KR101569168B1 - 태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료 - Google Patents

태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR101569168B1
KR101569168B1 KR1020097018749A KR20097018749A KR101569168B1 KR 101569168 B1 KR101569168 B1 KR 101569168B1 KR 1020097018749 A KR1020097018749 A KR 1020097018749A KR 20097018749 A KR20097018749 A KR 20097018749A KR 101569168 B1 KR101569168 B1 KR 101569168B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stem cells
cells
cell
placental stem
placental
Prior art date
Application number
KR1020097018749A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090109575A (ko
Inventor
제임스 더블유. 에딘져
로버트 제이. 하리리
지아-룬 왕
퀴안 예
허벌트 팰렉
Original Assignee
안트로제네시스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 안트로제네시스 코포레이션 filed Critical 안트로제네시스 코포레이션
Publication of KR20090109575A publication Critical patent/KR20090109575A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101569168B1 publication Critical patent/KR101569168B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A61K35/64—Insects, e.g. bees, wasps or fleas
    • A61K35/644—Beeswax; Propolis; Royal jelly; Honey
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)

Abstract

본 명세서에서는 태반 줄기세포 또는 제대(umbilical cord) 줄기세포를 이용하여 면역 관련 질병, 장애 또는 상태가 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 예를 들어 면역 관련 질병, 장애 또는 상태는 염증성 창자병, 이식 대 숙주병, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 건선, 홍반성 루푸스, 당뇨병, 균상 식육종(Alibert-Bazin 증후군) 또는 피부 경화증이 있다.

Description

태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료{TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES USING PLACENTAL STEM CELLS}
본 명세서에서는 사람 태반 줄기세포를 이용하여 원하지 않거나 유해한 면역 반응 때문에 일어나거나 그와 관련된 질병, 장애 또는 상태가 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 예를 들어 염증성 창자병, 이식 대 숙주병, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 건선, 홍반성 루푸스, 당뇨병, 균상 식육종(Alibert-Bazin 증후군) 또는 피부 경화증이 있다.
이 출원은 2007년 2월 12일 제출된 미국 가출원 제60/901,067호를 기초로 한 우선권을 주장하며, 본 명세서는 인용에 의하여 상기 명세서 내용 전부를 포함하고 있다.
사람 줄기세포는 여러 종류의 성숙한 세포 계통을 생성할 수 있는 전능성(totipotent)이거나 다능성(pluripotent)인 전구세포(precursor cell)이다. 줄기세포는, 비록 모든 조직은 아니지만, 수많은 조직을 재형성하고, 생리적 및 해부학적 기능을 되살리는데 쓰일 수 있다는 것을 밝혀주는 증거들이 있다.
수많은 서로 다른 포유류 줄기세포들의 특성이 분석된 바 있다. 예를 들어 Caplan 외 미국 특허 제5,486,359호(사람 중간엽 줄기세포), Boyse 외 미국 특허 제5,004,681호(태아와 신생아 조혈 줄기세포와 전구세포), Boyse 외 미국 특허 제5,192,553호 (상동), Beltrami 외, Cell 114(6):763~766 (2003)(심근 줄기세포), (Forbes 외, J. Pathol 197(4):510~518 (2002)(간 줄기세포)를 보라. 제대혈과 제대혈에서 유래한 총유핵세포는 절제 시술을 받은 환자들의 조혈 기능을 완전히 또는 부분적으로 회복하기 위한 이식에 쓰인 바 있다.
태반은 줄기세포의 세포원으로서 특히 매력적이다. 포유동물 태반은 풍부하고 의료 폐기물로 버려지는 것이 보통이기 때문에 의료용으로 유용한 줄기세포의 세포원으로서 독특한 지위를 가진다. 본 명세서에서는 그러한 분리된 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군을 제공하며 또한 원하지 않거나 유해한 면역 반응 때문에 일어나거나 그와 관련된 질병, 장애 또는 상태, 예를 들어 염증성 창자병, 이식 대 숙주병, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 건선, 홍반성 루푸스, 당뇨병, 균상 식육종(Alibert-Bazin 증후군) 또는 피부 경화증이 있는 개체를 치료하기 위하여 이들 세포를 이용하는 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 명세서에서는 면역 반응, 예를 들어 염증에 의하여 일어나거나 관련되거나 염증을 가져 오는 질병, 장애 및/또는 상태를 치료, 관리, 완화하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 명세서의 한 실시 태양에서는 나쁜, 유해한, 부적절한 또는 원하지 않는 면역 반응, 예를 들어 염증 때문에 일어나거나 그에 관련되는 질병, 장애 또는 상태를 가지고 있거나 그렇게 될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체에게 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포에 의하여 조건화된 배지를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 치료적 유효량은 상기 질병, 장애 또는 상태의 증상 중 하나 이상을 측정 가능하게 향상시키거나 그러한 증상 중 하나 이상의 진행을 줄여주는 양이다. 또한 본 명세서에서는 면역 반응에 의하여 일어나거나 그에 관련된 질병, 장애 및/또는 상태, 예를 들어 염증에 의하여 일어나거나 관련되거나 염증을 가져 오는 질병, 장애 및/또는 상태를 치료, 관리, 완화하거나 예방하는 약제 제조에 사용되는 태반 줄기세포의 용도를 제공한다. 어떠한 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포가 CD10+, CD34-, CD105+이고 CD200+인 태반 줄기세포다. 다른 특정한 태양에서는 상기 태반 줄기세포가 CD200과 HLA-G를 발현하거나, CD73, CD105와 CD200을 발현하거나, CD200과 OCT-4를 발현하거나, CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나, 또는 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나, 아니면 OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다. 더 구체적인 실시 태양에서는 이 태반 줄기세포가 면역 세포의 활성을 억제하는데, 예를 들어 T 세포 증식을 억제한다.
다른 특정한 태양에서는 상기 질병, 장애 또는 상태가 염증성 창자병(inflammatory bowel disease)이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 염증성 창자병은 크론 병이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 크론 병은 위십이지장(gastroduodenal) 크론 병이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 크론 병은 공장과 회장의 염증(jejunoileitis)이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 크론 병은 회장염이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 크론 병은 회결장염이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 크론 병은 크론 대장염이다. 다른 구체적인 태양에서, 상기 염증성 창자병은 궤양성 대장염이다.
다른 구체적인 태양에서, 상기 염증성 창자병의 증상은 GI 관의 일부분의 염증 및 팽윤, 복부 통증, 빈번한 창자의 공복(frequent emptying of the bowel), 설사, 직장 출혈, 빈혈, 체중 감소, 관절염, 피부 문제, 발열, 소장 벽의 굵어짐, 소장 내 상처 조직(scar tissue)의 형성, 소장 내 종기(sore) 또는 궤양의 형성, 소장 벽 내 하나 이상의 누(fistula)의 성장, 항문 내 하나 이상의 균열(fissure)의 성장, 영양 결핍의 진전, 신장 결석의 발달, 담석의 발생, 간 또는 담즙 계 질병의 발생, 혈액 설사, 오심, 복부 경련(abdominal cramp), 빈혈, 피로, 체중 손실, 식욕 저하, 신체 체액 및 영양소의 손실, 피부 병변(skin lesion), 관절 통증, 성장 장애, 골다공증의 발생, 또는 눈 염증 중 하나 이상이다.
다른 구체적 태양에서, 상기 염증성 창자병의 증상은 소양증성 또는 통증성 발진, 열, 전신성 홍피증(generalized erythroderma), 박리(desquamation), 빌리루빈의 증가한 (예를 들어, 정상보다 높은) 레벨, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 증가한 레벨, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 증가한 레벨, 알칼린 포스파타제(AP)의 증가한 레벨, 설사, 내부 출혈, 경련(cramping), 복부 통증, 장폐색, 눈의 작열감, 눈 자극, 광선공포증(photophobia), 감소한 눈물 분비에 따른 눈 통증; 구강 건조, 매운 또는 산성 음식에 대한 민감성, 복부 통증, 삼킴곤란(dysphagia), 연하통(odynophagia), 체중 저하, 폐색성 폐 질환, 근육 약화(muscular weakness), 신경병성 통증, 또는 근육 경련(muscle cramp) 중 하나 이상이다.
다른 특정 태양에서, 상기 질병, 장애 또는 상태는 이식-대-숙주 질환(graft-versus-host disease)이다. 구체적 특정 태양에서, 상기 이식 대 숙주 질환은 다른 동종 간(allogeneic) 골수 이식 후에 발생한다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 이식 대 숙주 질환은 실질 기관 이식 후에 발생한다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 이식 대 숙주 질환은 여러 조직 동종이식(composite tissue allograft) 후에 발생한다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 이식 대 숙주 질환은 상기 투여에 의해 적어도 하나의 단계 등급만큼 감소한다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 이식 대 숙주 질환은 상기 투여의 결과로 인해 이식 후 100일 이내에 등급 II를 넘어 진전되지 않는다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 이식 대 숙주 질환은 상기 투여의 결과로 인해 이식 후 100일 이내에 등급 I을 넘어 진전되지 않는다.
다른 특정 태양에서, 상기 질환, 장애 또는 상태는 류마티스성 관절염(RA)이다. 더 구체적 태양에서, 상기 투여는 RA의 하나 이상의 증상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, 또는 RA를 가진 개체 내에서 적어도 하나의 관절에서 RA의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 감소시킬 정도로 충분하다. 다른 구체적 태양에서, 상기 투여는 RA의 하나 이상의 증상에서 검출 가능한 개선을 야기할 정도로 충분하거나, 또는 RA를 가진 개체 내에서 적어도 하나의 비-관절(non-joint)에서 RA의 하나 이사의 증상의 개시를 검출 가능하게 감소시킬 정도로 충분하다. 구체적 특정 태양에서, 상기 비-관절 조직은 피부(진피), 폐, 자가면역 시스템 또는 혈액, 신장 조직, 심혈과 조직, 눈 조직, 또는 신경병적 조직이다. 더 구체적 태양에서, 상기 RA의 증상은 RA에 수반하는 상태이다. 더 구체적 태양에서, 상기 RA에 수반하는 상태는 괴저농피증, 호중구 피부염(neutrophilic dermatosis), Sweet 증후군, 바이러스성 감염, 결절 홍반, 소엽상 지방층염(lobular panniculitis), 손가락 피부의 위축, 손바닥 홍반, 광범위 얇아짐(diffuse thinning)(라이스 페이퍼 피부(rice paper skin)), 피부 허약, 예를 들어, 팔꿈치 위와 같은 외부 표면상의 피하 결절, 폐의 섬유증(예를 들어, 메토트렉세이트 치료의 결과로 인해), Caplan 결절, 맥관염 장애, 손발톱 주름 경색, 신경장애, 신장애, 아밀로이드증, 근육 가성비대(muscular pseudohypertrophy), 심내막염(endoscarditis), 좌 심실 부전, 판막염(valulitis), 공막연화증, 다발홑신경염(mononeuritis multiplex), 고리중쇠뼈 불완전 탈구(atlanto-axial subluxation)이다. 상기 방법의 다른 구체적 태양에서, 복수의 태반 또는 제대 줄기세포가 IL-1Ra 및 DHFR를 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된다.
다른 구체적 태양에서, 상기 질병, 장애 또는 상태는 다발성 경화증이다. 더 구체적 태양에서, 상기 다발성 경화증은 재발성/완화성(relapsing/remitting) 다발성 경화증, 속발성 진행성 다발성 경화증, 원발성 진행성 다발성 경화증, 또는 진행성/재발성 다발성 경화증이다. 다른 구체적 태양에서, 상기 다발성 경화증의 증상은 팔다리의 감각 장애, 시신경 장애, 추체로 장애(pyramidal tract dysfunction), 방광 장애, 창자 장애, 성 장애, 운동실조(ataxia), 또는 복시증(diplopia) 중 하나 이상이다.
다른 구체적 태양에서, 상기 질병, 장애 또는 상태는 홍반 루푸스(lupus erythematosus)이다. 더 구체적 태양에서, 상기 홍반 루푸스의 증상은 빰 발진, 나비모양 발진(butterfly rash), 원반 모양 루푸스, 탈모증, 구강, 비강 및 질 궤양, 피부 병변(lesions on the skin), 관절 통증 빈혈 및/또는 철 결핍, 정상 보다 낮은 혈소판 및 백혈구 수, 항인지질 항체 신드롬, 혈액 내 항카르디오리핀(anticardiolipin) 항체의 존재, 심막염, 심근염, 심장내막염, 폐 및/또는 흉막 염증, 흉막염(pleuritis), 흉막 삼출, 루푸스 폐렴, 만성 광범위 간질성 폐 질환(diffuse interstitial lung disease), 폐 고혈압, 폐 색전, 폐 출혈, 무통증 혈뇨 또는 단백뇨, 루푸스 신염, 신 부전, 및/또는 "wire loop" 이상이 있는 막 사구체신염의 발생; 신경병적 증상(예를 들어, 발작, 정신병, 뇌척수액 내 이상); T-세포 이상(예를 들어, CD45 포스파타제 결핍 및/또는 CD40 리간드의 증가된 발현); 및/또는 비특이적 증상들(예를 들어, 루푸스 위장염, 루푸스 췌장염, 루푸스 방광염, 자가면역 내 귀 질환(autoimmune inner ear disease), 부교감신경계 장애, 망막 맥관염, 전신성 맥관염, FcεRIγ의 증가된 발현, T 세포 내 증가하고 유지되는 칼슘 레벨, 혈액 내 이노시톨 트리포스페이트의 증가, 단백질 키나제 C 인산화의 감소, Ras-MAP 키나제 신호전달(signaling)의 감소, 및/또는 단백질 키나제 A I 활성의 결핍 중 하나 이상이다.
다른 구체적 태양에서, 상기 질병, 장애 또는 상태는 피부 경화증(scleroderma)이다. 더 구체적 태양에서, 상기 피부 경화증은 광범위(diffuse) 피부 경화증이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 피부 경화증은 국한된(limited) 피부 경화증(CREST 신드롬)이다. 더 구체적 태양에서, 상기 피부 경화증은 반상/선상(morphea/linear) 피부 경화증이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 증상은 얼굴 피부의 경화, 손가락 피부의 경화, 레이노 증후군(Reynaud's syndrome), 팔다리(extremity)의 부적절한 혈관 수축, 석회증, 모세혈관 확장(telangiectasia), 식도 운동 장애(dysmotility) 또는 혈중 항중심체(anti-centromere) 항체 또는 항scl 70/항-토포이성질화효소(anti-topoisomerase) 항체의 존재 중 어느 하나 이상이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 방법은 제2치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 더 구체적 태양에서, 상기 제2치료제는 소염제, 양성자 펌프 억제제, 면역 억제 화합물 또는 혈관 확장제이다.
다른 구체적 태양에서, 상기 질병, 장애 또는 상태는 균상 식육종(mycosis fungoides)(Alibert-Bazin 증후군)이다. 더 구체적 태양에서, 상기 균상 식육종은 패취 단계(patch phase)이다. 더 구체적 태양에서, 상기 균상 식육종이 피부 종양 단계(skin tumor phase)이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 균상 식육종이 피부 발적 단계(skin redness stage, 홍색피부증(erythroderma))이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 균상 식육종이 림프 노드 단계이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 증상은 가렵고 납작하며 붉은 반점(patch)의 발생; 납작하고 붉으며 도드라지고 단단한(플라크)(raised and hard(plaque)) 반점의 발생; 도드라진 덩어리(결절)(raised lump(nodule))의 발생; 크고 붉은 비늘 모양의 가려운 곳이 신체에 발생; 손바닥과 발바닥 피부의 갈라짐; 손바닥과 발바닥 피부의 비후(thickening); 균열(crack); 또는 림프 노드의 염증 중 하나 이상이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 방법은 개체에게 제2치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 더 구체적 태양에서, 상기 제2치료제는 소염제, 면역 억제 화합물, 햇빛 노출, 자외선 노출, 국소 스테로이드제, 국소 표재 방사선요법(superficial radiotherapy), 전신 피부 전자선 치료, 전신 홍반이 일어난 피부에 대한 유기농 꿀(organic honey) 도포, 인터페론, 레티노이드, 렉시노이드(rexinoid) 또는 보리노스탯(vorinostat)이다.
다른 태양에서, 상기 질병, 장애 또는 상태는 당뇨병이다. 구체적 태양에서, 상기 당뇨병은 제2항 당뇨병이다.
다른 태양에서, 상기 질병, 장애 또는 상태는 건선이다. 더 구체적 태양에서, 상기 건선은 플라크 건선(심상성 건선(psoriasis vulgaris))이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 건선은 굴곡성(flexural) 건선(역위 건선(inverse psoriasis))이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 건선은 물방울모양(guttate) 건선이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 건선은 농포성(pustular) 건선이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 건선은 손발톱 건선이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 건선은 건선성 관절염이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 건선은 홍색피부성(erythrodermic) 건선이다. 다른 구체적 태양에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기 세포에 의해 조건화된 배양 매질의 치료학적으로 유효한 양은 Psoriasis Area Severity Index에서 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 더 많은 포인트 감소를 야기하기에 충분한 양이다. 일 태양에서, 본 발명은 건선이 있는 개체에게 유효량의 태반 줄기세포를 투여하는 것을 제공하며, 여기에서 상기 유효량은 예를 들어, 건선의 증상들 중 하나 이상의 진전을 줄이거나, 증상들의 심각성을 감소시키는 데 있어 검출 가능한 개선을 야기하는 태반 줄기세포의 양이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 하나 이상의 증상들은 은빛 흰색 비늘성 피부로 덮여 있는 염증 피부의 돌출 영역의 하나 이상의 발생; 플라크의 발생; 피부 주름 내에 발생하는 피부의 활면 염증 패취(smooth inflamed patch); 하나 이상의 작은 경구 반점(spot)의 발생; 하나 이상의 농포의 발생; 하나 이상의 손톱 또는 발톱의 외형 변화; 하나 이상의 손발톱 균열; 관절 및 연결 조직 염증; 손발가락염; 척추염; 신체 표면 대부분 위 피부에 넓게 퍼진 염증 및 탈락(exfoliation); 또는 심각한 가려움, 팽윤 및/또는 통증이다. 다른 구체적 태양에서, 상기 방법은 하나 이상의 치료 성분 또는 치료를 투여하는 것을 더 포함하여, 여기에서 상기 치료 성분 또는 치료는 코르티코스테로이드를 포함하는 크림 또는 연고, 비타민 D3 유사체를 포함하는 크림 또는 연고, 안트랄린(anthralin)을 포함하는 크림 또는 연고, 아르간 오일(argan oil)을 포함하는 크림 또는 연고, 레티노이드를 포함하는 크림 또는 연고, 또는 코울 타르(coal tar)를 포함하는 크림 또는 연고 중 하나 이상; 하나 이상의 자외선, 예를 들어, 파장 약 280 nm 내지 315 nm, 특히 약 311 nm 내지 약 312 nm의 UVB에의 노출, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20분 동안; UVA 빛 노출과 함께 프소랄렌(psoralen)의 국소 투여; 또는 메토트렉세이트(methotrexate), 사이클로스포린, 레티노이드, 티오구아닌(tioguanine), 하이드록시우레아, 설파살라진, 마이코페노레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 아자티오프린(azathioprine), 경구 타크로리무스 및/또는 푸마릭 산 에스테르(fumaric acid ester)의 하나 이상의 하나 이상의 전신 투여를 포함한다.
상기 방법들 중 어느 하나의 다른 구체적 태양에서, 상기 방법은 상기 질병, 장애 또는 상태를 가진 개체에게 제2치료제(second therapeutic agent)를 투여하는 것을 포함한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 제2치료제는 항염증제, 면역조절 성분 및 면역억제 성분, 통증 치료제, 또는 항생제이다. 더 구체적 태양에서, 상기 제2치료제는 면역조절 성분이다. 더 구체적 태양에서, 상기 면역조절 성분은 면역 억제제이다. 더욱 구체적인 태양에서, 상기 면역 억제 성분은 항-CD3 항체(예를 들어, OKT3, 무로노마브(muronomab)), 항-IL-2 수용체 항체(예를 들어, 바실릭시마브(basiliximab)(SIMULECT(등록상표)) 및 다크리주마브(daclizumab)(ZENAPAX(등록상표)), 항 T 세포 수용체 항체 (예를 들어, 무로모나브-CD3), 아자티오프린(azathioprine), 칼시뉴린(calcineurin) 억제제, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 머르캅토퓨린, 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 타크로리무스, 또는 시롤리무스(sirolimus)이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 제2치료제는 다른 타입의 줄기세포를 포함하며, 예를 들어, 골수-유래 중간엽 줄기세포, 골수, 또는 조혈 줄기세포이다.
정의들
본 명세서에서 "SH2"라는 용어는 CD105 마커 표면의 에피토프에 결합하는 항체를 일컫는다. 따라서 SH2+로 나타내는 세포는 CD105+이다.
본 명세서에서 "SH3"과 "SH4"라는 용어는 CD73 마커 표면의 에피토프에 결합하는 항체들을 일컫는다. 즉 SH3+ 및/또는 SH4+라고 나타낸 세포는 CD73+이다.
본 명세서에서 "분리된 줄기세포"라는 용어는 상기 줄기세포가 유래한 조직, 예를 들어 태반의 다른 비줄기세포로부터 실질적으로 분리된 줄기세포를 말한다. 줄기세포는 자신과 자연 상태에서 결부된 비줄기세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 적어도 99%를 예를 들어 상기 줄기세포의 수집 및/또는 세포 배양 과정에서 제거하였을 때 "분리된" 줄기세포가 된다.
본 명세서에서 "분리된 세포군(isolated population of cells)"이라는 용어는 상기 세포군이 유래한 조직, 예를 들어 태반의 다른 세포들로부터 실질적으로 분리된 세포군을 말한다. 줄기세포는 상기 세포군이 자연 상태에서 결부된 세포들 중 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 적어도 99%가 상기 줄기세포군의 수집 및/또는 세포 배양 과정에서 제거되었을 때 "분리된" 세포군이다.
본 명세서에서, "태반 줄기세포"라는 용어는 형상, 세포 표면 표지 또는 1차 배양 후 계대 수에 무관하게 포유류 태반에서 유래한 줄기세포 또는 전구세포로서 조직 배양 기질(tissue culture substrate, 예를 들어 조직 배양 플라스틱 또는 피브로넥틴 피복 조직 배양판)에 부착하는 것을 말한다. 그러나 본 명세서에서 "태반 줄기세포"라는 용어는 이 분야 기술자들이 이해하는 영양막 세포(trophoblast), 세포 영양막 세포(cytotrophoblast), 배아 생식세포 또는 배아 줄기세포를 가리키지 않는다. 세포는 줄기세포의 특징 중 적어도 하나, 예를 들어, 표지 또는 유전자 발현 상(profile)이 하나 이상 유형의 줄기세포와 관련되거나, 배양시 적어도 10~40회 복제할 수 있으며, 중복능(multipotency), 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 혹은 양쪽 모두에서 3대 배엽층 중 하나 이상의 모든 세포로 분화할 수 있는 능력, 성체(즉 분화한) 세포 특성의 결여 등을 갖추고 있으면 "줄기세포"라고 간주한다. "태반 줄기세포"와 "태반 유래 줄기세포"라는 용어는 서로 교환하여 쓰일 수 있다. 본 명세서에서 달리 언급이 없는 한 "태반"이라는 용어는 탯줄을 망라한다. 본 명세서에서 개시하는 부착성 태반 줄기세포는 몇몇 실시 태양에서는 시험관내에서 중복성(즉 시험관내의 분화 조건하에서 이들 세포가 분화)이거나, 생체내에서 중복성(즉 이들 세포는 생체내에서 분화)이거나 양쪽 모두이다.
본 명세서에서 줄기세포는 특정 표지를 검출할 수 있으면 그 표지에 대하여 "양성"이다. 이를 테면 태반 줄기세포는 예를 들어 CD73에 대하여 양성인데, 이는 태반 줄기세포에서 CD73 신호가 배경 신호보다 측정 가능하게 더 큰 신호를 나타내기 때문(이를 테면 동종 세포 유형 대조군에 견주어)이다. 세포는 또한 어느 표지를 이용하여 그 세포를 적어도 하나의 다른 세포 유형과 구별할 수 있거나 그 표지가 세포 표면에 나타나거나, 발현될 때 그 표지를 이용하여 그 세포를 선별 또는 분리할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다.
본 명세서에서, "면역 조절(immunomodulation)"과 "면역 조절성(immunomodulatory)"은 면역 반응에 측정 가능한 변화를 일으키거나 일으킬 수 있는 능력을 갖춘 것, 그리고 그 능력을 뜻한다.
본 명세서에서, "면역 억제(immunosuppression)"과 "면역 억제성(immunosuppressive)"은 면역 반응에 측정 가능한 저하를 일으키거나, 일으킬 수 있는 능력을 갖춘 것, 그리고 그 능력을 의미한다.
상세한 설명
본 명세서에서는 태반 줄기세포 및/또는 제대 줄기세포의 하나 이상의 투여량을 질병, 장애 또는 상태를 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 부적절한, 바람직하지않은, 해로운 또는 유독한 면역 반응, 예를 들어, 자가면역 질환과 관련된, 이러한 면역 반응이 관여하는 또는 이러한 면역 반응으로부터 발생하는 질병, 장애 또는 상태를 가진 개체의 치료 방법이 제공된다. 그러한 개체의 치료를 위한 방법 및 그러한 줄기세포 단독 또는 다른 치료제와 함께 투여하는 방법이 이하에서 자세히 기술된다.
1. 태반 줄기세포를 이용한 면역 조절
본 발명은 면역 세포의 조절, 예를 들어 한 면역 세포 또는 복수의 면역 세포에 대하여 증식 등의 활성 억제 방법을 제공하는데, 면역 세포를 복수의 태반 줄기세포와 접촉시킴으로써 이루어진다. 그러한 면역조절은 바람직하지않는 또는 해로운 면역 반응, 예를 들어, 염증성 창자병, 이식-대-숙주 질환, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 건선, 홍반 루푸스, 당뇨, 균상 식육종(Alibert-Bazin 신드롬), 또는 공피증과 관련된, 또는 이러한 면역 반응에 의해 야기되는 질병, 장애 또는 상태를 가진 개체의 치료에 유용하다. 그러한 면역조절은 또한 예를 들어, 동종이식 조직, 예를 들어, 이식 장기, 복합 조직 동종이식, 및 이와 유사한 것에 대한 숙주 면역 반응의 제거 또는 감소에 유용하다.
한 실시 태양에서, 본 발명은 복수의 면역세포를 복수의 태반 줄기세포와 접촉시키되, 상기 태반 줄기세포가 면역 반응을 측정 가능한 수준으로 억제하기에 충분한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 면역 반응 억제 방법을 제공하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포는 림프구 혼합 배양 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석 또는 회귀 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능한 수준으로 억제한다.
태반 줄기세포는 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에서 기술하는 태반 줄기세포(발명의 상세한 설명 단락 2를 참조)이다. 면역억제를 위하여 사용되는 태반 줄기세포는 하나의 태반 또는 복수의 태반에서 유래하거나 얻을 수 있다. 면역 억제에 쓰이는 태반 줄기세포는 하나의 종, 예를 들어 줄기세포를 수혈받을 종 또는 면역 세포의 기능을 저하시키거나 억제하여야 할 종에서 유래하거나 여러 종으로부터 유래할 수 있다.
본 발명 방법의 맥락에서 "면역 세포"란 면역계의 어떠한 세포라도 의미하지만, 특히 T 세포와 자연세포독성(NK) 세포를 의미한다. 즉 본 발명의 다양한 실시 태양에서 태반 줄기세포는 복수의 면역 세포와 접촉하게 되는데, 여기서 상기 복수의 면역 세포는 복수의 T 세포(예를 들어 복수의 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포) 및/또는 자연세포독성 세포이거나 이들을 포함한다. 본 발명 방법의 맥락에서 "면역 반응"이란 면역 세포가 정상적으로 받을 있는 자극에 대하여 면역 세포가 일으키는 모든 반응, 예를 들어 항원의 존재에 따른 반응을 의미한다. 많은 실시 태양에서 면역 반응은 T 세포(CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포 등)가 외부 항원, 예를 들어 수혈이나 이식시 존재하는 항원, 또는 자가 면역 질환에서와 같은 자가 항원에 대한 반응으로서 증식하는 것일 수 있다. 면역 반응은 이식 부위 안의 T 세포가 증식하는 것일 수도 있다. 면역 반응은 또한 자연세포독성 세포의 모든 활성, 가지상 세포의 성숙 등일 수도 있다. 면역 반응은 하나 이상의 유(class)의 면역 세포의 활성에 의한 국소적, 조직 또는 장기 특이적 또는 전신적 효과일 수 있는데, 예를 들어 이식 대 숙주 질환의 면역 반응, 염증, 염증 관련 상처 조직의 형성, 자가면역 상태(류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병, 홍반 루프스 등) 등이 있다.
본 명세서의 맥락에서 "접촉"이란 태반 줄기세포와 면역 세포를 함께 한 용기(예를 들어 배양 접시, 플라스크, 비알 등)에 넣거나 생체, 예를 들어 동일한 개체(예를 들어 사람 등의 포유류)에 넣는 것을 망라한다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 접촉은 상기 면역 세포의 면역 기능이 측정 가능한 정도로 변화하는데 충분한 수의 태반 줄기세포와 면역 세포를 충분한 시간 동안 이루어진다. 더 바람직스럽게는, 여러 실시 태양에서 상기 접촉은 상기 태반 줄기세포의 부재하에 면역 기능과 비교했을 때, 면역 기능(예를 들어 항원에 반응하여 T 세포가 증식)을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 억제하는데 충분한 것이다. 생체 내에서 일어나는 이러한 억제는 시험관내 분석(이하를 참조하라)을 통하여 측정할 수 있는데, 즉 시험관내 분석에서 밝힌 억제도를 특정 수의 태반 줄기세포와 특정 수의 면역 세포를 가지는 대상 개체의 면역 억제도로 외삽할 수 있다.
본 발명은 몇몇 실시 태양에서 면역 반응 또는 하나 이상 종류로 이루어지는 복수의 면역 세포의 활성을 시험관 내에서 조절하기 위하여 태반 줄기세포를 이용하는 방법을 제공한다. 상기 태반 줄기세포와 복수의 면역 세포를 접촉시키는 것은 다음 단계들을 포함할 수 있다. 상기 태반 줄기세포와 면역 세포를 같은 물리적 공간에 모아서 적어도 상기 복수의 태반 줄기세포의 일부분이 상기 복수의 면역 세포의 적어도 일부분과 상호작용하도록 하는 단계; 상기 태반 줄기세포와 면역 세포를 같은 배지를 이용하는 물리적으로 분리된 공간 속에서 유지하는 단계; 혹은 상기 접촉은 상기 태반 줄기세포와 면역 세포 중 어느 하나의 배양 배지 또는 배양물을 나머지 세포에 접촉시키는 단계(예를 들어 태반 줄기세포 배양물로부터 배양 배지를 얻은 다음 이 배양 배지에 분리된 면역 세포를 재현탁하는 것)를 포함할 수도 있다. 특정 실시예에서 상기 접촉은 림프구 혼합 배양 반응(MLR)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 접촉은 회귀 분석에서 수행된다.
이러한 접촉은, 예를 들어, 특정한 복수의 태반 줄기세포가 어느 정도만큼 면역 조절성, 예를 들어 면역 억제성을 가지는지 측정하기 위한 실험 조건하에서 일어날 수 있다. 이러한 실험 조건은 예를 들어 MLR 또는 회귀 분석일 수 있다. MLR과 회귀 분석법을 수행하기 위한 절차는 종래 기술에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Schwarz의 "The Mixed Lymphocyte Reaction: An In Vitro Test for Tolerance", J Exp. Med. 127(5):879-890 (1968); Lacerda 외, "Human Epstein-Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted CB- 17 Scid/Scid Mice", J Exp. Med. 183:1215-1228 (1996)을 보라. 한 바람직한 실시 태양에서는 MLR 분석에서 복수의 태반 줄기세포가 복수의 면역 세포(예를 들어 림프구, 예를 들어 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 림프구)와 접촉하게 된다.
이러한 MLR은 복수의 태반 줄기세포의 면역 억제능을 측정하는데 쓰일 수 있다. 예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 가지상 세포(DC)와 태반 줄기세포를 약 10:1:2의 비율로 혼합하여 복수의 태반 줄기세포를 MLR 분석할 수 있는데, 여기서 상기 T 세포는 딸세포로 분획되는 염료, 예를 들어 CFSE로 염색되며, 또한 상기 T 세포는 약 6일 동안 증식이 허용된다. 6일 동안 태반 줄기세포 존재하에서 상기 T 세포가 증식한 정도가 상기 태반 줄기세포의 부재와 가지상 세포 존재하에서의 T 세포 증식보다 측정 가능한 수준으로 떨어져 있다면 상기 복수의 태반 줄기세포는 면역 억제성이다. 이러한 MLR에서 태반 줄기세포는 해동되거나 아니면 배양물로부터 수집된다. 약 20,000 개의 태반 줄기세포가 100 μL의 배지(RPMI 1640, 1 mM HEPES 완충액, 항생제와 5% 사람 혼주 혈청(混住血淸))에 재현탁한 다음, 웰의 바닥에 달라붙도록 2시간 동안 놓아두었다. CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 Miltenyi 자기 비드를 이용하여 온말초 혈액(whole peripheral blood) 단핵 세포로부터 분리해 내었다. 이 세포를 CFSE로 염색하고, 웰 당 총 100,000 개의 T 세포(CD4+ T 세포 단독, CD8+ T 세포 단독, 같은 분량의 CD4+와 CD8+ T 세포)를 가하였다. 상기 웰 속의 부피를 200 μL까지 끌어올린 다음 MLR 반응을 진행한다.
따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 복수의 태반 줄기세포가 림프구 혼합 배양 반응에서 측정 가능한 정도로 T 세포 증식을 억제하기에 충분한 시간 동안 상기 복수의 태반 줄기세포와 복수의 면역 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 면역 반응의 억제법을 제공한다. 한 실시 태양에서, 상기 MLR에서 쓰인 상기 태반 줄기세포는 더 큰 태반 줄기세포군의 한 시료 또는 한 부분(aliquot)일 수 있다.
서로 다른 태반 또는 같은 태반의 서로 다른 조직에서 얻은 태반 줄기세포군은 면역 세포의 활성을 조절하는 능력, 예를 들어 T 세포 활성, 증식이나 NK 면역 세포 활성의 억제 능력에 차이가 있을 수 있다. 따라서 사용 전에, 특정 태반 줄기세포군의 면역 억제능을 측정하는 것이 바람직하다. 이러한 억제능은 예를 들어, 상기 태반 줄기세포군의 시료를 MLR 또는 회귀 분석법으로 조사하여 측정할 수 있다. 한 실시 태양에서는 시료의 MLR을 수행하여, 상기 태반 줄기세포에 의항 면역 억제 정도를 측정한다. 이 면역 억제 정도는 시료를 채취한 상기 태반 줄기세포군의 억제도로 볼 수 있다. 따라서 이러한 MLR은 특정 태반 줄기세포군의 절대적이고 상대적인 면역 기능 억제 능력을 측정하는 방법으로 쓸 수 있다. MLR 파라미터는 더 많은 데이터를 얻기 위해 또는 태반 줄기세포 시료의 면역 억제능을 가장 잘 측정하기 위하여 조정될 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기세포에 의한 면역 억제는 분석법에 쓰인 태반 줄기세포의 수에 따라 대략 비례하는 것처럼 나타나기 때문에, 본 발명의 한 실시 태양에서는 둘 이상의 수의 태반 줄기세포, 예를 들어 반응 당 1×103, 3×103, 1×104 및/또는 3×104 개의 태반 줄기세포를 가지고 MLR을 수행할 수 있다. 분석법에서 T 세포수에 대한 태반 줄기세포수 역시 바뀔 수 있다. 예를 들어 분석법에서 태반 줄기세포와 T 세포는 모든 비율, 예를 들어 약 10:1 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:5로 쓰일 수 있는데, 태반 줄기세포 또는 T 세포를 상대방에 대하여 약간 더 많이 사용할 수도 있다.
회귀 분석법 역시 비슷한 방식으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 태반 줄기세포를 이용하여 생체 내에서 면역 반응, 또는 복수이고, 하나 이상의 종류인 면역 세포의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 태반 줄기세포와 면역 세포는 접촉할 수 있는데, 예를 들어 복수의 태반 줄기세포를 공여받는 대상 개체 안에서 접촉할 수 있다. 상기 접촉이 한 개체 내에서 이루어지는 실시 태양에서는 이 접촉은 외래 태반 줄기세포(즉 그 개체에서 유래하지 않은 태반 줄기세포)와 상기 개체에 내생적인 복수의 면역 세포 사이에서 이루어진다. 특정 실시 태양에서 상기 개체에 내생하는 면역 세포는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및/또는 NK 세포이다.
태반 줄기세포를 이용한 이러한 면역 억제는 부적합하거나 바람직하지 않은 면역 반응에 의하여 일어나거나 악화되거나 관련된 모든 상태에 유익하게 쓰일 수 있다. 태반 줄기세포 매개 면역 조절, 예를 들어 면역 억제는 일례로 한 개체의 면역계가 자신의 한 조직 또는 그 이상에 대하여 일으키는 부적합한 면역 반응을 억제하는데 유용할 것이다. 따라서 많은 실시 태양에서 본 발명은 면역 반응의 억제 방법을 제공하는데, 여기서 상기 면역 반응은 자가 면역 질환, 예를 들어 전신 홍반 루프스, 당뇨병, 류마티스성 관절염 또는 다발성 경화증이다.
상기 복수의 태반 줄기세포를 복수이고 하나 또는 그 이상의 종류에 속하는 면역 세포에 접촉시키는 단계는 생체 내에서 예를 들어 하나 이상의 조직을 이식받는 이에게 이식하는 맥락에서 혹은 이식편 옆에서 이루어질 수 있다. 이러한 조직은 예를 들어 골수 또는 혈액, 장기, 특정 조직(예를 피부 이식), 복합 조직 동종 이식편(즉 둘 이상의 다른 유형의 조직을 포함하는 이식편) 등일 수 있다. 이러한 방식으로 상기 태반 줄기세포는 이식받는 개체 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 면역 세포가 상기 이식 조직 속에서 일으키는 하나 또는 그 이상의 면역 반응을 억제하는데 쓰일 수 있다. 이러한 접촉은 상기 이식 과정 이전, 도중 및/또는 이후에 이루어질 수 있다. 일례로 태반 줄기세포는 이식시에 투여될 수 있다. 상기 태반 줄기세포는 또한 혹은 대안적으로 이식 전에, 예를 들어 이식하기 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 전에 투여될 수 있다. 상기 태반 줄기세포는 또한 혹은 대안적으로 이식 후에, 예를 들어 이식한 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 후에 투여될 수 있다. 상기 복수의 태반 줄기세포는 이식받는 개체 또는 이식편 조직에서 측정 가능한 면역 반응의 증세나 신호, 예를 들어 이식 대 숙주 질환 또는 측정 가능한 염증이 관측되기 전에 상기 복수의 면역 세포와 접촉하는 것이 바람직하다.
다른 실시 태양에서, 상기 개체 내 접촉은 주로 외생 태반 줄기세포와 외생 전구세포 또는 줄기세포, 예를 들어 면역 세포로 분화하는 외생 전구세포 또는 줄기세포 사이에서 이루어진다. 예를 들어, 항암 치료에 병행하여 부분적 또는 전체적 면역 절제 또는 골수 절제를 받는 개체는 태반 줄기세포를 하나 또는 그 이상의 유형의 줄기 또는 전구세포와 함께 투여받을 수 있다. 예를 들어, 상기 태반 줄기세포는 CD34+ 조혈 줄기세포 등의 복수의 CD34+ 세포와 함께 쓰일 수 있다. 이러한 CD34+ 세포는 말초 혈액, 제대혈, 태반 혈액 또는 골수와 같은 조직 공급원에서 얻은 CD34+ 세포를 예로 들 수 있다. 이 CD34+ 세포는 상기와 같은 조직 공급원 또는 온조직 공급원(예를 들어, 제대혈 또는 골수의 단위들)으로부터 분리하거나, 상기 조직 공급원(제대혈에서 얻은 백혈구 등)으로부터 부분적으로 정제되어 상기 태반 줄기세포와 함께 쓰일 수 있다. 태반 줄기세포와 제대혈 또는 제대혈에서 얻은 줄기세포의 조합은 Hariri의 미국 특허 출원 공보 제2003/0180269호에 기재되어 있다.
이러한 태반 줄기세포는 바람직하게는 어떠한 비율로 투여되는데, 상기 개체 속에 있는 알려진 혹은 예상되는 T 세포 등의 면역 세포 수에 대하여 약 10:1 내지 약 1:10의 비율 바람직하게는 약 1:5의 비율로 상기 개체에 투여된다. 그러나 비제한적인 실시예에서, 복수의 태반 줄기세포는 개체에 약 10,000:1, 약 1,000:1, 약 100:1, 약 10:1, 약 1:1, 약 1:10, 약 1:100, 약 1:1000, 약 1:10,000의 비율로 투여될 수 있다. 일반적으로 투여받을 개체 체중 1 kg 당 약 1×105 내지 1×108개의 태반 줄기세포, 바람직하게는 약 1×106 내지 1×107개의 태반 줄기세포를 투여하여 면역 억제를 이룰 수 있다. 많은 실시 태양에서 개체 또는 대사에 투여된 복수의 태반 줄기세포는 적어도 1×105, 3×105, 1×106, 3×106, 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109개 혹은 그 이상의 수로 태반 줄기세포를 포함하거나, 대략 이 정도 수의 태반 줄기세포를 포함하거나 혹은 이 정도 이하의 개수로 포함한다.
상기 태반 줄기세포는 하나 이상의 2차 줄기세포, 예를 들어 골수 유래의 중간엽 줄기세포와 함께 투여될 수 있다. 이러한 2차 줄기세포는 태반 줄기세포와 함께 개체에 예를 들어 약 1:10 내지 10:1의 비율로 투여될 수 있다.
생체 내에서 상기 태반 줄기세포와 면역 세포의 접촉을 촉진하기 위하여 상기 태반 줄기세포와 면역 세포가 서로 접촉하도록 하는데 충분한 모든 경로를 통하여 상기 태반 줄기세포를 개체에 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 태반 줄기세포는 정맥 투여, 근육 투여, 복강 투여 또는 이자 등의 장기에 직접 투여와 같은 방식으로 개체에 투여될 수 있다. 생체내 투여를 위하여, 상기 태반 줄기세포는 아래 6.1 단원에서 기술하는 것처럼 약학 조성물 제형으로 만들어질 수 있다.
상기 면역 억제 방법은 하나 또는 그 이상의 면역 억제제를 가하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 특히 생체 내 맥락에서 그러하다. 한 실시 태양에서 복수의 태반 줄기세포는 한 개체의 생체 내에서 상기 복수의 면역 세포와 접촉하게 되며, 면역 억제제를 함유하는 조성물이 이 개체에 투여된다. 면역 억제제는 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항-T 세포 수용체 항체(모노클론 또는 다중클론 또는 항체 조각 또는 그 유도체), 항-IL-2 수용체 항체(예를 들어 Basilizimab(등록상표 Simulect) 또는 daclizumab(등록상표 Zenapax)), 항 T 세포 수용체 항체(Muromonab-CD3 등), 아자티오프린(azathioprine), 코르티코이드계 스테로이드, 사이클로스포린, 타크롤리무스(tacrolimus), 미코페놀산모페틸(mycophenolate mofetil), 시롤리무스(sirolimus), 칼시뉴린 억제제 등이 있다. 특정 실시 태양에서 상기 면역 억제제는 포식 세포 염증 단백질(macrophage inflammatory protein) MIP-1α 또는 MIP-1β에 대한 중화 항체이다. 바람직하게는 상기 항MIP-1α 또는 항MIP-1β 항체는 상기 개체에서 MIP-1α 및/또는 MIP-1β의 양을, 이를 테면 이식 시점에서, 측정 가능한 수준으로 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.
2. 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군
본 발명의 면역 억제법은 태반 줄기세포를 이용한다. 즉 태반 혹은 그 일부로부터 얻을 수 있는 줄기세포로서 (1) 조직 배양 기질에 부착하고, (2) 비태반 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖추고 있으며, (3) 충분한 수일 때, CD4+ 및/또는 CD8+ 줄기세포가 림프구 혼합 배양 반응 분석 또는 회귀 분석에서 증식하는 것 등의 면역 기능을 측정 가능한 정도로 억제하는 능력을 가지는 줄기세포이다. 태반 줄기세포는 태반 혈액 또는 제대혈 등의 혈액에서 유래하지 않는다. 본 발명의 방법과 조성물에서 쓰이는 태반 줄기세포는 개체의 면역계를 억제하는 능력을 갖추고 있으며, 이러한 능력을 가지는 세포가 선택된다.
태반 줄기세포는 태아 또는 모체에서 유래한 것(즉 태아 아니면 모체의 유전형을 띨 수 있음)이다. 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군은 오로지 태아 유래 또는 오로지 모체 유래인 태반 줄기세포를 포함할 수 있고, 또 태아와 모체 유래가 섞인 혼합 태반 줄기세포군을 포함할 수도 있다. 상기 태반 줄기세포와 태반 줄기세포를 함유하는 태반 줄기세포군은 아래에 기술하는 형태학적 표지와 배양 특성에 따라 동정되고 선택될 수 있다.
