).

따라서, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리에 의한 경우 EAE 마우스에서 비장의 Treg 세포의 세포군을 증가시키고, 세포사멸 신호을 초기화 함으로써 MOG에 의해 재활성화된 T 세포의 세포군을 감소 또는 억제하는 것으로 확인되었다.

실시예 11. EAE 마우스의 척수에서 MP 및 MSC-IFNβ의 병용 치료에 의한 BBB 투과성의 조절 효과

CNS에서의 BBB (blood-brain barrier)의 파괴는 다발성 경화증에서 염증 및 탈수초와 관련되는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리에 의해 BBB 파괴를 완화시키는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 처리 후 7일째에 EAE 마우스에 EB dye를 정맥주사하는 실험을 수행하였다.

그 결과, MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹 또는 병용 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 EB-염색의 뇌 및 척수 조직에서 적은 양의 EB 혈관외유출(extravasation)이 확인되었다. 더욱이, MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에 비해 뇌 및 척수에서 EB의 양이 현저하게 감소되었다 (Brain, PBS: 0.4 ± 0.05; MSCs-GFP: 0.3 ± 0.04; MSCs-IFNβ0.3 ± 0.03; MP: 0.35 ± 0.05; Combination: 1.3 ± 0.03, P < 0.01; Spinal cord, PBS: 0.7 ± 0.04; MSCs-GFP: 0.5 ± 0.05; MSCs-IFNβ0.5 ± 0.04; MP: 0.4 ± 0.05; Combination: 0.3 ± 0.03, P < 0.05 or P < 0.01, 도 11A).

Occludin은 BBB 밀착연접(tight junction)의 중요한 구성요소이고, 밀착연접의 마커로 잘 알려져 있다 (Pharmacol. Rev. 57, 173-185). 본 발명자들은 EAE 마우스의 척수 단면의 면역형광 염색을 통해 occludin의 발현 여부를 조사하였다.

그 결과, MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에서는 PBS 처리 그룹에 비해 occludin 발현량이 증가되었다. MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 처리된 마우스의 척수에서의 형광강도 역시 PBS 처리된 마우스에서의 형광강도에 비해 약간 증가되었다. 그런데, MP 및 MSC-IFNβ의 병용 처리 그룹에서는 MSCs-GFP, MSCs-IFNβ 또는 MP 단독 처리 그룹에 비해 현저하게 형광강도가 증가됨을 확인하였다 (Occludin, PBS: 2800 ± 300; MSCs-GFP: 3350 ± 186; MSCs-IFNβ: 3720 ± 365; MP: 3150 ± 253; Combination: 9600 ± 751, P < 0.01, 도 11B).

따라서, MP 및 MSCs-IFNβ의 병용 처리에 의한 경우 밀착연접의 회복에 의해 EAE 마우스의 CNS에서 BBB 파괴가 감소 또는 완화됨을 확인하였다.

Claims

메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells)인 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 IFN-β(interferon beta)를 분비하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 메틸프레드니솔론은 투여 개체에 1 내지 30 mg/kg의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 메틸프레드니솔론은 복강 내 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 5×10⁵ 내지 2×10⁶ cells의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 정맥 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법으로 상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells)인 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 메틸프레드니솔론은 투여 개체에 1 내지 30 mg/kg의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 메틸프레드니솔론은 복강 내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 줄기세포는 5×10⁵ 내지 2×10⁶ cells가 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 줄기세포는 정맥 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물로서 상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells)인 조성물.