2.1 물리적·형태학적 특성
본 발명에서 사용되는 태반 줄기세포는 1차 배양되거나 세포 배양되었을 때 조직 배양 기질, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면(조직 배양용 플라스틱 등)에 부착한다. 배양 중인 태반 줄기세포는 일반적으로 섬유모세포 형상이며 별 모양이고 세포체의 중심에서 세포질 돌기가 몇 군데 불거져 나온다. 이 태반 줄기세포는 그러나 같은 조건하에서 배양된 섬유 모세포와 형태학적으로 구별이 가능한데, 태반 줄기세포는 섬유모세포보다 그러한 돌기를 더 많이 나타내기 때문이다. 형태학적으로 태반 줄기세포는 조혈 줄기세포와도 구별할 수 있는데, 조혈 줄기세포는 배양시 더 둥글거나 조약돌 모양을 나타낸다.
2.2 세포 표면, 분자 표지( 마커 )와 유전적 표지
본 발명의 방법과 조성물에 유용한 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군은 상기 줄기세포 또는 이 줄기세포를 함유하는 세포군의 동정 및/또는 분리에 쓰일 수 있는 표지를 여러 개 발현한다. 이 태반 줄기세포와 본 발명의 줄기세포군(즉 둘 이상의 태반 줄기세포)은 태반으로부터 직접 얻거나 태반의 어느 일부분(예를 들어 양막, 융모막, 태반의 태반엽 등)에서 얻은 줄기세포와 줄기세포 함유 세포군을 포함한다. 태반 줄기세포군은 또한 배양 중인 태반 줄기세포와 백과 같은 용기 안에 든 세포의 군(즉 둘 이상의 태반 줄기세포)을 포함한다. 태반 줄기세포는 하지만 영양막 세포가 아니다.
태반 줄기세포는 일반적으로 CD73, CD105, CD200, HLA-G 및/또는 OCT-4를 발현하고, CD34, CD38 또는 CD45를 발현하지 않는다. 태반 줄기세포는 또한 HLA-ABC(MHC-1)와 HLA-DR을 발현한다. 이들 표지는 태반 줄기세포를 동정하고 태반 줄기세포를 다른 줄기세포로부터 구별하는데 쓰인다. 상기 태반 줄기세포가 CD73과 CD105를 발현할 수 있기 때문에, 이들은 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 지닐 수 있다. 그러나 이 태반 줄기세포는 태아 특이적 표지인 CD200과 HLA-G를 발현할 수 있기 때문에 중간엽 줄기세포, 예를 들어 골수 유래 중간엽 줄기세포와 같이 CD200과 HLA-G를 발현하지 않는 것들과는 구별할 수 있다. 마찬가지 방식으로 CD34, CD38 및/또는 CD45의 미발현으로부터 이 태반 줄기세포가 비조혈(non-hematopoietic) 줄기세포임을 알 수 있다.
한 실시 태양에서 본 발명은 CD200+, HLA-G+인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 상기 복수의 태반 줄기세포는 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 분리된 세포군에 관한 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 또한 CD73+이고 CD105+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+이고 CD105+이다. 다른 실시 태양에서 상기 분리된 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양될 때, 하나 이상의 배아유사체를 발생한다.
본 발명 방법의 다른 실시 태양에서는 CD73+, CD105+와 CD200+인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 상기 복수의 줄기세포는 MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 상기 세포군의 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 또한 HLA-G+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34-, CD38-이고 CD45-이다. 더욱 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34-, CD38-, CD45-이고 HLA-G+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 세포군은 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.
본 발명은 또한 CD200+이고 OCT-4+인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73+이고 CD105+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 HLA-G+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34-, CD38- 이고 CD45-이다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+이고 HLA-G+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 세포군은 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때,하나 이상의 배아유사체를 형성한다.
본 발명은 또한 CD73+, CD105+이고 HLA-G+인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34-, CD38-이고 CD45-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD200+이다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+이고 CD200+이다.
본 발명은 또한 CD73+, CD105+인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체를 형성하고, MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34-, CD38-이고 CD45-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 OCT-4+이다. 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4+, CD34-, CD38-이고 CD45-이다.
본 발명은 또한 OCT-4+인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체를 형성하고, MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 다양한 실시 태양에서 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 상기 분리된 태반 세포는 OCT-4+ 줄기세포이다. 상기 세포군의 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73+이고 CD105+이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD200+이다. 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-이고 CD45-이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 세포군은 증폭된 것, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 절도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 절어도 열다섯 차례, 적어도 스무 차례 계대(passage)된 것이다.
본 발명에서 제공되는 면역억제 태반 줄기세포는 분리된 태반 줄기세포, 분리된 태반 줄기세포군, 또는 태반 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군을 포함하며, 여기세 상기 태반 줄기세포는 CD+, CD34-, CD105+ 및 CD200+이다.
본 발명은 또한 CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34-이고 CD133-인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명에서 제공되는 조성물 및 방법에 유용한 줄기세포는 HLA-A,B,C-, CD45-, CD133- 및 CD34-인 분리된 태반 줄기세포이다. 본 발명에서는 분리된 태반 줄기세포군이 또한 제공되는데, 여기에서 상기 태반 줄기세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%가 HLA-A,B,C-, CD45-, CD133- 및 CD34-이다. 특정 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포들로부터 분리된다. 다른 구체적 태양에서, 상기 태반 줄기세포군은 이러한 특성들을 나타내지 않는 태반 줄기세포로부터 분리된다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포는 그 기원이 비-모성(non-maternal)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포군의 상기 세포들의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 그 기원이 비-모성이다. 다른 태양에서, 본 발명은 태반 관류물로부터 상기 세포를 분리하는 것을 포함하는 HLA-A,B,C-, CD45-, CD133- 및 CD34-인 태반 줄기세포를 얻는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133-인 분리된 태반 줄기세포를 제공한다. 본 발명에서는 분리된 태반 줄기세포군이 또한 제공되는데, 여기에서 상기 태반 줄기세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%가 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133-이다. 특정 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포들로부터 분리된다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포는 그 기원이 비-모성(non-maternal)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포군의 상기 세포들의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 그 기원이 비-모성이다. 다른 구체적 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 이러한 특성들을 나타내지 않는 태반 줄기세포로부터 분리된다. 다른 태양에서, 본 발명은 태반 관류물로부터 상기 세포를 분리하는 것을 포함하는 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133-인 태반 줄기세포를 얻는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 CD10-, CD33-, CD44+, CD45- 및 CD117-인 분리된 태반 줄기세포를 제공한다. 본 발명에서는 분리된 태반 줄기세포군이 또한 제공되는데, 여기에서 상기 태반 줄기세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%가 CD10-, CD33-, CD44+, CD45- 및 CD117-이다. 특정 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포들로부터 분리된다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포는 그 기원이 비-모성(non-maternal)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포군의 상기 세포들의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 그 기원이 비-모성이다. 다른 구체적 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 이러한 특성들을 나타내지 않는 태반 줄기세포로부터 분리된다. 다른 태양에서, 본 발명은 태반 관류물로부터 상기 세포를 분리하는 것을 포함하는 CD10-, CD33-, CD44+, CD45- 및 CD117-인 태반 줄기세포를 얻는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 CD10-, CD13-, CD33-, CD45- 및 CD117-인 분리된 태반 줄기세포를 제공한다. 본 발명에서는 분리된 태반 줄기세포군이 또한 제공되는데, 여기에서 상기 태반 줄기세포의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%가 CD10-, CD13-, CD33-, CD45- 및 CD117-이다. 특정 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포들로부터 분리된다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포는 그 기원이 비-모성(non-maternal)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포군의 상기 세포들의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 그 기원이 비-모성이다. 다른 구체적 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 이러한 특성들을 나타내지 않는 태반 줄기세포로부터 분리된다. 다른 태양에서, 본 발명은 태반 관류물로부터 상기 세포를 분리하는 것을 포함하는 CD10-, CD13-, CD33-, CD45- 및 CD117-인 태반 줄기세포를 얻는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 대해 양성이거나/양성이고, CD117에 대해 음성인 HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-인 분리된 태반 줄기세포를 제공한다. 또한 본 발명은 분리된 태반 줄기세포군을 제공하는데, 여기에서 상기 줄기세포는 HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-이고, 상기 군 내 줄기세포의 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99%가 CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 양성이거나/양성이고, CD117에 음성이다. 특정 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포들로부터 분리된다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포는 그 기원이 비-모성(non-maternal)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포군의 상기 세포들의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 그 기원이 비-모성이다. 다른 구체적 태양에서, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 이러한 특성들을 나타내지 않는 태반 줄기세포로부터 분리된다. 다른 태양에서, 본 발명은 태반 관류물로부터 상기 세포를 분리하는 것을 포함하는 HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-이고, CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 양성이거나/양성이고, CD117에 음성인 태반 줄기세포를 얻는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 항체 결합에 의해 측정될 때 CD200+ 및 CD10+이고, 항체 결합 및 RT-PCR에 의해 측정될 때 CD117-인 태반 줄기세포를 제공한다. 다른 태양에서, 본 발명은 CD10+, CD29-, CD54+, CD200+, HLA-G+, HLA class I- 및 β-2-마이크로글로불린-인 태반 줄기세포를 제공한다. 다른 태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 표지의 발현이 중간엽 줄기세포(예를 들어, 골수-유래 중간엽 줄기세포)에서보다 적어도 2배 이상 많은 태반 줄기세포를 제공한다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포는 그 기원이 비-모성이다. 다른 특정 태양에서, 상기 분리된 태반 줄기세포군의 상기 세포의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 그 기원이 비-모성이다.
다른 태양에서, 본 발명은 태반 줄기세포군이 알데히드 디하이드로게나제 활성 분석에 의해 평가될 때 알데히드 디하이드로게나제(ALDH)에 대해 양성인 분리된 태반 줄기세포군을 제공한다. 그러한 분석은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Bostian and Betts, Biochem . J., 173, 787, (1978) 참조). 구체적 태양에서, 상기 ALDH 분석은 등록상표 ALDEFLUOR(Aldagen, Inc., Ashland, Oregon)을 알데히드 디하이드로게나제 활성의 마커로 사용한다. 구체적 태양에서, 상기 군은 상기 세포군 세포의 약 3% 내지 약 25%이다. 다른 태양에서, 본 발명은 알데히드 디하이드로게나제 활성에 대한 표지자로 등록상표 ALDEFLUOR를 사용하는 알데히드 디하이드로게나제 활성 분석에 의해 측정될 때 알데히드 디하이드로게나제에 대해 양성인 제대 줄기세포군을 제공한다. 구체적 태양에서, 상기 군은 상기 세포군 세포의 약 3% 내지 약 25%이다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포군 또는 제대 줄기세포군은 동일한 조건에서 배양된 동일한 세포의 수를 가진 골수-유래 중간엽 줄기세포군과 비교시 ALDH 활성이 적어도 3배, 또는 적어도 5배 높다.
상기 태반 줄기세포, 또는 태반 줄기세포군에 있어, 상기 줄기세포 또는 태반 줄기세포군은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20번, 또는 그 이상 계대(passage)되거나, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 또는 40번 군 배화(doubling), 또는 그 이상 증폭된 세포이거나, 이러한 세포를 포함할 수 있다.
상기 태반 세포 또는 세포군의 어떠한 특정 태양에서, 상기 세포의 핵형(karyotype), 또는 상기 군 세포의 적어도 약 95% 또는 약 99%는 정상(normal)이다. 상기 태반 세포 또는 세포군의 어떠한 다른 특정 태양에서, 상기 세포, 또는 세포군 내 세포는 그 기원이 비-모성(non-maternal)이다.
상기 표지들의 어떠한 조합을 함유하는 분리된 태반 줄기세포, 또는 분리된 태반 줄기세포군은 어떠한 비율로 혼합될 수 있다. 상기 태반 줄기세포군의 어떠한 두 개 이상은 분리될 수 있거나, 농축될 수 있어 하나의 태반 줄기세포군을 형성할 수 있다. 예를 들어, 위에서 설명된 표지 조합들 중 하나에 의해 정의되는 첫 번째 태반 줄기세포군을 포함하는 분리된 태반 줄기세포군은 위에서 설명된 표지 조합들 중 다른 것에 의해 정의되는 두 번째 태반 줄기세포군과 합쳐질 수 있으며, 상기 첫 번째 및 두 번째 군은 약 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 또는 약 99:1의 비율로 혼합된다. 유사한 방식으로, 상기 설명된 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포군의 어떠한 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 그 이상이 혼합될 수 있다.
상술한 태반 줄기세포의 한 구체적 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 IL-6, IL-8과 단핵구 화학주성 단백질(MCP-1)을 구성적으로(constitutively) 분비한다.
상술한 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포는 적어도 1×105, 5×105, 1×106, 5×106, 1×107, 5×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011 또는 이보다 많은 수의 태반 줄기세포를 함유하거나, 적어도 이 정도의 줄기세포를 함유하거나, 혹은 이 정도 수 이하의 줄기세포를 함유한다.
2.3 태반 줄기세포군의 선별과 제조
다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 세포군의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD200+, HLA-G+ 태반 줄기세포인 태반 세포군을 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD73+이면서 CD105+인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD73+, CD105+, CD34-, CD38-이고 CD45-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성하는 복수의 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.
다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD73+, CD105+, CD200+인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 HLA-G+ 인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34-, CD38-이고 CD45-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34-, CD38-, CD45-이고 HLA-G+인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포군을 선별하는 것을 더 포함한다.
다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD200+, OCT-4+인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD73+, CD105+ 인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 HLA-G+인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34-, CD38-이고 CD45-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+이고 HLA-G+인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.
다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD73+, CD105+, HLA-G+인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34-, CD38-이고 CD45-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD200+인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+이고 CD200+인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.
다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD73+, CD105+인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 복수의 태반 세포는 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34-, CD38-이고 CD45-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 OCT-4+인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 OCT-4+, CD34-, CD38-, CD45-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.
다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 OCT-4+인 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 복수의 태반 세포는 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD73+이고 CD105+인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD200+인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, CD45-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 면역 억제성인 세포군 또는 복수의 태반 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 앞서 설명한 복수의 태반 줄기세포 중 아무 것이라도 선별하는 단계, 상기 복수의 태반 줄기세포를 다른 세포, 예를 들어 다른 태반 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. 특정 실시 태양에서, 본 발명은 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 세포를 선별하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 태반 세포는 (a) 기질(substrate)에 부착하며, (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나, CD73, CD105와 CD200을 발현하거나, CD200과 OCT-4를 발현하거나 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 혹은 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하며, (c) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제한다. 이 방법은 또한 상기 태반 세포를 다른 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다.
더 구체적인 실시 태양에서 본 발명은 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하고, 이때 이 태반 줄기세포는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 HLA-G를 발현하고 (c) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제한다. 이 방법은 또한 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 구체적 실시 태양에서 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하고 (c) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 다른 특정 실시 태양에서, 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 OCT-4를 발현하고 (c) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 다른 특정 실시 태양에서, 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73과 CD105를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 다른 특정 실시 태양에서, 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하고 (c) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 기질에 부착하면서 (b) OCT-4를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다.
면역 억제성 태반 줄기세포군을 제조하는 방법의 한 특정 실시 태양에서, 상기 T 세포와 상기 태반 세포는 상기 MLR 속에서 약 5:1의 비율로 포함되어 있다. 이 방법에 사용되는 상기 태반 세포는 온전한 태반으로부터 유래하거나, 혹은 주로 양막, 또는 양막과 융모막으로부터 유래할 수 있다. 다른 특정 실시 태양에서, 이 태반 세포는 상기 MLR 분석에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 태반 세포가 없는 경우와 비교하였을 때, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 억제한다. 이 방법은 다른 면역 세포의 활성, 예를 들어 자연세포독성(NK) 세포의 활성을 억제하는 등의 면역 조절이 가능한 태반 세포군의 선별 및/또는 제조 단계를 더 포함할 수 있다.
2.4 세포 배양하의 성장
본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포의 성장은, 모든 포유류 세포와 마찬가지로 세포 성장용으로 선택한 특정 배지에 부분적으로 달려있다. 최적 조건 하에서 태반 줄기세포는 3~5 일만에 배증하는 것이 전형적이다. 세포 배양 중에 본 발명에 따른 상기 태반 줄기세포는 배양 기질, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면(조직 배양 접시 플라스틱, 피브로넥틴 피복 플라스틱 등)에 부착하여 단일 세포층을 이룬다.
본 발명의 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군은 적절한 조건 하에서 배양되었을 때 배아유사체(embryoid-like body), 즉 상기 부착 줄기세포층 위로 세포가 자란 3차원적 덩어리를 형성한다. 상기 배아유사체 내부의 세포는 배양 기질에 부착하지 않는 것이 전형적인 경우이고, 이는 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포도 마찬가지이지만, 배양 도중에서는 부착 세포에 달라붙은 채로 있다. 배아유사체 세포는 생존을 위하여 부착 태반 줄기세포에 의존하는데, 배아유사체는 부착 줄기세포의 부재하에서는 형성되지 않는다. 상기 부착 태반 줄기세포는 따라서 부착 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군 속에서 하나 또는 그 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다. 어떤 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 이 배아유사체 세포는 배아 줄기세포가 피더(feeder) 세포층 위에 자라는 것처럼 부착 태반 줄기세포 위에서 성장하는 것으로 생각된다. 골수 유래 중간엽 줄기세포 등의 중간엽 줄기세포는 배양시 배아유사체를 형성하지 않는다.
2.5 분화
부적절한 또는 해로운 면역 반응, 예를 들어, 염증에 의해 야기되거나, 또는 이러한 면역 반응과 관련된 질병, 장애 또는 상태를 치료하는 방법에 있어 유용한 본 발명에서 제공되는 태반 줄기세포는 다른 수임 세포 계통(committed cell lineage)로 세포 분화할 수 있다. 예를 들어, 이 태반 줄기세포는 지방 세포 형성(adipogenic), 연골 형성(chondrogenic), 신경 형성(neurogenic) 또는 골 형성(osteogenic) 세포 계통의 세포로 분화할 수 있다. 이러한 분화는 이 분야 종래 기술의 어떠한 분화 방법, 예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 비스한 세포 계통으로 분화하는 방법을 이용하여 달성하더라도 무방하다.
본 발명에서 제공되는 태반 줄기세포 및 제대 줄기세포는 in vitro, in vivo, 또는 in vitro 및 in vivo에서 특정 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 발휘할 수 있다. 다른 태양에서, 본 발명에서 제공되는 태반 줄기세포 및 제대 줄기세포는 특정 세포 계통으로의 분화를 야기하거나 촉진하는 조건에 있을 때 in vitro 분화될 수 있으나, 예를 들어, NOD-SCID 생쥐 모델과 같은 in vivo적으로는 검출 가능하도록 분화하지는 않는다.
3. 태반 줄기세포를 얻는 방법.
3.1 줄기세포 수집용 조성액
본 발명은 나아가 태반 줄기세포를 수집하고 분리하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 줄기세포는 생리학적으로 적합한 용액, 예를 들어 줄기세포 수집용 조성액(stem cell collection composition)을 포유류 태반으로부터 얻게 된다. 줄기세포 수집용 조성액은 2005년 12월 29일자 관련 미국 예비 출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 자세하게 기재되어 있다.
줄기세포 수집용 조성액은 줄기세포의 수집 및/또는 배양에 적당한 모든 생리학적으로 적합한 용액을 함유할 수 있는데, 여기에는 식염수(예를 들어 인산염 완충 식염수, Kreb 용액, 변형 Kreb 용액, Eagle 용액, 0.9% NaCl 등), 배양 배지(DMEM, H.DMEM 등) 등이 있다.
줄기세포 수집용 조성액은 태반 줄기세포를 보존하는 성질이 있는 성분을 하나 이상 갖추고 있을 수 있는데, 보존이란 즉 수집으로부터 시작하여 배양시까지 태반 줄기세포의 사멸을 막거나, 사멸을 지연하거나, 세포군 속에서 사멸하는 태반 줄기세포의 수를 줄이거나 하는 등의 특성이다. 이러한 성분으로는 세포자멸사 억제제(예를 들어 카스파제(caspase) 억제제, JNK 억제제), 혈관 확장제(vasodilator, 예를 들어 황산마그네슘, 혈압 강하제, 심방 나트륨 이뇨 펩티드(atrial natriuretic peptide, ANP), 아드레노코르티코트로핀(adrenocorticotropin), 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨(sodium nitroprusside), 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘, 인산디에스테르 가수분해 효소 억제제 등), 세포 괴사 억제제(예를 들어 2-(1H-인돌-3-일-3-펜틸아미노말레이미드, 디티오카르밤산피롤리딘 또는 클론아제팜), TNF-α 억제제 및/또는 산소 운반성 퍼플루오로카본(브롬화퍼플루오로옥틸, 브롬화퍼플루오로데실 등)을 들 수 있다.
줄기세포 수집용 조성액은 금속단백 분해효소, 세린 단백질 가수분해 효소, 중성 단백질 가수분해 효소, 리보핵산 가수분해효소, 디옥시리보핵산 가수분해 효소 등의 조직 분해 효소를 하나 이상 갖출 수 있다. 이러한 효소에는 콜라겐 분해 효소(예를 들어 콜라겐 분해효소 I, II, III 또는 IV, Clostridium histolyticum 유래 콜라겐 분해 효소 등), 디스파제(dispase), 터모리신(thermolysis), 엘라스타제, 트립신, 리버라제(LIBERASE), 히알루로니다제(hyaluronidase) 등이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
줄기세포 수집용 조성액은 살균 또는 정균(靜菌 bacteriostatic) 용도에 유효한 분량의 항생제를 포함할 수 있다. 몇몇 비제한적 실시 태양에서, 이 항생제는 마크롤리드(macrolide, 예를 들어 토브라마이신(tobramycin)), 세팔로스포린(세팔렉신(cephalexin), 세프라딘(cephradine), 세프록심(cefuroxime), 세프로질(cefprozil), 세파클로(cefaclor), 세픽심(cefixime) 또는 세파드록실(cefadroxil), 클라리트로마이신(clarithromycin), 에리드로마이신, 페니실린(페니실린 V 등) 또는 퀴놀론(오플록사신(ofloxacin), 시프로플락신(ciproflaxin) 또는 노르플록사신(norfloxacin)), 테트라사이클린, 스트렙토마이신이다. 특정 실시 태양에서, 이 항생제는 그램 양성 및/또는 그램 음성 세균, 예를 들어 Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus 등에 대한 활성이 있다.
줄기세포 수집용 조성액은 다음 화합물을 하나 이상 갖추고 있을 수 있다: 아데노신(약 1 mM에서 약 50 mM로), D-포도당(약 20 mM에서 약 100 mM), 마그네슘 이온(약 1 mM에서 약 50 mM), 분자량 20,000 달톤을 넘는 거대분자(예를 들어 합성 또는 천연 콜로이드, 덱스트란 등의 다당류 도는 폴리에틸렌 글리콜)로서 한 실시 태양에서는 내피의 정상적인 상태와 세포 생존능을 유지하기에 충분한 분량(약 25 g/L에서 약 100 g/L, 또는 약 40 g/L에서 약 60 g/L), 항산화제(예를 들어 약 25 μM 내지 약 100 μM 농도의 부틸화 수산화아니솔, 부틸화 수산화톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E), 환원제(약 0.1 mM 내지 약 5 mM 농도의 N-아세틸시스테인), 세포로의 칼슘 유입을 방지하는 제제(약 2 μM 내지 약 25 μM의 베라파밀(verapamil)), 니트로글리세린(예를 들어 약 0.05 g/L 내지 약 0.2 g/L), 항응고제로서 한 실시 태양에서는 잔류 혈액의 응고를 막기에 충분한 양(예를 들어 헤파린 또는 히루딘 약 1000 단위/L 내지 약 100,000 단위/L), 또는 아밀로리드(amiloride) 함유 화합물(예를 들어 아밀로리드, 아밀로리드에틸이소프로필, 아밀로리드헥사메틸렌, 아밀로리드디메틸 또는 아밀로리드이소부틸 약 1.0 μM 내지 약 5 μM).
3.2 태반의 수집과 취급
일반적으로 사람 태반은 출산 후 태반을 압박 방출한 직후에 회수된다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반은 환자의 완전한 병력을 얻은 후 이를 그 태반에 연관지은 다음 환자에게 충분한 설명 이후 동의를 받아서 회수된다. 이러한 병력 기록은 분만 이후에도 계속 기록되는 것이 바람직하다. 이러한 병력 기록은 태반 또는 그로부터 얻은 줄기세포의 후속 이용을 조화시키는데 쓰일 수 있다. 예를 들어, 사람 태반 줄기세포는 병력을 감안하여, 상기 태반에 관련된 신생아 또는 그 신생아의 부모, 형제나 다른 친척의 개인화된 의료(personalized medicine)에 쓰일 수 있다.
태반 줄기세포의 회수 전에 제대혈과 태반 혈액을 제거하게 된다. 몇몇 실시 태양에서 분만 후 태반 속 제대혈을 제거하게 된다. 이러한 태반에 대해서는 통상적인 제대혈 회수 방법을 사용할 수 있다. 바늘 또는 카뉼라(cannula)를 써서, 중력을 이용하여 태반을 실혈(exsanguination)하는 것이 전형적이다(Anderson의 미국 특허 제5,372,581호, Hessel 외 미국 특허 제5,415,665호를 보라). 이 바늘 또는 카뉼라는 탯줄 정맥에 대개 놓이고 되고, 태반을 부드럽게 마사지하여 제대혈이 태반으로부터 빠져나오는 것을 돕는다. 이러한 제대혈 회수법은 상업적으로, 예를 들어 미국 뉴저지주 Cdear Knolls의 LifeBank Inc., ViaCord, Cord Blood Registry나 Cryocell을 통하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 이러한 태반을 다른 조작 없이 중력만으로 방혈시켜 제대혈 회수 과정에서의 조직 손상을 최소화한다.
태반은 제대혈을 회수하고 줄기세포를 수집하기 위한 예를 들어 관류 또는 조직 분리를 위하여 분만 장소나 분만실로부터 다른 장소, 예를 들어 실험실로 운반되는 것이 전형적인 경우이다. 이러한 태반은 멸균되고, 단열된 운반 장비(태반 온도를 20~28℃로 유지), 예를 들어 멸균 집록(zip-lock) 플라스틱백에 태아에 가까운 부위의 탯줄을 집게로 집은 태반을 단열 용기에 담아서 운반되는 것이 바람직하다. 다른 실시 태양에서 이러한 태반은 2005년 9월 19일 출원 미국 특허 출원 제11/230,760에 기술된 것과 실질적으로 같은 제대혈 수집 키트에 담겨 운반된다. 이 태반은 분만 후 4~24 시간 안에 실험실로 운반되는 것이 바람직하다. 몇몇 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄을 집게로 집게 되는데, 이때 제대혈 회수 전에 태반 원반(placental disk)의 삽입 지점으로부터 4~5 cm 내 위치를 집는 것이 바람직하다. 다른 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄은 제대혈 회수 후이고 태반의 후속 처리 전에 집게로 집히게 된다.
줄기세포 수집 전에 태반을 멸균 조건에서 실온 또는 5~25℃의 온도에서 저장할 수 있다. 이러한 태반은 48 시간보다 더 긴 기간 동안 저장될 수도 있으며, 바람직하게는 잔류 제대혈을 모두 제거하기 위한 태반 관류 4~24 시간 전까지 저장하게 된다. 이 태반은 5~25℃ 온도에서 항응고제 용액 속에 저장되는 것이 바람직하다. 적절한 항응고제 용액은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 헤파린 또는 와파린 나트륨(warfarin sodium)을 쓸 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 이 항응고제 용액은 헤파린 용액(예를 들어 1:1000 희석 용액에서 1% w/w)을 포함한다. 이렇게 실혈된 태반의 저장 시간은 태반 줄기세포를 수집하기 36 시간 전을 넘기지 않는 것이 바람직하다.
위에 기술한 취지대로 수집과 준비를 마친 포유류 태반 또는 그의 일부분으로부터 종래 기술에 따른 모든 방법, 예를 들어 관류 또는 하나 이상의 조직 파괴 효소를 이용한 소화 등의 파괴에 의하여 줄기세포를 얻을 수 있다.
3.3 태반 조직의 물리적 파괴와 효소 소화
한 실시 태양에서, 줄기세포는 물리적 파괴, 예를 들어 태반의 효소 소화에 의하여, 예를 들어, 상기 3.1에서 설명된 줄기세포 수집 조성물을 사용하여 포유류 태반으로부터 얻어진다. 본 발명에 따른 줄기세포 수집용 조성액에 접촉하고 있는 채로 이 태반 또는 그 일부분을 예를 들어, 갈거나, 잡아 떼거나, 저미거나, 네모난 조각으로 썰거나, 잘게 썰거나, 액체에 담그어 연화시키는 등으로 처리할 수 있고 이어 하나 이상의 효소로 조직을 소화할 수 있다. 이러한 태반 또는 그 일부분을 하나 이상의 효소로 물리적으로 파괴하고 소화하여, 얻은 물질을 본 발명의 상기 줄기세포 수집용 조성액에 담그거나 섞을 수 있다. 예를 들어 트리판블루 배제법에 의하여 측정한 상기 장기 속의 세포 중 생존 세포 비율이 다수인 한, 바람직하게는 과반수인 한, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%인 한 어떠한 물리적 파괴법도 사용할 수 있다.
태반은 물리적 파괴 및/또는 효소 소화와 줄기세포 회수 단계 전에 구성 성분들로 나뉠 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기세포는 양막, 융모막, 태반엽, 또는 이들의 모든 조합으로부터 얻을 수 있다. 태반 줄기세포는 양막과 융모막을 함유한 태반 조직에서 얻는 것이 바람직하다. 태반 줄기세포는 태반 조직의 작은 덩어리, 예를 들어 부피가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80. 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 ㎣인 태반 조직의 덩어리를 파괴하여 얻는 것이 전형적인 경우이다.
바람직한 줄기세포 수집용 조성액은 조직 파괴 효소를 하나 이상 갖추고 있다. 효소 소화는 여러 효소의 조합, 예를 들어 매트릭스 금속단백 분해 효소와 중성 단백질 분해 효소나 예를 들어 콜라겐 분해 효소와 디스파제의 조합을 이용하면 바람직하다. 한 실시 태양에서 태반 조직의 효소 소화에서는 금속단백 분해 효소, 중성 단백 분해 효소, 히알루론산의 소화를 위한 콜라겐 분해 효소의 조합과 같은 점액 용해성(mucolytic) 효소, 디스파제와 히알루로니다제 또는 LIBERASE(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재 베링거 만하임 회사)과 히알루로니다제의 조합으로 이루어진 효소 조합을 사용한다. 태반 조직 파괴에 쓰일 수 있는 다른 효소로는 파파인, 디옥시리보핵산 가수분해효소, 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제와 같은 세린 단백 분해 효소를 들 수 있다. 세린 단백 분해 효소는 혈청 속 알파-2-마이크로글로불린에 의하여 억제될 수 있으므로 소화에 사용되는 배지는 혈청이 포함되어 있지 않아야 한다. EDTA와 디옥시리보핵산 분해 효소는 세포 회수율을 높이기 위하여 효소 소화에 흔히 사용된다. 끈적한 소화물 속에 줄기세포가 갇히는 일을 막기 위하여 소화물을 희석하는 것이 바람직하다.
조직 소화 효소의 모든 조합 역시 사용될 수 있다. 조직 소화 효소의 전형적인 농도로는 예를 들어 콜라겐 분해 효소 I과 IV의 경우 50~200 단위/mL, 디스파제의 경우 10 단위/mL, 엘라스타제의 경우 10~100 단위/mL을 들 수 있다. 태반 줄기세포를 방출하기 위하여 단백질 분해 효소를 조합하여, 즉 둘 이상의 단백질 분해 효소를 같은 효소 소화 반응에 사용하거나, 순서대로 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시 태양에서는 태반 또는 그 일부분을 30 분 동안 적절한 양의 2 mg/mL 콜라겐 분해 효소 I로 먼저 소화시킨 다음, 37℃에서 10 분 동안 0.25% 트립신으로 소화한다. 다른 효소를 사용한 다음 이어서 세린 단백 분해 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
다른 실시 태양에서 상기 줄기세포를 함유하는 상기 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 수집용 조성액에서 줄기세포를 분리하기 전에 이 조직을 파괴 및/또는 소화한 용액에, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌글리콜 비스(2-아미노에틸에테르)-N,N, N' , N'-테트라아세트산(EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 가하여 이 조직을 더 파괴할 수 있다.
온전한 태반 또는 태아와 모체 세포 양쪽을 포함하는 그 태반의 일부(예를 들어, 태반에서 융모막과 태반엽을 함유하는 부분)를 이용하는 경우, 수집한 상기 태반 줄기세포는 모체와 태아 양쪽에서 유래한 태반 줄기세포를 포함한다는 것을 이해할 필요가 있다. 모체 세포(양막 등)를 전혀 가지고 있지 않거나 또는 무시할 수 있는 정도로 가지고 있는 태반의 일부분이 쓰인 경우는 수집한 상기 태반 줄기세포가 거의 전적으로 태아 태반 줄기세포이다.
3.4 태반 관류
태반 줄기세포는 또한 포유류 태반을 관류하여 얻을 수 있다. 포유류 태반을 관류하여 줄기세포를 얻는 방법, 예를 들어 Hariri의 미국 출원 공보 제2002/0123141호와 2005년 12월 29일자의 관련 미국 예비출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 개시되어 있다.
태반 줄기세포는 관류, 이를 테면 관류 용액으로서 줄기세포 수집용 조성액을 이용하여 태반 혈관계를 관통하여 수집될 수 있다. 한 실시 태양에서는 배꼽(umbilical) 동맥과 배꼽 정맥 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 관류 용액을 흘려보냄으로써 포유류 태반을 관류할 수 있다. 관류 용액을 태반에 흘려보내는 것은 예를 들어 중력을 이용하여 태반으로 흐르게 함으로써 이룰 수 있다. 바람직하게는, 이 관류 용액을 연동(連動 peristaltic) 펌프 등의 펌프를 이용하여 강제로 태반에 주입한다. 배꼽 정맥은 예를 들어 멸균 도관(tubing)과 같은 살균된 연결부에 이어진 테플론 또는 플라스틱 재질 카뉼라 등의 카뉼라로 삽관될 수 있다. 이러한 살균된 연결부는 관류 매니폴드(manifold)에 연결된다.
관류를 준비하면서 태반은 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 태반의 가장 높은 지점에 자리하도록 놓는(예를 들어 매달아 두는) 것이 바람직하다. 이 태반은 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액 등의 관류 용액을 태반 혈관계 또는 태반 혈관계와 주변 조직에 통과시켜 관류할 수 있다. 한 실시 태양에서는 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 동시에 피펫에 연결되어 있는데, 이 피펫은 유연한 연결부를 통하여 관류 용액 저장소에 이어져 있다. 이 관류 용액은 배꼽 정맥과 동맥으로 흘러간다. 이 관류 용액은 상기 혈관들로부터 태반 주변 조직으로 스며나오고/스며나오거나 이들 혈관을 따라 주변 조직으로 흘러들어가며, 태반 표면으로부터 임신 도중 자궁에 붙인 적당한 열린 용기 속에 모이게 된다. 이 관류 용액은 한편 탯줄의 구멍을 통하여 주입할 수도 있으며, 모체 자궁벽에 접하고 있는 태반의 벽에 있는 구멍 속으로 흘러들어가거나 구멍으로부터 걸러나올 수 있다. 다른 실시 태양에서는 이 관류 용액으로 하여금 배꼽 정맥을 지나게 하여 배꼽 동맥에서 모으거나 배꼽 동맥을 지나게 하여 배꼽 정맥에서 모을 수 있다.
한 실시 태양에서 태아쪽 탯줄은 관류 동안 집게로 집히게 되며, 더 바람직하게는 태반 원반에 탯줄이 삽입되는 지점에서 4~5 cm 이내 위치에서 집게로 집히게 된다.
실혈(exsanguination) 과정에서 포유류 태반으로부터 처음 얻은 관류액은 제대혈 및/또는 태반 혈액의 잔류 적혈구 때문에 색깔을 띠는 것이 일반적이다. 이 관류액은 관류가 진행됨에 따라서 색깔이 옅어지며, 잔류 제대혈 세포들은 태반에서 씻겨 나간다. 일반적으로 태반을 처음에 실혈하는데는 30에서 100 mL의 관류액이면 충분하지만 관측된 결과에 따라 관류액의 양을 가감할 수 있다.
태반 줄기세포를 수집하는데 쓰이는 관류액의 양은 수집할 줄기세포의 수, 태반의 크기, 한 태반에서 수집할 회수 등에 따라 달라진다. 많은 실시 태양에서, 관류액의 양은 50 mL 내지 5000 mL, 50 mL 내지 4000 mL, 50 mL 내지 3000 mL, 100 mL 내지 2000 mL, 250 mL 내지 2000 mL, 500 mL 내지 2000 mL 또는 750 mL 내지 2000 mL이다. 실혈 후 700~800 mL의 관류액으로 태반을 관류하는 것이 전형적인 경우이다.
태반을 여러 시간 또는 여러 날에 걸쳐서 여러 번 관류할 수 있다. 여러 번 태반을 관류하는 경우, 무균 조건하의 용기 또는 적절한 담체 속에서 태반을 유지하고 배양하고 항응고제(예를 들어 헤파린, 와파린 나트륨, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린)를 포함하거나 포함하지 않은 줄기세포 수집용 조성액 또는 표준 관류 용액(예를 들어 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 정상적인 식염수)으로 관류할 수 있는데, 이 조성액 또는 관류 용액은 항생제(예를 들어 β-메르캅토에탄올(0.1 mM), 스트렙토마이신(예를 들어 40~100 μg/mL 농도로), 페니실린(예를 들어 40 단위/mL), 암포테리신 B(예를 들어 0.5 μg/mL))를 더 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 한 실시 태양에서 분리된 태반은 관류된 액체를 수집하지 않은 채로 일정 기간 유지되거나 배양되는데, 여기서 이 태반은 관류와 관류물 수집 이전에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안, 혹은 이틀, 사흘 또는 더 오랜 동안 유지되거나 배양된다. 이렇게 관류된 태반은 한 번 또는 여러 번에 걸쳐 유지될 수 있는데, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안 혹은 더 오랜 동안 유지할 수 있고, 이어서 두 번째 관류, 예를 들어 700~800 mL의 관류액으로 관류될 수 있다. 이 태반을 1, 2, 3, 4, 5회 또는 더 많이 관류할 수 있는데, 예를 들어 매 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간마다 관류할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반의 관류와 관류 용액, 예를 들어 줄기세포 수집용 조성액의 수집은 회수한 유핵 세포 수가 100 세포/mL보다 아래로 떨어질 때까지 반복된다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 개별적으로 더 처리하여 시간 의존적인 세포군, 예를 들어 줄기세포군을 회수할 수도 있다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 한 데 모을 수도 있다.
특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 태반을 실혈하 충분한 시간 동안 관류한 다음에 태반 줄기세포는 실혈되고 관류된 태반의 미세혈액순환 속으로 옮겨가서 본 발명의 방법에 따라 채집되는 것으로 생각되는데, 채집은 관류에 의하여 수집 용기 속으로 씻어넣는 방식이 바람직하다. 분리된 태반을 관류하면 잔류 제대혈을 제거할 수 있을 뿐 아니라 태반에 산소를 포함하는 적절한 양분을 공급할 수 있다. 이 태반은 배양되거나 제대혈을 제거하는데 쓰인 것과 유사한 용액으로 관류될 수 있는데, 이 용액에는 항응고제를 넣지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법으로 관류하면 포유류 태반을 상기 용액으로 관류하지 않고, 줄기세포를 얻기 위하여 다른 처리(예를 들어 효소 소화 등의 조직 파괴)를 하지도 않은 경우와 견주었을 때보다 유의미하게 더 많은 수의 줄기세포를 포유류 태반에서 얻을 수 있다. 여기서 "유의미하게 더 많은"이란 적어도 10% 이상 더 많은 것을 뜻한다. 본 발명에 따라 관류하면 유의미하게 더 많은 태반 줄기세포를 얻을 수 있는데, 예를 들어 태반 또는 그 일부분이 배양된 배양 배지로부터 djedfm 수 있는 태반 줄기세포 수보다 더 많다.
줄기세포는 하나 이상의 단백 분해 효소 또는 다른 조직 파괴성 효소를 갖추고 있는 용액으로 관류하여 분리할 수 있다. 특정 실시 태양에서, 태반 또는 그 일부분(예를 들어 양막, 양막과 융모막, 태반 소엽(placental lobule) 또는 태반엽 혹은 이들의 모든 조합)의 온도는 25~37℃로 조절되고, 이를 200 mL의 배양 배지 속에서 하나 이상의 조직 파괴성 효소와 30 분 동안 배양하게 된다. 이 관류물로부터 세포를 수집하고, 4℃로 식힌 다음, 5 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨과 2 mM 베타메르캅토에탄롤을 함유하는 차가운 억제제 혼합물로 세척한다. 몇 분 후 줄기세포를 찬(예를 들어 4℃) 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액으로 세척한다.
이러한 걸러냄(pan) 방식, 즉 관류물이 태반의 모체쪽을 통하여 스며나오면 이를 수집하는 방식은 모체와 태아세포가 섞여 나오게 된다는 것을 이해할 필요가 있다. 그 결과, 이 방법에 의하여 수집한 세포는 태아와 모체 유래 태반 줄기세포를 모두 가지는 혼합 집단을 포함한다 반면에 오로지 태반 혈관계만을 통하여 관류하는 방식에서는 관류액을 하나나 두 개의 태반 혈관을 따라 흘려 보내게 되고 남아 있는 혈관을 통하여 이를 수집하게 되는데, 이 방식은 거의 전적으로 태아에서 유래한 태반 줄기세포군을 얻게 하여 준다.
3.5 태반 줄기세포의 분리, 분류와 특성 파악
효소 소화 방식이건 관류에 의하여 얻은 것이건 관계없이, 포유류 태반에서 얻은 줄기세포는 처음에 피콜(Ficoll) 농도구배 원심분리를 하여 다른 세포로부터 정제할 수 있다. 이러한 원심분리는 원심분리 속도 등에 관한 모든 표준적인 실험 방법에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 태반에서 수집한 세포를 관류물에서 5000×g로 15분 동안 실온에서 원심분리하여 회수하는데, 이러한 원심분리로 파편이나 혈소판 등으로부터 줄기세포를 분리해낸다. 다른 실시 태양에서 태반 관류물은 약 200 mL로 농축되어, 피콜 위에 가해져 층을 이루고, 22℃에서 20분 동안 약 1100×g로 원심분리되어, 세포의 저밀도 계면층을 후속 처리를 위하여 수집하게 된다.
세포 펠렛은 신선한 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 유지에 적합한 배지, 예를 들어 2 단위/mL 헤파린과 2 mM EDTA(미국 뉴욕주 GibcoBRL)를 함유한 IMDM 무혈청 배지에 재현탁된다. 단핵 세포 총분획을 Lymphoprep(노르웨이 오슬로Nicomed Pharma사) 등으로 (제조사의 설명에 따라) 분리한다.
본 명세서에서 태반 줄기세포의 "분리"란 처리하지 않은 포유류 태반 속에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 뜻한다. 한 장기에서 얻은 줄기세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.
관류나 소화에 의하여 얻은 태반 세포는 예를 들어 차등 트립신 처리(differential trypsinization)로 더 분리되거나, 처음에 이를 이용하여 분리할 수 있는데, 여기서는 0.2% EDTA(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma사)를 함유한 0.05% 트립신 용액을 사용한다. 차등 트립신 처리는 태반 줄기세포가 플라스틱 표면으로부터 약 5분 이내에 탈착하는데 반하여 다른 부착 세포군은 20~30 분보다 더 많은 배양 시간을 요하는 것이 전형적인 경우이기 때문에 가능하다. 탈착된 태반 줄기세포는 트립산 처리와 트립신 중화 용액(Cambrex사의 TNS) 등을 이용한 트립신 중화 처리 후에 수집할 수 있다. 부착 세포를 분리하는 한 실시 태양에서는 예를 들어, 5~10×106 개의 세포를 담은 분액을 여러 개의 T-75 플라스크에 각각 나누어 담게 되는데, 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크가 바람직하다. 이 실시 태양에서는 세포를 시판되는 중간엽 줄기세포 성장 배지(Cambrex사의 MSCGM)으로 배양하고 조직 배양기(37℃, 5% CO2) 속에 놓을 수 있다. 10~15 일 후 PBS 세척으로 비부착 세포를 상기 플라스크로부터 제거한다. 이어 PBS를 MSCGM으로 대체한다. 바람직하게는 플라스크를 날마다 점검하여 다양한 부착 세포 유형을 확인하는데, 특히, 섬유모세포 유형의 세포를 확인하고 세포군의 증폭 여부를 점검한다.
포유류 태반에서 수집한 세포의 수와 종류는 예를 들어 흐름세포 측정법, 세포 분류법, 면역세포화학(예를 들어 조직 특이적 또는 세포 표지 특이적 항체로 세포를 염색하는 것), 형광표지 세포 분리(FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준적인 세포 검출법을 이용한 세포 형태와 세포 표면 표지의 변화를 측정함으로써, 빛이나 공초점 현미경을 이용한 세포 형태 분석 및/또는 PCR과 유전자 발현 분석(profiling) 등의 공지 기술을 이용한 유전자 발현 변화 측정으로써 감시할 수 있다. 이러한 방법은 하나 또는 그 이상의 특정 표지에 대하여 양성인 세포를 확인하는데에도 쓰일 수 있다. 예를 들어 상기 방법에 따라 CD34에 대한 항체를 이용하면 어느 세포가 CD34를 측정 가능한 양으로 함유하는지 알 수 있는데, 그러할 경우 이 세포는 CD34+이다. 마찬가지로 어느 세포가 역전사 PCR로 측정할 수 있는 양의 OCT-4 RNA를 생산하거나, 성체 세포보다 유의미하게 더 많은 양의 OCT-4 RNA를 생산하는 경우, 이 세포는 OCT-4+이다. 세포 표면 표지(예를 들어 CD34와 같은 CD 표지)와 OCT-4와 같이 줄기세포에 특이적인 유전자의 서열은 이 분야에 잘 알려져 있다.
태반 세포, 특히 피콜 분리, 차등 부착 또는 이들을 조합하여 분리한 세포는 형광표지 세포 분리 장치(FACS)를 이용하여 분류할 수 있다. FACS는 세포를 포함한 입자를 분류하는 공지의 방법으로서, 입자의 형광 특성에 바탕을 두고 있다(Kamarch의 Methods Enzymol, 151:150~165(1987)). 개별 입자의 형광부를 레이저로 들뜨게 하면 작은 전하가 발생하여 양과 음의 입자를 혼합물로부터 전자기적으로 분리할 수 있다. 한 실시 태양에서는 세포 표면 표지에 특이적인 항체 또는 리간드를 서로 다른 형광 표지로 표지한다. 이어서 사용된 항체에 결합하는지 여부에 따라 세포를 세포 분리기로 처리하여 분리한다. FACS로 분류된 입자들은 분리와 클로닝을 더 용이하게 하기 위하여 곧바로 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별 웰 속으로 운반될 수 있다.
한 세포 분류법에서는 태반에서 온 줄기세포를 CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 이러한 분류는 배양시 세포 부착 특성에 따라 줄기세포를 선별하는 방법과 함께 이루어질 수도 있다. 예를 들어 세포 부착 선별 단계는 표면 표지 발현에 따른 세포 분류 단계 전 또는 후에 수행할 수 있다. 일례로 한 실시 태양에서는 세포를 먼저 CD34의 발현 여부에 따라 분류하는데, CD34- 세포는 남기고, CD200+HLA-G+인 세포는 다른 모든 CD34- 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는 태반에서 얻은 세포를 CD200 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류하는데, 예를 들어 이들 표지 중 어느 하나라도 나타내는 세포는 후속 용도를 위하여 분리한다. 특정 실시 태양에서는 예를 들어 CD73 및/또는 CD105의 발현 여부 혹은 항체 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 항원 결정기의 존부 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 미발현 여부에 따라 CD200 및/또는 HLA-G를 발현하는 세포를 추가적으로 분류할 수 있다. 한 실시 태양에서는 예를 들어, 태반 세포를 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38과 CD45의 발현 또는 미발현에 의거하여 분류하고, CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34-, CD38-이고 CD45-인 태반 세포를 후속 용도를 위하여 다른 태반 세포로부터 분리한다.
한 실시 태양에서는 자기 비드를 이용하여 세포를 분리한다. 입자가 자기 비드(지름 0.5~100 ㎛)에 결합하는 능력에 따라 입자를 분리하는 방법인 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의하여 이 세포들을 분류할 수 있다. 이 자성의 미세구에는 유용한 변형을 다양하게 가할 수 있는데, 특정 세포 표면 분자 또는 불완전 항원(hapten)을 인식하는 항체를 공유 결합으로 연결하는 것 역시 이 변형에 포함된다. 이어서 이러한 비드를 세포와 섞어 주어 결합을 유도한다. 이 세포를 자기장 속에 통과시켜 특정 세포 표면 표지를 가지는 세포를 분리해 낸다. 한 실시 태양에서는 이들 세포를 이어서 분리한 다음 다른 세포 표면 표지들에 특이적인 항체와 결합한 자기 비드와 다시 섞어주게 된다. 이들 세포를 다시 자기장 속에 통과시켜 상기 항체 양쪽에 결합한 세포를 분리한다. 이러한 세포는 클론 분리를 위하여 각각의 미량역가판(microtiter dish)에 희석해 넣을 수 있다.
한편 세포 형태와 성장 특성을 바탕으로 하여 태반 세포를 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어 태반 세포는 배아시 섬유모세포 유사(fibroblastoid) 형상을 나타내는 것으로 특성 파악 및/또는 상기 유사 형상을 근거로 선별될 수 있다. 태반 줄기세포는 또한 배아유사체 형성 능력에 따라 특성 파악 및/또는 선별할 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는, 섬유모세포 유사 형상이고, CD73 및CD105를 발현하며, 배양시 하나 또는 그 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는, 배양시 하나 이상의 배아유사체를 생성하는 OCT-4+ 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다.
다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 콜로니 형성 단위 분석(colony forming unit assay)를 이용하여 확인하고 특성 파악하게 된다. 콜로니 형성 단위 분석은 이 분양에서 널리 알려져 있는데, Mesen Cult(캐나다 브리티시 콜럼비아 주 밴쿠버의 Stem Cell Technologies, Inc.의 상표) 배양 배지를 예로 들 수 있다.
태반 줄기세포의 생존능, 증식 잠재성과 수명은 이 분야에 알려진 표준적인 기법을 이용하여 평가할 수 있는데, 이들 기법의 예는 다음과 같다: 트리판블루 배제 분석, 디아세트산플루오레사인 흡수 분석, (생존능 평가를 위한)요오드화프로피듐 흡수 분석, 티미딘 흡수 분석, (증식을 평가하는) MTT 세포 증식 분석. 수명도 장기 배양시 세포군 배증의 최대값을 측정하는 등의 이 분야에 잘 알려진 방법으로 알아낼 수 있다.
태반 줄기세포는 이 분야에 잘 알려진 기법을 이용하여 나머지 태반 세포로부터 분리할 수 있는데, 이러한 기법은 다음과 같은 것이 있다: 원하는 세포의 선택적인 성장(적극적 선별), 원하지 않는 세포의 선택적 파괴(소극적 선별), 대두 응집소(agglutinin) 등에 대한 혼합 세포군 내의 차별적 응집성에 바탕을 둔 분리법, 냉동-해동 과정, 여과, 통상적인 원심분리와 구역 원심분리, 원심분리 세정(centrifugal elutriation, counter-streaming centrifugation), 단위 중량(unit gravity) 분리, 대향류 분포법(countercurrent distribution), 전기 영동 등.
4. 태반 줄기세포의 배양
4.1 배양 배지( Culture media )
분리된 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포가 자라나오는 태반 조직은 세포 배양을 개시하거나 파종하는데 쓰일 수 있다. 세포는 라미닌, 콜라겐(예를 들어 천연 또는 변성), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴과 세포외 막 단백질(미국 매사추세츠주 Bedford의 BD Discovery Labware사의 MATRIGEL)과 같은 세포외 매트릭스 또는 리간드로 피복되거나 무피복인 무균 조직 배양 용기로 옮겨진다.
이 분야에서 줄기세포 배양 용도로 적합하다고 인정받은 모든 배양 배지 또는 배양 조건을 이용하여 태반 줄기세포를 배양할 수 있다. 배양 배지는 혈청을 함유하는 것이 바람직하다. 태반 줄기세포는 예를 들어 다음 배양 배지를 이용할 수 있다: ITS(인슐린-트랜스페린-셀렌), LA+BSA(리놀레산+소 혈청 알부민), 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF, IGF-I와 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM-LG(Dulbecco's Modified Essential Medium, 저포도당)/MCDB 201(병아리 섬유모세포 기저(basal) 배지); 10% 소 태아 혈청(FBS) 함유 DMEM-HG(고 포도당); 15% FBS 함유 DMEM-HG; 10% FBS, 10% 말 혈청과 하이드로코르티손 함유 IMDM (Iscove 변형 Dulbecco 배지); 10% FBS, EGF와 헤파린 함유 Ml99; 10% FBS, 글루타맥스(상표)와 겐타마이신 함유 α-MEM(최소 필수 배지); 10% FBS, 글루타맥스와 겐타마이신 함유 DMEM 등. 바람직한 배지는 2% FBS, ITS, LA+BSA, 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF와 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM-LG/MCDB-201이다.
태반 줄기세포 배양에 쓰일 수 있는 다른 배양 배지에는 DMEM(고농도 또는 저농도의 포도당), Eagle 기본 배지, Ham FlO 배지(FlO), Ham F-12 배지(F12), Iscove 변형 Dulbecco 배지, 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSCGM), Liebovitz L-15 배지, MCDB, DMIEM/F12, RPMI 1640, 개량 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201(시그마사)와 CELL-GRO FREE가 포함된다.
이 배양 배지는 하나 또는 그 이상의 성분을 보충받을 수 있는데 이러한 성분으로는 혈청(예를 들어 바람직하게는 약 2~15%(v/v)인 소 태아 혈청, 소 혈청(ES), 사람 혈청(HS)), 바람직하게는 약 0.001%(v/v)인 베타-메르캅토에탄올(BME), 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-I), 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장 인자(VEGF)와 에리드로포이에틴이 있으며, L-발린을 포함하는 아미노산, 그리고 미생물 오염을 조절하기 위한 하나 또는 그 이상의 항생제 및/또는 항진균약(antimycotic)이 있는데 항생제 및/또는 항진균약에는 페니실린 G, 황산스트렙토마이신, 암포테리신 B, 겐타마이신과 니아스타틴이 있으며 단독으로 또는 이들을 조합하여 쓸 수 있다.
4.2 태반 줄기세포의 증폭( expansion )과 증식( proliferation )
분리된 태반 줄기세포 또는 분리된 줄기세포군(예를 들어 생체 내에서 줄기세포 또는 줄기세포군에 정상적으로 결부되어 있는 태반 세포들을 적어도 50% 떼어낸 줄기세포 또는 줄기세포군)을 얻은 뒤에는 이 줄기세포 또는 줄기세포군을 시험관내에서 증식시키고 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 태반 줄기세포군은 배양 접시, 플라스크, 다중웰 플레이트 등의 조직 배양 용기에서 그 태반 줄기세포가 세포 합류(confluence) 조건의 70~90%에 이르는데 충분한 시간, 즉 이 줄기세포와 그 자손이 조직 배양 용기 표면적의 70~90%를 차지할 때까지 배양할 수 있다.
태반 줄기세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 파종할 수 있다. 예를 들어 이 세포들을 낮은 밀도(예를 들어 1 ㎠ 당 약 100에서 약 5000 세포) 내지 높은 밀도(1 ㎠ 당 약 50,000 세포 또는 그 이상)로 파종할 수 있다. 한 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 0 내지 5% 이산화탄소 속에서 배양한다. 몇몇 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 2 내지 약 25% 산소 속에서 배양하고, 바람직하게는 약 5 내지 약 20퍼센트 산소를 사용한다. 이들 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 37℃에서 배양하게 된다. 이들 세포는 배양기 속에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양 배지는 정지상이거나 교반될 수 있는데, 예를 들어 생반응기를 이용할 수 있다. 태반 줄기세포는 낮은 산화성 스트레스(글루타티온의 첨가, 아스코르브산, 카탈라아제, 토코페롤, N-아세틸시스테인 등) 하에서 성장하는 것이 바람직하다.
70%~90% 세포 합류를 이룬 다음에는 이들 세포를 계대할 수 있다. 예를 들어, 공지 기술을 이용하여 이들 세포를 효소 처리, 이를 테면 트립신 처리하여 조직 배양 표면으로부터 떼어낼 수 있다. 피펫으로 세포를 떼어내고 그 세포 수를 세어 약 20,000~100,000 줄기세포, 바람직하게는 약 50,000 줄기세포를 신선한 배양 배지를 담고 있는 새 배양 용기에 옮겨 계대한다. 이 새로운 배양 배지는 상기 줄기세포를 들어낸 배양 배지과 같은 종류인 것이 전형적인 경우이다. 본 발명은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 회, 또는 그 이상 계대한 태반 줄기세포군도 망라하고 있다.
4.3 태반 줄기세포군
본 발명은 태반 줄기세포군을 제공한다. 태반 줄기세포군은 하나 이상의 태반으로부터 곧바로 분리해 낼 수 있다. 즉, 이 태반 줄기세포군은 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군으로서, 관류물(perfusate)로부터 얻은, 혹은 관류물 안에 포함된 것이거나, 효소 소화물(digestate)로부터 얻은, 혹은 소화물 안에 포함된 것(즉 태반 또는 그 일부분을 효소 소화하여 수집한 세포)일 수 있다. 본 발명의 분리된 태반 줄기세포를 배양하고 증폭하여 태반 줄기세포군을 얻는데 사용할 수도 있다. 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군은 또한 배양하고 증폭하여 태반 줄기세포군을 얻는데 사용할 수도 있다.
본 발명의 태반 줄기세포군은 태반 줄기세포를 포함하는데, 예를 들어 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포를 포함한다. 많은 실시 태양에서는 분리된 태반 줄기세포군의 세포 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 태반 줄기세포이다. 즉 한 태반 줄기세포군에는 예를 들어 최대 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%의 비줄기세포가 포함될 수 있다.
본 발명은 효소 소화 방식이건 관류에 의하여 얻은 것이든 관계 없이, 특정 표지 및/또는 특정 배양 또는 형태적 특성을 띠는 태반 줄기세포를 선별함으로써 분리된 태반 줄기세포군을 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 기질(substrate)에 부착하고, (b) CD200과 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서 이 세포군의 제조 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 본 발명은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD200과 OCT-4를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 본 발명의 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD73과 CD1054를 발현하면서 (c) 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 상기 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 상기 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) OCT-4를 발현하며, (c) 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 실시 태양 중 어느 것이라도, 이 방법은 ABC-p(태반 특이적인 ABC 운반(transporter) 단백질. Allikments 외 Cancer Res. 58(23): 5337~9(1998) 등을 참조하라)를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방법은 또한 예를 들어 중간엽 줄기세포에 특이적인 특성, 이를 테면 CD29의 발현, CD22의 발현, CD90의 발현 또는 이들 특성의 조합을 적어도 하나 갖추고 있는 세포를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 실시 태양 중에서 기질은 세포 배양 및/또는 세포, 예를 들어 태반 줄기세포의 선별이 이루어질 수 있는 어떠한 표면이라도 좋다. 전형적인 경우, 기질은 플라스틱, 예를 들어 조직 배양 접시 또는 다중웰 플레이트의 플라스틱이다. 조직 배양 플라스틱은 라미닌 또는 피브로넥틴 등의 생분자로 피복될 수 있다.
태반 줄기세포 등의 세포를 선별하여 태반 줄기세포군을 얻는데 세포 선별 분야에서 알려진 모든 수단을 쓸 수 있다. 예를 들어, 흐름 세포 측정 또는 FACS에서 하나 이상의 세포 표면 표지에 대하여 특이적인 항체(들)를 이용하여 세포를 선별할 수 있다. 항체와 자기 비드를 같이 사용하여 선별할 수도 있다. 특정 줄기세포 관련 표지에 대하여 특이적인 항체가 이 분야에서 알려져 있다. 그 예로는 OCT-4(미국 매사추세츠주 캠브리지 Abcam), CD200(Abcam), HLA-G(Abcam), CD73(미국 캘리포니아주 샌디에고 BD Biosciences Pharmaingen), CD105(Abcam, 미국 메인주 Saco의 BioDesign International)에 특이적인 항체 등을 들 수 있다. 다른 표지에 대한 항체 역시 시판 중인데, 예를 들어 CD34, CD38과 CD45에 대한 항체를 StemCell Technologies 또는 BioDesign International로부터 구할 수 있다.
분리된 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포나 태반 세포가 아닌 세포를 함유할 수 있다.
분리된 태반 줄기세포군을 하나 이상의 비줄기세포 또는 비태반 세포 세포군과 혼합할 수 있다. 예를 들어 분리된 태반 줄기세포군을 혈액(예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈), 혈액 유래 줄기세포(예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈 유래 줄기세포), 혈액 유래 유핵 세포군, 골수 유래 중간엽 세포, 골수 유래 줄기세포군, 미정제 골수, 성체(체세포) 줄기세포, 조직 내에 포함된 줄기세포군, 배양된 줄기세포, 완전 분화된 세포군(예를 들어 연골세포, 섬유모세포, 양막 세포, 뼈모세포, 근육 세포, 심근 세포 등) 등과 혼합할 수 있다. 분리된 태반 줄기세포군 속의 세포와 다수의 다른 유형 세포를, 각 세포군의 총 유핵세포수를 비교하여 혼합할 수 있는데 그 혼합 비율은 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1 :1; 1 :2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1 :5,000; 1 :10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1 :500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000 또는 약 1:100,000,000이다. 분리된 태반 줄기세포군 속의 세포를 복수의 세포 유형을 가지는 복수의 세포들과 혼합할 수도 있다.
한 실시 태양에서는 분리된 태반 줄기세포군을 복수의 조혈 줄기세포와 혼합한다. 이러한 조혈 줄기세포는 예를 들어 다음 세포원으로부터 얻을 수 있다: 미처리된 태반 혈액, 제대혈 또는 말초 혈액 내, 태반 혈액·제대혈·말초 혈액 유래 총 유핵세포 속, 태반 혈액·제대혈·말초 혈액 유래 분리된 CD34+ 세포군, 미처리 골수, 골수 유래 총 유핵세포 속, 골수 유래 분리된 CD34+ 세포군 등.
5. 태반 줄기세포의 보존
태반 줄기세포는 보존될 수 있는데, 요컨대 장기 저장을 허용하는 조건 또는 세포 자멸사 또는 세포 괴사 등에 의한 세포 사멸을 억제하는 조건하에 둘 수 있다.
태반 줄기세포는 예를 들어 2005년 12월 29일자의 관련 미국 예비출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 개시된 조성물인 세포 자멸사 억제제, 세포 괴사 억제제 및/또는 산소 운반성 퍼플루오로카본 함유 조성물을 이용하여 보존할 수 있다. 본 발명의 한 실시 태양에서는, 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군을 세포 자멸사 억제제와 산소 운반성 퍼플루오로카본을 함유하는 줄기세포 수집용 조성액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포자멸사 억제제는 상기 세포자멸사 억제제로 처리하지 않은 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 세포자멸사를 방지하거나 감소시키는데 충분한 양으로 존재한다. 한 특정 실시 태양에서, 상기 세포자멸사 억제제는 JNK 억제제이다. 더 특정한 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화 또는 증식을 조절하지 못한다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성액은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본을 별도의 층에 함유한다. 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포 수집용 조성액은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본을 유탁액으로 함유한다. 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포 수집용 조성액은 유화제, 예를 들어 레시틴을 더 함유한다. 다른 실시 태양에서 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본은 상기 줄기세포와 접촉할 때 약 0℃ 내지 약 25℃에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본은 상기 줄기세포와 접촉할 때 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 5℃에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 운송시 이루어진다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 냉동과 해동시에 이루어진다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 태반 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군을 세포 자멸사 억제제와 장기 보존용(organ-preserving) 화합물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포자멸사 억제제는 상기 세포자멸사 억제제로 처리하지 않은 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 세포자멸사를 방지하거나 감소시키는데 충분한 양으로 존재한다. 특정 실시 태양에서 상기 장기 보존용 화합물은 UW 용액(ViaSpan으로도 알려져 있으며 미국 특허 제4,798,824호에 기재됨. 또한 Southard 외, Transplantation 49(2):251-257 (1990))이거나 Stern 외, 미국 특허 제5,552,267호에 기재된 용액이다. 다른 실시 태양에서 상기 장기 보존용 화합물은 히드록시에틸 전분, 락토비온산(lactobionic acid), 라피노스(raffinose) 또는 이들의 조합이다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성액은 산소 운반성 퍼플루오로카본을 2개의 층 또는 유탁액 형태로 더 포함한다.
본 발명 방법의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 관류시 세포 자멸사 억제제, 산소 운반성 퍼플루오로카본, 장기 보존용 화합물 및 이들의 조합을 함유하는 줄기세포 수집용 조성액과 접촉시킨다. 다른 실시 태양에서는 상기 줄기세포를 효소 소화 등의 조직 파괴 과정 중에 접촉시킨다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 관류에 의한 세포 수집 또는 효소 소화 등의 조직 파괴에 의한 세포 수집 이후에 상기 줄기세포 수집용 조성액에 접촉시킨다.
전형적인 경우, 태반 세포의 수집 과정, 농축 과정과 분리시에는 저산소증과 기계적 응력에 말미암은 세포 스트레스를 없애거나 최소화하는 것이 바람직하다. 본 방법의 다른 실시 태양에서는 따라서 줄기세포 또는 줄기세포군이 세포 수집, 농축 또는 분리 중에 저산소 조건에 노출되는 시간을 해당 보존 과정 도중에 6 시간 미만으로 줄이는데, 여기서 저산소 조건이란 정상적인 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 과정 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 2시간 미만이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 줄기세포군은 세포 수집, 농축 또는 분리 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 1 시간 미만 또는 30 분 미만이거나 저산소 조건에 노출되지 않는다. 다른 구체적인 실시 태양에서 상기 줄기세포군은 세포 수집, 농축 또는 분리 도중 전단 응력을 받지 않는다.
본 발명의 태반 줄기세포는 냉동보존될 수 있는데, 예를 들어 냉동보존용 배지가 담긴 앰퓰 등의 소형 용기 속에 보존될 수 있다. 적절한 냉동보존용 배지로는 이를 테면 성장 배지 또는 시판되는 세포 냉동 배지 C2695, C2639, C60939(Sigma) 등의 세포 냉동 배지를 포함하는 배양 배지를 들 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 냉동보존용 배지는 DMSO(디메틸술폭사이드)를 이를테면 약 10%(v/v) 농도로 포함하는 것이 바람직하다. 냉동보존용 배지는 메틸셀룰로오스 및/또는 글리세롤 등의 추가적 성분을 갖추고 있을 수 있다. 태반 줄기세포는 냉동보존시 분당 섭씨 1도씩 냉각하는 것이 바람직하다. 바람직한 냉동보존용 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 바람직하게는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 냉동보존된 세포를 사용하기 위하여 해동하기 전에 액체 질소 속으로 옮길 수 있다. 예를 들어 몇몇 실시 태양에서는 앰퓰의 온도가 약 -90℃에 이르면 이를 액체 질소 저장 공간으로 옮긴다. 냉동보존된 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 해동하는 것이 바람직하다.
6. 태반 줄기세포의 용도
6.1 태반 줄기세포 함유 조성물
본 발명의 면역 억제 방법은 태반 줄기세포 또는 그들로부터 얻은 생분자를 함유하는 조성물을 사용할 수 있다. 마찬가지 방식으로 본 발명에 따른 복수의 태반 줄기세포와 줄기세포군은 예를 들어 연구 또는 치료 용도의 생리학적으로 적합 또는 의학적으로 적합한 모든 화합물, 조성물 또는 장치와 결합하여 쓰일 수 있다.
6.1.1 냉동보존된 태반 줄기세포
본 발명의 면역억제성 태반 줄기세포군은 보존될 수 있는데, 이를테면 나중에 사용하기 위하여 냉동보존될 수 있다. 줄기세포와 같은 세포의 냉동 보존을 위한 방법은 잘 알려져 있다. 태반 줄기세포군은 개체에게 쉽게 투여할 수 있는 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명은 의학 용도에 적합한 용기에 담긴 태반 줄기세포군을 제공한다. 이러한 용기의 예로는 무균 플라스틱백, 플라스크, 단지(jar) 또는 상기 태반 줄기세포군을 쉽게 꺼낼 수 있는 다른 용기를 들 수 있다. 예를 들어 이 용기는 혈액백 또는 다른 플라스틱, 수용 대상에게 정맥 투여하기 적합한, 의학적으로 허용되는 백일 수 있다. 이 용기는 통합한 줄기세포군의 냉동보존을 지원하는 것이 바람직하다.
냉동보존된 면역억제성 태반 줄기세포군은 한 기증자 또는 여러 기증자로부터 유래한 태반 줄기세포를 포함할 수 있다. 이 태반 줄기세포군은 의도한 수용자와 완벽하게 HLA 유형이 맞거나, 부분적 또는 완전히 HLA-불일치할 수 있다.
따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 면역억제성 태반 줄기세포군을 용기에 담은 조성물을 제공한다. 한 특정 실시 태양에서는 이 줄기세포군을 냉동보존한다. 다른 특정 실시 태양에서는 이 용기가 백, 플라스크 또는 단지이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 백이 무균 플라스틱 백이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 백이 상기 태반 줄기세포군의 정맥 투여에 적합하거나, 이를 허용하거나 촉진한다. 이 백은 투여 전 또는 도중에 약물 등의 용액이 하나 이상 상기 태반 줄기세포와 섞일 수 있도록 서로 연결된 내부 빈 공간(lumen) 또는 구획을 여러 가지고 있을 수 있다. 다른 구체적 실시 태양에서는 이 조성물이 통합 줄기세포군의 냉동보존을 촉진하는 화합물을 하나 이상 함유한다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군이 생리적으로 허용되는 수용액 속에 함유되어 있다. 더 특정한 실시 태양에서는 상기 생리적으로 허용되는 수용액이 0.9% NaCl 용액이다. 다른 구체적 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포군은 상기 줄기세포군의 투여 대상자와 HLA 유형이 일치하는 태반 세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 통합 줄기세포군은 적어도 부분적으로 상기 줄기세포군의 투여 대상자와 HLA-불일치하는 태반 세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 복수의 기증자에서 유래한 것이다.
6.1.2 약학 조성물
면역 억제성 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 생체 내에서 사용하기 위한 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 약학적으로 허용되는 담체속에 포함하고 있는데, 이러한 담체로는 식염수 또는 생체내 투여에 적합한 다른 생리적으로 허용되는 용액을 들 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 태반 줄기세포군 또는 본 명세서에서 언급한 태반 줄기세포 유형 중 아무 것이나 함유하여도 좋다. 본 발명의 약학 조성물은 태아, 모체 또는 양쪽 태반 줄기세포를 모두 갖추고 있을 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 나아가 단일 기증자 또는 그 태반이나 여러 기증자 또는 그 태반들에서 유래한 태반 줄기세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 면역억제성 태반 줄기세포를 얼마든지 함유할 수 있다. 예를 들어 여러 실시 태양에서 태반 줄기세포 1회 투여량은 적어도 1×105, 5×105, 1×106, 5×106, 1×107, 5×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011 또는 이보다 더 많은 수의 태반 줄기세포를 함유하거나, 적어도 이 정도 수의 줄기세포를 함유하거나, 혹은 이 정도 수 이하의 줄기세포를 함유한다.
본 발명의 약학 조성물은 생존능이 있는 세포를 50% 이상(즉 세포군 속의 세포 중 적어도 50%가 기능을 발휘하거나 살아 있음) 갖춘 세포군을 포함한다. 적어도 세포군 속 세포의 60%가 생존능을 가지고 있는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 상기 약학 조성물 속 세포군의 세포 중 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 생존능을 가지고 있다.
본 발명의 약학 조성물은 예를 들어 줄기세포 생착(engraftment)을 촉진하는 화합물(항-T 세포 수용체 항체, 면역 억제제 등), 알부민, 덱스트란 40, 젤라틴, 히드록시에틸 전분 등의 안정제를 하나 이상 함유할 수 있다.
6.1.3 태반 줄기세포의 조건 배지( conditioned media)
본 발명의 태반 줄기세포를 이용하여 면역 억제성 조건 배지(conditioned medium), 즉 상기 줄기세포가 분비 또는 배설하는 생분자로서, 한 종류 또는 여러 종류인 복수의 면역 세포에 대하여 측정 가능한 면역 억제 효과를 가지는 생분자를 하나 이상 함유하는 배지를 제조할 수 있다. 많은 실시 태양에서, 이 조건 배지는 태반 줄기세포가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 또는 더 오래 동안 성장한 배지를 포함하고 있다. 다른 실시 태양에서 조건 배지는 태반 줄기세포가 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 세포 합류하거나 100% 세포 합류에 이른 배지를 포함하고 있다. 이러한 조건 배지는 별도의 태반 줄기세포군 또는 다른 종류의 줄기세포의 배양을 지원할 수 있다. 다른 실시 태양에서 조건 배지는 태반 줄기세포가 성체 세포 유형으로 분화한 배지를 포함하고 있다. 다른 실시 태양에서 본 발명의 조건 배지는 태반 줄기세포와 비태반 줄기세포가 배양된 배지를 포함한다.
따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포 배양물로부터 얻은 배양 배지를 포함하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포는 (a) 기질(substrate)에 부착하며, (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나 CD73, CD105와 CD200을 발현하거나 CD200과 OCT-4를 발현하거나 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하고, (c) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포의 배양은 상기 배지 속에서 24 시간 이상 이루어진 것이다. 특정 실시 태양에서 이 조성물은 복수의 상기 태반 줄기세포를 더 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 이 좃어물은 복수의 비태반 세포를 포함한다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 비태반 세포가 CD34+ 세포, 예를 들어 말초 혈액 조혈 전구세포, 제대혈 전구세포 또는 태반 혈액 전구세포와 같은 조혈 전구세포를 포함한다. 상기 비태반 세포는 또한 골수 유래 중간엽 줄기세포와 같은 중간엽 줄기세포 등의 다른 줄기세포를 포함할 수 있다. 상기 비태반 세포는 또한 하나 이상의 종류의 성체 세포 또는 성체 세포주일 수 있다. 다른 특정 실시 태양에서 이 조성물은 항증식제, 예를 들어 항MIP-1α 또는 항MIP-1β 항체를 포함한다.
6.1.4 태반 줄기세포를 함유하는 매트릭스
본 발명은 면역 억제성 태반 줄기세포군을 함유하는 매트릭스, 하이드로겔, 3차원 골격(scaffold) 등을 더 포함한다.
본 발명의 태반 줄기세포는 천연 매트릭스, 예를 들어 양막 소재와 같은 태반의 생물질에 파종할 수 있다. 이러한 양막 소재로는 포유류 태반에서 바로 절제된 양막, 고정되거나 열처리된 양막, 실질적으로 건조(즉 <20% H2O)한 양막, 융모막, 실질적으로 건조한 융모막, 실질적으로 건조한 양막과 융모막 등을 들 수 있다. 태반 줄기세포를 파종할 수 있는 바람직한 태반 생물질은 Hariri의 미국 출원 공보 제2004/0048796호에 기재되어 있다.
본 발명의 태반 줄기세포는 주사 등에 적합한 하이드로겔 용액 속에 현탁할 수 있다. 이러한 조성물에 적합한 하이드로겔로는 RAD16과 같은 자가 조립(self-assembling) 펩티드를 들 수 있다. 한 실시 태양에서는 상기 세포를 함유하는 하이드로겔 용액을, 예를 들어 틀 속에서 굳혀서 착상(implantation)을 위하여 그 속에 세포를 함유하는 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 매트릭스 속의 태반 줄기세포를 배양하여 착상 전에 체세포분열로 세포를 증폭할 수도 있다. 상기 하이드로겔은 예를 들어 유기 고분자(천연 또는 합성)로서 공유, 이온 또는 수소 결합을 통하여 가교되어 물을 가둘 수 있는 열린 3차원 격자를 만듦으로써 겔을 이룬다. 하이드로겔 형성 물질로는 알긴산과 그 염과 같은 다당류, 펩티드, 폴리포스파진(polyphosphazine)과 폴리아크릴레이트 등 이온결합으로 가교되는 것들 혹은 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체와 같이 각각 온도, pH에 의하여 가교되는 블록 공중합체를 들 수 있다. 몇몇 실시 태양에서 본 말명의 상기 하이드로겔 또는 매트릭스는 생분해성이다.
본 발명의 몇몇 실시 태양에서는 상기 제형에 제자리(in situ) 중합성 겔이 포함된다(예를 들어 미국 특허 출원공보 제2002/0022676호, Anseth 외, J. Control Release, 78(l-3):199-209 (2002) 또는 Wang 외, Biomaterials, 24(22):3969-80(2003)을 보라).
몇몇 실시 태양에서 이 고분자는 적어도 수용액 속에서 부분적으로 용해성인데, 수용액으로는 물, 완충 염 용액 또는 하전된 측쇄를 가지는 수성 알코올 용액 또는 그의 단일가 이온염을 들 수 있다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측쇄를 가지는 고분자의 예로는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메트아크릴산), 아크릴산과 메트아크릴산의 공중합체, 폴리(아세트산비닐)과 술폰화 폴리스티렌과 같은 술폰화 고분자를 들 수 있다. 산성 측쇄를 가지는 공중합체로서 아크릴산 또는 메트아크릴산과 비닐에테르 모노머 또는 고분자를 반응시켜 얻는 공중합체도 사용할 수 있다. 산성 측쇄의 예로는 카르복시기, 술폰산기, 할로겐화(바람직하게는 플루오르화) 알코올기, 페놀성 OH기와 산성 OH기가 있다.
본 발명의 태반 줄기세포 또는 이들의 공배양물을 3차원 구조 또는 골격에 파종된 다음 생체 내에서 착상(implant)시킬 수 있다. 이러한 구조는 하나 이상의 아무 성장 인자, 세포, 약물 혹은 조직 형성을 촉진시키거나 본 발명의 실시를 다른 방식으로 향상·개선하는 다른 성분과 조합함으로써 착상될 수 있다.
본 발명에 쓰일 수 있는 3차원 골격의 예로는 부직 매트, 다공성 포말 또는 자가 조립 펩티드를 들 수 있다. 부직 매트는 글리콜산과 락트산의 합성 흡수성 공중합체(PGA/PLA 등)를 포함하는 섬유(미국 뉴저지주 Somerville의 Ethicon Inc.사의 VICRYL)로부터 만들 수 있다. 포말은 예를 들어 동결건조 또는 냉동진공건조(미국 특허 제6,355,699호 등을 보라)와 같은 공정에 의하여 제조된 폴리(ε-카프롤락탐)/폴리(글리콜산)(PCL/PGA) 공중합체로 구성된 포말을 3차원 골격으로 쓸 수도 있다.
다른 태양에서, 상기 스캐폴드는 예를 들어, 전기방사 나노섬유 스캐폴드와 같은 나노섬유 스캐폴드이거나, 나노섬유 스캐폴드를 포함할 수 있다. 더 구체적 태양에서, 상기 나노섬유 스캐폴드는 폴리(L-락틱 산)(PLLA), 타입 I 콜라겐, 비닐리덴 플루오라이드와 트리플루오로에틸렌의 공중합체(PVDF-TrFE), 폴리(-카프로락톤), 폴리(L-락타이드-co-ε-카프로락톤)[P(LLA-CL)] (예를 들어, 75:25), 및/또는 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발레레이트) (PHBV)와 타입 I 콜라겐의 공중합체를 포함한다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 스캐폴드는 태반 줄기세포의 연골세포로의 분화를 촉진한다. 나노섬유 스캐폴드, 예를 들어, 전기방사 나노섬유 스캐폴드를 생성하는 방법은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, Xu et al., Tissue Engineering 10(7):1160-1168 (2004); Xu et al., Biomaterials 25:877-886 (20040; Meng et al., J. Biomaterials Sci ., Polymer Edition 18(1):81-94 (2007) 참조.
본 발명의 태반 줄기세포는 생리적으로 허용되는 세라믹 소재에 파종하거나 접촉시킬 수 있는데, 이러한 세라믹 소재에는 인산모노-, 인산디-, 인산트리-, 인산알파트리-, 인산베타트리- 와 인산테트라칼슘, 수산화인회석, 불소인회석, 황산칼슘, 플루오르화칼슘, 산화칼슘, 탄산칼슘, 인산마그네슘칼슘, BIOGLASS(등록상표)와 같이 생활성이 있는 유리 및 이들의 혼합물이 포함되지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 현재 시판 중인 생체적합한 다공성 세라믹 소재에는 SURGIBONE(캐나다 CanMedica Corp.의 등록상표), ENDOBON(프랑스 Merck Biomaterial France의 등록상표), CEROS(스위스 Bettlach의 Mathys AG의 등록상표), 그리고 HEALOS(미국 매사추세츠주 Raynham의 DePuy, Inc.의 상표) VITOSS, RHAKOSS 및 CORTOSS(미국 펜실베니아주 Malvern의 Orthovita의 등록상표들)와 같은 광물화 콜라겐 뼈 이식 제품 들이 포함된다. 이러한 구조는 천연 및/또는 합성 재료의 혼합물, 블렌드 또는 복합물일 수 있다.
다른 실시 태양에서 태반 줄기세포는 펠트에 파종하거나 접촉시킬 수 있는데, 이러한 펠트는 예를 들어 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블렌드 혹은 히알루론산과 같은 생흡수성 소재로부터 제조한 다중 필라멘트사(multifilament yarn)로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포를 복합 구조일 수 있는 포말 골격(foam scaffold)에 파종할 수 있다. 이러한 포말 골격은 체내에서 수리, 교체, 보강되어야 할 특정 구조 부분의 모양처럼 유용한 형태로 성형할 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 구조를 본 발명의 세포를 접종하기 전에 예를 들어 0.1M 아세트산 처리하고, 이어 폴리리신, PBS 및/또는 콜라겐과 배양하여 세포 부착을 향상시킬 수 있다. 매트릭스의 외부면을 변형하여 세포의 부착과 성장 및 조직의 분화를 향상할 수 있는데, 이러한 변형에는 매트릭스의 혈장 피복 또는 하나 이상의 단백질(예를 들어 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코스아미노글리칸(예를 들어 황산헤파린, 황산-4-콘드로이틴, 황산-6-콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라틴 등), 세포 매트릭스 및/또는 다른 물질의 부가 있으며, 상기 물질은 젤라틴, 알긴산염, 한천, 아가로스와 식물 검 등이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 실시 태양에서는 이 3차원 골격을 혈전 형성을 방지하는 물질로 처리하거나, 이 3차원 골격이 그러한 물질을 함유한다. 이러한 물질과 그 처리는 내피 성장, 이동과 세포외 매트릭스 축적을 촉진하고 유지한다. 이러한 물질과 처리법의 예로는 라미닌과 제IV형 콜라겐과 같은 기저막 단백질, EPTFE 등의 합성 물질, PURSPAN(미국 캘리포니아주 버클리의 The Polymer Technonolgy Group Inc.의 상표) 등의 분절된 폴리우레탄요소 실리콘을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 3차원 골격은 또한 헤파린과 같은 항혈전 형성제를 함유할 수 있다. 태반 줄기세포의 파종 전에 상기 골격을 처리하여 표면 전하를 변화(예를 들어 혈장으로 피복)시킬 수 있다.
6.2 유전자 변형 태반 줄기세포
다른 한 측면에서는 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포와 제대 줄기세포를 유전자 변형, 예를 들어 원하는 핵산이나 폴리펩티드를 생산하도록 변형하거나, 원하는 핵산이나 폴리펩티드를 생산하는 분화된 세포, 예를 들어 간세포, 간 형성성 세포, 연골 세포 및/또는 연골 세포성 세포로 유전자 변형할 수 있다. 유전자 변형은 예를 들어 다음을 비롯한 바이러스 기반 벡터를 이용하여 할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다: 파필로마 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터 등의 비통합성(non-integrating) 복제 벡터; 역전사바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 관련 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 또는 복제 결함 바이러스 벡터. DNA를 세포에 도입하는 다른 방법에는 리포좀, 전기 천공(electroporation), 입자 건(particle gun), 직접 DNA 주사 등이 포함된다.
일례로 줄기세포를 하나 이상의 적절한 발현 조절 요소(control element)에 의하여 통제되거나, 작동 연관된 DNA로 형질 전환하거나 유전자 이입(transfection)할 수 있는데, 예를 들어 이러한 조절 요소는 프로모터나 인핸서(enhancer) 서열, 전사 종료자(terminator), 폴리아데닐화 자리, 내부 리보솜 도입(entry) 자리가 있다. 이러한 DNA는 선택용 표지(selectable marker)를 갖추고 있는 것이 바람직하다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 줄기세포를 예를 들어 영양 강화 배지(enriched medium) 속에서 키웠다가 선택성 배지로 바꿀 수 있다. 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 조작하기 위한 DNA가 원하는 폴리펩티드, 예를 들어 사이토킨, 성장 인자, 분화 제제(differentiation agent) 또는 치료용 폴리펩티드 등의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖추고 있다.
줄기세포를 조작하는데 쓰이는 이 DNA는 사람 세포 등의 포유동물 세포에서 핵산 서열의 발현을 구동하는데 이 분야에 알려진 모든 프로모터를 쓸 수 있다. 예를 들어 프로모터에는 CMV 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, 파필로마 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 프로모터, 엘라스틴 유전자 프로모터 등이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 한 특정 태양에서는 이 프로모터를 조절할 수 있어서 원하는 때에만 해당 뉴클레오티드 서열을 발현한다. 프로모터는 유도성(예를 들어 금속티오네인(metallothionein)과 열 충격 단백질에 관련된 것들)이거나 구성적(constitutive) 프로모터일 수 있다.
다른 특정 실시 태양에서는 이 프로모터가 조직 특이적이거나 조직 특이성을 나타낸다. 이러한 프로모터의 예에는 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein) 유전자 조절 부위(Readhead 외, 1987, Cell 48:703)(희소돌기 아교세포); 엘라스틴 I 유전자 조절 부위(Swit 외, 1984, Cell 38:639; Ornitz 외, 1986, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol. 50:399; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425)(이자 외분비 세포(cinar cells)); 인슐린 유전자 조절 부위(Hanahan, 1985, Nature 315:115)(이자 베타 세포); 미오신 경쇄-2 유전자 조절 부위(Shani, 1985, Nature 314:283)(골격근)가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 세포를 조작하여 하나 이상의 유전자 발현을 "주입(knock in)"하거나 "결손(knock out)"할 수 있다. 세포에 자연적으로 존재하는 유전자의 발현을 저감할 수 있는데, 예를 들어 상동성 재조합 등의 방법으로 유전자를 완벽하게 불활성화함으로써 발현을 억제할 수 있다. 한 예로 어떤 실시 태양에서는 해당 단백질의 중요부를 암호화하는 엑손이나 그 부위에 5' 방향인 엑손을 네오(neo) 등의 적극적 선택용 표지(positive selectable marker)로 중단시켜 해당 표적 유전자로부터 정상적인 mRNA 생산을 막아 그 유전자를 불활성화한다. 유전자는 유전자 전체를 또는 그 일부를 결실(deletion)시켜 불활성화할 수도 있다. 해당 표적 유전자에 대하여 상동성이 있고 유전체 상으로는 서로 멀리 떨어져 있는 두 유전자 부위를 갖춘 유전자 구성체(contruct)를 이용하여, 이 두 부위 사이의 서열을 결실시킬 수 있다(Mombaerts 외, 1991, Proc . Nat . Acad . Sci . U.S.A. 88:3084). 표적 유전자 발현을 억제하는 안티센스, 디엔에이자임(DNAzyme), 소형 저해 RNA(small interfering RNA)와 리보자임 분자들도 상기 줄기세포 속의 표적 유전자 활성을 낮추는데 사용할 수 있다. 예를 들어 주조직 적합성 유전자 복합체(HLA)의 발현을 억제하는 안티센스 RNA 분자는 면역 반응과 관련하여 가장 쓸모가 많다고 입증된 바 있다. 3중 나선 분자를 사용하여 표적 유전자 활성을 낮출 수 있다. 예를 들어 L. G. Davis 외(편집인), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2판, 미국 코네티컷주 Norwalk의 Appleton & Lange 刊을 보라. 이 책의 내용은 인용에 의하여 본 명세서에 포함된다.
한 실시 태양에서는 본 발명의 태반 또는 제대 줄기세포를 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖추고 있는 핵산 분자로 유전자 변형할 수 있는데, 여기서 이 원하는 폴리펩티드의 발현은 외래 요소(exogenous factor), 예를 들어 폴리펩티드, 소형 유기 분자 등을 써서 조절할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드일 수 있다. 더 구체적인 태양에서는 이 원하는 폴리펩티드가 IL-12나 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)이다. 다른 더 구체적인 태양에서는 이 원하는 폴리펩티드가 인터류킨-1 수용체 길항제와 2수소화엽산 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)의 융합 단백질이고 상기 외래 요소가 항엽산제, 예를 들어 메토트렉세이트이다. 이러한 유전자 구성체는 메토트렉세이트에 접촉하였을 때 IL-1Ra나IL-1Ra와 DHFR의 융합 단백질을 발현하는 태반 또는 제대 줄기세포를 유전자 조작하는데 유용하다. 이러한 유전자 구성체는 예를 들어 류마티스 관절염의 치료에 쓸 수 있다. 이 실시 태양에서는 메토트렉세이트 등의 항엽산제에 노출되었을 때 IL-1Ra와 DHFR의 융합 단백질이 유전 해독 과정에서 상향 조절된다. 그러므로 다른 특정 태양에서는 태반 줄기세포나 제대 줄기세포를 유전자 조작하는데 쓸 핵산이 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖추고 있는데, 여기서 이 제1과 제2 폴리펩티드는 외래 인자의 존재 하에서 유전 해독이 상향 조절되는 하나의 융합 단백질로 발현한다. 이 폴리펩티드는 일과성으로 발현되거나 장기적으로(예를 들어 몇 주나 몇 달에 걸쳐) 발현된다.
이러한 핵산 분자는 유전자 조작된 줄기세포를 적극 선택할 수 있게 하거나 조작된 줄기세포를 시각화하게 해 주는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 갖추고 있을 수 있다. 또 하나의 더 구체적인 태양에서는 이 뉴클레오티드 서열이 예를 들어 적절한 시각화 조건에서 형광을 내는 폴리펩티드를 암호화하는데, 예를 들어 루시퍼라제(Luc)이다. 더 구체적인 태양에서는 이러한 핵산 분자가 IL-1Ra-IRES-Luc을 포함하는데, 여기서 IRES는 내부 리보솜 도입 자리(internal ribosome entry site)이다.
6.3 무한증식화된 태반 줄기세포주
포유류 태반 세포는 성장 촉진 유전자를 함유하는 모든 적절한 벡터를 이용하여 전환(transfection)됨으로써 조건부로 무한 증식(conditionally immortalized)할 수 있는데, 여기서 성장 촉진 유전자는 적절한 조건 하에서 전환된 세포의 성장을 촉진하여, 상기 성장 촉진 단백질의 제조 및/또는 활성을 외부 인자로 조절할 수 있게 하는 것이다. 상기 성장 촉진 유전자의 바람직한 실시 태양은 종양유전자인데, 예를 들면 v-myc, N-myc, c-myc, p53, SV40 대형 T 항원, 폴리오마 대형 T 항원, E1a 아데노바이러스 또는 사람 파필로마바이러스의 E7 단백질이 있지만 여기에 한정되지는 않는다.
상기 성장 촉진 단백질의 외부 조절은 상기 성장 촉진 유전자를 외부 조절 가능한 프로모터, 예를 들어 전환된 세포의 온도를 조절하거나 세포와 접촉하는 배지의 조성을 바꿈으로써 그 활성을 조절할 수 있는 프로모터의 조절하에 둠으로써 이룰 수 있다. 한 실시 태양에서는 테트라사이클린(tet) 조절 유전자 발현 시스템(Gossen 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992 또는 Hoshimaru 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996을 보라)을 이용할 수 있다. tet의 부재 하에서는 이 벡터 내부에 자리잡은, tet에 의하여 조절되는 트랜스 활성화 인자(tTA)가 ph CMV * -1 로부터 전사를 강하게 활성화하는데, ph CMV * - 1 는 사람 사이토메갈로바이러스의 최소 프로모터와 tet 조절 유전자 서열에 연결된 것이다. tTA는 대장균의 전위유전단위(transposon)-10 유래 tet 저항 오페론의 억제자(tetR)와 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP16의 산성 영역을 융합한 단백질이다. 낮고 독성이 없는 tet 농도(약 0.01~1.0 ㎍/mL)에서는 tTA에 의한 트랜스 활성화가 거의 중단된다.
한 실시 태양에서 이 벡터는 선별용 표지, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함한다. 세균 네오마이신 내성 유전자(neo R )는 본 발명에 쓰일 수 있는 표지의 한 예이다. neo R 을 가진 세포는 100~200 ㎍/mL의 G418을 성장 배지에 부가하는 것과 같이 당업자에게 잘 알려진 수단을 써서 선별할 수 있다.
세포의 전환은 역전사 바이러스 감염과 같이 당업자에게 잘 알려진(하지만 이것만으로 제한되지는 않는) 모든 수단을 사용하여 이루어질 수 있다. 일반적으로 세포 배양물의 전환은 상기 벡터를 생산하는 세포주로부터 수집한 조절 배지와 N2 보강 물질을 함유하는 DMEM/F12의 혼합물 속에서 세포를 배양함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어 상술한 바에 따라 마련한 태반 세포 배양물을 예를 들어 닷새 동안 시험관내 배양 후 상기 조절 배지 1부피와 N2 보강 물질을 함유한 DMEM/F12 2부피의 혼합물 속에서 약 20시간 동안 배양함으로써 감염시킬 수 있다. 선별용 표지를 갖춘 전환 세포는 앞서 설명한 바와 같이 선별할 수 있다.
세포 전환 후에 배양물을 세포 증식을 허용하는 표면, 예를 들어 24 시간 동안 적어도 30%의 세포가 배증하도록 허용하는 표면 위에 계대한다. 이때 기질은 폴리오르니틴(10 ㎍/mL) 및/또는 라미닌(10 ㎍/mL)으로 피복한 조직 배양 플라스틱으로 이루어진 폴리오르니틴/라미닌 기질, 폴리리신/라미닌 기질 또는 피브로넥틴으로 처리한 표면인 것이 바람직하다. 이어서 이 배양물에 3~4 일마다 성장 배지를 가하여 주는데, 이 배지는 하나 이상의 증식 향상 인자로 보강되었거나 보강되지 않았을 수 있다. 증식 향상 인자는 배양물이 50% 세포 합류 수준 미만일 때 성장 배지에 추가한다.
80~95% 세포 합류 수준일 때 트립신 처리와 같은 표준적인 방법을 이용하여 조건부 무한 증식 태반 줄기세포주를 계대할 수 있다. 약 스무 번째 계대까지는 몇몇 실시 태양에서는 선별(예를 들어 네오마이신 내성 유전자를 가지는 세포를 선별용 G418 부가에 의한)을 유지하는 것이 바람직하다. 세포를 액체 질소에 얼려서 장기간 보존할 수 있다.
앞서 설명한 방법에 따라 마련한 조건부 무한 증식 사람 태반 줄기세포주로부터 클론 세포주를 분리할 수 있다. 일반적으로 한계 희석(limit dilution)이나 클로닝 고리(cloning ring) 등의 표준적인 방법을 이용하여 이러한 클론 세포주를 분리하고 증폭할 수 있다. 클론 세포주는 일반적으로 앞서 기술한 방식에 따라 영양분을 공급하고 계대해 줄 수 있다.
조건부 무한증식 사람 태반 줄기세포주는 클론성(clonal)일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없으며, 분화를 촉진하는 배양 조건하에서 상기 성장 촉진 단백질의 제조 및/또는 활성을 억제함으로써 분화하도록 유도할 수 있는 것이 일반적인 경우이다. 예를 들어, 상기 성장 촉진 단백질을 암호화하는 유전자가 외부 조절 가능한 프로모터 조절을 받는 경우, 배지의 온도 또는 조성을 변화시켜 성장 촉진 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 앞서 논한 테트라사이클린 조절 유전자 발현 시스템에서는 테트라사이클린을 가하여 상기 성장 인자의 전사를 억제함으로써 분화를 이룰 수 있다. 일반적으로 1 ㎍/mL 테트라사이클린을 4~5일 동안 처리하면 분화를 일으키기에 충분하다. 더 분화를 일으키려면 성장 배지에 추가적인 성분을 넣을 수 있다.
6.4 분석 방법
본 발명의 태반 줄기세포는 분석 방법에서 이용하여 배양 조건, 환경 요인, 분자(예를 들어 생분자, 소형 무기 분자 등) 등이 줄기세포 증식, 증폭 및/또는 분화에 미치는 영향을 그러한 조건에 노출되지 않은 태반 줄기세포와 비교하여 살펴볼 수 있다.
한 바람직한 실시 태양에서는 본 발명의 태반 줄기세포를 분자에 접촉시켜 세포 증식, 증폭 또는 분화의 변화를 분석한다. 예를 들어 본 발명의 한 실시 태양에서는 복수의 태반 줄기세포의 증식을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 복수의 줄기세포를 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 화합물과 접촉하지 못한 상기 복수의 줄기세포와 비교하였을 때 상기 화합물이 상기 복수의 줄기세포의 증식에 측정 가능한 변화를 일으키는 경우, 상기 화합물을 태반 줄기세포의 증식을 조절하는 화합물로 동정한다. 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 증식 억제제로 동정한다. 다른 특정 실시 태양에서는 상기 화합물의 증식 촉진제로 동정한다.
다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 태반 줄기세포의 증폭을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 복수의 줄기세포를 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 화합물과 접촉하지 못한 상기 복수의 줄기세포와 비교하였을 때 상기 화합물이 상기 복수의 줄기세포의 증폭에 측정 가능한 변화를 일으키는 경우, 상기 화합물을 태반 줄기세포의 증폭을 조절하는 화합물로 동정한다. 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 증폭 억제제로 동정한다. 다른 특정 실시 태양에서는 상기 화합물의 증폭 촉진제로 동정한다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 태반 줄기세포의 분화를 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 분화를 허용하는 조건 하에서 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 화합물과 접촉하지 못한 상기 줄기세포와 비교하였을 때 상기 화합물이 상기 줄기세포의 분화에 측정 가능한 변화를 일으키는 경우, 상기 화합물을 태반 줄기세포의 분화를 조절하는 화합물로 동정한다. 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 분화 억제제로 동정한다. 다른 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 분화 촉진제로 동정한다.
6.5 태반 줄기세포 은행
출산 후 태반으로부터 얻는 줄기세포를 수많은 다른 방식으로 배양하여 태반 줄기세포 롯(lot)의 집단, 예를 들어 개별적으로 투여 가능한 용량의 집단을 이룰 수 있다. 이러한 롯은 예를 들어 태반 관류물 또는 효소 소화된 태반 조직으로부터 얻을 수 있다. 복수의 태반으로부터 얻은 태반 줄기세포 롯의 집단은 예를 들어 장기 저장을 위한 태반 줄기세포의 은행 속에 정렬할 수 있다. 일반적으로 부착 줄기세포는 태반 재료의 초기 배양으로부터 파종 배양물(seed culture)을 형성하여 얻게 되고, 이를 통제된 조건 하에서 증폭시켜 대략 횟수로 배증시켜 세포군을 제조하게 된다. 롯들은 한 태반 조직으로부터 유래하는 것이 바람직하지만, 복수의 태반 조직으로부터 유래할 수도 있다.
한 실시 태양에서 줄기세포 롯은 다음과 같이 얻을 수 있다. 태반 조직을 먼저 파괴, 예를 들어 잘게 썰고 콜라겐 분해 효소 등(앞의 2.3을 보라)의 적절한 효소로 소화하여 파괴한다. 이 태반 조직은 예를 들어 하나의 태반에서 얻은 양막 전체, 융모막 전체 또는 양자 모두를 포함하는 것이 바람직하지만 양막 또는 융모막의 일부만 포함할 수도 있다. 소화된 조직은 예를 들 어 1~3 주 동안 배양되는데, 바람직하게는 2주가 좋다. 비부착성 세포를 제거한 다음, 형성되는 고밀도 콜로니를 수집, 예를 들어 트립신 처리를 통하여 수집한다. 이들 세포는 수집되어 편리한 분량의 배양 배지 속에 재현탁화되는데 이를 제0 계대(Passage 0) 세포라고 정의한다.
제0 계대 세포는 증폭 배양물(expansion culture)을 파종하는데 쓰인다. 증폭 배양물은 별개의 세포 배양 장치, 예를 들어 NUNC(상표)의 Cell Factory의 모든 배열일 수 있다. 제0 계대 배양물 속의 세포는 증폭 배양물을 파종하기 위하여 얼마든지 나뉠 수 있는데, 1×103, 2×103, 3×103, 4×103, 5×103, 6×103, 7×103, 8×103, 9×103, 1×104, 2×104, 3×104, 4×104, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 10×104 개의 줄기세포로 증폭 배양물을 파종할 수 있다. 바람직하게는 약 2×104 내지 약 3×104개의 제0 계대 세포를 이용하여 증폭 배양물을 파종한다. 증폭 배양물의 수는 제0 계대 세포의 수에 달려 있는데, 이 수의 다소는 상기 줄기세포를 얻은 특정 태반(들)에 달려 있다.
증폭 배양물은 배양물 속 세포 농도가 일정한 값, 예를 들어 약 1×105 세포/㎠에 이를 때까지 성장시키게 된다. 이 시점에서는 세포를 수집하거나 냉동보존할 수 있고, 아니면 앞서 설명한 바와 같이 새로운 증폭 배양물로 계대할 수도 있다. 세포는 사용 전에 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19회 또는 20회 계대될 수 있다. 증폭 배양 도중에는 세포군 배증의 누적 횟수에 대한 기록을 가지고 있는 것이 바람직하다. 제0 계대 배양에서 얻은 세포는 배증 회수를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38회 또는 40회, 혹은 60회까지로 하여 증폭할 수 있다. 그러나 개별 투여량 별로 세포군을 나누기 전의 세포군 배증 횟수는 약 15 내지 약 30회, 바람직하게는 약 20회인 것이 적당하다. 이들 세포는 증폭 과정 내내 연속적으로 배양되거나, 증폭 도중 1회 이상 냉동될 수 있다.
개별 투여에 쓰일 세포는 나중에 쓰기 위하여 냉동, 예를 들어 냉동보존될 수 있다. 개별 투여량에는 예를 들어 1 mL 당 약 1백만 내지 약 1억개의 세포가 포함될 수 있고, 그 총수는 약 106 내지 109개이다.
본 방법의 특정 실시 태양에서는 제0 계대 세포를 4회까지 배증하게 한 다음 1차 세포 은행 속에 냉동하여 둔다. 1차 세포 은행에서 나온 세포는 언 채로 있고 2차 세포 은행을 파종하는데 쓰이는데, 2차 세포 은행의 세포들은 약 8차례 더 배증하게끔 증폭된다. 이 단계의 세포를 수집하고 냉동한 다음 이를 이용하여 새로운 증폭 배양물을 파종하는데, 여기서 약 8차례 더 배증하도록 하여 누적 세포 배증 횟수를 약 20회로 한다. 계대 도중의 중간 시점에서 얻은 세포는 후속 증폭 배양을 위하여 1 mL 당 약 100,000 내지 약 1천만 세포, 바람직하게는 1백만 세포 단위로 냉동할 수 있다. 약 20 차례 배증한 세포는 투여 또는 줄기세포 함유 조성물을 제조하기 위하여 1 mL 당 약 1백만에서 약 1억개의 세포에 해당하는 용량의 개별 투여량으로 얼릴 수 있다.
한 바람직한 실시 태양에서는 태반을 기증한 기증자(예를 들어 모체)에 대하여 적어도 한 가지 병원체의 존부를 검사하게 된다. 검사 병원체에 대하여 산모가 양성이면 그 태반에서 얻은 전체 롯을 파기한다. 이러한 검사는 태반 줄기세포 롯의 제조 도중 어느 때이건 할 수 있고, 예를 들어 제0 계대 세포의 수립 전후 또는 증폭 배양 도중도 가능하다. 존부를 검사하는 병원체의 예로는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 사람 면역결핍 바이러스(I형과 II형), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 바이러스 등이 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
6.6 질병의 치료
본 명세서에서는 부적절하거나 원하지 않는 면역 반응에 의하여 일어나거나 이와 관련된 질병, 장애 또는 상태, 예를 들어 면역 억제로 치료 개선 효과를 볼 수 있는 질병, 장애 및/또는 상태에 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체에게 태반 줄기세포를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체적 태양에서 상기 그 투여량은 상기 개체의 면역 반응을 측정 가능하게 억제하기에 충분한 양이다. 이러한 면역 반응은 예를 들어 MLR이나 회귀 분석에서 상기 개체에서 얻은 T 세포를 이용하여 수행하는 T 세포 증식이다.
부적절하거나 원하지 않는 면역 반응에 의하여 일어나거나 이와 관련된 질병, 장애 또는 상태에 있는 개체, 예를 들어 다발성 경화증이 있거나 다발성 경화증을 가질 위험이 있는 사람, 크론병 또는 궤양성 대장염 등의 염증성 창자병이 있거나 그 위험에 처하여 있는 사람, 이식 대 숙주 질환이 있거나 그 위험에 처하여 있는 사람, 피부 경화증이 있거나 그 위험에 처하여 있는 사람, 류마티스성 관절염이 있거나 그 위험에 처하여 있는 사람, 당뇨병이 있거나 그 위험에 처하여 있는 사람, 건선이 있거나 그 위험에 처하여 있는 사람, 균상 식육종이 있거나 그 위험에 처하여 있는 사람 등은 질병의 진행 중 어느 시점에서라도 복수의 태반 줄기세포 치료를 받을 수 있고, 선택적으로는 하나 이상의 치료제도 투여받을 수 있다. 예를 들어, 이 개체는 진단 후 곧바로, 혹은 진단을 받은 시점으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6일 내에, 혹은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50주 또는 더 오랜 기간 안에, 혹은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 더 오랜 기간 안에 치료를 받을 수 있다. 이 개체는 병의 임상 경과 도중에 한 번 또는 여러 번 치료받을 수 있다. 이 개인은 적절할 경우 급성 발작 도중, 증상 완화시 또는 만성 퇴행기 도중에 치료받을 수 있다.
위와 같은 질병, 장애 또는 상태를 치료하는데 유용한 이 태반 줄기세포는 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포 중 어느 것이라도 될 수 있다. 어느 특정한 태양에서는 상기 태반 줄기세포가 CD200과 HLA-G를 발현하거나 CD73, CD105와 CD200을 발현하거나 CD200과 OCT-4를 발현하거나 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나, 아니면 OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다. 어떠한 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포가 CD10+, CD34-, CD105+이고 CD200+인 태반 줄기세포다. 다른 특정 태양에서는 이 태반 줄기세포가 CD117-이다.
한 실시 태양에서는 이 개체에게 약 3억개의 태반 줄기세포를 투여한다. 투여량은 그러나, 체중 등의 상기 개체의 신체적 특성에 따라 달라질 수 있어서, 투여량은 1회 투여 당 태반 줄기세포 1백만 내지 100 억개, 바람직하게는 1000만개와 10억개 사이, 또는 태반 줄기세포 5천만개와 1억개 사이 범위에 포함될 수 있다. 이러한 투여는 정맥 투여가 바람직하지만 살아있는 세포를 투여하는데 있어서 종래 기술에서 인정받은 어떠한 경로를 사용하여도 좋은데, 예를 들어 비경구, 피하, 근육내, 복막내, 안내 투여 등이다. 한 실시 태양에서는 세포 은행에서 구한 태반 줄기세포를 사용한다. 한 실시 태양에서는 예를 들어 양막, 양막/융모막, 융모막 또는 탯줄에서 얻은 태반 줄기세포 일정 투여량을 약괴(bolus) 주입이나 카테터 투여에 적합한 혈액백(bag) 또는 유사한 백 속에 담는다.
본 명세서의 한 실시 태양에서는 부적절하거나 원하지 않는 면역 반응에 의하여 일어나거나 이와 관련된 질병, 장애 또는 상태, 예를 들어 면역 억제로 치료 개선 효과를 볼 수 있는 질병, 장애 및/또는 상태에 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체에게 태반 줄기세포에 의하여 조건화된 배지를 상기 개체의 면역 반응을 측정 가능하게 억제할 수 있는 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 면역 반응은 예를 들어 MLR이나 회귀 분석에서 상기 개체에서 얻은 T 세포를 이용하여 수행하는 T 세포 증식이다.
태반 줄기세포나 제대 줄기세포 또는 태반 줄기세포나 제대 줄기세포가 조건화한 배지를 1회분의 투여량으로 투여하거나 여러 차례 투여할 수 있다. 여러 차례 태반 줄기세포를 투여하는 경우, 그 투여량은 부적절하거나 원하지 않는 면역 반응에 의하여 일어나거나 이와 관련된 질병, 장애 또는 상태의 급성 증상 중 하나 이상을 완화하기 위한 치료법의 일부분이거나, 그러한 질병, 장애 또는 상태의 만성 경과를 막거나 증세를 완화하기 위하여 고안한 장기 치료법의 일부분일 수 있다.
6.7 다발성 경화증의 치료
본 명세서의 다른 측면에서는 다발성 경화증 또는 다발성 경화증 관련 증상이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체에 복수의 태반 줄기세포나 태반 줄기세포가 조건화한 배지를 그 개체의 면역 반응을 조절, 예를 들어 억제하기에 충분한 양과 기간에 걸쳐 투여하는 단계를 포함한다.
다발성 경화증(MS)은 중추신경계의 만성, 재발성 염증 질환이다, 이 질환은 중추 신경계와 PNS 액손을 감싸는 미엘린 수초와 희소돌기 아교세포 및 신경 세포 자체의 손상을 가져 온다. 이 질환은 자가 반응성 T 세포, 특히 CD4+ T 세포가 매개하는데, 이 세포는 세포 부착 분자(adhesion molecule)와 염증 유발(pro-inflammatory) 사이토킨의 영향 아래 증식하고, 혈뇌 장막을 넘어 중추 신경계에 진입한다. 다발성 경화증의 증상은 사지의 감각 장애, 시각 신경 기능 장애, 추체로 기능 장애, 방광 기능 장애, 창자의 기능 장애, 성 기능 장애, 조화 운동 불능과 겹보임을 포함한다.
네 가지 다른 임상 경로가 다발성 경화증에서 확인되었다. 첫째인 재발/완화 MS(RRMS)는 며칠 또는 몇 주에 걸쳐 급성으로 나타나는 자기 제한성(self-limiting) 신경 기능 장애의 발작과 이에 이어지는 몇 달에 걸친, 때로 불완전한 회복기로 특징지을 수 있다. 둘째인 2차 진행성 MS(SPMS)는 RRMS로 시작하지만 경로가 바뀌면서 급성 발작과 무관하게 일어나는 지속적인 기능 황폐로 특징지을 수 있다. 셋째인 1차 진행성 MS(PPMS)는 급성 발작 없이 발병시부터 지속적으로 일어나는 기능 저하로 특징지을 수 있다. 넷째인 진행/완화 MS(PRMS)는 진행성 경로를 따라 시작하지만, 기능 저하의 진행과 간헐적인 발작이 겹쳐 일어난다.
다발성 경화증 보유자는 운동 능력 평가, 선택적으로는 MRI를 이용하여 평가한다. 예를 들어 한 운동 능력 평가인 확장된 장애 상태 척도(expanded disability scale)에서는 보유자의 능력을 아래와 같이 순차적으로 점수화한다.
0.0 정상적인 신경학적 진단 결과
1.0 장애 없음. 한 FS에 최저 수준의 징후
1.5 장애 없음. 하나 이상의 FS에 최저 수준의 징후
2.0 한 FS에 최저 수준의 장애
2.5 한 FS에 사소한 장애 또는 두 FS에 최저 수준의 장애
3.0 한 FS에 중간 수준의 장애 또는 세네 FS에 사소한 장애. 완전한 보행 능력.
3.5 보행 완전하지만 한 FS에 중간 수준의 장애가 있고 몇몇 FS에 최저 수준보다 심한 장애.
4.0 비교적 심한 장애가 있으나 도움 필요 없고 하루에 약 12 시간 정도 스스로 완전한 보행 능력을 가짐. 약 500 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음.
4.5 하루 대부분을 도움없이 완전한 보행 능력을 가짐. 하루 종일 일할 수 있으며 완전한 활동에는 어떤 제약이 있거나 최저 수준의 도움이 필요할 수 있음. 비교적 심한 장애가 특징적이고 300 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음.
5.0 약 200 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음. 완전한 일상적 활동(특별한 준비 없이 하루 종일 일할 수 있는 상태)을 하는데 방해가 될 만큼 심한 장애
5.5 약 100 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음. 완전한 일상적 활동을 배제할 만큼 심한 장애.
6.0 약 100미터를 휴식 없이 또는 쉬면서 걷는데 간헐적이거나 한 쪽 방향으로 고정적인 도움(지팡이, 목발, 고정기)을 요함.
6.5 약 20미터를 휴식 없이 또는 쉬면서 걷는데 양 방향으로 고정적인 도움(지팡이, 목발, 고정기)을 요함.
7.0 도움을 받아도 5미터를 넘어 걸을 수 없음. 실질적으로 휠체어에 매임. 표준 휠체어에서는 바퀴질을 혼자 하며 휠체어를 스스로 갈아탈 수 있음. 약 하루 12시간 동안 휠체어 사용 가능.
7.5 몇 발자국 이상 걸을 수 없음. 휠체어에 매임. 갈아탈 때 도움이 필요할 수 있음. 스스로 바퀴질을 하지만 표준 휠체어서 하루 종일 있을 수는 없음. 전동 휠체어가 필요할 수 있음.
8.0 실질적으로 의자 또는 침대에 매여 있거나 휠체어로 천천히 돌아다니 지만 침대로부터 하루 대부분 일어나 있을 수 있음. 스스로 돌보는 많은 기능을 유지하고 있으며 팔의 사용은 대개 효과적임.
8.5 하루 대부분 침대에 매여 있음. 몇가지는 팔을 효과적으로 사용하며 얼마간 스스로를 돌보는 기능이 있음.
9.0 침대를 떠날 수 없음. 대화와 식사가 가능.
9.5 가망 없는 침상 위의 환자. 효과적인 대화할 수 없거나 먹고 삼킬 수 없음.
10.0 다발성 경화증으로 인한 사망.
이 점수 체계에서 "FS"는 측정 대상인 여덟 가지 기능 체계(functional system)를 가리키는데, 추체계, 소뇌계, 뇌간계, 감각계, 대소장과 방광계, 시각계, 대뇌계와 기타 계를 포함한다.
다른 유사한 평가 체계도 알려져 있는데, Scripps 신경학적 평가 척도, 보행성 지표, 다발성 경화증 기능 복합 평가(MSFC) 등이 있다.
다발성 경화증의 진행은 발작 빈도를 측정함으로써 평가할 수도 있다.
다발성 경화증의 진행은 자기 공명 영상법을 이용하여 평가할 수도 있는데, 여기서는 다발성 경화증과 관련된 신경 손상(예를 들어 새로운 손상, 인핸싱 뇌 결절(enhancing brain nodule) 또는 통합 고유 활성 손상(combined unique active lesion))을 검출할 수 있다.
따라서 본 명세서의 한 실시 태양에서는 다발성 경화증을 가지는 개체, 예를 들어 다발성 경화증 진단을 받은 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체의 면역 반응을 억제하기에 충분한 수의 복수의 태반 줄기세포를 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 특정 태양에서 이 MS는 재발/완화 MS이다. 다른 구체적인 실시 태양에서 이 MS는 2차 진행성 MS이다. 다른 구체적인 실시 태양에서 이 MS는 1차 진행성 MS이다. 다른 구체적인 태양에서 이 MS는 진행/완화 MS이다. 한 특정 실시 태양에서 상기 투여는 이 개체의 다발성 경화증 증상을 하나 이상 측정 가능한 정도로 개선한다. 더 특정한 실시 태양에서 이 증상은 예를 들어, 사지의 하나 이상의 감각 장애, 시각 신경 기능 장애, 추체로 기능 장애, 방광 기능 장애, 창자 기능 장애, 성 기능 장애, 조화 운동 불능 및 겹보임이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 투여는 EDSS 척도에서 적어도 0.5점 이상의 점수 향상을 가져온다. 다른 특정 태양에서는 상기 투여가 적어도 한 MS 평가 척도에 따른 기능의 유지를 가져 오는데, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월 동안 유지된다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 투여는 EDSS 척도에서 적어도 1점 이상의 점수 향상을 가져온다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 투여는 EDSS 척도에서 2점 이상의 점수 향상을 가져온다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 투여는 다발성 경화증 평가 척도 또는 자기 공명 영상법상으로 측정 가능한 증상 완화를 가져 온다. 이 개체는 적절할 경우 급성 발작 도중, 증상 완화시 또는 만성 퇴행기 도중에 치료받을 수 있다. 다른 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포를 다발성 경화증을 앓고 있는 여성에게 분만 후에 투여하여, 임신 도중 경험한 증상 완화 또는 재발 빈도 감소를 유지할 수 있다.
한편 본 명세서에서는 다발성 경화증을 가지는 개체, 예를 들어 다발성 경화증 진단을 받은 개체를 치료하는 방법도 제공하는데, 이 방법은 상기 개체의 면역 반응을 억제하기에 충분한 수의 복수의 태반 줄기세포 및 하나 이상의 치료제를 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 투여는 상기 개체의 다발성 경화증의 하나 이상의 증상을 측정 가능한 수준으로 개선한다. 한 실시 태양에서 이 치료제는 당질 코르티코이드이다. 한 특정한 실시 태양에서 이 당질 코르티코이드는 부신피질 자극호르몬(ACTH), 메틸프레드니솔론 또는 덱사메타손이다. 다른 실시 태양에서 이 치료제는 면역 조절제 또는 면역 억제제이다. 많은 특정 실시 태양에서 이 면역 억제제 또는 면역 조절제는 IFNβ-1a, IFNβ-1b, 아세트산글리아트리아머, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클라드리빈, 사이클로스포린 또는 미톡산트론이다. 다른 실시 태양에서 이 치료제는 정맥하 면역 글로불린, 혈장 교환술 또는 술파살라진이다. 다른 실시 태양에서 이 개체는 상기 치료제의 모든 조합을 투여받을 수 있다.
6.8 염증성 창자병의 치료
일 태양에서, 태반 줄기세포, 태반 줄기세포군, 및/또는 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포군을 포함하는 조성물은 염증성 창자병(IBD), 예를 들어, 크론 병 또는 궤양성 대장염을 가진, 또는 이러한 질환이 발생할 위험성이 높은 개체를 치료하기 위하여 사용된다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 복수의 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포에 의해 조건화된 배지를 개체 내 면역 반응을 검출 가능한 정도로 조절, 예를 들어, 억제하기에 충분한 양과 시간 동안 투여하는 것을 포함하는 염증성 창자병이 있는 개체 또는 염증성 창자병과 관련된 증상이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
크론 병. 일 태양에서, 상기 IBD는 크론 병이며, 때때로 회장염 또는 장염으로 명명된다. 크론 병은 소화 관(또한 위장관, 또는 GI, 관(트랙)으로 명명됨)의 염증을 야기하는 만성 장애이다. 크론 병은 구강부터 항문까지 GI 관의 어느 부위에도 영향을 미칠 수 있으나, 대부분은 일반적으로 회장이라고 불리우는 소장의 하부에 영향을 미친다. 크론 병의 다섯 가지 타입이 알려져 있다. 위십이지장 크론 병은 위와 십이지장(소장의 최상위 부분)에 영향을 미친다. 공장회장염증(jejunoileitis)은 소장의 가장 긴 부분인 공장의 크론 병이다. 회장염은 소장의 최하부인 회장의 크론 병이다. 회결장염(ileocolitis)은 크론 병의 가장 일반적인 형태로 회장 및 대장에 영향을 미친다. 마지막으로, 크론 대장염(육아종 대장염)은 대장에 영향을 미치며, 질병 조직 사이사이에 건강한 조직이 종종 있고, 크론 대장염은 직장을 포함하지 않고 단지 대장에 발생한다는 점에서 궤양성 대장염과 구별된다. 크론 병은 소장의 내면에서 백혈구의 축적을 야기하는, 예를 들어, 음식, 유익한 세균 등을 포함하는 GI 관 내의 항원들에 대한 신체의 면역 시스템의 부적절한 반응으로부터 발생하는 것으로 생각된다. 크론 병과 관련된 염증은 또한 사이토카인 종양 괴사 인자(TNF-α)의 활동에 기인한다.
궤양성 대장염. 다른 태양에서, 상기 IBD는 궤양성 대장염이다. 궤양성 대장염은 직장 및/또는 대장의 내면에 염증 및 종기(궤양)를 야기하는 질병이다. 궤양은 일반적으로 대장 내의 세포를 죽이는 염증이 발생하는 곳에 형성되며; 궤양들은 일반적으로 그 후 출혈이 일어나고, 고름을 형성한다. 염증이 직장 및 대장의 하부에 발생할 때, 상기 질병은 궤양성 직장염(proctitis)으로 명명된다. 전체 대장에 발생할 때, 상기 질병은 범대장염(pancolitis)이라 불린다. 대장의 단지 왼쪽에 발생할 때, 상기 질병은 국소(limited) 또는 말단(distal) 대장염이라 불린다. 궤양성 대장염의 증상들은 복부 통증, 출혈성 설사, 열, 오심, 복부 경련, 빈혈, 피로, 체중 감소, 식욕 감소, 직장 출혈, 신체 체액 및 영양소 손실, 피부 병변(skin lesion), 관절 통증 및 성장 장애(어린이에 있어)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 궤양성 대장염은 또한 눈의 염증, 간 질환, 및 골다공증과 같은 합병증을 야기할 수 있다.
따라서, 일 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 태반 줄기세포를 투여하는 것을 포함하는 염증성 창자병을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료학적으로 유효한 양은 상기 염증성 창자병(IBD)의 적어도 하나의 증상을 검출 가능한 정도로 개선하는 양이다. 구체적 태양에서, 상기 IBD는 크론 병이다. 더 구체적 태양에서, 상기 크론 병은 위십이지장 크론 병, 공장회장염(jejunoileitis), 회장염, 회결장염 또는 크론 대장염이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 증상은 크론 병의 증상이다. 더 구체적 태양에서, 크론 병의 증상은 GI 관의 일부분의 염증 및 팽윤, 복부 통증, 빈번한 창자의 공복(frequent emptying of the bowel) 및/또는 설사이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 크론 병의 증상은 직장 출혈, 빈혈, 체중 감소, 관절염, 피부 문제, 발열, 소장 벽의 굵어짐(thickening), 소장 내 상처 조직(scar tissue)의 형성, 소장 내 종기(sore) 또는 궤양의 형성, 소장 벽 내 하나 이상의 누(fistula)의 성장, 항문 내 하나 이상의 균열(fissure)의 성장, 영양 결핍의 진전(예를 들어, 단백질, 칼로리, 비타민 중 하나 이상의 결핍), 신장 결석의 발달, 담석의 발생, 간 또는 담즙 계 질병의 발생이다.
다른 더 구체적 태양에서, 상기 IBD는 궤양성 대장염이다. 더 구체적 태양에서, 상기 궤양성 대장염은 궤양성 직장염(proctitis), 범대장염(pancolitis), 국소 대장염 또는 말단 대장염(distal colitis)이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 증상은 궤양성 대장염의 증상이다. 더 구체적 태양에서, 상기 증상은 복부 통증, 출혈성 설사, 열, 오심, 복부 경련(abdominal cramp), 빈혈, 피로, 체중 손실, 식욕 저하, 직장 출혈, 신체 체액 및 영양소의 손실, 피부 병변(skin lesion), 관절 통증 및 성장 장애이다. 다른 더 구체적 태양에서, 상기 증상은 골다공증, 눈 염증 또는 간 질환이다.
다른 구체적 태양에서, 상기 태반 줄기세포를 투여받는 개체는 하나 이상의 제2치료제를 추가적으로 투여받으며, 여기에서 상기 제2치료제는 항염증제, 스테로이드, 면역 억제제, 및/또는 항생제를 포함한다. 크론 병 또는 궤양성 대장염의 치료에 유용한 항염증 약물의 예는 메살라민, 5-ASA (5-아미노살리실릭 산) 성분(예를 들어, 등록상표 ASACOL (메살라민, 지연-방출), DIPENTUM (오살라진), 등록상표 PENTASA(메살라민 조절-방출)), 설파사라진(5-ASA와 설파피리딘의 조합), 항-염증 항체(예를 들어, 인프릭시마브(Infliximab)(등록상표 REMICADE), 및 이와 유사한 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 크론 병 또는 궤양성 대장염의 치료에 유용한 스테로이드의 예는 코르티손, 하이드로코르티손, 프레디손, 메틸프레드니손, 및 이와 유사한 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전형적으로, 본 발명이 속한 분야에서 이용되는 것처럼, 스테로이드의 투여량은 처음에 다소 많은 양으로 투여되고, 염증이 가라앉음에 따라 적은 양으로 투여된다. 크론 병의 치료에 유용한 면역 억제제의 예는 사이클로스포린 A, 6-머캅토퓨린 또는 아자티오프린(azathioprine)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 크론 병의 치료에 사용될 수 있는 항생제는, 예를 들어, 암피실린, 설폰아마이드, 세파로스포린(cephalosporin), 테트라사이클린, 및/또는 메트로니다졸을 포함한다. 다른 구체적 태양에서, 제2치료제는 예를 들어, Trichuris suis의 알과 같은 돼지 편충의 투여이다.
6.9 이식 대 숙주병의 치료
다른 태양에서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 태반 줄기세포, 또는 태반 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 이식-대-숙주 질환(GVHD)이 있는 또는 GVHD가 발생할 위험성이 있는, 또는 GVHD 증상을 경험할 수 있는 이식 수여자 또는 이식을 받을 개체와 같은 개채를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 치료학적으로 유효한 양은 GVHD의 하나 이상의 증상을 검출 가능한 정도로 개선하는 것이 충분하거나, GVHD의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능한 정도로 감소하기에 충분한 양이다.
GVHD는 전형적으로 완전히 또는 부분적으로 동종 조직 이식 후에 또는 이러한 이식의 결과로 발생하며, 특히 동종 조혈 줄기세포 이식 후에 발생하고, 이식 5-100일 이내에 전형적으로 발생하는 피부염, 장염 및 간염 중 하나 이상을 포함할 수 있다. GVHD는 급성 또는 만성일 수 있다. 급성 GVHD는 이식 후 5-47일까지 일반적인, 가렵거나 통증성인 발진이 나타나는 것으로 구별될 수 있다. 초급성 GVHD는 또한 발열, 전신성 홍피증, 및 박리가 수반할 수 있다. 간 또한 개입될 수 있으며, 증가된 (예를 들어, 정상보다 높은) 빌리루빈 레벨, 알라린 아미노프랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 및 알칼린 포스파타제(AP)로 확인된다. 급성 GVHD는 또한 대장을 포함할 수 있으며, 설사, 내부 출혈, 경련, 복투 통증 및 장폐색을 야기한다. 만성 GVHD는 급성 GVHD를 경험한 이식 환자에서 발생하거나, 또는 전에 자각증상이 없는 환자에게서 발생할 수 있다. 만성 GVHD의 증상은 눈의 작열감, 눈 자극, 광선공포증(photophobia), 및 감소한 눈물 분비에 따른 눈 통증; 구강 건조, 매운 또는 산성 음식에 대한 민감성, 복부 통증, 삼킴곤란(dysphagia)(삼키는 것의 어려움), 연하통(odynophagia)(삼킴 시의 통증), 체중 저하, 폐색성 폐 질환, 근육 약화(muscular weakness), 신경병성 통증, 및/또는 근육 경련(muscle cramp)을 포함한다.
그러므로, 상기 방법의 특정 태양에서, 태반 줄기세포의 치료학적으로 유효한 양은 급성 GVHD의 하나 이상의 증상을 검출 가능한 정도로 개선하기에 충분하거나, 또는 급성 GVHD의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능한 정도로 줄이기에 충분한 양이다. 더 구체적 태양에서, 상기 하나 이상의 증상은 피부염, 피부 소양증, 발진, 장염, 간염, 열, 홍피증(erythroderma), 박리(desquamation), ALT 레벨 증가, AST 레벨 증가, AP 레벨 증가; 빌리루빈의 증가한 레벨; 복부 통증, 경련(cramping), 내부 출혈, 또는 장폐색이다. 상기 방법의 다른 구체적 태양에서, 태반 줄기세포의 치료학적으로 유효한 양은 만성 GVHD의 하나 이상의 증상을 검출 가능한 정도로 개선하기에 충분하거나, 또는 만성 GVHD의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능한 정도로 줄이기에 충분한 양이며, 상기 하나 이상의 증상은 눈의 작열감, 눈 자극, 감소한 눈물 생성, 광선공포증(photophobia), 감소한 눈물 분비에 따른 눈 통증, 구강 건조, 매운 또는 산성 음식에 대한 민감성, 복부 통증, 삼킴곤란(dysphagia)(삼킴 시의 어려움), 연하통(odynophagia)(삼킴 시의 통증), 체중 저하, 폐색성 폐 질환(쌕쌕거림 호흡곤란 및/또는 만성 기침 중 어느 하나를 포함), 근육 약화(muscular weakness), 신경병성 통증, 및/또는 근육 경련(muscle cramp)이다. 상기 방법의 다른 특정 태양에서, 급성 GVHD 및/또는 만성 GVHD의 증상은 고빌리루빈혈증, 황달, 문맥 고혈압, 경변(cirrhosis), 출혈성 결막염, 위막 형성(psudomembrane formation), 토끼눈증(lagophthalmos), 만성 각막결막염, 건성(sicca), 점상각막병증(punctuate keratopathy), 구강 점막의 위축, 홍반, 볼 또는 입술 점막의 태선모양 병변의 발생, 폐쇄성 세기관지염(bronchiolitis obliterans), 질염, 질 협착, 자가면역 혈소판감소, 및/또는 빈혈을 포함한다.
상기 방법은 공급자 또는 수용자의 성질에 의해 영향받지 않는다. 이식은 종 계통(line)을 교차할 수 있다. 바람직한 태양들에서, 공급자 및 수용자는 같은 종, 예를 들어, 둘 다 인간이다. 이식 수용자는 완전히 또는 부분적으로 공급자에 동종(allogeneic)일 수 있다. 이식은 자가 이식일 수 있다. 이식 수용자 또는 공급자는 5세 미만, 1 내지 10세, 5 내지 15세, 10 내지 20세, 15 내지 25세, 20 내지 30세, 25 내지 35세, 30 내지 40세, 35 내지 45세, 40 내지 50세, 45 내지 55세, 50 내지 60세, 55 내지 65세, 60 내지 70세, 또는 70세 또는 그 이상일 수 있다.
GVHD는 일반적으로 증상의 심각성에 따라 등급이 나누어진다. 예를 들어, 일 태양에서, GVHD의 증상은 단계 나누어지고, GVHD는 하기 표 1 및 2에 나타나는 바와 같이, 피부, 간, 및/또는 소장 증상에 따라 0(GVHD 아님)부터 IV (생명 위협하는 GVHD)까지 분류된다.
급성 이식-대-숙주 병의 단계(staging)
단계 피부 간(빌리루빈 레벨, mg/dL) 소장
+ 신체면의 25% 미만의 반구진 발진(maculopapular rash) 2-3 설사 500-1000 mL/d 또는
지속적 오심
++ 신체면의 25-50%의 반구진 발진 3-6 설사 1000-1500 mL/d
+++ 전신 홍피증 6-15 설사 >1500 mL/d
++++ 박리 및 수포 >15 장폐색이 있는 또는 없는 통증
급성 GVHD의 등급(grading)
총 등급 단계
피부 간 장 기능 손상
0 (없음) 0 0 0 0
I (온순(Mild)) + 내지 ++ 0 0 0
II (중간(Moderate)) + 내지 +++ + + +
III (심함(Severe)) ++ 내지 +++ ++ 내지 +++ ++ 내지 +++ ++
IV (생명 위협) ++ 내지 ++++ ++ 내지 ++++ ++ 내지 ++++ +++
따라서, 상기 방법의 다른 태양에서, 태반 줄기세포의 치료적으로 유효한 양은 예를 들어, 개체, 예를 들어, 이식을 받은 개체 (이식 수령자) 내 이식-대-숙주 질환의 하나 이상의 증상의 개선을 야기하여, 상기 이식 대 숙주 질환의 등급이 적어도 한 등급 감소하기에 충분한 양이다. 특정 태양에서, 상기 이식 대 숙주 질환은 등급 IV에서 등급 III로; 등급 IV에서 등급 II로; 등급 IV에서 등급 I로; 등급 IV에서 등급 0으로; 등급 III에서 등급 II로; 등급 III에서 등급 I로; 등급 III에서 등급 0으로; 등급 II에서 등급 I로; 등급 II에서 등급 0로; 또는 등급 I에서 등급 0로 감소한다. 상기 방법의 다른 태양에서, 태반 줄기세포의 치료학적으로 유효한 양은 상기 개체 내 이식 대 숙주 질환이 이식 후 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100일 이내에 등급 0, 등급 I, 등급 II 또는 등급 II를 넘어 진전되지 않도록 하는 양이다.
다양한 특정 태양에서, GVHD을 가진 개체, 또는 GVHD이 발생할 위험성이 있는 개체는 동종 조혈 세포 이식을 받은 개체(예를 들어, GVHD 예방 조치를 받지 않은 개체; 노령 개체; HLA-비식별 조혈 줄기세포의 수령자; 동종감작(allosensitized) 공급자로부터 이식을 받은 자; 비관련 공급자로부터 이식을 받은 자); 실질 기관 이식을 받은 개체, 특히 림포이드 조직을 포함하는 기관의 이식, 예를 들어, 소장 이식을 받은 개체; 및 방사선 조사되지 않은 혈액 제품을 받은 개체(예를 들어, 신생아 및 태아, 선천성 면역결핍 신드롬 개체, 면역억제 화합요법을 받는 개체, 부분적 HLA-식별, HLA-동종 공급자로부터 직접적 혈액 수혈을 받은 개체), 복합 조직 동종이식(즉, 한 개보다 많은 조직 타입을 받은 동종이식)을 받은 개체; 및 이와 유사한 개체이다. GVHD는 또한 자가(autologous) 또는 공통유전자형(syngenic) 조혈 세포 이식 후에 발생한다. 다른 특정 태양에서, 상기 개체는 이식에 부속하여 준치사 또는 치사량의 방사선을 수용한다(예를 들어, 방사선 조사를 받는다).
특정 태양에서, 상기 태반 또는 제대 줄기세포는 이식 전 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 개체에게 투여된다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 또는 제대 줄기세포는 이식과 동시에 투여된다. 다른 특정 태야에서, 태반 또는 제대 줄기세포는 이식 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 이내에 투여된다. 태반 또는 제대 줄기세포의 투여는 다회 투여, 예를 들어, 이식 전, 이식과 동시 또는 이식 후, 또는 이들의 조합 방식으로 다회 투여로 수행된다. 다른 태양에서, 제대 또는 태반 줄기세포는 등급 II 또는 더 심각한 이식 대 숙주 질환이 개체(이식 수령자)에 나타날 때 이식 후 어느 때라도 투여된다.
상기 방법의 다른 태양에서, 개체, 예를 들어, 이식 수령자 또는 이식을 받을 개체는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포 및 추가적으로 적어도 하나의 다른 치료 성분을 투여받는다. 다른 특정 태양에서, 상기 치료 성분은 아티모사이트 글로불린(athymocyte globulin), 마이코페놀레이트 모페틸, 시롤리무스, 캄파쓰(Campath)-1H, 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 수베로일아닐라이드 하이드록사믹 산(suberoylanilide hydroxamic acid)(SAHA), 코르티손, 하이드로코르티손, 프레디손, 또는 메틸프레드니손이다. 다른 특정 태양에서, 상기 치료 성분은 면역억제 성분 또는 면역조절 성분이다. GVHD에 적용 가능한 면역억제 성분 및 면역조절 성분은 본 발명이 속한 분야에서 알려져 있으며, 메토트렉세이트, 레프루노마이드, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이클로스포린 A, 마크로라이드 항생제(예를 들어, FK506 (타크로리무스)), 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신(시롤리무스), 미조리빈(mizoribine), 데옥시스페르구알린(deoxyspergualin), 브레퀴나르(brequinar), 말로노니트릴로아민데스(malononitriloamindes)(예를 들어, 레프룬아미드(leflunamide)), T 세포 수용체 조절제, 및 사이토카인 수용체 조절제, 펩타이드 유사체(mimetics), 및 항체(예를 들어, 인간, 인간화, 키메라, 단일클론, 다클론, Fvs, ScFvs, Fab 또는 F(ab)2 절편 또는 에피토프 결합 절편), 핵산 분자(예를 들어, 안티센스 핵산 분자 및 삼중 헬릭스(helices)), 작은 분자, 유기 화합물, 및 무기 화합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 면역조절 성분은 메토트렉세이트, 레프루노마이드(leflunomide), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이톡산(cytoxan), 임뮤란, 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제(예를 들어, FK506 (타크로리무스)), 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 미코페놀레이트 모페틸, 라파마이신(시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아민데스(malononitriloamindes)(예를 들어, 레프루나미드(leflunamide)), T 세포 수용체 조절제, 및 사이토카인 수용체 조절제를 포함한다. T 세포 수용체 조절제의 예는 항-T 세포 수용체 항체(예를 들어, 항-CD4 항체(예를 들어, cM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9.Is (IDEC and SKB), mAB 4162W94, 등록상표 ORTHOCLONE 및 OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), 항-CD3 항체(예를 들어, 등록상표 NUVION(Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), 또는 리툭산(Rituxan) (IDEC)), 항-CD5 항체(예를 들어, 항-CD5 리신-연결 면역복합체), 항-CD7 항체(예를 들어, CHH-380 (Novartis)), 항-CD8 항체, 항-CD40 리간드 단일클론 항체(예를 들어, IDEC-131 (IDEC)), 항-CD52 항체(예를 들어, 등록상표 CAMPATH 1H (Ilex)), 항-CD2 항체, 항-CD1a 항체(예를 들어, 자넬림(Xanelim)(Genentech)), 및 항-B7 항체(예를 들어, IDEC-114) (IDEC))), CTLA4-면역글로불린, 탈리도마이드, 또는 상기 6.6 항목에서 언급된 화합물들 중 하나를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 태양에서, T 세포 수용체 조절제는 CD2 길항제이다. 다른 태양에서, T 세포 수용체 조절제는 CD2 길항제가 아니다. 다른 특정 태양에서, 상기 성분은 항체 MEDI-501 (T10B9)이다. 다른 특정 태양에서, T 세포 수용체 조절제는 CD2 결합 분자, 바람직하게는 MEDI-507이다. 다른 태양에서, T 세포 수용체 조절제는 CD2 결합 분자가 아니다. GVHD의 치료, 또는 GVHD 증상의 치료에 유용한 상기 치료 성분들 중 어떠한 조합도 투여될 수 있다. 그러한 치료 성분은 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포와의 조합으로 동시에 또는 분리된 치료 경로로 투여될 수 있다.
6.10 류마티스성 관절염의 치료
다른 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지를 투여하는 것을 포함하는, 류마티스성 관절염(RA)을 가진, 또는 RA의 증상을 경험하는, 또는 RA가 발생할 위험성이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하여, 여기에서 상기 치료학적으로 유효한 양은 RA의 하나 이상의 증상에 검출 가능한 개선을 가져오기에 충분하거나, 또는 RA의 하나 이상의 증상의 발생을 검출 가능하게 줄일 정도로 충분한 양이다. 류마티스성 관절염은 만성, 염증성 자가면역 상태로, 그 상태에서 신체 면역 시스템은 관절, 및 일반적으로 신체의 다른 조직을 공격한다.
특정 태양에서, 상기 투여는 RA 개체의 적어도 하나의 관절에서 RA의 하나 이상의 증상에 검출 가능한 개선을 야기하게게 충분하거나, RA의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 감소시키기에 충분하다. 다른 특정 태양에서, 상기 투여는 RA 개체의 적어도 하나의 비-관절에서 RA의 하나 이상의 증상에 검출 가능한 개선을 야기하게게 충분하거나, RA의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 감소시키기에 충분하다. RA에 의해 영향을 받을 수 있는 비-관절의 예들은 피부(진피), 폐, 자가면역 시스템 또는 혈액, 신장 조직, 심혈관 조직, 폐 조직, 눈 조직, 또는 신경 조직을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 태양에서, RA의 증상은, 어떠한 한정 없이, 아침 강직(morning stiffness)(예를 들어, 지속이 1시간 이상), 하나 이상의 관절 또는 관절 그룹의 연-조직 팽윤(soft-tissue swelling), 관절 통증, 피하 결정, 류마티스성 인자의 95% 초과 존재, 또는 관절 진무름(erosion)을 암시하는 방사선적 변화이다.
특정 태양에서, 상기 투여는 RA에 부속하는 하나 이상의 상태의 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, 또는 RA에 부속하는 하나 이상의 상태의 개시를 검출 가능하게 줄이기에 충분하다. 그러한 상태의 예는 괴저농피증, 호중구 피부염(neutrophilic dermatosis), Sweet 증후군, 바이러스성 감염, 결절 홍반, 소엽상 지방층염(lobular panniculitis), 손가락 피부의 위축, 손바닥 홍반, 광범위 얇아짐(diffuse thinning)(라이스 페이퍼 피부(rice paper skin)), 피부 허약, 예를 들어, 팔꿈치 위와 같은 외부 표면상의 피하 결절, 폐의 섬유증(예를 들어, 메토트렉세이트 치료의 결과로 인해), Caplan 결절, 맥관염 장애, 손발톱 주름 경색, 신경장애, 신장애, 아밀로이드증, 근육 가성비대(muscular pseudohypertrophy), 심내막염(endoscarditis), 좌 심실 부전, 판막염(valulitis), 공막연화증, 다발홑신경염(mononeuritis multiplex), 고리중쇠뼈 불완전 탈구(atlanto-axial subluxation) 및 이와 유사한 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법의 다른 태양에서, RA 개체는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포와 적어도 하나의 다른 치료 성분을 추가적으로 투여받는다. 특정 태양에서, 상기 치료 성분은, 예를 들어, 진통제, 또는 항-염증제이다. 다른 특정 태양에서, 상기 치료 성분은 질병-조정 항류마티스 약물(disease-modifying antirheumatic drug)(DMARD)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 DMARD는 하나 이상의 생체이물질(xenobiotic)(예를 들어, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, D-펜니실라민(pennicillamine), 골드 염, 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 레프루노마이드, 메토트렉세이트, 미노사이클린 또는 설파살라진) 또는 생물학적 성분(예를 들어, 에타네르셉트(etanercept) (등록상표 ENBREL), 인프릭시마브(infliximab)(등록상표 REMICADE), 아달리무마브(adalimumab)(등록상표 HUMIRA), 또는 섹션 6.8에서 개시된 화합물들 중 하나와 같은 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 차단제; 인터루킨-1 차단제; 항-B 세포(CD20) 항체(예를 들어, 리툭시마브 또는 등록상표 RITUXAN); 또는 T 세포 활성화 차단제(예를 들어, 아바타셉트 또는 등록상표 ORENCIA)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 진통제 또는 항염증제는 글루코코르티코이드, 비-스테로이드성 항염증 약물, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 아스피린, 오피에이트, 또는 리도카인(국소)이다. GVHD의 치료 또는 GVHD의 증상의 치료에 적합한 상기 치료 성분들의 어떠한 조합도 투여될 수 있다. 그러한 치료 성분은 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포와 어떠한 조합으로도 투여될 수 있으며, 동시에 또는 분리된 치료 경로로 투여될 수 있다.
특정 태양에서, RA 개체에게 투여된 복수의 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포는 RA에 대한 치료적 폴리펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된다. 더 구체적 태양에서, 상기 RA 치료 폴리펩타이드는 IL-1Ra (인터루킨-1 수용체 길항제)이다. 다른 특정 태양에서, 상기 RA 치료 폴리펩타이드는 IL-1Ra 및 DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타제)를 포함하는 융합 단백질이다. 더 구체적 태양에서, 상기 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포는 IL-1Ra-DHFR 융합 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질전환되고, 여기에서 상기 융합 단백질의 발현은 항폴레이트, 예를 들어, 메토트렉세이트에 의해 촉진된다. 다른 구체적 태양에서, 복수의 제2 타입의 줄기세포가 RA 개체에게 투여되고, 여기에서 복수의 제2 타입 줄기세포는 RA 치료 펩타이드, 예를 들어 위에서 설명된 폴리펩타이드 중 어느 것을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 더 구체적 태양에서, 상기 핵산은 IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc을 코딩하며, 여기에서 IRES는 내부 리보솜 진입 사이트(internal ribosomal entry site)이고, Luc는 루시페라제이다. 다른 특정 태양에서, 상기 핵산은 IL-1Ra 또는 IL-1Ra-DHFR 융합 폴리펩타이드의 발현을 조절할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
RA를 치료하기 위해 사용되는 유전적으로 조작된 태반 줄기세포, 제대 줄기세포 또는 다른 종류의 줄기세포는 유전적으로 변형되지 않는 줄기세포와 조합하여 RA 개체에게 투여될 수 있다.
6.11 피부 경화증의 치료
다른 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지를 투여하는 것을 포함하는, 피부경화증이 있는, 또는 피부경화증의 증상을 경험하는, 또는 피부경화증이 발생할 위험성이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료학적으로 유효한 양은 피부경화증의 하나 이상의 증상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, 피부경화증의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄일 정도로 충분한 양이다.
피부경화증은 피부 또는 다른 기관에 콜라겐이 과도하게 축적하는 것이 특징인 만성 질환이다. 피부경화증은 국소에 존재할 수도 있고 전신적일 수도 있다. 상기 질환의 국소 형태는, 무력하게 하는 반면, 치명적이지는 않은 경향이 있다. 광범위 피부경화증 또는 전신성 피부경화증으로 표시되는 상기 질병의 전신 형태는 심장, 신장, 폐 또는 소장 손상의 결과로 치명적일 수 있다. 피부경화증의 세 가지 타입들은 광범위(diffuse) 피부경화증 및 국소(limited)(CREST 신드롬) 피부경화증이며, 이것은 전신적이고, 반상/선상(morphea/linear) 피부경화증이며, 피부에 국한된다. 광범위 피부경화증은 더 심각한 형태이고, 이것의 환자는 빠른 발병, 넓게 퍼진 피부 경화, 및 중요한 내부 기관 손상, 특히 폐 및 위장관의 손상을 경험한다.
피부경화증의 국소 형태는 더 온화하고, 느린 개시 및 진전을 보인다. 피부 경화는 일반적으로 손 및 얼굴에 국한되고, 내부 기관 개입은 광범위 형태보다 덜 심각하다. 일반적으로, Raynaud 현상이 몇 년에 걸쳐 피부경화증에 앞서 일어날 수 있다. Raynaud 현상은 차가운 곳에 노출된 말초, 특히 손 및 발의 작은 동맥의 혈관수축에 기인하며, 전통적으로 3단계 색깔 변화에 의해 특징지워진다. 3가지 색깔은 첫 번째는 흰색, 그 후 청색이며, 마지막으로 다시 따뜻해질 경우의 적색이다. 국소 형태는 종종 CREST 신드롬으로 명명되며, 여기에서 "CREST"는 다섯 가지 현상의 두문자어이고, 다섯 가지 현상은 석회증(예를 들어, 피부와 같은 연 조직의 칼슘 축적), Raynaud 신드롬, 식도 운동장애, 손발가락 경화증(손가락의 피부경화증) 및 실핏줄확장(거미모양 정맥)이다.
피부경화증의 발생은 자가항체의 존재, 특히 항-중심체(anti-centromere) 항체 또는 항-scl 70/항-토포이성질화효소(anti-topoisomerase) 항체의 존재와 관련이 있다. 질병 개체의 90%까지에 있어 검출 가능한 항-핵 항체를 가지고 있다. 항-중심체 항체는 전신 형태(10%)에서 보다 국소 형태(80-90%)에서 더 일반적이며, 항-scl70는 아프리카계 미국인 환자 및 광범위 형태(30-40%)에서 더 일반적이다.
따라서, 본 발명에서 제공된 상기 치료 방법에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포의 투여는 피부경화증의 하나 이상의 증상의 발생을 억제하거나, 그 심각성을 줄이거나, 또는 질병이 진전되는 것이 줄어들게 한다. 일 태양에서, 상기 피부경화증은 국소 피부경화증이다. 다른 태양에서, 상기 피부 경화증은 광범위(diffuse) 피부 경화증이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 증상은 얼굴 피부의 경화, 손가락 피부의 경화, 레이노 증후군(Reynaud's syndrome), 팔다리(extremity)의 부적절한 혈관 수축, 석회증, 모세혈관 확장(telangiectasia), 또는 식도 운동 장애(dysmotility) 중 하나 이상이다. 다른 구체적 태양에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포의 투여는 개체의 혈액 밀리리터에서 하나 이상의 항-핵(nuclear) 항체, 예를 들어, 항중심체(anti-centromere) 항체 또는 항-토포이성질화효소(anti-topoisomerase) 항체의 양 또는 농도를 검출 가능한 정도로 감소시킨다.
다른 태양에서, 본 발명에서 제공된 치료 방법은 제2치료제 또는 치료 성분을 투여하는 것을 포함하며, 상기 제2치료제 또는 치료 성분은 항염증제, 예를 들어, 스테로이드성 항-염증 약물, 또는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 아세트아미노펜, 나프록센, 이부프로펜, 아세틸살리실릭 산, 및 이와 유사한 것이다. NSAID가 투여되는 더 구체적 태양에서, 프로톤 펌프 억제제(PPI), 예를 들어, 오메프라졸이 또한 투여된다. 다른 태양에서, 상기 제2치료제는 마이코페놀레이트 모페틸, 사이클로포스파미드 또는 메토트렉세이트와 같은 면역억제 화합물이다. 다른 태양에서, 상기 질병 개체가 원위성(digital) 궤양 및 폐 고혈압이 있는 경우, 프로스타사이클린(iloprost)와 같은 혈관확장제가 투여된다.
다른 태양에서, 상기 제2치료제는 두 번째 타입의 세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포, 예를 들어, CD34+ 조혈 줄기세포의 약 105 cells/kg 내지 약 109 cells/kg 중 하나 이상의 투여량이다. 특정 태양에서, 상기 두 번째 타입의 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 예를 들어, 골수-유래 중간엽 줄기세포이다. 상기 두 번째 타입의 줄기세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포는 예를 들어, 약 100:1, 75:1, 50:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100과 같은 비율로 태반 줄기세포와 함께 투여될 수 있다. 그러한 중간엽 줄기세포는 예를 들어, 골수, 골수 흡출물(aspirate), 지방 조직 및 이와 유사한 것과 같은 고유의 제공원으로부터 상업적으로 얻을 수 있다.
피부경화증 또는 피부경화증의 증상의 치료에 적합한 상기 치료 성분의 어떠한 조합들도 투여될 수 있다. 그러한 치료 성분들은 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포와 조합하여, 동시에 또는 다른 치료 경로로 투여될 수 있다.
태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포는 약학 조성물, 예를 들어, 정맥, 근육내 또는 복강 내 주사에 적합한 약학 조성물의 형태로 피부경화증으로 고통받는 개체에게 투여될 수 있다.
6.12 건선의 치료
다른 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지를 투여하는 것을 포함하는, 건선이 있는, 또는 건선의 증상을 경험하는, 또는 건선이 발생할 위험성이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료학적으로 유효한 양은 건선의 하나 이상의 증상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, 건선의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄이거나, 또는 건선의 진전을 감소시키기에 충분한 양이다.
건선은 피부 및 관절에 영향을 미치는 질환이며, 주로 피부 위에 나타나는 건선성 플라크라 불리우는 붉은 비늘 모양의 반점(patch)을 형성한다. 건선 반점은 염증 및 과도한 피부 생성 영역이다. 피부는 빠르게 이러한 영역에 축적하며 은백색 외관을 띤다. 플라크는 주로 팔꿈치 및 무릎의 피부에 발생하지만, 두피 및 생식기를 포함하는 어떠한 영역에도 영향을 미칠 수 있다. 건선은 면역-기인인 것으로 추측된다.
건선의 몇몇 다른 타입은 다음과 같이 구분된다:
플라크 건선(심상성 건선(psoriasis vulgaris))은 가장 일반적인 건선의 형태이며, 일반적으로 플라크로 명명되는 은백색 비늘모양 피부로 덮여있는 염증 피부의 돌출(raised) 영역으로 나타난다.
굴곡성(flexural) 건선(역위 건선(inverse psoriasis))은 피부 주름, 예를 들어, 생식기 주위(넓적다리 및 샅 사이), 겨드랑이, 과체중자 위 아래, 유방 아래와 같은 피부 주름에서 발생하는 피부의 민무늬 염증 반점(smooth inflamed patch)으로 나타난다.
물방울모양(guttate) 건선은 몸통, 수족 및 두피와 같은 신체의 많은 영역에서 나타나는 수많은 작은 타원형(눈물방물-모양) 반점(spot)으로 나타난다. 물방울모양 건선은 스트렙토코쿠스 식도 감염과 관련이 있다.
농포성(pustular) 건선은 비-감염 농 (농포)으로 채워진 돌출된 융기(bump) 형태로 나타난다. 농포성 건선은 국소적으로 위치할 수 있고, 이 경우 일반적으로 손 및 발에 위치하며(손발박닥 농포증), 또는 신체의 어떠한 부위에도 무작위적으로 발생하는 넓게 퍼진 패취(patch) 형태로 전신적일 수 있다.
손발톱 건선은 손톱 및 발톱의 외형에 다양한 변형을 형성하며, 이러한 변형은 손발톱판 아래의 변색, 손발톱의 오목(pitting), 손발톱을 가로지르는 라인 형성, 손발톱 아래 피부의 비후, 및 손발톱의 이완(손발톱박리증) 및 손발톱 균열을 포함한다.
건선성 관절염은 관절 및 연결 조직 염증을 포함하며, 예를 들어, 손가락과 발가락 관절의 염증이고, 이것은 손발가락염으로 알려진 손가락과 발가락의 소세지-모양 팽윤을 야기한다. 건선성 관절염은 또한 히프, 무릎 및 척추(척추염)에 영향을 미칠 수 있다.
홍색피부성(erythrodermic) 건선은 신체 표변의 대부분 위 피부의 넓게 퍼진 염증과 탈락(exfoliation)으로 나타난다. 그것은 심각한 가려움, 팽윤 및 통증이 수반될 수 있다. 그것은 종종 불안정한 플라크 건선의 악화의 결과이며, 특히 전신적 치료의 갑작스런 중단 후에 발생한다. 이러한 형태의 건선은 치명적일 수 있으며, 심각한 염증 및 탈락이 체온을 조절하는 신체 능력을 저해하고, 피부는 장벽 기능을 잃게 된다.
일 태양에서, 본 발명은 건선 개체에게 유효한 투여량의 태반 줄기세포를 투여하는 것을 제공하며, 상기 유효한 양은 예를 들어, 위에서 열거된 건선의 증상들의 하나 이상에서 검출 가능한 개선을 야기하거나, 증상들의 심각성을 줄이거나, 또는 증상들의 진전을 줄이기에 충분한 태반 줄기세포의 양이다.
건선의 심각성은 예를 들어, Psoriasis Area Severity Index (PASI)로 평가될 수 있다. PASI는 병변의 심각성의 평가와 영향받는 면적을 합쳐 0 (질병 아님)부터 72(최대 질병)까지의 단일 스코어로 나타낸 것이다.
PASI를 계산하기 위하여, 신체는 다음의 4부분으로 나뉘어진다: 다리, 몸통(트렁크 영역(위, 가슴, 등(back), 등); 팔; 및 머리. 이 영역들의 각각은 그 자체로 스코어 매겨지고, 그 후 4가지 스코어는 최종 PASI로 합쳐진다. 각 섹션에서, 건선으로 고통받는 피부의 영역의 퍼센트가 측정되고, 그 후 다음과 같은 0 내지 6의 등급으로 전환된다:
관여 영역 퍼센트 등급
0 0
< 10 1
10-29% 2
30-49 3
50-69 4
70-89 5
90-100 6
심각성은 4개의 다른 파라미터에 의해, 0 내지 4의 등급으로 평가되며, 4가지 파라미터는 가려움, 홍반 (붉어짐), 비늘벗음(scaling) 및 굵어짐(thickness)이다. 4가지 심각성 파라미터의 합계는 그 후 피부의 각 섹션(부분)에 대해 계산되고, 그 면적의 면적 스코어에 의해 곱해지며, 각 섹션의 중량에 의해 곱해진다(머리 0.1, 팔 0.2, 몸통 0.3 및 다리 0.4). 예: (Ibody+Ebody+Sbody+Tbody) x Abody x 0.3 = Totalbody. 마지막으로, 총 PASI는 4개 피부 섹션 모두에 대한 PASI 합으로 계산된다.
심각성의 정도는 또한 건선으로 고통받는 개체를 사진 찍고, 건선 병변에 의해 덮여진 신체 면적 퍼센트를 컴퓨터로 계산하여 평가할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 제공되는 상기 방법의 특정 태양에서, 건선은 플라크 건선(심상성 건선(psoriasis vulgaris)), 굴곡성(flexural) 건선(역위 건선(inverse psoriasis)), 물방울모양(guttate) 건선, 농포성(pustular) 건선, 손발톱 건선, 건선성 관절염 또는 홍색피부성(erythrodermic) 건선이다. 상기 방법의 특정 태양에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지의 치료학적으로 유효한 양은 건선의 하나 이상의 증상에 있어 개선을 야기하거나, 증상의 개시를 지연시키거나, 또는 증상의 진전을 약화시키기에 충분한 양이며, 상기 하나 이상의 증상은 피부의 비늘벗음, 피부의 붉어짐, 피부의 비후, 플라크 형성, 손발톱판 아래의 변색, 손발톱의 오목(pitting), 손발톱을 가로지르는 라인 형성, 손발톱 아래 피부의 비후, 손발톱박리증, 농포의 발생, 관절 또는 연결 조직 염증, 피부의 염증, 피부의 탈락(exfoliation)이다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지의 치료학적으로 유효한 양은 Psoriasis Area Severity Index에서 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 더 많은 포인트 감소를 야기하기에 충분한 양이다.
다른 태양에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지의 치료학적으로 유효한 양은 제2치료제와 함께 투여된다. 제2치료제는 국소적용, 예를 들어, 크림 또는 연고일 수 있으며, 이들은 코르티코스테로이드(예를 들어, 데스옥시메타신), 비타민 D3 유사체(예를 들어, 칼시포트리올(calcipotriol)), 안트랄린(anthralin), 아르간 오일, 레티노이드 또는 코울 타르 중 하나 이상을 포함한다. 다른 특정 태양에서, 제2치료제는 하나 이상의 자외선, 예를 들어, 파장 약 280 nm 내지 315 nm, 특히 약 311 nm 내지 약 312 nm의 UVB에의 노출, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20분 중 하나 이상의 노출을 포함한다. 다른 특정 태양에서, 제2치료제는 UVA 노출과 함께 프소랄렌(psoralen)의 국소 투여를 포함한다. 다른 특정 태양에서, 제2치료제는 메토트렉세이트(methotrexate), 사이클로스포린, 레티노이드, 티오구아닌(tioguanine), 하이드록시우레아, 설파살라진, 마이코페노레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 아자티오프린(azathioprine), 경구 타크로리무스 및/또는 푸마릭 산 에스테르(fumaric acid ester)의 하나 이상의 하나 이상의 전신 투여를 포함한다.
6.13 홍반성 루푸스의 치료
다른 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지를 투여하는 것을 포함하는, 홍반성 루푸스(LE)가 있는, 또는 홍반성 루푸스의 증상을 경험하는, 또는 홍반성 루푸스가 발생할 위험성이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료학적으로 유효한 양은 홍반성 루푸스의 하나 이상의 증상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, 홍반성 루푸스의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄일 정도로 충분하거나, 또는 LE의 진전을 감소시키기에 충분한 양이다.
LE의 증상은 다양하며, 상기 질병은 다른 개체마다 다르게 진행될 수 있다. 증상은 피부 증상(예를 들어, 빰 발진(나비모양 발진(butterfly rash)으로도 불림), 원반 모양 루푸스(피부 위의 두껍고, 붉은 비늘모양의 패취), 탈모증, 구강, 비강 및 질 궤양, 및/또는 피부 병변(lesions on the skin)); 근골격 증상(예를 들어, 관절 통증); 조혈계통 증상(예를 들어, 빈혈 및 철 결핍, 정상보다 낮은 혈소판 및 백혈구 수, 항인지질 항체 신드롬(환자 혈청 내에 인지질에 대한 자가항체가 존재하는 혈전관련 장애), 및/또는 혈액 내 항카르디오리핀(anticardiolipin) 항체의 존재); 심장 증상(예를 들어, 심막염, 심근염, 및/또는 심장내막염); 폐 증상(예를 들어, 폐 및/또는 흉막 염증, 흉막염(pleuritis), 흉막 삼출, 루푸스 폐렴, 만성 광범위 간질성 폐 질환(diffuse interstitial lung disease), 폐 고혈압, 폐 색전, 및/또는 폐 출혈); 간 증상(예를 들어, 자가면역 간염; 황달; 혈류 내 항핵 항체(antinuclear antibody)(ANA), 평활근 항체(SMA), 간/신장 마이크로솜 항체(LKM-1) 및/또는 항-미토콘드리아 항체(AMA)의 존재); 신 증상(예를 들어, 무통증 혈뇨 또는 단백뇨, 루푸스 신염, 신 부전, 및/또는 "wire loop" 이상이 있는 막 사구체신염의 발생); 신경병적 증상(예를 들어, 발작, 정신병, 뇌척수액 내 이상); T-세포 이상(예를 들어, CD45 포스파타제 결핍 및/또는 CD40 리간드의 증가된 발현); 및/또는 비특이적 증상들(예를 들어, 루푸스 위장염, 루푸스 췌장염, 루푸스 방광염, 자가면역 내 귀 질환(autoimmune inner ear disease), 부교감신경계 장애, 망막 맥관염, 전신성 맥관염, FcεRIγ의 증가된 발현, T 세포 내 증가하고 유지되는 칼슘 레벨, 혈액 내 이노시톨 트리포스페이트의 증가, 단백질 키나제 C 인산화의 감소, Ras-MAP 키나제 신호전달(signaling)의 감소, 및/또는 단백질 키나제 A I 활성의 결핍)을 포함할 수 있다.
따라서, 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포, 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지의 치료학적으로 유효한 양은 LE의 증상의 하나 이상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, LE의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄이기에 충분하거나, 또는 LE의 하나 이상의 증상의 악화를 줄이기에 충분한 양이며, 여기에서 상기 하나 이상의 증상은 LE의 피부, 조혈, 근골격, 신경병적, 신장, 간, 또는 T-세포 증상 중 하나 이상을 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 치료적으로 유효한 양은 LE의 증상의 하나 이상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, LE의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄이기에 충분하거나, 또는 LE의 하나 이상의 증상의 악화를 줄이기에 충분한 양이며, 여기에서 상기 하나 이상의 증상은 빰 발진, 나비모양 발진(butterfly rash), 원반 모양 루푸스, 탈모증, 구강, 비강 및 질 궤양, 피부 병변(lesions on the skin), 관절 통증 빈혈 및/또는 철 결핍, 정상 보다 낮은 혈소판 및 백혈구 수, 항인지질 항체 신드롬, 혈액 내 항카르디오리핀(anticardiolipin) 항체의 존재, 심막염, 심근염, 심장내막염, 폐 및/또는 흉막 염증, 흉막염(pleuritis), 흉막 삼출, 루푸스 폐렴, 만성 광범위 간질성 폐 질환(diffuse interstitial lung disease), 폐 고혈압, 폐 색전, 폐 출혈, 자가면역 간염; 황달; 혈류 내 항핵 항체(antinuclear antibody)(ANA), 평활근 항체(SMA), 간/신장 마이크로솜 항체(LKM-1) 및/또는 항-미토콘드리아 항체(AMA)의 존재, 무통증 혈뇨 또는 단백뇨, 루푸스 신염, 신 부전, 및/또는 "wire loop" 이상이 있는 막 사구체신염의 발생; 신경병적 증상(예를 들어, 발작, 정신병, 뇌척수액 내 이상); T-세포 이상(예를 들어, CD45 포스파타제 결핍 및/또는 CD40 리간드의 증가된 발현); 및/또는 비특이적 증상들(예를 들어, 루푸스 위장염, 루푸스 췌장염, 루푸스 방광염, 자가면역 내 귀 질환(autoimmune inner ear disease), 부교감신경계 장애, 망막 맥관염, 전신성 맥관염, FcεRIγ의 증가된 발현, T 세포 내 증가하고 유지되는 칼슘 레벨, 혈액 내 이노시톨 트리포스페이트의 증가, 단백질 키나제 C 인산화의 감소, Ras-MAP 키나제 신호전달(signaling)의 감소, 및/또는 단백질 키나제 A I 활성의 결핍을 포함한다.
태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포는 약학 조성물의 형태, 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 복강 내 주사에 적합한 약학 조성물의 형태로 피부경화증으로 고통받고 있는 개체에게 투여될 수 있다.
6.14 균상 식육종의 치료
다른 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지를 투여하는 것을 포함하는, 균상 식육종이 있는, 또는 균상 식육종의 증상을 경험하는, 또는 균상 식육종이 발생할 위험성이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료학적으로 유효한 양은 균상 식육종의 하나 이상의 증상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, 균상 식육종의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄일 정도로 충분하거나, 균상 식육종의 진전을 줄이기에 충분한 양이다.
균상 식육종은 피부에서 성장하는 드문 암의 부류인 피부 T-세포 림프종의 가장 일반적인 질병이다. T 세포가 피부뿐만 아니라 말초 혈액에도 영향을 미치는 더욱 드문 형태인 Sezary 신드롬은 균상 식육종의 모든 경우의 약 5%에서 발생한다. 균상 식육종은 일반적으로 피부 증상에 의해 정의되는 다음의 단계로 진전된다: (1) 패취 상, 이 단계에서 피부는 평평하고 붉은 색의 패취(patch), 또는 어두운 피부 개체에서는 매우 밝은 또는 매우 어두운 패취를 가지며, 이것들은 매우 가렵고, 돌출되고 단단해질 수 (플라크) 있음; (2) 피부 종양 상(phase), 여기에서 붉고 자줏빛의 도드라진 덩어리(결절)가 나타나고, 이것은 둥근지붕-모양(버섯과 같은)이거나 궤양화될 수 있음; (3) 피부 붉어짐 (홍피증) 단계, 여기에서 개체의 피부는 매우 가렵고, 비늘 모양이며 크고 붉은색의 영역이 생기고, 손바닥과 발바닥 피부가 두꺼워지고 균열이 생김; 및 (4) 림프 노드 상, 여기에서, 균상 식육종은 림프 노드에 의해 신체의 다른 부분으로 이동하기 시작하고, 이것에 염증이 생기고, 종종 암화되며, 간, 폐, 또는 골수로 퍼질 수 있음.
특정 태양에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지의 치료학적으로 유효한 양은 균상 식육종의 하나 이상의 증상에 검출 가능한 개선을 가져오기에 충분하거나, 균상 식육종의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄이기에 충분하거나, 또는 균상 식육종의 하나 이상의 증상의 악화를 줄이기에 충분한 양이며, 여기에서 상기 하나 이상의 증상은 하나 이상의 균상 식육종의 피부, 조혈계통, 근골격, 신경, 신장, 간, 또는 T-세포 증상을 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 치료학적으로 유효한 양은 균상 식육종의 하나 이상의 증상에 검출 가능한 개선을 가져오기에 충분하거나, 균상 식육종의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄이기에 충분하거나, 또는 균상 식육종의 하나 이상의 증상의 악화를 줄이기에 충분한 양이며, 여기에서 상기 하나 이상의 증상은 피부 위 가렵고 밝은 또는 어두운 반점(patch)의 발생, 피부 플라크, 피부 종양의 발생, 피부의 도드라진 융기, 붉은 비늘 모양의 가려운 곳이 신체에 발생; 손바닥과 발바닥 피부의 갈라짐; 손바닥과 발바닥 피부의 비후(thickening); 또는 림프 노드의 염증을 포함한다.
다른 태양에서, 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지의 치료학적으로 유효한 양은 제2치료제 또는 제2치료 성분과 함께 투여된다. 더 구체적 태양에서, 제2치료제 또는 치료 성분은 상기 개체의 감염 영역의 햇빛 또는 자외선 노출, 국소 스테로이드, 국소 표재 방사선요법(superficial radiotherapy), 전신 피부 전자선 치료, 홍반이 일어난 피부에 대한 유기농(Manuka) 꿀(organic honey) 적용, 또는 생물학적 치료제 중 하나 이상이다. 다른 특정 태양에서, 상기 생물학적 치료는 인터페론, 레티노이드, 렉시노이드(rexinoid), 보리노스탯(vorinostat)(예를 들어, 등록상표 ZOLINZA) 중 하나 이상의 개체 투여를 포함한다.
6.15 당뇨병의 치료
다른 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 부착성 태반 줄기세포 또는 부착성 제대 줄기세포, 또는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포에 의해 조건화된 배양 배지를 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병이 있는, 또는 당뇨병의 증상을 경험하는, 또는 당뇨병이 발생할 위험성이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료학적으로 유효한 양은 당뇨병의 하나 이상의 증상에서 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분하거나, 당뇨병의 하나 이상의 증상의 개시를 검출 가능하게 줄일 정도로 충분하거나, 또는 당뇨병의 진전을 감소시키기에 충분한 양이다. 특정 태양에서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병으로 알려진 당뇨병 타입 1, 타입 I 당뇨병, T1D, 또는 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)이다.
태반 줄기세포는 질병의 진행 동안 1회 이상의 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 줄기세포는 첫 번째 진단 후 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일, 또는 1주 내에 투여된다. 일 태양에서, 상기 치료학적으로 유효한 양의 줄기세포는 비정상적으로 높은 혈당, 글루코스 내성 시험에 의해 측정되는 인슐린 저항성의 부족, 피로 또는 의식 상실을 포함하는, 제1형 당뇨병의 증상을 역전시키거나, 증상의 심각성을 감소하거나, 또는 그렇지 않다면 개선할 수 있는 충분한 양이다.
태반 줄기세포는 졔2치료제와 함께 투여될 수 있으며, 예를 들어, 제2치료는 췌장 조직 및/또는 섬 세포의 이식; 자가 또는 동종 줄기세포 치료, 및 이와 유사한 것이다.
6.16 제2 치료용 조성물과 제2 요법
상기 치료 방법에 있어, 방법은 제2치료 조성물 또는 제2치료제의 투여를 포함한다. 위에서 언급한 특정 질병을 치료하는 방법에 있어서의 특정 제2치료 화합물 또는 제2치료제의 언급은 배타적이도록 의도된 것이 아니다. 예를 들어, 본 명세서에서 언급된 질병, 장애 또는 상태 중 어떠한 것은 본 명세서에서 언급된 항염증 화합물 또는 면역억제 화합물 중 어느 것으로 치료될 수 있다. 태반 줄기세포가 제2치료 성분 또는 제2 타입의 줄기세포와 투여되는 태양에서, 태반 줄기세포 및 제2치료 성분 및/또는 제2 타입 줄기세포는 동시에 또는 다른 시간에 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 투여들은 각 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 20, 30, 40, 또는 50분 이내에, 또는 각 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22시간 이내에, 또는 각 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9 또는 10일 이내에 투여될 수 있다.
특정 태양에서, 부적절한, 유독한 또는 해로운 면역 반응에 의해 야기되는, 또는 이러한 면역 반응과 관련된 질병, 장애 또는 상태의 치료는 제2 타입 줄기세포, 또는 제2 타입 줄기세포군의 투여를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 제2 타입 줄기세포는 중간엽 줄기세포이며, 예를 들어, 골수-유래 중간엽 줄기세포이다. 다른 태양에서, 제2 타입 줄기세포는 다능성(multipotent) 줄기세포, 다능성(pluripotent) 줄기세포, 전구세포(precursor cell), 조혈 줄기세포, 예를 들어, CD34+ 조혈 줄기세포, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 또는 배아 생식세포이다. 두 번째 타입의 줄기세포, 예를 들어, 중간엽 줄기세포는 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포와 어떠한 비율로도 투여될 수 있으며, 예를 들어, 약 100:1, 75:1, 50:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100의 비율로 투여될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 예를 들어, 골수, 골수 흡입물, 지방 조직, 및 이와 유사한 것과 같은 고유 공급원으로부터 또는 상업적으로 얻을 수 있다.
다른 특정 태양에서, 상기 제2치료제는 면역조절 화합물을 포함하며, 여기에서 상기 면역조절 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온; 3-(4'아미노이솔인돌린-1'-원(onw))-1-피페리딘-2,6-디온; 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온; 또는 α-(3-아미노프탈리미도(aminophthalimido)) 글루타리미드(glutarimide)이다. 더 구체적 태양에서, 상기 면역조절 화합물은 다음의 구조식을 갖는 화합물이다.
Figure 112009055146835-pct00001
여기에서, X와 Y 중 하나는 C=O, X와 Y 중 다른 하나는 C=O 또는 CH2, R2는 수소 또는 저급 알킬, 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화물, 포접화합물(clathrate), 에난티오머, 디아스테레오머, 라세메이트, 또는 이들의 입체이성체의 혼합물임.
다른 특정 태양에서, 상기 면역조절 화합물은 다음의 구조식을 가지는 화합물이다.
Figure 112009055146835-pct00002
여기에서, X와 Y 중 하나는 C=O이고, 다른 하나는 CH2 또는 C=O;
R1은 H, (C1-C8)알킬, (C3-C7)사이클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, C(O)R3, C(S)R3, C(O)OR4, (C1-C8)알킬-N(R6)2, (C1-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3', C(S)NR3R3' 또는 (C1-C8)알킬-O(CO)R5;
R2는 H, F, 벤질, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, 또는 (C2-C8)알키닐;
R3 및 R3'는 서로 독립적으로 (C1-C8)알킬, (C3-C7)사이클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, (C0-C8)알킬-N(R6)2, (C1-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, (C1-C8)알킬-O(CO)R5, 또는 C(O)OR5;
R4는 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C1-C4)알킬-OR5, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로사이클로알킬, 또는 (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴;
R5는 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, 또는 (C2-C5)헤테로아릴;
각 R6은 독립적으로 H, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C2-C5)헤테로아릴, 또는 (C0-C8)알킬-C(O)O-R5 또는 R6 그룹들은 결합하여 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 있고;
n은 0 또는 1; 및
*은 키랄-탄소 중심을 나타내고;
또는 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화물, 포접화합물(clathrate), 에난티오머, 디아스테레오머, 라세메이트, 또는 이들의 입체이성체의 혼합물임.
다른 특정 태양에서, 상기 면역조절 화합물은 다음의 구조식을 갖는 화합물이다.
Figure 112009055146835-pct00003
여기에서,
X와 Y 중 하나는 C=O이고, 다른 하나는 CH2 또는 C=O;
R은 H 또는 CH2OCOR';
(i) R1, R2, R3, 또는 R4 각각은 다른 것과 독립적으로 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알콕시 또는 (ii) R1, R2, R3, 또는 R4 중 하나는 니트로 또는 -NHR5이고, R1, R2, R3, 또는 R4 중 나머지는 수소;
R5는 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬;
R6는 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 벤조, 클로로, 또는 풀루오로;
R'는 R7-CHR10-N(R8R9);
R7은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(CnH2n)-이고, 여기서 n은 0 내지 4;
R8 및 R9 각각은 다른 것과 독립적으로 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬, 또는 R8 및 R9는 결합하여 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 또는 -CH2CH2X1CH2CH2-이고, 여기서 X1은 -O-, -S-, 또는 -NH-;
R10은 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 또는 페닐; 및
*은 키랄-탄소 중심을 나타내고;
또는 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화물, 포접화합물(clathrate), 에난티오머, 디아스테레오머, 라세메이트, 또는 이들의 입체이성체의 혼합물임.
염증성 창자병 또는 염증성 창자병의 증상의 치료에 적합한 상기 치료 성분의 어떠한 조합도 투여될 수 있다. 그러한 치료 성분들은 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포와 어떠한 조합으로, 동시에 또는 분리된 치료 경로로 투여될 수 있다.
태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포는 IBD, 예를 들어, 크론 병으로 고통받는 개체에게 약학 조성물, 예를 들어, 정맥, 근육내 또는 복강내 주사에 적합한 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 태반 줄기세포는 단회 투여로 투여될 수 있으며, 또는 다회 투여로 투여될 수 있다. 태반 줄기세포가 다회 투여로 투여될 때, 투여량은 IBD, 예를 들어 크론 병의 하나 이상의 급성 증상을 완화하도록 설계된 치료 처방의 일부일 수 있으며, 또는 상기 질병의 만성 경과의 심각성을 예방하거나, 또는 줄이도록 설계된 장기 치료 처방의 일부일 수 있다. 태반 줄기세포가 제2치료 성분 또는 제2 타입의 줄기세포와 투여되는 태양에서, 태반 줄기세포 및 제2치료 성분 및/또는 제2 타입 줄기세포는 동시에 또는 다른 시간에 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 투여들은 각 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 20, 30, 40, 또는 50분 이내에, 또는 각 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22시간 이내에, 또는 각 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9 또는 10일 이내에 투여될 수 있다.
도 1은 (A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 줄기세포에서 유래한 태반 줄기세포의 생존능(viability)을 나타낸다. X축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.
도 2는 (A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 줄기세포 중 HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+ 세포의 백분율을 FACSCalibur로 측정한 것을 나타낸다. X축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.
도 3은 (A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 줄기세포 중 HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+ 세포의 백분율 FACS Aria로 측정한 것을 나타낸다. X축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.
도 4는 태반 관류물에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.
도 5는 양막에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.
도 6은 융모막에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.
도 7은 양막-융모막판에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.
도 8은 제대에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.
도 9는 (A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 평균 발현을 나타낸다.
도 10A와 10B. 림프구 혼합 배양 반응(MLR)은 미경험(naive) 면역 반응의 모형이며 태반 줄기세포에 의하여 억제된다. "생존(live)" 게이트를 통과한 비율과 CD8+과 CD4+ T 세포 게이트를 통과한 비율로부터 저농도 카복시플루오레사인 숙신이미드 에스테르 세포(CFSElow 세포)의 백분율을 측정하였다(각각 도 10A와 10B). 이 백분율은 6일 동안의 MLR(도 10C와 10D, MLR 선) 그리고 태반 줄기세포의 부가시(도 3C와 3D, PMLR 선)에 증가하였고, 이 효과는 CD8+과 CD4+ T 세포 구역 양쪽 모두에서 역전되었다.
도 11. 양막-융모막판(AC)과 제대 버팀질(umbilical cord stroma, UC)로부터 얻은 태반 유래 줄기세포는 동종간 림프구 혼합 배양 반응(allo-MLR)을 억제한다. MLR 분석은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 또는 같은 수의 CD4+와 CD8+ T 세포를 가지고 수행하였다. 가로축: 증식 억제의 백분율
도 12는 태반 줄기세포와 제대 줄기세포가 동종간 림프구 혼합 배양 반응을 억제한다는 것을 나타낸다. 둥근 바닥 96-웰 플레이트를 이용한 6일간의 분석 결과이다. 태반 세포: T 세포: 가지상 세포(dendritic cell) = 약 1:10:1. 줄기세포는 양막-융모막(AC), 양막(AM) 또는 제대(UC)에서 얻었다. FB: 섬유모세포. BM: 골수 유래 중간엽 줄기세포.
도 13은 서로 다른 기증자 유래의 태반 줄기세포가 동종간 림프구 혼합 배양 반응을 다른 정도로 억제한다는 것을 나타낸다. 이 그림은 61665와 63450으로 표시한 태반 기증자 두 명으로부터 얻은 태반 줄기세포의 MLR 억제도를 비교한다. 63450 태반에서 얻은 줄기세포는 61665 태반에서 얻은 줄기세포보다 MLR를 더 크게 억제하는 것처럼 보인다.
도 14는 14일간 회귀 분석(regression assay)과 변형 태반 줄기세포 회귀 분석을 나타낸다. X축은 분석시 부가된 태반 줄기세포의 수를 나타낸다. 생존한 CD23+ 림프모구 유사 세포주(lymphoblastoid cell line, LCL. 인공적으로 생산된 전환 B 세포주)의 수는 Y축에 나타나 있다.
도 15는 6일간 회귀 분석에서 태반 줄기세포의 T 세포 증식 억제를 나타낸다. 카복시플루오레사인 숙신이미드 에스테르(CFSE) 염색된 T 세포를 이용하여 회귀 분석을 수행하였다. 6일 후 T 세포 증식을 평가하였다. 양막-융모막판(AC), 제대(UC), 양막(AM) 또는 골수(BM) 줄기세포의 T 세포 증식의 상대적인 억제 정도를 나타내었다.
도 16은 배양 배지 교체를 허용하는 조건에서 트랜스웰 삽입막(transwell insert)을 MLR에 도입하여 T 세포로부터 태반 세포를 분리하였을 때 억제도의 백분율 변화값을 나타낸다. MLR 당 제대 줄기세포수를 25,000, 50,000, 75,000 또는 100,000개로 하였을 때는 상대적으로 높은 수준의 억제가 이루어진다는 것과 높은 역가(titre)에서 억제를 이루기 위하여 세포 대 세포 접촉의 필요성이 상대적으로 높다는 점을 모두 보여준다.
도 17에서 12,500(UC OP/TW 12.5) 내지 100,000(UC OP/TW 100)개로 부가한 제대 버팀질 줄기세포(UC)는 MLR로부터 막(TW)에 의하여 분리되거나 또는 MLR과 접 촉 상태(OP)에 있었다. CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 같은 수로 사용하였고, MLR 억제도의 백분율(CFSElow 89%)을 계산하였다.
도 18은 태반 줄기세포 용량과 세포 대 세포 접촉 의존성은 선형 관계가 아니라는 것을 나타낸다. 삽입막 도입시 MLR 억제의 변화는 도 17에 나타낸 값으로부터 계산하였다.
도 19는 태반 줄기세포와 BMSC가 T 세포 반응을 차별적으로 억제하는 것을 나타낸다. PDAC 또는 BMSC에 의한 억제도는 MLR에서 CFSElow 게이트를 통과한, 70%를 넘는 수의 T 세포 백분율과 부착 세포 MLR를 비교하여 계산하였다. 이 MLR은 부착세포로부터 분리되어 수행되거나(트랜스웰) 또는 개방형 웰(open)에서 수행되었다. X축은 500,000개의 T 세포와 50,000개의 가지상 세포에 더해진 부착세포의 수를 1000 단위로 나타낸다. 부착세포와 T 세포의 비율은 1:5 내지 1:40이다.
도 20은 태반 줄기세포와 골수 유래 줄기세포에 의한 면역 억제에 있어서 세포 대 세포 접촉 조건의 차이를 나타낸다. 도 15에 나타낸 억제 데이터로부터 접촉 의존도를 계산하여 부착세포/T 세포 비(n=2인 UC를 제외하고 n=3)에 대하여 표시하였다.
도 21은 T 조절세포는 PDAC T 세포 억제에 필요하지 않다는 것을 나타낸다. 회귀 분석은 온전한 PBMC 또는 T 조절세포가 고갈된 PBMC에 대하여 수행하였는데, 두 경우 모두 CFSE 염색을 하였고, 몇몇 조건에서는 UC PDAC를 부가하였다. N=1.
도 22는 보조 MLR에서 CFSEhi 세포는 증식한다. CFSE 염색한 PDAC MLR을 통하여 상기 CFSEhi 세포fmf FACS Aria로 분리하였다. 이 세포를 MLR에서 이용하였다. N=1.
도 23은 줄기세포 MLR의 상층액이 75% 교체율에서 MLR을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다. UC(PUC), AC(PAC)와 BMSC(PBM) MLR을 수행하였고, 모두 MLR을 50% 넘게 억제하였다. 실험에서 얻은 상등액을 이용하여 신선한 MLR에 쓸 배지 200 μL 중 10 내지 150 μL를 대체하였다. 대조군으로서 T 세포와 AC(T/AC) 또는 T 세포와 골수 유래 줄기세포(T/BM) 공동배양액의 배지를 같은 방식(n=2)으로 이용하였다.
도 24A, 24B. 전배양한 T 세포와 부착세포는 MLR 억제에 영향을 미치지 못한다. 두 증여자로부터 얻은 T 세포를 두 차례의 독립적인 실험에 이용하였다. 숙성한 가지상 세포(A) 또는 CFSE 염색한 CD3+ T 세포(B)를 제대 줄기세포(UC) 또는 골수 유래 줄기세포와 표시한 만큼의 날짜 동안 가지상 세포(제0일, A) 또는 CFSE+ CD3+ T 세포(B, 이로써 MLR을 개시함)의 부가 전까지 같이 배양하였다. 이어서 부착세포 MLR을 6일 동안 정상적으로 진행하였다. N=2.
도 25A, 25B: A. MLR에서 MIP-1α와 MIP-1β의 분비, 그리고 태반 줄기세포 또는 골수 유래 줄기세포의 MLR은 MLR 억제와 역방향 상관 관계가 있다. B. 같은 실험의 T 세포와 자연세포독성 세포 CFSE 데이터. 상청액은 MLR로부터 도 14B와 같이 채취하였고, MIP-1α와 MIP-1β의 존부를 분석하였다. B. MLR을 상술한 대로 수행하였고, CFSElow 세포는 평균 55%(T 세포) 또는 83%(자연세포독성 세포) 수준에서 관측되었다. 줄기세포 부가시의 억제 효과를 계산하였다. N=2(자연세포독성 세포 부분은 N=1).
도 26. 변형 회귀 분석과 MLR 상청액에서, MCP-1을 측정하였다. 상기 태반 줄기세포에 의한 MLR 억제와 회귀 분석은 화학주성 물질(chemoattractant) MCP-1의 분비와 상관 관계가 있다. AC: 양막-융모막판에서 얻은 줄기세포. UC: 제대에서 얻은 줄기세포. 옅은 색 막대: MLR 분석법 결과. 짙은 색 막대: 회귀 분석 결과. Y축: 분석 용액 속 MCP-1(pg).
도 27은 변형 MLR과 회귀 분석 시험의 상청액 속 IL-6 측정 결과를 나타낸다. 상기 태반 줄기세포에 의한 MLR 억제와 회귀 분석은 IL-6 분비와 상관 관계를 가진다. AC: 양막-융모막판에서 얻은 줄기세포. UC: 제대에서 얻은 줄기세포. 옅은 색 막대: MLR 분석법 결과. 짙은 색 막대: 회귀 분석 결과. Y축: 분석 용액 속 IL-6의 pg.
실시예 1: 부착성 태반 줄기세포의 분리
이 실시예에서는 부착성 태반 줄기세포를 수집하고 분리하는 것을 설명한다.
실험 재료와 방법, 태반 증여자는 사설 제대혈 은행의 회원인 산모로부터 모집하였는데, 이들은 충분한 정보를 얻은 후에 제대혈 수집 후 연구 용도로 실혈한 태반을 사용하는 것에 대하여 허락하였다. 태반 증여자들은 냉동 보존을 위한 자 신의 제대혈 시료의 정상적인 처리 과정에서 생기는 블라인드화(blinded) 데이터를 사용하는 것도 허락하였다. 이로써 수집한 제대혈과 아래 기술하는 이 실험 방법에 따라 얻은 유출 관류물을 비교할 수 있게 되었다.
탯줄과 태반의 실혈 후 이 태반을 실온의 멸균, 단열 용기에 넣고 출산 4시간 이내에 실험실로 옮겼다. 태반은 검사하였을 때 태반이 조각났거나, 제대 혈관의 찢김 등의 손상이 있으면 폐기하였다. 태반은 멸균 용기 속에서 2~20시간 동안 실온(23±2℃)에 두거나 냉장(4℃)하였다. 이 태반을 주기적으로 25±3℃의 멸균 식염수 속에 담그고 세척하여 눈에 보이는 표면 혈액이나 장기 조각을 없앴다. 탯줄을 그 태반 삽입부로부터 약 5 cm 지점에서 가로 절단하고 제대 혈관에 멸균 도관(sterile fluid path)에 연결된 테플론 또는 폴리프로필렌 카테터를 삽관하여 태반을 쌍방향으로 관류할 수 있게 하고 스며 나온 유체를 수집할 수 있게 하였다. 여기서 사용된 시스템은 조건화, 관류, 스며 나온 유체 수집의 모든 측면을 통제된 주변 분위기와 조건 하에서 할 수 있게 하여 주었을 뿐 아니라, 혈관내 압력과 유속, 혈관 내부(core)와 관류물의 온도 및 회수한 스며나온 유체의 양을 실시간으로 감시할 수 있게 해 주었다. 분만 후 24시간 동안의 기간에 걸쳐 여러 가지 조건화 실험법들을 평가하였고, 스며나온 유체 속 세포 조성을 흐름 세포 측정, 광학 현미경과 콜로니 형성 단위 분석으로 분석하였다.
태반의 조건화( Placental Conditioning ). 태반 줄기세포를 증식시키고 소집(recruitment)하기에 생리적으로 적합한 환경을 모사(模寫)하고 유지하기 위하여 태반을 다양한 조건에서 유지하였다. 삽관(cannula)을 2 단위/mL 헤파린(미국 뉴저 지주 EJkins-Sinn)과 2 mM EDTA를 함유한 IMDM 무혈청 배지(미국 뉴욕주 GibcoBRL)로 분출 세척(flushing)하였다. 태반 관류는 관류물 약 150 mL를 모을 때까지 분당 50 mL의 속도로 계속하였다. 이 관류물을 "초기 분획(early fraction)"이라고 표시하였다. 같은 속도로 태반을 계속 관류하자 약 150 mL의 두번째 분획을 얻었는데 이를 "후기 분획(late fraction)"이라고 표시하였다. 이 과정 중에 태반을 부드럽게 마사지하여 관류와 세포 재료의 회수를 도왔다. 스며나온 유체를 관류 회로로 수집하는 데는 동맥 삽관을 통한 중력 배수(gravity drainage)와 흡입을 모두 사용하였다.
태반을 부모 동의서를 받은 다음 제대혈과 함께 분만실에서 얻은 다음 분만 12~24시간 내에 실온에서 처리하였다. 처리 전에 태반의 막을 제거하고 모체 쪽을 씻어 남아 있는 피를 없앴다. 제대 혈관은 혈액 시료 채취를 위하여 쓰이는 20 게이지 버터플라이 바늘로 만든 카테터로 삽관하였다. 이어서 태반을 헤파린 처리(mL 당 2단위)한 Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM)로 분당 15 mL 속도로 10분 동안 관류하고, 그 관류물을 한 시간 내에 모체 쪽으로부터 수집하고 유핵 세포 수를 세었다. 수집한 유핵 세포의 수가 마이크로리터 당 100 아래로 떨어질 때까지 태반 관류와 그를 위한 수집 방법을 한두 차례 반복하였다. 이 관류물들을 모으고 가벼운 원심분리로 파편이나 혈소판, 탈핵 세포막을 제거하였다. 유핵 세포를 이이서 피콜 하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리로 분리하고, 이를 세척한 다음 HDMEM 속에 재현탁하였다. 부착성 세포를 분리하기 위하여, 5~10×106 개의 세포를 담은 분액을 여러 개의 T-75 플라스크에 각각 나누어 담고 세포를 BioWhittaker사에서 입수한, 시판되는 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSCGM) 속에서 배양하면서 조직 배양기(37℃, 5% CO2) 속에 놓아 두었다. 10~15일 후 PBS 세척으로 상기 비부착 세포를 제거하고, PBS를 MSCGM으로 대체한다. 플라스크를 날마다 점검하여 다양한 부착 세포 유형을 확인하는데, 특히, 섬유모세포 유형의 세포를 확인하고 세포군의 증폭 여부를 점검한다.
세포 회수와 분리. 세포는 200×g로 15분 동안 실온에서 원심분리하여 관류물로부터 회수한다. 이렇게 함으로써 세포로부터 불순물 파편과 혈소판을 떼어낼 수 있다. 이 세포 펠렛을 2 단위/mL 헤파린과 2 mM EDTA를 함유한 IMDM 무혈청 배지(미국 뉴욕주 GibcoBRL) 속에 재현탁한다. 그 단핵 세포 총분획은 Lymphoprep(노르웨이 오슬로 Nicomed Pharma사의 상표) 등으로 제조사의 권장 방법에 따라 분리하고 그 단핵 세포 분획을 재현탁한다. 세포 수는 혈구계로 세었다. 세포 생존율은 트리판블루 배제법으로 평가하였다. 중간엽 세포는 0.2% EDTA 함유 0.05% 트립신(Sigma사)으로 차등 트립신화함으로써 분리하였다. 섬유모세포상( fibroblastoid) 세포는 플라스틱 표면에서 5분 내에 탈착하는 반면 다른 부착성 세포군들은 20~30분 넘게 배양이 필요하기 때문에 차등 트립신화 처리가 가능하다. 탈착한 섬유모세포상 세포는 트립신화 처리와 트립신 중화액(TNS, BioWhitaker사)을 이용한 트립신 중화 처리 후 수확하였다. 이 세포를 HDMEM으로 세척하고 MSCGM 속에 현탁하였다. 이 세포들의 흐름 세포 측정은 Becton-Dickenson사 FACSCalibur 장비와 FITC 및 PE 표지 단일 클론 항체를 이용하여 수행하였는데, 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC)의 공지 표지를 기준으로 선별하였고, CD10, CD34, CD44, CD45와 CD90에 대한 항체가 여기에 포함되었다. 항체는 Becton-Dickinson과 Caltag Laboratories사(미국 캘리포니아주 South San Francisco)에서 구입하였고, SH2, SH3과 SH4 항체 생산용 하이브리도마는 AM. Cul.에서 입수하였다. 배양 상층액 속 항체의 반응성은 FITC나 PE로 표지한 F(ab)'2 염소 항마우스 항체로 검출하였다. 세포 계통 분화는 시중에서 입수할 수 있는 분화 유도와 유지용 배양 배지(BioWhittaker사)를 제조사의 설명에 따라 써서 이룰 수 있었다.
태반 줄기세포의 분리. 상기 배양 플라스크 속의 부착성 세포를 현미경 관찰하자 형태적으로 상이한 세포 유형을 볼 수 있었는데, 방추(spindle) 모양 세포, 큰 핵과 수많은 핵주강(核周腔 perinuclear space) 속 액포를 가진 둥근 세포, 여러 개의 돌기를 가지고 있고, 그 중 하나를 통하여 플라스크에 부착하고 있는 별 모양 세포를 비롯한 세포들이 있었다. 이 유형의 부착성 세포의 특성을 더 파악하려는 시도는 유사한 비(非)줄기세포들을 골수, 제대와 말초 혈액의 배양에서도 볼 수 있었기 때문에 더 하지 않았다. 그러나 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC)와 모양이 비슷하고 세포 덩이(cluster) 모습으로 관찰되는 섬유모세포상 세포는 차등 트립신화 처리와 2차 플라스크 속의 계대 배양(subculture)으로 분리하였다. 트립신 처리 후에 모양이 둥글어 보인 이 세포들을 위상차 현미경으로 관찰하자 세포가 고도로 육아(肉芽 granulation) 모양이고 실험실에서 얻거나 BioWhittaker 등의 상 업적인 입수처에서 얻는 골수 유래 MSC와 유사하게 나타났다.
계대 배양하자 이 부착성 태반 세포는 그 초기 상태와는 달리 몇 시간 내에 부착하였고 그 특징적인 섬유모세포상 형태를 취하였으며 비교 대상 골수 유래 MSC와 성장 양상이 유사하였다. 더욱이 계대 배양과 배지 교체 도중에 느슨하게 부착하고 있던 단핵 세포들은 씻기어 나갔고, 세포 배양물은 균질적이고 눈에 띠는 비섬유모세포상 세포의 불순물이 없는 상태를 유지하였다.
이어지는 실험에서 서로 다른 관류 실험에서 얻은 이들 부착성 세포의 세포 표면 표지 표현형 혹은 OCT-4의 경우에는 그 유전자 발현 표현형의 특성을 분석하였다. 이 실험 결과는 아래 표 3에 정리하였다.
개개의 관류물 실험에서 얻은 태반 줄기세포 (PLSC) 의 특성 분석.
Figure 112009055146835-pct00004
+: 흐름 세포 측정법으로 검출하였거나, OCT-4에 대해서는 RT-PCR로 유전자 발현 검출.
-: 미검출.
공란: 표지의 존재를 시험하지 않음.
FTE: 세포 증폭 실패.
D-5%FCS: DMEM-5% FCS.
BWtoA: BW 배지에서 Anthro-1 배지로 옮김.
실시예 2: 태반 줄기세포의 배양
분만 후의 포유류 태반으로부터 관류 혹은 효소 소화 등의 물리적 파괴에 의하여 태반 줄기세포를 얻을 수 있다. 이 세포를 60% DMEM-LG(Gibco), 40% MCDB-201(Sigma), 2% 소 태아 혈청(FCS) (Hyclone Laboratories), 1×인슐린-트랜스페린-셀렌(ITS), 1×리놀렌산-소 혈청 알부민(LA-BSA), 10-9 M 덱사메타손(Sigma), 10-4 M 아스코르브산 2-인산(Sigma), 표피 성장 인자(EGF) 10 ng/mL(R&D Systems), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-BB) lO ng/mL(R&D Systems)과 1OO 단위 penicillin/100O 단위 스트렙토마이신을 함유하는 배양 배지 속에서 배양한다.
이 세포들이 배양되는 배양 플라스크는 다음과 같이 마련할 수 있다. 피브로넥틴(FN) 피복 T75 플라스크는 5 ng/mL 사람 피브로넥틴(Sigma F0895)을 함유하는 PBS 5 mL를 이 플라스크에 가하여 마련할 수 있다. 이 피브로넥틴 용액을 담은 플라스크를 37℃에서 30 분 동안 방치한다. 이어서 세포 배양 전 이 피브로넥틴 용액을 덜어낸다. 이러한 처리 이후 플라스크를 건조할 필요는 없다. 혹은 이 플라스크를 4℃에서 하룻밤 동안 또는 더 오랜 동안 피브로넥틴 용액과 접촉시킬 수 있다. 세포 배양 전 이 플라스크를 덥히고 피브로넥틴 용액을 덜어낸다.
관류에 의한 태반 줄기세포의 분리
태반 관류물로부터 태반 줄기세포 배양을 확립하는 절차는 다음과 같다. 피콜 농도구배에서 얻은 세포를 상기와 같이 하여 얻은 피브로넥틴 피복 T75 플라스크에 플라스크 당 50~100×106 개 세포를 15 mL 배양 배지 속에 담아 파종한다. 5개에서 10 개의 플라스크가 필요한 것이 전형적인 경우이다. 이 플라스크를 12~18 시간 동안 37℃에서 배양하여 세포가 부착하도록 한다. 따뜻한 PBS 10 mL를 각 플라스크에 가하여 세포를 현탁하여 제거하고 천천히 섞어 준다. 이 배지 15 mL를 덜어낸 다음 새 배양 배지 15 mL를 가한다. 배지 전부를 배양 시작 후 3~4일 후에 갈아준다. 그 다음 배지 교체에서는 배지의 50% 또는 7.5 mL를 꺼내어 갈아준다.
대략 제12일째에 이 세포 배양액을 현미경으로 확인하여 부착 세포 콜로니가 성장했는지 점검한다. 세포 배양이 약 80% 세포 합류 수준, 전형적으로는 배양 시작 후 제13일 내지 제18일째에 이르면 부착 세포를 트립신 소화에 의하여 수확한다. 이 1차 배양으로부터 수확한 세포를 제0 계대로 일컫는다.
물리적 파괴와 효소 소화에 의한 태반 줄기세포의 분리
소화된 태반 조직으로부터 태반 줄기세포 배양을 확립하는 절차는 아래와 같다. 관류된 태반을 무균 종이 시트 위에 모체 쪽을 위로 하여 올려 놓는다. 모체 쪽 태반 표면층의 약 0.5 cm를 칼날로 제거하고, 그 칼날을 이용하여 대략 1×2×1 cm 크기의 태반 조직 절편을 떼어낸다. 이 태반 조직을 다시 잘게 썰어 약 1 ㎣ 크기 조각으로 나눈다. 이들 조각을 50 mL 팔콘(Falcon) 튜브에 모으고 콜라겐 분해 효소 IA(2 mg/ml, Sigma)로 30분 동안 소화한 다음 트립신-EDTA (0.25%, GIBCO BRL)로 37℃ 물 중탕에서 10분 동안 처리한다. 이렇게 얻은 용액을 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리하여 효소 소화 용액을 덜어낸다. 이 펠렛으로부터 약 10 부피의 PBS 현탁액(예를 들어 5 mL 펠렛은 45 mL PBS에 현탁하게 된다)을 얻은 다음, 이 튜브를 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리한다. 이 조직/세포 펠렛을 130 mL의 배양 배지 속에 재현탁한 다음, 피브로넥틴 피복 T75 플라스크마다 13 mL의 세포를 파종한다. 세포를 37℃의 5% 이산화탄소 농도 가습 공기 속에서 배양한다. 이 단계에서는 선택적으로 태반 줄기세포를 냉동보존할 수 있다.
태반 줄기세포의 계대 배양( subculturing )과 증폭( expansion )
37℃ 물 중탕으로 냉동보존된 세포를 급히 해동한다. 따뜻한 배지 10 mL로 냉동 비알로부터 태반 줄기세포를 곧바로 꺼내어 15 mL 짜리 무균 튜브로 옮긴다. 이 세포를 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리한다. 이 세포를 피펫을 통하여 10 mL의 따뜻한 배지 속에 조심스레 현탁하고, 트리판블루 배제 실험으로 생존능이 있는 세포 수를 센다. 상술한 대로 준비한 피브로넥틴 피복 플라스크에 6000~7000 세포/㎠의 비율(T-75 플라스크 당 약 5×105 세포)로 세포를 파종한다. 이 세포를 37℃로 5% 이산화탄소와 90% 습도 하에서 배양한다. 세포가 75~85% 세포합류 수준에 이르르면 사용된 배지 전부를 플라스크에서 무균 제거한 다음 버린다. 0.25% 트립신/EDTA(w/v) 용액 3 mL를 가하여 세포층을 덮고, 이 세포를 5분 동안 37℃, 5% 이산화탄소와 90% 습도 하에서 배양한다. 이 플라스크를 한 두 차례 가볍게 건드려 세포 탈착을 돕는다. 95%를 넘는 수의 세포가 탈착하고 구형이 되면, 각 T-75 플라스크에 따뜻한 배양 배지 7 mL를 가하고 이 용액을 세포층 표면에 몇 차례 피펫질하여 분산시킨다.
상술한 것처럼 세포 수를 세고 생존능을 측정한 다음, 이 세포를 분당 회전수 1000으로 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 하나의 T-75 플라스크에서 나온 세포 펠렛을 배양 배지 속에 부드럽게 현탁하고 이를 두 개의 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크 표면에 골고루 나눠 편다.
상기 방법을 이용하여 CD105, CD117, CD33, CD73, CD29, CD44, CD10, CD90과 CD133을 발현하는 부착성 태반 줄기세포군들을 동정하였다. 이 세포군은 CD34 또는 CD45를 발현하지 않았다. 이 태반 줄기세포 배양 중 전부가 아닌 일부는 HLA-ABC 및/또는 HLA-DR를 발현하였다.
실시예 3: 태반 구조물로부터 태반 줄기세포의 분리
3.1 실험 재료와 방법
3.1.1 관심 대상 표현형의 분리
정상적인 만기 임신으로부터 서로 다른 다섯 종류의 태반 세포군을 얻었다. 모든 증여자는 연구 목적을 위하여 자신의 태반이 사용되는데 대하여 전적으로 서면 동의하였다. 다섯 종류의 세포군을 분석하였는데 이들은: (1) 태반 관류물(태반 혈관계를 관류하여 얻음) (2) 양막 효소 소화물 (3) 융모막 효소 소화물 (4) 양막-융모막판 효소 소화물과 (5) 효소 소화한 제대 세포에서 유래한 태반 세포였다. 이들 다양한 조직을 무균 PBS(미국 캘리포니아주 Carlsbad의 Gibco-Invitrogen Corporation)로 세척하고 무균 페트리 접시 위에 각각 올려 놓았다. 이들 조직을 무균 수술용 작은칼(scalpel)로 잘게 썬 다음 50 mL 원추형 Falcon 튜브 속에 담았다. 잘게 썬 조직을 37℃ 물 중탕 속에서 1× 콜라겐 분해 효소(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma- Aldrich)로 20분 동안 소화한 다음 원심분리하고, 0.25% 트립신-EDTA(Gibco-Invitrogen Corp)으로 37℃ 물 중탕 속에서 10분 동안 소화하였다. 다양한 이들 조직을 소화 후 원심분리하고 무균 PBS(Gibco-Invitrogen Corp)로 헹구어 주었다. 재구성한 세포를 두 차례 걸러주었는데 한 번은 100 ㎛ 세포 체(strainers)로써 한 번은 30 ㎛ 분리용 필터로 걸러 잔류 세포외 매트릭스 또는 세포 파편을 없앴다.
3.1.2 세포 생존률 평가와 세포 수 세기
수동 방식의 트리판블루 배제법을 이용하여 소화 후 세포 수와 그 생존률을 측정하였다. 세포를 트리판블루 염료(Sigma-Aldrich)와 1:1 비율로 섞은 다음 이 세포를 혈구계로 세었다.
3.1.3 세포 표면 표지( 마커 )의 특성 분석
HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+인 세포를 특성 분석을 위하여 선별하였다. 이 표현형을 갖춘 세포를 동정하고, 수를 센 다음, 두 대의 Becton-Dickinson사 흐름세포 측정 장치(flow cytometer)인 FACSCalibur와 FACS Aria(미국 캘리포니아주 산호세 Becton-Dickinson)로 특성을 분석하였다. 이들 다양한 태반 세포를 세포 1백만 개당 약 10 μL 항체의 비율로 교반기 위에서 30 분 동안 실온에서 염색하였다. 아래 나타낸 항-사람 항체를 사용하였다: 이소티오시안산플루오레사인 결합(FITC-conjugated) 단일 클론항체로서, HLA-G(미국 노스캐롤라이나주 Raleigh의 Serotec), CD1O(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Immunocytometry Systems), CD44(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Biosciences Pharmingen)와 CD105(미국 미네소타주 미니아폴리스의 R&D Systems Inc.)에 대한 항체), (피코에리드린(PE) 결합 단일클론 항체로서, CD44, CD200, CD117 및 CD13에 대한 항체(BD Biosciences Pharmingen)), (피코에리드린-CY5(PE Cy5) 결합 스트렙아비딘과 단일 클론항체로서 CD117(BD Biosciences Pharmingen)에 대한 항체), (피코에리드린-Cy7(PE Cy 7) 결합 단일클론 항체로서 CD33과 CD1O 에 대한 항체(BD Biosciences)), (알로피코시아닌(APC) 결합 스트렙아비딘과 단일클론 항체로서 CD38에 대한 것(BD Biosciences Pharmingen)), (그리고 바이오틴화 CD90 (BD Biosciences Pharmingen). 배양 후, 이 세포를 한 번 헹구어 주어 결합하지 않은 항체를 씻어내고, 하룻밤 동안 4℃에서 4% 파라포름알데히드(미국 오하이오주 클리블랜드의 USB)로 고정하였다. 다음 날, 이 세포를 두 차례 헹구어 준 다음, 30 μm 필터로 여과하였다. 이어서 세포를 흐름 세포측정 장치에 넣고 실험하였다.
항 마우스 IgG 항체(BD Biosciences Pharmingen)로 염색한 시료를 음성 대조군으로 사용하여 광전 증배관(PM tube)을 조정하였다. 항 사람 항체 하나만으로 염색한 시료는 양성 대조군으로 사용하여 스펙트럼의 겹침/보상(overlaps/compensation) 정도를 보정하였다.
3.1.4 세포 분류와 배양
한 집단의 태반 세포(관류물, 양막 또는 융모막 유래)를 7-아미노-악티노마이신 D(7AAD, BD Biosciences Pharmingen)와 관심 대상 표현형에 특이적인 단일클론 항체로 염색하였다. 이 세포를 세포 백만 개 당 항체 10 μL의 비율로 염색하고 실온에서 30분 동안 교반기 위에서 배양하였다. 이어서 BD FACS Aria를 이용하여 이들 세포 중 관심 대상 표현형을 발현하는 살아 있는 세포를 분류하고 배지에 고루 발라주었다. 분류(sorted, 관심 대상 세포군)와 "전체"(all, 분류되지 않은 세포) 태반 세포군을 배지에 발라주어 비교하였다. 세포는 피브로넥틴(Sigma- Aldrich) 피복 96 웰 플레이트에 표 4에 나타낸 세포 밀도(세포/cm2)로 발라주었다. 이 세포 밀도, 그리고 해당 세포 유형을 이중으로 혹은 삼중으로 배지에 발라주는지 여부는 해당 관심 표현형을 발현하는 세포의 수에 따라 결정하였다.
배지에 바른(plating) 세포의 밀도
96 웰 플레이트 배양
배지 표면에 발라준 세포의 밀도
조 건 분 류(sorted) 전체(all) 전체 최고 밀도
세포원 A
제1집합 40.6×103/㎠ 40.6×103/㎠ 93.8×103/㎠
제2집합 40.6×103/㎠ 40.6×103/㎠ 93.8×103/㎠
제3집합 40.6×103/㎠ 40.6×103/㎠ 93.8×103/㎠
세포원 B
제1집합 6.3×103/㎠ 6.3×103/㎠ 62.5×103/㎠
제2집합 6.3×103/㎠ 6.3×103/㎠ 62.5×103/㎠
세포원 C
제1집합 6.3×103/㎠ 6.3×103/㎠ 62.5×103/㎠
제2집합 6.3×103/㎠ 6.3×103/㎠ 62.5×103/㎠
완전 배지(60% DMEM-LG (Gibco)와 40% MCDB-201(Sigma)), (2% 소 태아 혈청(Hyclone Labs.)), (1×인슐린-트랜스페린-셀렌(ITS)), (1×리놀렌산-소 혈청 알부민(LA-BSA)), (10-9 M 덱사메타손(Sigma)), (10-4 M 아스코르브산 2-인산(Sigma)), (표피 성장 인자 10 ng/mL (R&D Systems)), (혈소판 유래 성장 인자(PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems)) 를 상기 96 웰플레이트의 각 웰에 가하고 이 플레이트를 5% CO2/37℃ 배양기 속에 놓았다. 제7일에 완전 배지 100 μL를 각 웰에 부가하였다. 이 96 웰 플레이트를 약 2주 동안 감시하고, 제12일에 배양물의 최종 평가를 마무리하였다.
3.1.5 데이터 분석
표준적 게이트 기법을 이용하여 FASCalibur 데이터를 FlowJo (Tree star, Inc) 소프트웨어로 분석하였다. BD FACS Aria 데이터는 FACSDiva 소프트웨어(Becton- Dickinson)로 분석하였다. FACS Aria 데이터는 표준적인 게이트 조절법뿐 아니라 중복 신호 구별 게이트 조절법(doublet discrimination gating)을 사용하여 중복신호(doublet)를 최소화하였다. 모든 결과는 마이크로소프트 엑셀에 정리하였고, 본 명세서의 모든 수치는 평균±표준편차(수치, 평균 표준오차 standard error of mean, SEM) 형태로 나타내었다.
3.2 결과
3.2.1 세포 생존률
소화 후 생존률은 수동 트리판블루 배제법(도 1)을 이용하여 평가하였다. (양막, 융모막 또는 양막-융모막 판에서 유래한) 대부분의 소화된 조직의 평균 세포 생존률은 약 70%였다. 양막 유래 세포는 평균 세포 생존률이 74.35%±10.31% (n=6, SEM=4.21), 융모막 유래 세포는 평균 생존률이 78.18%±12.65% (n=4, SEM=6.32), 양막-융모막 판은 평균 생존률이 69.05%±10.80% (n=4, SEM=5.40)이었고 제대 세포는 평균 생존률이 63.30%±20.13% (n=4, SEM=1O.06)였다. 관류물 유래의 세포는 소화 처리하지 않았는데, 가장 높은 생존률인 89.98±6.39% (n=5, SEM=2.86)을 나타내었다.
3.2.2 세포 계량
태반에서 유래한 5 종류의 서로 다른 세포군을 분석하여 HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+ 세포의 수를 결정하였다. BD FACSCalibur 데이터 분석 결과, 양막, 관류물 그리고 융모막에서 이들 세포의 총수가 가장 많았다. 각각 30.72±21.80 세포 (n=4, SEM=10.90), 26.92±22.56 세포 (n=3, SEM=13.02)와 18.39±6.44 세포 (n=2, SEM=4.55)였다. 양막-융모막판과 탯줄은 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 총수가 가장 적었다. 각각 4.72±4.16 세포(n=3, SEM=2.40)와 3.94±2.58 세포(n=3, SEM=1.49)였다.
마찬가지로 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 총수를 백분율 분석하자, 양막과 태반 관류물이 이러한 표현형을 발현하는 세포를 가장 높은 비율로 함유하였다(각각 0.0319%±0.0202%(n=4, SEM=0.0101)와 0.0269%±0.0226%(n=3, SEM=0.0130)였다. 도 2 참조). 비록 탯줄은 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포를 조금밖에 가지고 있지 않았지만(도 2), 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율은 세번째로 높았다. 0.020±0.0226%(n=3, SEM=0.0131)(도 2). 융모막과 양막-융모막판은 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율이 가장 낮았는데, 각각 0.0184±0.0064%(n=2, SEM=0.0046)와 0.0177±0.0173%(n=3, SEM=0.010)이었다(도 2).
BD FACS Aria 데이터에서도 양막, 관류물과 융모막이 HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+ 세포를 나머지 세포원보다 더 많이 제공하는 것으로 나타나 상기 BD FACSCalibur 분석 결과와 부합하였다. 양막, 관류물, 융모막에서 관심 대상 표현형을 발현하는 세포 총수의 평균은 각각 126.47±55.61 세포(n=15, SEM=14.36), 81.65±34.64 세포(n=20, SEM=7.75)와 51.47±32.41 세포(n=15, SEM=8.37)였다. 양막-융모막판과 탯줄은 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율이 가장 낮았는데, 각각 44.89±37.43 세포(n=9, SEM=12.48)와 11.00±4.03 세포(n=9, SEM=1.34)였다.
BD FACS Aria 데이터는 B와 A 세포원이 가장 높은 비율로 HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+ 세포를 함유하며, 각각 0.1523±0.0227%(n=15, SEM=0.0059)와 0.0929±0.0419%(n=20, SEM=0.0094)임을 나타내었다(도 3). D 세포원은 관심 대상 표현형을 발현하는 비율이 세번째로 높았는데, 0.0632±0.0333%(n=9, SEM=0.0111)였다(도 3). C와 E 세포원은 관심 대상 표현형을 발현하는 비율이 가장 낮았는데, 각각 0.0623±0.0249%(n=15, SEM=0.0064)와 0.0457±0.0055%(n=9, SEM=0.0018)이었다(도 3).
각 세포원으로부터 HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+ 세포들을 동정하고 그 수를 계량한 다음에, 나아가 세포가 세포 표면 표지 HLA-G, CD1O, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200과 CD105를 발현하는지 여부를 분석하고 특성 파악하였다.
3.2.3 태반 관류물 유래 세포
관류물 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13표지에 대하여 양성이었다(도 4). 관류물 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 37.15%±38.55%(n=4, SEM=19.28)가 HLA-G 발현), (세포 중 36.37%±21.98%(n=7, SEM=8.31)가 CD33 발현), (세포 중 39.39%±39.91%(n=4, SEM=19.96)가 CD117 발현), (세포 중 54.97%±33.08%(n=4, SEM=16.54)가 CD10 발현), (세포 중 36.79%±11.42%(n=4, SEM=5.71)가 CD44 발현), (세포 중 41.83%±19.42%(n=3, SEM=11.21)가 CD200 발현), (세포 중 74.25%±26.74%(n=3, SEM=15.44)가 CD90 발현), (세포 중 35.10%±23.10%(n=3, SEM=13.34)가 CD38 발현), (세포 중 22.87%±6.87%(n=3, SEM=3.97)가 CD105 발현), (세포 중 25.49%±9.84%(n=3, SEM=5.68)가 CD13 발현.
3.2.4 양막 유래 세포
양막 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었다(도 5). 양막 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 57.27%±41.11%(n=3, SEM=23.73)가 HLA-G 발현), (세포 중 16.23%±15.81%(n=6, SEM=6.46)가 CD33 발현), (세포 중 62.32%±37.89%(n=3, SEM=21.87)가 CD117 발현), (세포 중 9.71%±13.73%(n=3, SEM=7.92)가 CD1O 발현), (세포 중 27.03%±22.65%(n=3, SEM=13.08)가 CD44 발현), (세포 중 6.42%±0.88%(n=2, SEM=0.62)가 CD200 발현), (세포 중 57.61%±22.10%(n=2, SEM=15.63)가 CD90 발현), (세포 중 63.76%±4.40%(n=2, SEM=3.11)가 CD38 발현), (세포 중 20.27%±5.88%(n=2, SEM=4.16)가 CD105 발현), (세포 중 54.37%±13.29%(n=2, SEM=9.40)가 CD13 발현.
3.2.5 융모막 유래 세포
융모막 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38와 CD13에 대하여 양성이었지만 CD33와 CD105의 발현은 가변적이었다(도 6). 융모막 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 53.25%±32.87%(n=3, SEM=18.98)가 HLA-G 발현), (세포 중 15.44%±11.17%(n=6, SEM=4.56)가 CD33 발현), (세포 중 70.76%±11.87%(n=3, SEM=6.86)가 CD117 발현), (세포 중 35.84%±25.96%(n=3, SEM=14.99)가 CD1O 발현), (세포 중 28.76%±6.09%(n=3, SEM=3.52)가 CD44 발현), (세포 중 29.20%±9.47%(n=2, SEM=6.70)가 CD200 발현), (세포 중 54.88%±0.17%(n=2, SEM=0.12)가 CD90 발현), (세포 중 68.63%±44.37%(n=2, SEM=31.37)가 CD38 발현), (세포 중 23.81%±33.67%(n=2, SEM=23.81)가 CD105 발현), (세포 중 53.16%±62.70%(n=2, SEM=44.34)가 CD13 발현.
3.2.6 양막- 융모막판 태반 세포
양막-융모막판 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었다(도 7). 양막-융모막판 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 78.52%±13.13%(n=2, SEM=9.29)가 HLA-G 발현), (세포 중 38.33%±15.74%(n=5, SEM=7.04)가 CD33 발현), (세포 중 69.56%±26.41%(n=2, SEM=18.67)가 CD117 발현), (세포 중 42.44%±53.12%(n=2, SEM=37.56)가 CD1O 발현), (세포 중 32.47%±31.78%(n=2, SEM-22.47)가 CD44 발현), (세포 중 5.56%(n=1)가 CD200 발현), (세포 중 83.33%(n=1)가 CD90 발현), (세포 중 83.52%(n=1)가 CD38 발현), (세포 중 7.25%(n=1)가 CD105 발현), (세포 중 81.16%(n=1)가 CD13 발현.
3.2.7 탯줄 유래 세포
탯줄 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었지만 CD117, CD1O, CD44와 CD200의 발현은 가변적이었다(도 8). 탯줄 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 62.50%±53.03%(n=2, SEM=37.50)가 HLA-G 발현), (세포 중 25.67%±11.28%(n=5, SEM=5.04)가 CD33 발현), (세포 중 44.45%±62.85%(n=2, SEM=44.45)가 CD117 발현), (세포 중 8.33%±11.79%(n=2, SEM=8.33)가 CD1O 발현), (세포 중 21.43%±30.30%(n=2, SEM=21.43)가 CD44 발현), (세포 중 0.0%(n=1)가 CD200 발현), (세포 중 81.25%(n=1)가 CD90 발현), (세포 중 64.29%(n=1)가 CD38 발현), (세포 중 6.25%(n=1)가 CD105 발현), (세포 중 50.0%(n=1)가 CD13 발현.
모든 표지 발현의 평균을 정리한 결과는 도 9에 나타내었다.
3.2.8 BD FACS Aria 분류 결과 보고서
HLA ABC, CD45, CD34와 CD133을 가장 높은 비율로 발현하는 세 가지 서로 다른 세포군(관류물, 양막과 융모막 유래 세포)를 7AAD와 이들 표지에 대한 항체들로 염색하였다. 이 세 종류의 세포군에 대하여 관심 대상 표현형을 발현하는 세포들을 선택하여 세포 분류하였다. BD FACS Aria 세포 분류 결과는 표 5에 나타나 있다.
BD FACS Aria 세포 분류 보고서
세포원 처리한 이벤트 수 분류한 이벤트 수
(관심 대상 표현형)		 전체에 대한 %
관류물 135540110 51215 0.037786
양막 7385933 4019 0.054414
융모막 108498122 4016 0.003701
양성인 세포를 선택적으로 분류하여 얻은 세 종류의 서로 다른 세포군("분류")과 그에 대응하는 비분류 세포군을 배지 표면에 발라준 다음 배양하여 그 결과를 제12일째에 평가하였다. 분류된 관류물 유래 세포는 세포 밀도 40,600 세포/cm2로 발라주었는데, 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다. 관류물 유래 비분류 세포 세 집단 중 둘은 대부분 작고, 둥글며 웰 가장자리에 몇몇 부착세포를 가지는 비부착성 세포를 낳았는데, 이들은 세포 밀도를 40,600 세포/cm2로 하여 배지에 발라주었다. 관류물 유래 비분류 세포 중 배지에 93,800 세포/cm2로 발라준 것들은 대부분 작고, 둥글며 웰 가장자리에 몇몇 부착세포를 가지는 비부착성 세포를 낳았다.
양막 유래 분류 세포는 배지에 6,300 세포/cm2로 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 양막 유래 비분류 세포는 밀도를 6,300 세포/cm2로 하여 배지에 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 양막 유래 비분류 세포 중 밀도를 62,500 세포/cm2로 하여 발라준 것은 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다.
융모막 유래 분류 세포는 배지에 6,300 세포/cm2로 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 융모막 유래 비분류 세포는 밀도를 6,300 세포/cm2로 하여 배지에 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 융모막 유래 비분류 세포 중 밀도를 62,500 세포/cm2로 하여 발라준 것은 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다. 이들 세포는 후속 배양에서 부착성이 되었다.
앞서 기술한 내용과 관련 있는 실험 후에 그 태반 줄기세포를 더 배양하고 CD117과 CD133에 대한 항체로 세포를 표지하자, 양성 관측값과 유사한 정도로 유의한 배경 신호(background)가 나타났는데, 여기서는 스트렙트아비딘 결합 항체를 비오틴 결합 피코에리드린(PE)으로 표지하였다. 이 배경 신호 때문에 처음에는 상기 태반 줄기세포가 이 두 표지에 대하여 양성이라고 보았다. 그러나 다른 표지인 APC 또는 PerCP를 사용하자, 이 배경 신호가 줄어들었고, 상기 태반 줄기세포는 CD117과 CD133 양쪽 표지에 대하여 음성이라고 옳게 확인할 수 있었다.
실시예 4 : 태반 줄기세포의 분화
부착성 태반 줄기세포를 몇 가지 서로 세포 계통으로 분화하였다. 부착 태반 줄기세포는 양막, 융모막, 태반엽 또는 이들의 조합을 포함하는 태반 내 해부 자리의 조직을 물리적으로 파괴하여 태반에서 얻었고, 제대 줄기세포는 제대 조직을 물리적으로 파괴하여 얻었다.
태반 줄기세포와 제대 줄기세포를 낮은 농도의 소 태아 혈청과 제한적인 분량의 성장 인자가 들어 있는 배지 속에서 수립하였다. 흐름 세포 측정 결과, 전형적인 태반 줄기세포는 CD200+CD105+CD73+CD34-CD45- 표현형이 70% 이상인 것으로 나타났다. 태반 줄기세포는 지방세포, 연골세포와 골세포 계통으로 분화한 것으로 밝혀졌다.
IBMX, 인슐린, 덱사메타손과 인도메타신이 함유된 유도 배지(induction medium) 속에서 줄기세포는 3 내지 5 주만에 지방이 축적된 지방세포로 바뀌었다. 골 형성 유도 배양 조건에서는 태반 줄기세포가 골 결절(bone nodule)을 형성하고 세포외 매트릭스에 칼슘 침착을 일으킨 것으로 드러났다. 태반 유래 부착 세포(placenta-derived adherent cell, PDAC)의 연골 형성 분화는 미세펠렛(micropellet) 형태로 이루어졌으며 조직 덩어리(tissue aggregate) 속의 글리코스아미노글리칸 생성을 통하여 확인되었다.
실시예 5 : 태반 줄기세포를 이용한 면역 조절
태반 줄기세포는 T 세포와 자연세포독성 세포의 증식 억제를 포함하는 면역 조절 효과를 지닌다. 이하의 실험은 태반 줄기세포가 림프구 혼합 배양 반응 분석과 회귀 분석의 두 가지 분석에서 자극에 대한 T 세포 반응을 조절하는 능력을 지닌다는 점을 밝혀준다.
5.1 림프구 혼합 배양 분석
MLR은 표적 세포군에 대한 작동 세포군(effector population)의 반응을 측정한다. 여기서 작동 세포는 림프구 또는 CD8+ T 세포 또는 NK 세포와 같은 정제된 부분 세포군일 수 있다. 표적 세포군은 동종 이형인 피조사(allogeneic irradiated) 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)이거나, 본 발명의 명세서에서 처럼 성숙한 가지상세포이다. 반응 세포군(responder population)은 전체 T 세포의 20%로 추산되는 동종이형 특이(allo-specific) 세포로 이루어진다. 변형 태반줄기세포 MLR은 반응에서 태반 줄기세포를 이용한다.
태반 줄기세포를 96 웰 플레이트 웰 속에 발라준 다음 작용체 세포군을 가하였다. 태반 줄기세포와 아세트산5(6)-카르복시플루오레사인 N-숙신이미드 에스테르(CFSE)로 염색한 작용체를 표적물인 성숙한 가지상세포의 부가 전에 24시간 동안 전배양하였다. 6일 후에 상청액과 비부착 세포를 수확하였다. 상청액을 Luminex 비드 분석법으로 분석하고, 세포를 흐름 세포 측정법으로 분석하였다.
고전적인 MLR은 CD8+과 CD4+ T 세포 구역(compartment)에서 증식 반응을 나타낸다. 이 반응은 두 동종이형 기증자끼리 서로 만난 적이 없기 때문에 미경험 T 세포의 반응이다. 표준 MLR에서는 CD8+과 CD4+ T 세포가 양쪽 모두 맹렬하게 증식하였다. 태반 줄기세포를 MLR에 가하자, CFSELow 반응 세포(responder cell)의 비율로써 측정한 상기 CD8+과 CD4+ T 세포 증식은 저하되었다.
태반 줄기세포를 MLR에 가했을 때 일어나는 효과(PMLR)는 도 10A와 10B(PMLR 그래프), 그리고 도 11에서 볼 수 있다. CD4+만을 또는 CD8+ T 세포만을 각각 사용하건, CD4+와 CD8+ T 세포를 같은 양으로 함께 사용하건 결과는 비슷하였다. 양막-융모막판 또는 탯줄 버팀질(umbilical cord stroma)로부터 얻은 태반 줄기세포는 MLR에서 비슷한 정도로 면역 반응을 억제하였으며, CD8+과 CD4+ T 세포 사이에 차이는 나타나지 않았다. 이는 전체 T 세포 반응(bulk T cell reaction)도 마찬가지였다.
CD8+ T 세포, CD8+ T 세포, CD8+과 CD4+ T 세포, 그리고 동종 이형 가지상 세포(DC)에 대하여 별도의 MLR을 수행하였다. 태반 줄기세포를 MLR에 가하고, 태반 줄기세포가 없는 MLR을 대조군으로 삼아 T 세포 증식 정도를 평가하였다.
CD4+와 CD8+ T 세포와 CD14+ 단핵세포를 백혈구 연층(軟層 buffy coat)으로부터 Miltenyi MACS 컬럼과 비드를 써서 제조사의 설명에 따라 분리하였다. 가지상 세포는 단핵 세포를 1% 헌혈 혈장(donor plasma), IL-4와 GM-CSF이 보충된 RPMI 1640 속에서 6일 동안, 그리고 IL- lβ, TNF-α와 IL-6로 보강된 RPMI 1640 속에서 이틀 동안 배양하여 얻었다. 동종 이형(allogeneic) T 세포와 가지상 세포(DC)를 T 세포:DC= 10:1의 비율로 배양하여 고전적인 6일 MLR을 달성하였다. T 세포 증식은 T 세포를 MLR 분석에 부가하기 전에 CFSE(Carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester)로 염색하여 평가하였다. CFSE는 염색이 딸세포군 속에서 희석되는 정도를 측정하여 증식 정도를 평가하는데 쓰인다.
MLR 분석에 태반 줄기세포(PSC)를 T 세포:DC:PSC=10:1 :2의 비율로 가하였다. 이 반응에서는 96 웰 플레이트 속에서 5% 사람 혼주혈청(R5)이 보강된 RPMI 1640 최종 부피가 200 μL가 되도록 하였다. 엿새 뒤, 비부착세포를 간단하게 재현탁한 다음 RPMI로 세척한 5 mL 튜브로 옮기고, CD4와 CD8 항체로 염색하였다. CD4와 CD8 구역의 증식은 BD FACS Calibur로 평가하였다.
태반 줄기세포. 태반 줄기세포는 앞서 실시예 1과 2에 기술한 대로 획득하였다. 다음 태반 조직으로부터 태반 줄기세포를 획득하였다: 양막(AM) 또는 양막/융모막(AC). 탯줄 줄기세포는 탯줄을 소화시켜 얻었다(UC). 섬유모세포(FB)와 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSCs)를 첨가하여 대조군으로 삼았다.
결과. 태반 줄기세포를 MLR에 가하면, T 세포 증식이 저하된다(도 12). 도 10에 나타낸 실험에 쓰인 태반 줄기세포는 61665로 표시한 하나의 태반으로부터 유래하였다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포가 쓰이고 양 T 세포를 모두 사용하지 않은 실험에서, 실험한 모든 태반 줄기세포에 대하여 CD4+ 구역은 CD8+ 구역보다 더 많이 억제되었다(도 12A). 양막(AM)과 탯줄(UC) 태반 줄기세포의 CD4+ 활성화 억제는 약 60%-75%로서 중간엽 줄기세포(MSC)에 의한 억제와 대충 비슷한 수준이었다. CD4+와 CD8+ T 세포를 함께 MLR 실험한 경우, 태반 줄기세포는 CD4+ 구역의 증식을 CD8+ 구역보다 훨씬 더 많이 억제하였다(도 12B). 특히 AM 태반 줄기세포에 의한 CD4+ T 세포 증식 억제는 90%에 접근하여 MSC가 나타내는 억제도를 뛰어넘었다. 이 두 구역 사이의 억제도 차이는 AM과 AC 태반 줄기세포의 경우에 가장 컸다.
서로 다른 기증자로 얻은 태반 줄기세포는 T 세포 증식 억제 정도를 달리한다(도 13). 65450으로 표시한 다른 태반에서 온 태반 줄기세포는 MLR 상에서 CD4+와 CD8+ T 세포 증식을 61665 태반과는 다르게 억제하였다. 놀랍게도 태반 65450으로부터 얻은 AC와 UC PSC는 T 세포 증식을 80% 내지 95%로 억제하여, 이 분석법에서 MSC에 의한 수준을 뛰어넘었다. 태반 65450에서 얻은 AC 태반 줄기세포는 그러나 그다지 T 세포 증식을 억제하지 않았다(도 10A의 AC 태반 줄기세포의 억제도와 비교하라).
태반 줄기세포는 MLR에서 자연세포독성 세포(NK)의 활성도 억제하였다.
5.2 회귀 분석
태반 줄기세포는 회귀 분석에서 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV) 항원을 발현하는 B 세포주에 대한 T 세포 반응을 억제하는 것이 드러났다. 이 회귀 분석은 면역 회상(recall) 분석법으로서, EBV 항원 펩티드를 표면에 전시하는 EBV-전환 MHC 클래스 I과 II B 세포에 의하여 일어나는 작동 T 세포(effector T cell) 메커니즘을 측정한다. 이 분석법은 T 세포와 인공적으로 만든 전환 B 세포(transformed B cell)인, 같은 기증자로부터의 림프모구 유사 세포주(lymphoblastoid cell line, LCL)를 섞어 줌으로써 수행한다. 이 LCL은 다양한 범위의 T 세포와 B 세포 적응 반응을 일으키는 9 가지의 엡스타인 바 바이러스 항원을 발현하는데, 고전적 회귀 분석에서는 오로지 작동 T 세포 메커니즘만을 측정하였다. 이 회귀 분석법은 LCL이 활성 B 세포 표지인 CD23을 발현한다는 점에서 자연적으로 발생하는 병원체에 감염된 표적에 대한 세포 독성(cytotoxicity)을 측정하는 편리한 수단이 된다. 따라서 CD23 발현 세포의 수는 이 분석에서 살아남은 LCL 수의 척도가 된다.
17일간의 고전적 회귀 분석 결과는 도 14의 첫번째 막대 그래프에 나타낸 것과 비슷하였다. CD23+ 세포는 나타나지 않았는데, 그것은 CD4+와 CD8+ T 세포가 이들을 모두 사멸시켰기 때문이다. 다음 두 막대 그래프에서 보이는 바와 같이, 태반 줄기세포를 부가하면 생존하는 CD23+ 세포의 수가 늘어났다. 특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 관측된 이러한 효과에 대한 두 가지 설명이 있을 수 있다. T 세포가 죽어서 남은 LCL이 마음대로 증폭할 수 있도록 되었거나, 아니면 태반 줄기세포가 T 세포에 영향을 미치기보다는 주로 LCL의 수명을 늘린 것일 수 있다.
별도의 회귀 분석에서는 실험실 기증자로부터 T 세포와 가지상 세포를 얻었다. 엡스타인 바 바이러스 전환 B 세포주인 LCL은 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 용균성(lytic) EBV 세포주인 B95.8의 상청액과 사이클로스포린 A와 함께 2주일 동안 배양하여 얻었다. 이 LCL은 9 가지의 EBV 항원을 발현하였다. 증식하여 확장하는 이 LCL 세포주는 10% 소 태아 혈청이 보강된 RPMI 1640 속에서 유지하였다. 이 회귀 분석은 CD4+와 CD8+ T 세포를 자가(autologous) LCL과 T 세포:LCL=10:1의 비율로 섞어 줌으로써 이루어졌다. 이 분석은 5% 사람 혼주혈청(R5)이 보강된 RPMI 1640 200 μL가 담긴 96 웰 플레이트에서 이루어졌다. 이 플레이트에 태반 줄기세포를 T 세포:LCL:PSC=10:1:2로 첨가하였다. 이 분석은 6, 10일 또는 17일에 걸쳐 이루어졌다.
CFSE 염색 T 세포를 이용하여 6일 회귀 분석을 수행하였다. 65450 태반으로부터 얻은 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 회귀 분석에서 약 65% 내지 97%로 억제하였는데, 이러한 결과는 MLR에서 이들 태반 줄기세포(PSC)가 이룬 결과와 상응한다(도 15). 역시 65450 태반으로부터 얻은 UC와 AC 세포주도 T 세포 증식을 현저하게 억제하였지만, 65450 AM PSC는 증식을 억제하지 않았다.
별도 실험에서는 자연세포독성 세포가 MLR과 회귀 분석에서 마찬가지로 억제된다는 것이 밝혀졌다. NK 세포의 억제 효과는 해당 MLR 또는 회귀 분석이 50 단위/mL의 IL-2를 함유하여 이루어졌을 때 약 45%(수치 범위는 약 40%에서 약 65%, SEM 5%)였다.
태반 줄기세포는 면역원성이 아니다. 어떠한 태반 기증자 또는 태반 해부 자리에서 유래한 태반 줄기세포더라도 배경(background) T 세포 증식의 5%보다 더 많은 T 세포 증식이 관측된 것은 없었다.
세포-세포 접촉의 필요성. 상기 회귀 분석에서 세포독성 효과와 MLR의 동종이형 인식(allo-recognition)은 모두 표적과 작동 세포 사이의 T 세포 수용체-MHC 상호작용에 의존하였다. 태반 줄기세포 매개 억제에 있어서 세포-세포 접촉의 필요성은 트랜스웰(transwell) 삽입막 분석으로 평가하였다. 이 분석에서는 T 세포와 태반 줄기세포가 막으로 서로 분리된 채로 MLR을 수행하였다. 도 16에서 볼 수 있듯이, MLR에 쓰인 태반 줄기세포의 수가 더 많을수록 억제 감소가 더 커지는데, 이는 태반 줄기세포(UC)가 T 세포 증식을 억제하기 위하여, 특히 고밀도에서는, T 세포와 상당한 정도의 접촉을 요한다는 것을 가리킨다.
별도의 실험에서는 태반 줄기세포의 T 세포 면역 억제에서 한 수용성 인자가 적어도 부분적으로는 연루되어 있는 것으로 보인다는 점을 확인하였다. 이 태반 줄기세포가 매개 면역 억제가 세포-세포 접촉에 의존하는지를 밝히기 위하여, 바닥의 틈을 통하여 수용성 인자만이 다닐 수 있는 삽입막이 설치된 웰에 태반 줄기세포를 놓은 트랜스웰 분석을 수행하였다. 웰 바닥에는 상기 태반 줄기세포로부터 분리된 채 MLR 또는 T 세포가 단독으로 존재하였다. 관측된 효과가 태반 줄기세포의 상대적 투여량에 의존하는지를 밝히기 위하여 이들 줄기세포를 T 세포와 가지상 세포에 대하여 서로 다른 상대적 비율로 첨가하였다. 탯줄 줄기세포를 MLR에서 분리하였을 때, 억제 효과는 부분적으로 사라졌다. 태반 줄기세포를 도 11에서 쓰인 것과 유사한 밀도로 사용하였을 때, MLR 억제는 CD4+ T 세포에서 75%, CD8+ T 세포에서 85%(도 17과 도 18)가 줄어들었다. 억제 효과는 태반 줄기세포 투여량의 4분의 1만이 사용되었을 때(UC OP 25)도 아직 66%를 유지하였고, 12,5000 UC 태반 줄기세포를 가하자 배경(background) 수준으로 감소하였다. 삽입막을 이용하여 분리했을 때 억제도의 변화는 관측되지 않았다(도 17). 25,000 개의 태반 줄기세포에서는 여전히 활발한 억제 효과에도 불구하고, 삽입막 도입에 따른 가장 적은 상대적 억제도 감소가 관측되었다(도 18).
실시예 6: 태반 줄기세포 면역 억제의 접촉 의존성은 골수 유래 중간엽 줄기세포와 다르다
면역 조절의 접촉 의존성 정도를 밝히는 실험에서, 탯줄 줄기세포는 면역 조절에서 골수 유래 줄기세포와 비교했을 때 확연히 다른 세포-세포 접촉 요건을 나타내었다. 무엇보다 태반 줄기세포는 면역 조절을 위하여 세포-세포 접촉에 더 의존하였는데, 태반 또는 중간엽 줄기세포의 수가 많을 수록 특히 그러하였다.
골수 유래 줄기세포(BMSC)와 탯줄 줄기세포(UC)는 백혈구 혼합 배양 반응 분석(Mixed leukocyte reaction assay, MLR) 상의 부착세포 대 T 세포 비율에 따라 서로 다른 세포-세포 접촉 요건을 가진다. 태반 줄기세포가 T 세포와 가지상 세포(DC)로부터 분리된 MLR 실험인 트랜스웰 실험에서 면역 억제는 상기 두 종류의 부착세포에 따라 달라졌다. 도 19는 개방형 웰(open well)과 트랜스웰 실험 결과를 나란히 보여준다. 대략 100,000 또는 75,000 개의 UC 또는 BMSC를 개방형 웰 실험에 사용하였을 때 유사한 정도의 억제 효과가 관측되었다. 그러나 트랜스웰 실험에서는 UC가 BMSC보다 MLR을 덜 억제하는데, 이는 태반 줄기세포/T 세포 비율이 이처럼 높을 때 접촉 의존성도 커진다는 것을 의미한다. 태반 줄기세포 대 T 세포 비율을 낮추었을 때, 태반 줄기세포는 세포 별 억제력은 더 높았다.
이러한 억제도 데이터로부터 접촉 의존성 정도를 계산하였다. 도 20은 UC와 BMSC MLR의 접촉 의존성을 나타낸다. 골수 유래 세포는 높은 BMSC/T 세포 비율에서 UC의 경우보다 접촉 의존성이 낮다. 다른 말로 하면, UC 태반 줄기세포와 BMSC는 중요한 메커니즘 파라미터인 세포-세포 접촉 의존성에 관한 거동을 달리한다.
조절 T 세포(Treg)는 BMSC 매개 T 세포 억제에 필요하다. Aggarwal과 Pittenger의 "Human Mesenchymal Stem Cells Modulate Allogeneic Immune Cell Responses," Blood 105(4): 1815-1822 (2004)를 참조하라. 건강한 기증자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+CD25+ T 조절 세포를 고갈시킨 다음 자가 EBV 전환세포를 이용하여 회귀 분석을 하였다. 몇몇 조건에서는 UC를 부가하였다. 도 21에서 볼 수 있는 바와 같이, 회귀 분석상의 태반 줄기세포 매개 T 세포 반응 억제는 T 조절 세포의 존부와 관계없이 차이가 없었다. 따라서 T 조절 세포는 BMSC 매개 T 세포 억제에 필요한 것으로 보고되었지만, 태반 줄기세포 매개 면역 억제에 있어서 T 조절 세포는 어떠한 구실을 하지는 않는다.
태반 줄기세포에 의하여 억제된 MLR로부터 T 세포를 덜어낸 다음, 가지상 세포를 새로 부가하는 MLR 실험을 하였다. 이 T 세포는 CFSE로 염색하였는데, 증식 과정에서 딸세포들로 고루 배분된다. CFSEHi 세포는 증식하지 못한 T 세포(예를 들어 도 21 패널의 가장 왼쪽 피크)이다. 이 세포군은 염색한 T 세포를 FACS Aria로 세포 분류하여 얻었다. 이들 세포를 새 가지상 세포와 함께 두번째 MLR에서 사용하였다. 도 22에서 볼 수 있는 바와 같이, 계속적인 억제 효과는 관측되지 않았는데, 이전에 억제되었던 세포는 가지상 세포에 대항하여 잘 증식하였다. CFSELo 세포(즉 딸세포) 때문에 이러한 억제가 이루어졌을 가능성은 적은데, 이는 이들 세포 자신이 뒤이어 증식하였기 때문이다. CFSEHi 세포군은 이 기증 가지상 세포에 대하여 증식하지 않았을 비 동종이형 특이 세포(non-allo-specific cell)와 태반 줄기세포에 의하여 억제되는 T 세포로 이루어졌다. 태반 줄기세포를 들어내자, 억제되었던 세포들이 증식하였다.
상청액 10%를 BMSC MLR 상청액으로 갈아주었을 때 BMSC는 MLR을 억제한다. 이와 정반대로, 태반 줄기세포를 함유하는 MLR 상청액으로 상청액을 갈아주었을 때에는, 심지어 배지의 75%를 갈아주더라도 T 세포 증식에 변화가 없었다(도 23).
가지상 세포 또는 휴식 T 세포(resting T cell)를 태반 줄기세포와 MLR 시작 전에 서로 다른 시간 동안 배양하면 이들 세포가 영향을 받을 수 있다. 이러한 점은 태반 줄기세포 또는 BMSC를 T 세포(도 24A) 또는 가지상세포(DC, 도 24B)와 시간을 달리하여 분석 시작 전에 배양함으로써 시험하였다. T 세포와 태반 줄기세포를 사전 배양하면 억제성 표현형을 그다지 변화시키지 못한다(도 20A). 그러나 BMSC T 세포 억제는 DC/PDAC 사전 배양 기잔에 따라 달라진다. 도 20B에 나타난 것처럼, BMSC에 의한 억제는 T 세포 하루 뒤에 가지상 세포를 부가하였을 때 가장 강하다. 그러나 가지상 세포를 T 세포와 같은 시간에 부가하면 훨씬 더 낮은 억제력을 보인다. 이틀간 사전 배양하면, 억제도는 DC를 T 세포 하루 뒤(+1 일)에 부가한 경우에 근접한다. 태반 줄기세포 매개 억제에서는 비슷한 경향을 볼 수 없었다.
실시예 7: MLR 과 회귀 분석에서의 태반 줄기세포와 탯줄 줄기세포의 사이토킨 특성
양막-융모막판(AC) 유래의 탯줄 줄기세포(UC)와 태반 줄기세포는 MLR 배지 속으로 몇몇 사이토킨을 분비하는 것을 확인되었다.
몇몇 분석에서는 사이토킨 어레이를 이용하여 상청액 속 사이토킨과 케모킨의 농도를 측정하였다. 몇몇 인자는 상청액 속으로 분비되는 것으로 밝혀졌는데, MLR과 회귀 분석에 가장 연관성이 있는 것은 포식세포 염증성 단백질인 MIP-1α와 MIP-1β였다. 이들은 모두 T 세포를 유인하는 화학주성 물질로서, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염에 반응하여 CD8+ T 세포가 분비한다. MLR로 분석하였을 때, 이들 화학주성 물질의 분비는 태반 줄기세포와 MSC의 MLR 억제와 역방향의 상관 관계(도 25)가 있다. 태반 줄기세포나 MSC는 MIP-1α와 MIP-1β를 분비하지 않았다.
다른 연구에서는 MCP-1과 IL-6의 분비 사이에 상관 관계를 발견하였는데, 이들은 모두 중요한 면역 조절자이다(도 26과 도 27. 도 11과 비교하라). 태반 줄기세포 단독으로는 IL-6이나 MCP-1을 분비하지 않았지만, MLR과 T 세포 증식을 회귀 분석에서 억제(도 11)하는 UC와 AC 세포주는 MCP-1과 IL-6을 분비한다(도 26과 도 27). 비록 IL-6은 대개 염증 유발성(pro-inflammatory) 작용을 하지만(예를 들어 Kishimoto 외, Annu. Rev. Immunol. 23:1-21 (2005)을 보라), Il-6은 마우스에서 간 손상시 보호 작용을 하는 등의 다른 기능도 가지고 있다(예를 들어 Klein 외, J. Clin . Inves. 15:860~869 (2005)을 보라).
별도의 실험에서는 MLR 또는 회귀 분석에 쓰인 AC에 대하여 사이토킨 분비를 분석하였다. 사이토킨은 6일째 줄기세포 배양물, 줄기세포 MLR 또는 줄기세포 회귀 분석물에 대하여 Luminex 시스템을 이용하여 측정하였다. MLR은 줄기세포, 가지상 세포(DC)와 T 세포를 2:1:10의 비율로 포함하였다. 엡스타인 바 바이러스 회귀 분석은 줄기세포, EBV 종양 세포(Ts)와 T 세포를 Ts:줄기세포:T 세포=2:1:10의 비율로 포함하였다.
줄기세포 단독 배양, MLR과 회귀 분석에서 IL-6(11 ng/mL)와 IL-8(16 ng/mL)의 농도는 일정하게 유지되는 것으로 드러났다. MCP-1의 농도는 줄기세포 단독 배양과 비억제성 대조군 부착세포 MLR과 회귀 분석에서 약 2 ng/mL이었지만 억제 줄기세포 MLR과 줄기세포 회귀 분석에서는 약 10 ng/mL로 증가하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 수치는 MCP-1에 대하여 기록된 혈청 농도 범위 안에 포함된다.
인터루킨-2(IL-2)는 T 세포 생존 인자이자 CD4+CD25+ T 조절 세포의 절대 인자(obligate factor)이다. 이 T 세포 부분집합은 AC 줄기세포에 의한 T 세포 억제에는 필요하지 않지만, AC 줄기세포에 의한 MLR 억제에서는 IL-2 농도가 꾸준하게 감소한다. AC 줄기세포가 부재한 상태의 MLR 상청액은 약 35 pg/mL의 IL-2를 포함한데 반하여, AC 줄기세포를 함유한 MLR은 IL-2를 440 pg/mL까지 함유하였다.
이러한 IL-2 농도는 억제도와 상관 관계가 있었다. 예를 들어 85% 억제도를 나타낸 CD4+ T 세포 MLR에서는 IL-2를 330 pg/mL 함유하였고, AC 줄기세포를 이용하여 85% 억제도를 나타낸 CD8+ T 세포 MLR에서는 IL-2를 66 pg/mL 함유하였다. 이러한 결과는 전통적으로 면역 반응의 자극제로 알려진 IL-2와 MCP-1이 면역 억제에서도 역할을 맡을 수도 있다는 것을 가리킨다.
실시예 8: 냉동보존된 줄기세포 산물의 생산과 줄기세포 은행
이 실시예는 태반 줄기세포의 분리와 냉동된 줄기세포에 바탕을 둔 산물을 생산하는 것을 설명한다.
요약: 태반 조직을 절개하고 소화한 다음 초대(primary)와 증폭 배양 (expansion culture)하여 대규모 세포량(cell dose)을 낳는 증폭된 세포 산물(expanded cell product)을 이룩한다. 세포를 두 층을 가진(two-tiered) 세포 은행에 저장하고 냉동 세포 산물로 배급한다. 하나의 기증된 태반에서 유래한 모든 세포량(cell dose)을 로트(lot)로 정의하고, 지정된 방에서 Class 100 라미나 흐름 후드를 다용하여 한 번에 한 태반 로트씩 처리한다. 이 세포 산물은 CD105+, CD200+, CD10+, CD34-로 규정할 수 있고, 정상적인 핵형을 지니며 모체 세포 함량이 없다.
8.1 줄기세포를 얻는 방법
조직 절개와 소화: 압박 분만 24시간 후보다 전에 태반을 입수한다. 태반 조직을 양막, 양막과 융모막의 조합 또는 융모막에서 얻는다. 이 조직을 액 1 mm 크기의 작은 조각으로 다진다. 다진 조직을 1 mg/mL 콜라겐 분해효소 1A로 1시간 동안 37℃에서 소화한 다음 트립신-EDTA로 37℃에서 30분 동안 처리한다. 5% FBS를 갖춘 PBS로 3회 씻은 다음, 이 조직을 배양 배지 속에 재현탁한다.
다른 실시 태양에서는 태반을 압박 분만 후 24시간 안에 확보한다. 태반을 씻은 다음 탯줄의 모체에서 먼 쪽 끝(distal end)을 지혈기(hemostat)를 집어 조인다. 이 탯줄을 태반과의 경계에서 잘라 멸균 접시로 옮긴다. 지혈기 아래로 탯줄을 자른 다음, 탯줄을 마사지하여 피떡을 없애고 겐타마이신과 암포테리신 B를 함유하는 PBS 500 mL 속으로 옮긴다. 수술용 메스(scalpel)를 써서 탯줄의 부착점으로부터 3인치 반지름으로 잘라 남은 태반 재료를 다듬어낸다. 피떡을 남은 태반 재료에서 뽑아내고 탯줄의 뿌리 부분에 자리잡고 있는 양막-융모막 5 g을 탯줄과 같은 용기로 옮긴다. 이 탯줄과 양막-융모막 조직을 자르고 약 1 ㎣ 크기의 조각으로 잘게 다진다. 이 조직을 이어서 1 mg/mL의 콜라겐 분해효소 1A(조직 1 g 당 20 mL)로 1시간 동안 37℃에서 소화한 다음 트립신-EDTA(조직 1 g 당 10 mL)로 37℃에서 30분 동안 소화한다. 5% FBS 함유 PBS로 세 번 씻고, 이 조직을 배양 배지(조직 1 g 당 20 mL)에 재현탁한 다음 T 플라스크로 약 0.22 mL/㎠ 비율로 옮긴다.
초대 배양: 초대 배양(primary culture)의 목적은 소화된 태반 조직으로부터 세포를 수립하기 위함이다. 소화한 조직을 배양 배지 속에 현탁하고, Corning T-플라스크 속에 놓은 다음, 이를 37℃의 5% CO2로 유지되는 가습 체임버 속에서 배양하였다. 배지의 절반은 5일 배양 후 갈아준다. 세포 밀도가 높은 콜로니는 배양 2주째에 생긴다. 트립신-EDTA로 콜로니를 수확하고, 이어서 2% FBS를 함유하는 PBS로 배양을 중지시킨다. 세포를 원심분리하고 배양 배지에 재현탁하여 파종 증폭 배양물을 제조한다. 이 세포를 배증한 적이 없는 제0계대로 정의한다.
증폭 배양물: 초대 배양에서 수확한 세포, 증폭 배양물에서 수확한 세포 또는 세포 은행에서 해동한 세포를 증폭 배양물의 파종(seeding)에 쓴다. Cell Factory(NUNC사 상표)를 무균 필터를 통한 공기 중 5%의 CO2로 10분 동안 분당 50 mL/트레이의 비율로 처리하고 이를 37℃의 5% CO2로 유지되는 가습 체임버 속에서 덥혀 주었다. 파종할 세포를 트리판블루와 혈구계로 세고, 세포 수, 생존율과 계대수, 배증한 누적 총 수를 기록한다. 세포를 배양 배지 속에 mL 당 약 2.3×104개로, 그리고 트레이 당 110 mL로 상기 Cell Factory에 파종한다. 배양 3~4일 후, 그리고 다시 5~6일 후에 배양 배지를 덜어내고 새 배지로 갈아준 다음 공기 중 5%의 CO2로 한 번 더 처리해 준다. 세포가 ㎠ 당 약 105개에 이르면 세포를 트립신-EDTA로 처리하여 수확하고, 2% FBS 함유 PBS로 배양을 중지시킨다. 세포를 이어서 원심분리하고 배양 배지 속에 재현탁한다.
냉동보존: 냉동할 세포를 배양물로부터 트립신-EDTA 처리(예를 들어 ㎠ 당 5분 동안 0.044 mL)로 수확하고 2% FBS 함유 PBS로 배양을 중지시킨 다음 혈구계로 그 수를 센다. 원심분리(예를 들어 300×g) 후, 세포를 10% DMSO 함유 FBS에 mL 당 약 1백만 세포의 비율로 재현탁하여 세포 은행의 설립에 사용하고, mL 당 1천만 세포의 비율로 개별 냉동 세포량의 설립에 사용한다. 다른 실시 태양에서는 이 세포를 10% HAS와 10% DMSO가 든 플라스말라이트(plasmalyte) 속에 이 세포 용액을 mL 당 약 2백만 세포로 희석한다. 이 세포 용액을 냉동 용기로 옮기는데, 이 냉동 용기는 -80℃ 냉동고 속의 이소프로필 알코올 중탕 속에 있다. 다음 날 세포를 액체 질소로 옮긴다.
8.2 줄기세포 은행의 설계
"로트(lot)"는 한 기증 태반에서 유래한 모든 세포량(cell dose)으로 정의한다. 증폭 배양 과정에서 세포는 8 계대와 30 배증에 걸쳐서 정상적인 성장, 핵형과 세포 표면 표지 표현형을 유지하였다. 이러한 제약 하에서 세포량은 5 계대 이후, 약 20 배증된 것들을 포함한다. 공급할 동등한 세포를 생산하기 위하여 하나의 로트를 배양하여 증폭한 다음 두 층을 가지는 세포 은행과 냉동 세포로 보관한다. 특히 초대 배양에서 수확한, 배증을 겪지 않은 제0계대 세포로 정의한 세포들을 증폭 배양물을 개시하는데 사용한다. 첫번째 계대 후 약 4회의 배증을 거쳐 세포를 마스터 세포 은행(MCB) 속에 냉동시킨다. MCB로부터 얻은 비알을 사용하여 추가로 증폭 배양물을 파종한다. MCB에서 해동한 세포를 두 차례 더 계대하고 나서, 세포를 작업용 세포 은행(working cell bank, WCB) 속에 냉동시키는데, 약 12회 배증한 때이다. WCB로부터 얻은 비알을 이용하여 증폭 배양물을 파종하여 2회 더 계대하여, 약 20회 배증한 제5계대 세포를 얻는데, 이들을 개별 세포량으로 냉동한다.
8.3 배양을 위한 세포 해동
세포의 냉동 용기를 밀봉 플라스틱 백에 담고 37℃의 물 중탕 속에 담근다. 조그만 얼음 조각 외에는 내용물이 다 녹을 때까지 용기를 서서히 흔들어 준다. 용기를 상기 밀봉 플라스틱 백에서 꺼내고 10배 부피의 배양 배지를 세포에 부드럽게 섞어 주며 천천히 가한다. 시료를 채취하고 혈구계로 측정하여 증폭 배양물을 파종한다.
8.4 주사를 위한 세포 해동
세포의 냉동 용기를 건조 질소 이동 용기(dry nitrogen shipper)에 담아 투여할 곳으로 옮긴다. 투여하기 전에 용기를 밀봉 플라스틱 백 속에 넣고 이를 37℃의 물 중탕 속에 담근다. 조그만 얼음 조각 외에는 내용물이 다 녹을 때까지 용기를 서서히 흔들어 준다. 용기를 상기 밀봉 플라스틱 백에서 꺼내고 같은 부피의 2.5% HSA/5% 덱스트란을 가하여 준다. 더 이상의 세척 없이 세포를 주사한다.
8.5 시험 규격
모든 기증 태반에는 모체 혈액 시료가 따른다. 이 시료를 놓고 B형 간염 핵심 항체와 표면 항원, C형 간염 바이러스 항체와 핵산, HIV I과 II 항체와 핵산에 대하여 검사한다. 태반의 처리와 초대 배양은 시험 결과를 받기 전에 시작하지만, 모체 혈액 시료와 연결된 태반의 시험 결과가 모든 바이러스에 대하여 음성인 경우에만 계속한다. 기증자가 병원체 어떠한 것에라도 양성으로 시험 결과가 나오면 로트를 폐기한다. 나아가 표 6에 기재하는 시험을 MCB, WCB 및 WCB의 한 비알에서 유래한 세포량의 시료에 대하여 수행한다. 모든 규격을 만족할 때만 로트를 이용한다.
세포 시험 및 규격
시 험 방 법 필요한 시험 결과
무균성 BD BACTEC PEDS PLUS/F 및 BACTEC Myco/F Lytic 음성
내독소 LAL 겔 응고(gel clot) ≤ 5 EU/mL*
생존율 트리판블루 생존율 > 70%
마이코플라스마 직접 배양, DNA-플루오크롬(FDA PTC 1993) 음 성
세포의 동정 흐름 세포 측정법(아래를 보라) CD105+, CD200+,
CD10+, CD34-
세포의 순도 마이크로새틀라이트(microsatelite) 오염 세포 검출 무
핵 형 G-띠 분석(banding)과 중기 세포의 염색체 수 세기 정 상
* 세포량 당 냉동 세포 40 mL이고, mL 당 최대 5 EU로 설계한 세포 산물의 경우, 이 세포 산물은 체중이 40 kg을 넘는 세포 피투여자에 대한 최대값인 5 EU/kg/투여량 미만이다.
8.6 표면 표지 표현형 분석
세포를 1% 파라포름알데히드(PFA) 함유 PBS 속에 20분 동안 둔 다음 염색하기 전까지 (최대 1주 동안) 냉장고에 보관한다. 세포를 2% FBS, 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS(염색 완충액)으로 씻은 다음, 염색 완충액 속에 재현탁한다. 세포를 다음 항체 접합물로 염색한다: CD105-FITC, CD200-PE, CD34-PECy7, CD10-APC. 세포를 또한 면역 동형(isotype) 대조군으로 염색한다. 30분 배양 후 세포를 세척하고 염색 완충액에 재현탁한 다음 흐름 세포 측정기로 분석한다. 동형 대조군과 비교하여 형광이 늘어난 세포를 그 표지에 대한 양성 세포로 분류한다.
실시예 9: 태반 줄기세포 또는 제대 줄기세포를 이용한 면역 관련 질환의 치료
이 실시예에서는 면역 관련 질환이나 상태의 예시 치료법을 제공한다.
9.1 크론병의 치료
크론병의 한 형태인 회결장염이 있고 복부 통증, 피 섞인 설사와 발열을 겪고 있는 개체가 있다. 이 개체에게 CD10+CD34-CD105+CD200+ 태반 줄기세포 및/또는 제대 줄기세포 1~5×108 개를 0.9% NaCl 용액에 담아 정맥하 투여한다. 이후 두 주 동안 이 개체를 관찰하여 증상 중 하나 이상이 줄어드는지 평가한다. 다음 한 해 동안 이 개체를 관찰하고, 필요할 경우 같은 분량의 태반 줄기세포를 투여한다.
9.2 이식 대 숙주병의 치료
동종 골수 이식(allogeneic bone marrow transplant)을 기다리고 있는 개체에게 CD10+CD34-CD105+CD200+ 태반 줄기세포 및/또는 제대 줄기세포 5~10×108 개를 0.9% NaCl 용액에 담아 골수 이식 24시간 전 이내에 정맥하 투여한다. 골수 이식 후 24시간 이내에 줄기세포 투여를 반복한다. 이 개체를 이후 100일 동안 관찰하고 GVHD가 발병하고 등급 I(grade I)을 넘어가게 되면 추적 투여량(follow-up dose)으로 CD10+CD34-CD105+CD200+ 태반 줄기세포 및/또는 제대 줄기세포 5~10×108 개를 투여한다.
9.3 류마티스성 관절염의 치료
관절 세 곳 이상에 류마티스성 관절염이 있는 개체가 있다. 이 개체에 태반 줄기세포나 제대 줄기세포에 대하여 IL-1Ra와 DHFR을 포함하는 융합 폴리펩티드를 생산하도록 변형한 태반 줄기세포를 조합한 세포들을 투여하는데, 이 때 이 두 종류 줄기세포를 1:1 비율로 투여한다. 상기 유전공학 조작한 세포와 조작하지 않은 세포는 0.9% NaCl 용액에 담은 CD10+CD34-CD105+CD200+ 태반 줄기세포 및/또는 제대 줄기세포 1~5×108개이다. 이 개체에게 표준 투여량의 메토트렉세이트를 주고, 관절 염증이 줄어드는지 관찰한다.
균등물
본 발명은 본 명세서에서 기술한 특정 실시 태양의 범위 내로 한정되지 아니한다. 실제로 당업자에게는 앞선 기재와 첨부 도면의 내용으로부터 전술한 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 있을 수 있다는 점은 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부하는 청구범위 내에 포함되는 것이다.
본 명세서에서 인용하는 많은 간행물, 특허와 특허 출원은 그 전문에서 개시하는 바를 참고 문헌으로 삼고 있다.

Claims (34)

  1. CD10, CD105 및 CD200은 발현하고, CD34는 발현하지 않는 태반 줄기 세포를 포함하는 염증성 창자병 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 창자병은 궤양성 대장염 또는 크론병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 염증성 창자병은 크론병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염증성 창자병은 궤양성 대장염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 크론병은 위십이지장(gastroduodenal) 크론병, 공장회장염증(jejunoileitis), 회장염(ileitis), 회결장염(ileocolitis) 또는 크론 대장염(Crohn's colitis)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 하기 증상 중 하나 이상의 증상의 검출 가능한 개선을 야기하기에 충분한 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    GI 관의 일부분의 염증 및 팽윤, 복부 통증, 빈번한 창자의 공복(frequent emptying of the bowel), 설사, 직장 출혈, 빈혈, 체중 감소, 소장 벽의 굵어짐, 소장 내 상처 조직(scar tissue)의 형성, 소장 내 종기(sore) 또는 궤양의 형성, 소장 벽 내 하나 이상의 누(fistula)의 진전, 항문 내 하나 이상의 균열(fissure)의 진전, 영양 결핍의 진전, 혈액 설사, 오심, 복부 경련(abdominal cramp), 빈혈, 피로, 식욕 저하, 신체 체액 및 영양소의 손실, 빌리루빈의 증가, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 증가, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 증가, 알칼린 포스파타제(AP)의 증가, 내부 출혈, 경련(cramping) 또는 장폐색(ileus).
  7. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 제2치료제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제2치료제는 메살라민, 5-ASA (5-아미노살리실릭 산) 성분, 오살라진, 설파사라진, 항-염증 항체, 스테로이드 또는 면역억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항-염증 항체는 인프릭시마브(Infliximab)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 스테로이드는 코르티손, 하이드로코르티손, 프레디손 또는 메틸프레드니손인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 면역억제제는 사이클로스포린 A, 6-머캅토퓨린 또는 아자티오프린(azathioprine)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
KR1020097018749A 2007-02-12 2008-02-12 태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료 KR101569168B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90106707P 2007-02-12 2007-02-12
US60/901,067 2007-02-12
PCT/US2008/001831 WO2008100498A2 (en) 2007-02-12 2008-02-12 Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157005148A Division KR20150039214A (ko) 2007-02-12 2008-02-12 태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090109575A KR20090109575A (ko) 2009-10-20
KR101569168B1 true KR101569168B1 (ko) 2015-11-13

Family

ID=39618996

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157005148A KR20150039214A (ko) 2007-02-12 2008-02-12 태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료
KR1020097018749A KR101569168B1 (ko) 2007-02-12 2008-02-12 태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157005148A KR20150039214A (ko) 2007-02-12 2008-02-12 태반 줄기세포를 이용한 염증 질환의 치료

Country Status (22)

Country Link
US (7) US8460650B2 (ko)
EP (6) EP2687220A3 (ko)
JP (2) JP5979811B2 (ko)
KR (2) KR20150039214A (ko)
CN (3) CN101657206B (ko)
AU (1) AU2008216749B2 (ko)
CA (1) CA2677397C (ko)
CY (1) CY1114301T1 (ko)
DK (1) DK2120977T3 (ko)
ES (1) ES2425181T3 (ko)
HK (2) HK1135328A1 (ko)
HR (1) HRP20130765T1 (ko)
IL (5) IL200338A (ko)
ME (1) ME01562B (ko)
MX (2) MX349225B (ko)
NZ (3) NZ612888A (ko)
PL (1) PL2120977T3 (ko)
PT (1) PT2120977E (ko)
RS (1) RS52921B (ko)
SI (1) SI2120977T1 (ko)
WO (1) WO2008100498A2 (ko)
ZA (2) ZA200905376B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018008941A1 (ko) 2016-07-04 2018-01-11 주식회사 강스템바이오텍 연골 무세포 파쇄물 및 줄기세포를 포함하는 연골분화 촉진용 복합체 및 그의 용도

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8147824B2 (en) 1999-08-05 2012-04-03 Athersys, Inc. Immunomodulatory properties of multipotent adult progenitor cells and uses thereof
US7311905B2 (en) * 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
KR100915483B1 (ko) 2000-12-06 2009-09-03 로버트 제이 하리리 태반 줄기 세포의 회수 방법
ES2629155T3 (es) 2001-02-14 2017-08-07 Anthrogenesis Corporation Matrices de tejido que comprenden células madre placentarias, y métodos para su preparación
US8460650B2 (en) 2007-02-12 2013-06-11 Anthrogenesis Corporation Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
KR20050086780A (ko) * 2002-11-26 2005-08-30 안트로제네시스 코포레이션 세포요법제, 세포요법제 단위 및 이를 이용한 치료방법
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
EP1641915B1 (en) 2003-06-27 2016-07-27 DePuy Synthes Products, Inc. Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
NZ550027A (en) * 2004-03-26 2009-03-31 Celgene Corp Systems and methods for providing a stem cell bank
JP5340599B2 (ja) 2004-12-23 2013-11-13 エシコン・インコーポレイテッド 臍帯組織由来産褥細胞ならびにその製造方法および使用方法
AU2006304274B2 (en) * 2005-10-13 2012-08-16 Celularity Inc. Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells
CA2624925C (en) 2005-10-13 2014-09-30 Anthrogenesis Corporation Immunomodulation using placental stem cells
US10117900B2 (en) 2005-11-09 2018-11-06 Athersys, Inc. MAPC treatment of brain injuries and diseases
US11000546B2 (en) 2005-11-09 2021-05-11 Athersys, Inc. Immunomodulatory properties of MAPCs and uses thereof
PL1971681T3 (pl) 2005-12-16 2018-01-31 Depuy Synthes Products Inc Kompozycje oraz sposoby do hamowania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w przypadku transplantacji z brakiem zgodności tkankowej
EP1974013A2 (en) * 2005-12-29 2008-10-01 Anthrogenesis Corporation Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition
JP5550235B2 (ja) 2005-12-29 2014-07-16 アントフロゲネシス コーポレーション 胎盤幹細胞集団
EP2412801A1 (en) * 2005-12-29 2012-02-01 Anthrogenesis Corporation Co-Culture of placental stem cells and stem cells from a second source
NZ727755A (en) 2006-01-23 2023-01-27 Abt Holding Co Mapc therapeutics without adjunctive immunosuppressive treatment
US7993918B2 (en) 2006-08-04 2011-08-09 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using placental stem cells
CN104099290A (zh) 2006-10-23 2014-10-15 人类起源公司 用胎盘细胞群治疗骨缺损的方法和组合物
US8506949B2 (en) 2007-01-17 2013-08-13 Stemnion, Inc. Methods for modulating inflammatory and/or immune responses
US8221741B2 (en) 2007-01-17 2012-07-17 Marshall Vivienne S Methods for modulating inflammatory and/or immune responses
AU2008216748A1 (en) 2007-02-12 2008-08-21 Anthrogenesis Corporation Hepatocytes and chondrocytes from adherent placental stem cells; and CD34+, CD45- placental stem cell-enriched cell populations
JP5597129B2 (ja) 2007-06-18 2014-10-01 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド 胎盤由来の幹細胞および前駆体細胞の単離方法
US9200253B1 (en) 2007-08-06 2015-12-01 Anthrogenesis Corporation Method of producing erythrocytes
EP2200622B2 (en) 2007-09-19 2015-07-29 Pluristem Ltd. Adherent cells from adipose or placenta tissues and use thereof in therapy
WO2009045360A2 (en) 2007-09-28 2009-04-09 Celgene Cellular Therapeutics Tumor suppression using human placental perfusate and human placenta-derived intermediate natural killer cells
US9393273B2 (en) 2008-05-27 2016-07-19 Pluristem Ltd. Methods of treating inflammatory colon diseases
NZ591294A (en) 2008-08-20 2012-10-26 Anthrogenesis Corp Treatment of stroke using isolated placental cells
KR20210010648A (ko) 2008-08-20 2021-01-27 안트로제네시스 코포레이션 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법
RU2011110736A (ru) 2008-08-22 2012-09-27 Антродженезис Корпорейшн (Us) Способы и композиции для лечения костных дефектов с помощью плацентарных клеточных популяций
EP3115451A1 (en) 2008-09-02 2017-01-11 Pluristem Ltd. Adherent cells from placenta tissue and use thereof in therapy
EP2334310B1 (en) * 2008-09-02 2016-06-29 Pluristem Ltd. Adherent cells from placenta tissue and use thereof in therapy
US20110243922A1 (en) * 2008-10-08 2011-10-06 Hakon Hakonarson Genetic Alterations Associated with Type I Diabetes and Methods of Use Thereof for Diagnosis and Treatment
RU2015130665A (ru) 2008-11-19 2018-12-24 Антродженезис Корпорейшн Амниотические адгезивные клетки
NZ602569A (en) * 2008-11-21 2014-03-28 Anthrogenesis Corp Treatment of diseases, disorders or conditions of the lung using placental cells
JP5646502B2 (ja) * 2008-12-19 2014-12-24 デピュイ・シンセス・プロダクツ・エルエルシーＤｅＰｕｙ Ｓｙｎｔｈｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， ＬＬＣ 神経因性疼痛を治療するための臍帯組織由来細胞
US10557116B2 (en) * 2008-12-19 2020-02-11 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of lung and pulmonary diseases and disorders
US8771677B2 (en) 2008-12-29 2014-07-08 Vladimir B Serikov Colony-forming unit cell of human chorion and method to obtain and use thereof
WO2010082787A2 (ko) * 2009-01-15 2010-07-22 코아스템(주) 연골줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환 치료용 또는 항염증용 약제학적 조성물
PL2411506T3 (pl) * 2009-03-25 2019-07-31 Celularity, Inc. Hamowanie nowotworu z użyciem ludzkich pochodzących z łożyska komórek nk pośrednich i związki immunomodulujące
WO2010111663A1 (en) 2009-03-26 2010-09-30 Ethicon, Inc. Human umbilical cord tissue cells as therapy for alzheimer' s disease
US8796315B2 (en) 2009-06-25 2014-08-05 Darlene E. McCord Methods for improved wound closure employing olivamine and human umbilical vein endothelial cells
CA2767014C (en) 2009-07-02 2022-01-25 Anthrogenesis Corporation Method of producing erythrocytes without feeder cells
CA2781649C (en) * 2009-11-30 2017-07-11 Pluristem Ltd. Adherent cells from placenta and use of same in disease treatment
KR20120115602A (ko) 2010-01-26 2012-10-18 안트로제네시스 코포레이션 태반 줄기 세포를 사용한 골 관련 암의 치료
WO2011103462A1 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Osiris Therapeutics, Inc. Methods of manufacture of immunocompatible amniotic membrane products
TW201703777A (zh) * 2010-04-07 2017-02-01 安瑟吉納西斯公司 利用胎盤幹細胞之血管新生
CN102933221A (zh) * 2010-04-08 2013-02-13 人类起源公司 使用胎盘干细胞治疗结节病
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
PT2576768T (pt) 2010-06-01 2017-08-11 Auxocell Laboratories Inc Células estaminais da geleia nativa de wharton e a sua purificação
JP5996533B2 (ja) 2010-07-13 2016-09-21 アントフロゲネシス コーポレーション ナチュラルキラー細胞を生成させる方法
CN103501822A (zh) * 2010-12-17 2014-01-08 人类起源公司 使用胎盘干细胞治疗脊髓损伤和外伤性脑损伤
US20120164114A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-28 Abbot Stewart Treatment of immune-related diseases and disorders using amnion derived adherent cells
US8574899B2 (en) 2010-12-22 2013-11-05 Vladimir B Serikov Methods for augmentation collection of placental hematopoietic stem cells and uses thereof
US20120171161A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Sascha Abramson Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof
AU2011352036A1 (en) * 2010-12-31 2013-07-18 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules
US8709401B2 (en) * 2011-02-25 2014-04-29 Howmedica Osteonics Corp. Primed stem cells and uses thereof to treat inflammatory conditions in joints
JP6030114B2 (ja) 2011-03-22 2016-11-24 プルリステム リミテッド 放射線照射または化学物質による傷害を治療するための方法
EP2696901A1 (en) * 2011-04-13 2014-02-19 Biocell Center S.p.a. Method of collection, classification and preservation of samples containing stem cells
WO2012149046A1 (en) * 2011-04-25 2012-11-01 University Of Southern California Methods and compositions for improved tissue regeneration by suppression of interferon -gamma and tumor necrosis factor-alpha
TWI602570B (zh) 2011-06-01 2017-10-21 安瑟吉納西斯公司 使用胎盤幹細胞之疼痛治療
WO2013055476A1 (en) 2011-09-09 2013-04-18 Anthrogenesis Corporation Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells
ITTO20111183A1 (it) * 2011-12-21 2013-06-22 Univ Degli Studi Torino Mezzo condizionato ottenuto da cellule staminali mesenchimali placentari e suo uso nel trattamento terapeutico della preeclampsia
CN103185778B (zh) * 2011-12-30 2015-03-18 深圳市亚辉龙生物科技有限公司 一种检测抗Scl70抗体的试剂装置及其方法
EP3321355B1 (en) * 2011-12-30 2021-08-25 Amit Patel Methods and compositions for the clinical derivation of an allogenic cell and therapeutic uses
ES2666576T3 (es) 2012-02-23 2018-05-07 Anthrogenesis Corporation Identificación de compuestos antitumorales usando placenta
US8940294B2 (en) 2012-03-02 2015-01-27 Tissuetech, Inc. Methods of isolating and culturing stem cells
ES2671932T3 (es) 2012-08-01 2018-06-11 United Therapeutics Corporation Tratamiento de hipertensión arterial pulmonar con células madre mesenquimatosas
ES2713988T3 (es) 2012-08-01 2019-05-24 United Therapeutics Corp Tratamiento de hipertensión arterial pulmonar con células progenitoras endoteliales tratadas con prostaciclina
RU2522972C2 (ru) * 2012-08-27 2014-07-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации ". Способ лечения хронических воспалительных заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями
KR101532556B1 (ko) 2012-09-03 2015-06-30 메디포스트(주) 간엽줄기세포의 배양 방법
CN103040860B (zh) 2012-11-29 2018-08-14 刘学武 一种启动哺乳动物干细胞的方法及二氧化氯在制备用于启动哺乳动物干细胞的药物的应用
CA2892375A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Darlene E. MCCORD Hydroxytyrosol and oleuropein compositions for induction of dna damage, cell death and lsd1 inhibition
EP3878452B1 (en) * 2013-01-09 2023-09-20 United Therapeutics Corporation Treatment of vasculopathy with prostacyclin and mesenchymal stem cells
EP2953635A4 (en) 2013-02-05 2016-10-26 Anthrogenesis Corp NATURAL KILLER CELLS FROM PLAZENTA
JP6327647B2 (ja) * 2013-02-13 2018-05-23 国立大学法人徳島大学 炎症性疾患の予防又は治療用組成物
AU2014222671B2 (en) * 2013-03-01 2017-04-27 Apceth Gmbh & Co. Kg Protection of the vascular endothelium from immunologically mediated cytotoxic reactions with human CD34-negative progenitor cells
WO2014141111A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Pluristem Ltd. Methods for prevention and treatment of graft-versus-host disease
ES2703784T3 (es) * 2013-03-14 2019-03-12 Celularity Inc Uso de células madre placentarias en el tratamiento de la lesión renal aguda
US10039792B1 (en) 2013-03-16 2018-08-07 Brahm Holdings, Llc Methods for the treatment of inflammation and pain using human birth tissue material composition
JP6512759B2 (ja) 2013-08-19 2019-05-15 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤
US20160287642A1 (en) * 2013-11-15 2016-10-06 Women And Infants Hospital Of Rhode Island Methods of treating or preventing a lung disorder
CN103555664B (zh) * 2013-11-19 2015-11-04 武汉道培胎盘干细胞生物技术有限公司 一种培养人胎盘间充质干细胞的方法
JP6474549B2 (ja) * 2014-03-03 2019-02-27 国立大学法人徳島大学 幹細胞の培養産物の評価指標及びその利用
EP3137084B1 (en) * 2014-05-02 2019-12-25 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Benzyl amiloride for the treatment of psoriasis
US10363278B2 (en) 2014-06-15 2019-07-30 Amnio Technology Llc Frozen therapeutic dose and package
US20160095307A1 (en) * 2014-10-07 2016-04-07 NuTech Medical, Inc. Method and composition for hypothermic storage of placental tissue
EP3250389B1 (en) 2015-01-30 2020-12-30 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Mobile printing
CA3177726A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
MX2017015145A (es) * 2015-05-28 2018-08-01 Celularity Inc Celulas madre derivadas de placenta para restaurar el motor regenerativo, corregir defectos proteomicos y extender la esperanza de vida.
AU2016330612A1 (en) * 2015-09-29 2018-04-26 Celularity Inc. Cell potency assay
CN108473949A (zh) 2015-12-04 2018-08-31 弗莱德哈钦森癌症研究中心 扩增的造血干细胞/祖细胞群体的用途
EP3503933A1 (en) 2016-08-24 2019-07-03 Arthrex, Inc. Tissue use for repair of injury
WO2018053233A1 (en) * 2016-09-15 2018-03-22 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Inhibition of acetyl-coa metabolism for treatment and prevention of immune system diseases and disorders
TW201819623A (zh) * 2016-10-18 2018-06-01 美商幹細胞生物科技股份有限公司 用於降低膽紅素位準之組成物及方法
ES2927406T3 (es) 2016-10-24 2022-11-04 United Therapeutics Corp Potenciación de las propiedades inmunomoduladoras de las MSC mediante treprostinil
JP7105195B2 (ja) 2016-11-15 2022-07-22 株式会社カネカ 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
WO2018106931A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3601531B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with live biotherapeutics
US20210369786A1 (en) * 2017-10-27 2021-12-02 Alis Pharma Ltd. Fetal tissue extract, methods for producing the extract, and the use thereof
WO2019132026A1 (ja) 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 接着性幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
CN108089057B (zh) * 2018-01-26 2019-09-17 吉林大学 一种用于超低温光电输运测试的测试平台
US11400119B2 (en) 2018-04-09 2022-08-02 Cellresearch Corporation Pte. Ltd. Method of transporting mesenchymal stem cells by means of a transporting solution and a method of administering stem cells to wounds
AU2019283518A1 (en) * 2018-06-05 2021-01-14 Medipost Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising mesenchymal stem cells as effective ingredient for prevention or treatment of inflammatory disease
DE202018003814U1 (de) 2018-08-19 2018-11-09 Mohamed Shehata Ali Mohamed Antipsoriatisches Gel für Hautanwendung II
KR102159630B1 (ko) * 2018-11-06 2020-09-24 차의과학대학교 산학협력단 태반-유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 담즙정체성 간질환 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
US11511017B2 (en) 2019-03-12 2022-11-29 Arthrex, Inc. Ligament reconstruction
JP2022524687A (ja) * 2019-03-27 2022-05-10 プルリステム リミテッド 審美および化粧処置ならびに毛髪成長の刺激のための方法および組成物
CA3138884A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Accelerated Biosciences Corp. Precursory regulatory cytotrophoblast cells and uses thereof
EP3984596A4 (en) 2019-06-14 2023-06-21 Kaneka Corporation POPULATION OF CELLS COMPRISING MESENCHYMATOUS CELLS, PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THEM AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF
KR20200000415A (ko) * 2019-12-24 2020-01-02 (주)안트로젠 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 중간엽줄기세포 배양액 및 이의 제조방법
MX2021007943A (es) * 2020-03-12 2021-11-04 Pluristem Ltd Metodos y composiciones para el tratamiento de infecciones virales y secuelas de las mismas.
KR102340058B1 (ko) 2020-05-12 2021-12-16 경북대학교 산학협력단 양막상피세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 안구질환 예방 또는 치료용 조성물
CN111821251B (zh) * 2020-07-07 2022-06-14 北京清大赛尔生物科技有限公司 化妆品用组合物和化妆品
CN113827618B (zh) * 2021-10-20 2023-09-26 上海交通大学医学院附属仁济医院 干细胞条件培养基在制备用于治疗炎症性皮肤的药物中的用途

Family Cites Families (312)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3862002A (en) * 1962-05-08 1975-01-21 Sanfar Lab Inc Production of physiologically active placental substances
US4060081A (en) 1975-07-15 1977-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Multilayer membrane useful as synthetic skin
US4458678A (en) 1981-10-26 1984-07-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-seeding procedures involving fibrous lattices
US4520821A (en) 1982-04-30 1985-06-04 The Regents Of The University Of California Growing of long-term biological tissue correction structures in vivo
US4485097A (en) 1982-05-26 1984-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Bone-equivalent and method for preparation thereof
US4829000A (en) 1985-08-30 1989-05-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reconstituted basement membrane complex with biological activity
US4798824A (en) * 1985-10-03 1989-01-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Perfusate for the preservation of organs
US5902741A (en) 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
US5266480A (en) 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
US5863531A (en) * 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
NZ226750A (en) 1987-10-29 1990-09-26 Amrad Corp Ltd Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene
US5192553A (en) 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5004681B1 (en) 1987-11-12 2000-04-11 Biocyte Corp Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood
GB8803697D0 (en) 1988-02-17 1988-03-16 Deltanine Research Ltd Clinical developments using amniotic membrane cells
US5284766A (en) * 1989-02-10 1994-02-08 Kao Corporation Bed material for cell culture
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5437994A (en) 1989-06-15 1995-08-01 Regents Of The University Of Michigan Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5635386A (en) 1989-06-15 1997-06-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture
US5605822A (en) * 1989-06-15 1997-02-25 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for growing human hematopoietic cells
US5399493A (en) 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5763266A (en) 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
DE69033493D1 (de) 1989-07-25 2004-08-12 Cell Genesys Inc Homologe rekombination für universelle donorzellen und chimerische säugetierzellen
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
AU635844B2 (en) 1989-11-06 1993-04-01 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5635387A (en) 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
US6326198B1 (en) 1990-06-14 2001-12-04 Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5811094A (en) 1990-11-16 1998-09-22 Osiris Therapeutics, Inc. Connective tissue regeneration using human mesenchymal stem cell preparations
US5733542A (en) 1990-11-16 1998-03-31 Haynesworth; Stephen E. Enhancing bone marrow engraftment using MSCS
US5226914A (en) 1990-11-16 1993-07-13 Caplan Arnold I Method for treating connective tissue disorders
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5197985A (en) * 1990-11-16 1993-03-30 Caplan Arnold I Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US6010696A (en) 1990-11-16 2000-01-04 Osiris Therapeutics, Inc. Enhancing hematopoietic progenitor cell engraftment using mesenchymal stem cells
US5192312A (en) * 1991-03-05 1993-03-09 Colorado State University Research Foundation Treated tissue for implantation and methods of treatment and use
US5190556A (en) 1991-03-19 1993-03-02 O.B. Tech, Inc. Cord cutter sampler
US5744361A (en) * 1991-04-09 1998-04-28 Indiana University Expansion of human hematopoietic progenitor cells in a liquid medium
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5356373A (en) 1991-11-15 1994-10-18 Miles Inc. Method and apparatus for autologous transfusions in premature infants
AU679436B2 (en) 1991-12-23 1997-07-03 British Bio-Technology Limited Stem cell inhibiting proteins
US6120735A (en) 1992-02-26 2000-09-19 The Ohio States University Fractional cell sorter
CA2110283A1 (en) 1992-03-31 1993-10-14 Tatsutoshi Nakahata Physiologically active protein and hemotopoietic stem cell growth agent
US5552267A (en) 1992-04-03 1996-09-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Solution for prolonged organ preservation
US5460964A (en) 1992-04-03 1995-10-24 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing hematopoietic cells
AU4543193A (en) 1992-06-22 1994-01-24 Henry E. Young Scar inhibitory factor and use thereof
US5672346A (en) 1992-07-27 1997-09-30 Indiana University Foundation Human stem cell compositions and methods
US5928947A (en) 1992-07-27 1999-07-27 California Institute Of Technology Mammalian multipotent neural stem cells
US5849553A (en) 1992-07-27 1998-12-15 California Institute Of Technology Mammalian multipotent neural stem cells
SG86980A1 (en) 1992-11-16 2002-03-19 Applied Immunesciences Pluripotential quiescent stem cell population
US5772992A (en) 1992-11-24 1998-06-30 G.D. Searle & Co. Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors
US5654186A (en) 1993-02-26 1997-08-05 The Picower Institute For Medical Research Blood-borne mesenchymal cells
RU2155066C2 (ru) * 1993-03-31 2000-08-27 Про-Ньюрон, Инк. Ингибитор пролиферации стволовых клеток и его использование
GB9308271D0 (en) 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
US5709854A (en) * 1993-04-30 1998-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo
US5698579A (en) * 1993-07-02 1997-12-16 Celgene Corporation Cyclic amides
US5372581A (en) 1993-07-21 1994-12-13 Minneapolis Children's Services Corporation Method and apparatus for placental blood collection
IL107483A0 (en) 1993-11-03 1994-02-27 Yeda Res & Dev Bone marrow transplantation
US5599705A (en) * 1993-11-16 1997-02-04 Cameron; Robert B. In vitro method for producing differentiated universally compatible mature human blood cells
US5591625A (en) * 1993-11-24 1997-01-07 Case Western Reserve University Transduced mesenchymal stem cells
US6288030B1 (en) * 1993-12-22 2001-09-11 Amgen Inc. Stem cell factor formulations and methods
US6001654A (en) 1994-01-28 1999-12-14 California Institute Of Technology Methods for differentiating neural stem cells to neurons or smooth muscle cells using TGT-β super family growth factors
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
EP0952792B1 (en) * 1994-06-06 2003-08-27 Case Western Reserve University Biomatrix for tissue regeneration
US6174333B1 (en) * 1994-06-06 2001-01-16 Osiris Therapeutics, Inc. Biomatrix for soft tissue regeneration using mesenchymal stem cells
DE4422667A1 (de) 1994-06-30 1996-01-04 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung und Züchtung hämatopoetischer Vorläuferzellen
US6103522A (en) * 1994-07-20 2000-08-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Human marrow stromal cell lines which sustain hematopoiesis
US5516532A (en) 1994-08-05 1996-05-14 Children's Medical Center Corporation Injectable non-immunogenic cartilage and bone preparation
US5827742A (en) 1994-09-01 1998-10-27 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Method of selecting pluripotent hematopioetic progenitor cells
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
DK0793714T3 (da) * 1994-11-16 2002-09-02 Tosoh Corp Anvendelse af stamcellefaktor og opløselig interleukin-6-receptor til ex vivo ekspansion af hæmatopoietiske multipotentielle celler
US5874301A (en) * 1994-11-21 1999-02-23 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
US5914268A (en) 1994-11-21 1999-06-22 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
US5789147A (en) 1994-12-05 1998-08-04 New York Blood Center, Inc. Method for concentrating white cells from whole blood by adding a red cell sedimentation reagent to whole anticoagulated blood
US5736396A (en) 1995-01-24 1998-04-07 Case Western Reserve University Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation
US5695998A (en) * 1995-02-10 1997-12-09 Purdue Research Foundation Submucosa as a growth substrate for islet cells
US6011000A (en) * 1995-03-03 2000-01-04 Perrine; Susan P. Compositions for the treatment of blood disorders
US5906934A (en) 1995-03-14 1999-05-25 Morphogen Pharmaceuticals, Inc. Mesenchymal stem cells for cartilage repair
US5716616A (en) * 1995-03-28 1998-02-10 Thomas Jefferson University Isolated stromal cells for treating diseases, disorders or conditions characterized by bone defects
EP1304113B1 (en) 1995-03-28 2007-07-25 Thomas Jefferson University Isolated stromal cells and methods of using the same
US6974571B2 (en) 1995-03-28 2005-12-13 Thomas Jefferson University Isolated stromal cells and methods of using the same
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
US5733541A (en) * 1995-04-21 1998-03-31 The Regent Of The University Of Michigan Hematopoietic cells: compositions and methods
DK0822955T3 (da) 1995-04-27 1999-09-27 Procter & Gamble Bærersubstrat behandlet med invers emulsion med højt indhold af indvendig vandfase og fremstillet med et organopolysiloxanp
US5925567A (en) 1995-05-19 1999-07-20 T. Breeders, Inc. Selective expansion of target cell populations
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5830708A (en) 1995-06-06 1998-11-03 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix
WO1996040875A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Methods for obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells and antibodies for use therein
US5654381A (en) 1995-06-16 1997-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Functionalized polyester graft copolymers
US5877299A (en) * 1995-06-16 1999-03-02 Stemcell Technologies Inc. Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations
US6306575B1 (en) 1995-06-16 2001-10-23 Stemcell Technologies, Inc. Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations
US5858782A (en) * 1995-11-13 1999-01-12 Regents Of The University Of Michigan Functional human hematopoietic cells
AU1119397A (en) 1995-11-14 1997-06-05 Regents Of The University Of Minnesota Ex vivo culture of stem cells
ATE288480T1 (de) 1995-11-16 2005-02-15 Univ Case Western Reserve Chondrogene in vitro induktion von menschlichen mensenchymalen stammzellen
EP0861894B1 (en) * 1995-11-17 2006-03-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation-suppressive polypeptide
US5716794A (en) * 1996-03-29 1998-02-10 Xybernaut Corporation Celiac antigen
EP2311471A3 (en) * 1996-04-19 2013-05-15 Osiris Therapeutics, Inc. Regeneration and augmentation of bone using mesenchymal stem cells
AU2808397A (en) 1996-04-26 1997-11-19 Case Western Reserve University Skin regeneration using mesenchymal stem cells
US5919176A (en) 1996-05-14 1999-07-06 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Apparatus and method for collecting blood from an umbilical cord
US5635517B1 (en) 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
US6281230B1 (en) 1996-07-24 2001-08-28 Celgene Corporation Isoindolines, method of use, and pharmaceutical compositions
US5798368A (en) 1996-08-22 1998-08-25 Celgene Corporation Tetrasubstituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolines and method of reducing TNFα levels
HU228769B1 (en) 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
US5827740A (en) 1996-07-30 1998-10-27 Osiris Therapeutics, Inc. Adipogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
US6358737B1 (en) * 1996-07-31 2002-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Osteocyte cell lines
KR100539030B1 (ko) 1996-08-12 2005-12-27 셀진 코포레이션 면역치료제 및 이를 이용하여 사이토카인 농도를 감소시키는 방법
US5851984A (en) 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US5916202A (en) 1996-08-30 1999-06-29 Haswell; John N. Umbilical cord blood collection
US6227202B1 (en) 1996-09-03 2001-05-08 Maulana Azad Medical College Method of organogenesis and tissue regeneration/repair using surgical techniques
US5945337A (en) 1996-10-18 1999-08-31 Quality Biological, Inc. Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium
US5919702A (en) 1996-10-23 1999-07-06 Advanced Tissue Science, Inc. Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly
US5969105A (en) 1996-10-25 1999-10-19 Feng; Yiqing Stem cell factor receptor agonists
US6335195B1 (en) * 1997-01-28 2002-01-01 Maret Corporation Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation
US5968820A (en) 1997-02-26 1999-10-19 The Cleveland Clinic Foundation Method for magnetically separating cells into fractionated flow streams
US6152142A (en) 1997-02-28 2000-11-28 Tseng; Scheffer C. G. Grafts made from amniotic membrane; methods of separating, preserving, and using such grafts in surgeries
US6231880B1 (en) 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
PT1028737E (pt) 1997-07-03 2007-07-11 Osiris Therapeutics Inc Células estaminais mesenquimatosas humanas de sangue periférico
US7514074B2 (en) 1997-07-14 2009-04-07 Osiris Therapeutics, Inc. Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells
DE69831957T3 (de) 1997-07-14 2009-07-23 Osiris Therapeutics, Inc. Herzmuskelregenerierung unter verwendung mesenchymaler stammzellen
US6077708A (en) 1997-07-18 2000-06-20 Collins; Paul C. Method of determining progenitor cell content of a hematopoietic cell culture
US5879318A (en) * 1997-08-18 1999-03-09 Npbi International B.V. Method of and closed system for collecting and processing umbilical cord blood
AU9127098A (en) * 1997-09-04 1999-03-22 Osiris Therapeutics, Inc. Ligands that modulate differentiation of mesenchymal stem cells
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6093531A (en) 1997-09-29 2000-07-25 Neurospheres Holdings Ltd. Generation of hematopoietic cells from multipotent neural stem cells
US5955476A (en) 1997-11-18 1999-09-21 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing inflammatory cytokine levels
US5874448A (en) * 1997-11-18 1999-02-23 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6 dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing TNFα levels
US6248587B1 (en) 1997-11-26 2001-06-19 University Of Southern Cailfornia Method for promoting mesenchymal stem and lineage-specific cell proliferation
US6059968A (en) 1998-01-20 2000-05-09 Baxter International Inc. Systems for processing and storing placenta/umbilical cord blood
US6291240B1 (en) 1998-01-29 2001-09-18 Advanced Tissue Sciences, Inc. Cells or tissues with increased protein factors and methods of making and using same
AU760560B2 (en) * 1998-02-12 2003-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
PT1062321E (pt) * 1998-03-13 2005-05-31 Osiris Therapeutics Inc Utilizacoes para celulas estaminais mesenquimais humanas nao autologas
TR200101501T2 (tr) 1998-03-16 2002-06-21 Celgene Corporation 2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)izoindolin türevleri, bunların hazırlanması ve enflamatuar sitokinlerin inhibitörleri olarak kullanımı.
CA2320040C (en) 1998-03-18 2007-05-22 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
US6368636B1 (en) 1998-03-18 2002-04-09 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
US20030118567A1 (en) 1999-03-26 2003-06-26 Stewart Duncan John Cell-based therapy for the pulmonary system
AU2999199A (en) 1998-04-03 1999-10-25 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells as immunosuppressants
CA2331122A1 (en) 1998-05-04 1999-11-11 Point Therapeutics, Inc. Hematopoietic stimulation
US6835377B2 (en) 1998-05-13 2004-12-28 Osiris Therapeutics, Inc. Osteoarthritis cartilage regeneration
CA2328425A1 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Osiris Therapeutics, Inc. Production of megakaryocytes by co-culturing human mesenchymal stem cells with cd34+ cells
WO1999061587A1 (en) 1998-05-29 1999-12-02 Osiris Therapeutics, Inc. Human cd45+ and/or fibroblast + mesenchymal stem cells
JP2003505006A (ja) 1998-06-08 2003-02-12 オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド ヒト間葉幹細胞の使用による造血幹細胞分化の調節
WO1999064566A2 (en) 1998-06-08 1999-12-16 Osiris Therapeutics, Inc. In vitro maintenance of hematopoietic stem cells
US6713245B2 (en) 1998-07-06 2004-03-30 Diacrin, Inc. Methods for storing neural cells such that they are suitable for transplantation
ATE238049T1 (de) 1998-07-28 2003-05-15 Synthes Ag Verwendung von kreatinsubstanzen zur behandlung von knochen- und knorpelzellen und geweben
US5958767A (en) 1998-08-14 1999-09-28 The Children's Medical Center Corp. Engraftable human neural stem cells
JP3517359B2 (ja) 1998-09-14 2004-04-12 テルモ株式会社 細胞分離・回収装置および細胞の分離・回収方法
CA2345397A1 (en) 1998-09-23 2000-03-30 Mount Sinai Hospital Trophoblast cell preparations
CA2349415A1 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Monash University Embryonic stem cells
CN1180079C (zh) 1998-11-12 2004-12-15 基质细胞有限责任公司 在三维装置中从造血祖细胞产生淋巴组织-特异细胞
US6548299B1 (en) * 1999-11-12 2003-04-15 Mark J. Pykett Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices
US6184035B1 (en) * 1998-11-18 2001-02-06 California Institute Of Technology Methods for isolation and activation of, and control of differentiation from, skeletal muscle stem or progenitor cells
US6102871A (en) 1998-11-23 2000-08-15 Coe; Rosemarie O. Blood collection funnel
US6328765B1 (en) 1998-12-03 2001-12-11 Gore Enterprise Holdings, Inc. Methods and articles for regenerating living tissue
KR20010101266A (ko) 1998-12-17 2001-11-14 프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르 Ｊｎｋ 단백질 키나제의 억제제로서의 4-아릴옥신돌
US6288089B1 (en) 1998-12-21 2001-09-11 Michael Zawada Use of kinase inhibitors for treating neurodegenerative diseases
PT1144026E (pt) 1998-12-24 2004-12-31 Biosafe Sa Sistema para separacao sanguinea util, em particular, para concentracoes de celulas estaminais hematopoieticas
CA2361806C (en) * 1999-03-18 2012-03-13 Celgene Corporation Substituted 1-oxo- and 1,3-dioxoisoindolines and their use in pharmaceutical compositions for reducing inflammatory cytokine levels
US20030007954A1 (en) * 1999-04-12 2003-01-09 Gail K. Naughton Methods for using a three-dimensional stromal tissue to promote angiogenesis
ATE321803T1 (de) 1999-04-16 2006-04-15 Univ Wm Marsh Rice Funktionalisiertes polypropylenfumarat und polypropylenfumarat-co-ethylenglykol
IN191359B (ko) 1999-04-20 2003-11-29 Nat Inst Immunology
AU4860900A (en) 1999-06-02 2000-12-18 Lifebank Services, L.L.C. Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells
US6333029B1 (en) * 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6355699B1 (en) 1999-06-30 2002-03-12 Ethicon, Inc. Process for manufacturing biomedical foams
US8075881B2 (en) * 1999-08-05 2011-12-13 Regents Of The University Of Minnesota Use of multipotent adult stem cells in treatment of myocardial infarction and congestive heart failure
US7015037B1 (en) * 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
US8147824B2 (en) 1999-08-05 2012-04-03 Athersys, Inc. Immunomodulatory properties of multipotent adult progenitor cells and uses thereof
US20040072888A1 (en) * 1999-08-19 2004-04-15 Bennett Brydon L. Methods for treating inflammatory conditions or inhibiting JNK
US7119114B1 (en) 1999-08-19 2006-10-10 Signal Pharmaceuticals, Llc Pyrazoloanthrone and derivatives thereof as JNK inhibitors and compositions and methods related thereto
IL148090A (en) 1999-09-03 2005-08-31 Cleveland Clinic Foundation Continuous particle and molecule separation with an annular flow channel
US6239157B1 (en) 1999-09-10 2001-05-29 Osiris Therapeutics, Inc. Inhibition of osteoclastogenesis
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US6280718B1 (en) 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
IL151650A0 (en) * 2000-03-09 2003-04-10 Saneron Ccel Therapeutics Inc Human cord blood as a source of neural tissue for repair of the brain and spinal cord
US7211226B2 (en) 2000-03-09 2007-05-01 Fleetgaurd, Inc. Catalyst and filter combination
WO2001075094A1 (en) 2000-04-04 2001-10-11 Thomas Jefferson University Application of myeloid-origin cells to the nervous system
US7282366B2 (en) * 2000-04-27 2007-10-16 Geron Corporation Hepatocytes for therapy and drug screening made from embryonic stem cells
US7442390B2 (en) * 2000-06-05 2008-10-28 University Of South Florida Method for enhancing engraftment of cells using mesenchymal progenitor cells
ATE332708T1 (de) 2000-06-06 2006-08-15 Glaxo Group Ltd Krebsbehandlung zusammensetzung, welche ein antineoplastisches mittel und pde4 inhibitor enthält
US6455306B1 (en) 2000-06-09 2002-09-24 Transcyte, Inc. Transfusable oxygenating composition
US7211594B2 (en) 2000-07-31 2007-05-01 Signal Pharmaceuticals, Llc Indazole compounds and compositions thereof as JNK inhibitors and for the treatment of diseases associated therewith
US20050009876A1 (en) * 2000-07-31 2005-01-13 Bhagwat Shripad S. Indazole compounds, compositions thereof and methods of treatment therewith
US6897231B2 (en) 2000-07-31 2005-05-24 Signal Pharmaceuticals, Inc. Indazole derivatives as JNK inhibitors and compositions and methods related thereto
US6458810B1 (en) 2000-11-14 2002-10-01 George Muller Pharmaceutically active isoindoline derivatives
US20020086005A1 (en) 2000-11-22 2002-07-04 Choy-Pik Chiu Tolerizing allografts of pluripotent stem cells
US7429599B2 (en) 2000-12-06 2008-09-30 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating or preventing an inflammatory or metabolic condition or inhibiting JNK
US20080152629A1 (en) 2000-12-06 2008-06-26 James Edinger Placental stem cell populations
US7311905B2 (en) 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
US7129242B2 (en) 2000-12-06 2006-10-31 Signal Pharmaceuticals, Llc Anilinopyrimidine derivatives as JNK pathway inhibitors and compositions and methods related thereto
US7122544B2 (en) 2000-12-06 2006-10-17 Signal Pharmaceuticals, Llc Anilinopyrimidine derivatives as IKK inhibitors and compositions and methods related thereto
KR100915483B1 (ko) * 2000-12-06 2009-09-03 로버트 제이 하리리 태반 줄기 세포의 회수 방법
US7091353B2 (en) 2000-12-27 2006-08-15 Celgene Corporation Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
US20030045552A1 (en) * 2000-12-27 2003-03-06 Robarge Michael J. Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
ES2629155T3 (es) 2001-02-14 2017-08-07 Anthrogenesis Corporation Matrices de tejido que comprenden células madre placentarias, y métodos para su preparación
CA3046566A1 (en) * 2001-02-14 2002-08-22 Anthrogenesis Corporation Post-partum mammalian placental stem cells for use in the treatment of neurological or renal diseases and disorders
EP1491093B1 (en) 2001-02-14 2013-07-31 ABT Holding Company Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
US6987184B2 (en) 2001-02-15 2006-01-17 Signal Pharmaceuticals, Llc Isothiazoloanthrones, isoxazoloanthrones, isoindolanthrones and derivatives thereof as JNK inhibitors and compositions and methods related
US20020132343A1 (en) 2001-03-19 2002-09-19 Clark Lum System and method for delivering umbilical cord-derived tissue-matched stem cells for transplantation
CA2396536A1 (en) 2001-08-10 2003-02-10 Saiko Uchida Human stem cells originated from human amniotic mesenchymal cell layer
DE10139783C1 (de) 2001-08-14 2003-04-17 Transtissue Technologies Gmbh Zellzusammensetzungen zur Behandlung von Osteoarthrose, sowie Verfahren zu deren Herstellung
EP1288293A1 (en) 2001-08-30 2003-03-05 Norio Sakuragawa Human neural stem cells originated from human amniotic mesenchymal cell layer
CN1195055C (zh) 2001-09-06 2005-03-30 周胜利 从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法
US20030068306A1 (en) * 2001-09-14 2003-04-10 Dilber Mehmet Sirac Medium
US9969980B2 (en) 2001-09-21 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
CA2468171C (en) 2001-11-15 2015-10-06 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
JP3728750B2 (ja) 2001-11-22 2005-12-21 ニプロ株式会社 培養皮膚及びその製造方法
US7799324B2 (en) 2001-12-07 2010-09-21 Geron Corporation Using undifferentiated embryonic stem cells to control the immune system
JP3934539B2 (ja) 2001-12-12 2007-06-20 独立行政法人科学技術振興機構 胎盤等由来の成体又は生後組織の前駆細胞
DE60236016D1 (de) 2001-12-21 2010-05-27 Mount Sinai Hospital Corp Zelluläre zusammensetzungen und verfahren zur deren bereitung und verwendung
KR20040081749A (ko) 2002-01-14 2004-09-22 헨리 포드 헬쓰 시스템 혈관을 형성하고 혈관신생 및 영양 인자를 생성시키는데사용하기 위한 골수 기질 세포로부터의 물질
AU2003205266A1 (en) * 2002-01-22 2003-09-02 Advanced Cell Technology, Inc. Stem cell-derived endothelial cells modified to disrupt tumor angiogenesis
EP1482787A4 (en) * 2002-02-13 2006-02-15 Anthrogenesis Corp EMBRYONIC TYPE DERIVED STEM CELLS DERIVED FROM MAMMALIAN POST-PARTUM PLACENTA, USES THEREOF, AND METHODS OF TREATMENT BASED ON CELLS OF THIS TYPE
US8460650B2 (en) 2007-02-12 2013-06-11 Anthrogenesis Corporation Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
US7736892B2 (en) 2002-02-25 2010-06-15 Kansas State University Research Foundation Cultures, products and methods using umbilical cord matrix cells
US20030161818A1 (en) 2002-02-25 2003-08-28 Kansas State University Research Foundation Cultures, products and methods using stem cells
KR20050013531A (ko) 2002-03-15 2005-02-04 디파트먼트 오브 베테랑스 어페어스 오피스 오브 더 제네럴 카운셀 (024) 세포의 아시알로결정자 및 당접합체를 이용하여 세포를조직 및 기관으로 표적화하는 방법 및 이를 위한 조성물
US20030187515A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-02 Hariri Robert J. Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
MXPA04009996A (es) 2002-04-12 2005-07-01 Celgene Corp Metodos para la identificacion de moduladores de la angiogenesis, compuestos descubiertos por los mismos, y metodos de tratamiento usando los compuestos.
EP1538913A2 (en) 2002-04-12 2005-06-15 Celgene Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
WO2003089619A2 (en) 2002-04-19 2003-10-30 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Placental derived stem cells and uses thereof
US20050058641A1 (en) * 2002-05-22 2005-03-17 Siemionow Maria Z. Tolerance induction and maintenance in hematopoietic stem cell allografts
MXPA04011851A (es) 2002-05-30 2005-03-31 Celgene Corp Metodos para utilizar inhibidores de jnk o mkk para modular diferenciacion de celula y para tratar desordenes mieloproliferativos y sindromes mielodispl??sticos.
US7422736B2 (en) 2002-07-26 2008-09-09 Food Industry Research And Development Institute Somatic pluripotent cells
AU2003278212B2 (en) 2002-07-31 2009-07-09 Centre National De La Recherche Scientifique Stem cells derived from adipous tissue and differentiated cells derived from said cells
KR20050086780A (ko) 2002-11-26 2005-08-30 안트로제네시스 코포레이션 세포요법제, 세포요법제 단위 및 이를 이용한 치료방법
ES2351386T3 (es) 2003-02-11 2011-02-03 John E. Davies Células progenitoras procedentes de la gelatina de wharton de cordón umbilical humano .
AU2004212009B2 (en) 2003-02-13 2010-07-29 Celularity Inc. Use of umbilical cord blood to treat individuals having a disease, disorder or condition
WO2004087896A2 (en) 2003-03-31 2004-10-14 Pfizer Products Inc. Hepatocyte differentiation of stem cells
CN1548529A (zh) 2003-05-09 2004-11-24 中国人民解放军军事医学科学院基础医 一种人胎盘间充质干细胞的分离方法
EP1641915B1 (en) * 2003-06-27 2016-07-27 DePuy Synthes Products, Inc. Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US20050042595A1 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Banking of multipotent amniotic fetal stem cells
US20050089513A1 (en) 2003-10-28 2005-04-28 Norio Sakuragawa Side population cells originated from human amnion and their uses
EP1682654A2 (en) 2003-11-10 2006-07-26 Amgen Inc. Methods of using g-csf mobilized c-kit+cells in the production of embryoid body-like cell clusters for tissue repair and in the treatment of cardiac myopathy
KR100560340B1 (ko) 2003-11-11 2006-03-14 한훈 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법
KR20050047500A (ko) 2003-11-17 2005-05-20 오일환 중간엽기질세포를 이용한 생착증진 방법
NZ547689A (en) 2003-11-19 2009-05-31 Signal Pharm Llc Indazole compounds and methods of use thereof as protein kinase inhibitors
JP2005151907A (ja) 2003-11-27 2005-06-16 Shigeo Saito 胎盤又は羊膜由来ヒト幹細胞及びその樹立方法並びに臓器への分化誘導方法
TWI338714B (en) 2003-12-02 2011-03-11 Cathay General Hospital Method of isolation and enrichment of mesenchymal stem cells from amniotic fluid
BRPI0417186A (pt) 2003-12-02 2007-03-06 Celgene Corp método de tratamento de um indivìduo tendo uma hemoglobinopatia ou uma anemia, de modulação da diferenciação de uma célula-tronco ou precursora de cd34+ para uma linhagem de eritróides, e, composição farmacêutica
US20050176139A1 (en) 2004-01-12 2005-08-11 Yao-Chang Chen Placental stem cell and methods thereof
US20050266391A1 (en) 2004-01-15 2005-12-01 Bennett Brydon L Methods for preserving tissue
US20080095749A1 (en) 2004-03-22 2008-04-24 Sudeepta Aggarwal Mesenchymal stem cells and uses therefor
EP2298861B1 (en) 2004-03-22 2017-09-13 Mesoblast International Sàrl Mesenchymal stem cells and uses therefor
NZ550027A (en) 2004-03-26 2009-03-31 Celgene Corp Systems and methods for providing a stem cell bank
WO2005105992A1 (en) 2004-04-21 2005-11-10 New York Eye & Ear Infirmary Chondrocyte culture formulations
JP2006006249A (ja) 2004-06-28 2006-01-12 Hiroshima Univ 羊膜由来細胞の培養方法及びその利用
US7244759B2 (en) 2004-07-28 2007-07-17 Celgene Corporation Isoindoline compounds and methods of making and using the same
US20080292597A1 (en) 2004-07-29 2008-11-27 David A Steenblock Umbilical Cord Stem Cell Composition & Method of Treating Neurological Diseases
WO2006019357A1 (en) 2004-08-16 2006-02-23 Cellresearch Corporation Pte Ltd Isolation of stem/progenitor cells from amniotic membrane of umbilical cord.
US7147626B2 (en) 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
US7909806B2 (en) 2004-09-23 2011-03-22 Anthrogenesis Corporation Cord blood and placenta collection kit
US8039258B2 (en) 2004-09-28 2011-10-18 Ethicon, Inc. Tissue-engineering scaffolds containing self-assembled-peptide hydrogels
US20080213332A1 (en) * 2004-11-10 2008-09-04 Shimon Slavin Cells Isolated from Placenta, Device for Isolating Same, and Uses Thereof
BRPI0518255A2 (pt) 2004-11-23 2008-11-11 Celgene Corp mÉtodos de tratamento ou prevenÇço de uma lesço do sistema nervoso central, para reduzir ou evitar um efeito adverso, e composiÇço farmacÊutica
CA2596957C (en) 2004-12-03 2015-04-14 New Jersey Institute Of Technology Substrate recognition by differentiable human mesenchymal stem cells
WO2006083394A2 (en) 2004-12-21 2006-08-10 Ethicon, Inc. Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same
US20060171930A1 (en) 2004-12-21 2006-08-03 Agnieszka Seyda Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same
JP5340599B2 (ja) 2004-12-23 2013-11-13 エシコン・インコーポレイテッド 臍帯組織由来産褥細胞ならびにその製造方法および使用方法
WO2006071773A2 (en) 2004-12-23 2006-07-06 Ethicon Incoporated Treatment of osteochondral diseases using postpartum-derived cells and products thereof
WO2006071778A2 (en) 2004-12-23 2006-07-06 Ethicon Incorporated Treatment of parkinson's disease and related disorders using postpartum derived cells
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
CA2593549C (en) 2005-01-07 2016-04-26 Wake Forest University Health Sciences Regeneration of pancreatic islets by amniotic fluid stem cell therapy
WO2006091766A2 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 Jau-Nan Lee Human trophoblast stem cells and use thereof
US20060222634A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Clarke Diana L Amnion-derived cell compositions, methods of making and uses thereof
AU2006238733A1 (en) 2005-04-16 2006-10-26 Axordia Limited Cytotrophoblast stem cell
WO2006122147A2 (en) 2005-05-10 2006-11-16 Rutgers, The State University Of New Jersey Alginate poly-l-lysine encapsulation as a technology for controlled differentiation of embryonic stem cells
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
BRPI0611739A2 (pt) * 2005-06-10 2011-12-20 Celgene Corp colágeno de atelopeptìdeo, composição, método e kit para aumentar, avolumar ou substituir tecido de um mamìfero, e, processos para preparar e para reticular colágeno de atelopeptìdeo, e para reduzir a quantidade de partìculas virais em uma composição de colágeno
US20070038298A1 (en) * 2005-06-30 2007-02-15 Sulner Joseph W Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric
EP1919500A2 (en) * 2005-07-13 2008-05-14 Anthrogenesis Corporation Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric
WO2007009061A2 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Anthrogenesis Corporation Ocular plug formed from placenta derived collagen biofabric
WO2007011693A2 (en) * 2005-07-14 2007-01-25 Medistem Laboratories, Inc. Compositions of placentally-derived stem cells for the treatment of cancer
US20080226612A1 (en) 2005-08-19 2008-09-18 Bio Regenerate, Inc. Compositions of Cells Enriched for Combinations of Various Stem and Progenitor Cell Populations, Methods of Use Thereof and Methods of Private Banking Thereof
AU2006304274B2 (en) 2005-10-13 2012-08-16 Celularity Inc. Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells
CA2624925C (en) * 2005-10-13 2014-09-30 Anthrogenesis Corporation Immunomodulation using placental stem cells
CN100344757C (zh) 2005-10-18 2007-10-24 天津昂赛细胞基因工程有限公司 人胎盘、脐带间充质干细胞库及其构建方法
PL1971681T3 (pl) 2005-12-16 2018-01-31 Depuy Synthes Products Inc Kompozycje oraz sposoby do hamowania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w przypadku transplantacji z brakiem zgodności tkankowej
WO2007073552A1 (en) 2005-12-19 2007-06-28 Ethicon, Inc. In vitro expansion of postpartum derived cells in roller bottles
SG10201401805YA (en) 2005-12-22 2014-08-28 Jane Ennis Viable cells from frozen umbilical cord tissue
WO2007076522A2 (en) 2005-12-28 2007-07-05 Ethicon, Incorporated Treatment of peripheral vascular disease using postpartum-derived cells
EP1974013A2 (en) 2005-12-29 2008-10-01 Anthrogenesis Corporation Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition
EP2412801A1 (en) 2005-12-29 2012-02-01 Anthrogenesis Corporation Co-Culture of placental stem cells and stem cells from a second source
JP5550235B2 (ja) * 2005-12-29 2014-07-16 アントフロゲネシス コーポレーション 胎盤幹細胞集団
US20070253931A1 (en) 2006-01-12 2007-11-01 Osiris Therapeutics, Inc. Use of mesenchymal stem cells for treating genetic diseases and disorders
US9944900B2 (en) 2006-01-18 2018-04-17 Hemacell Perfusion Pulsatile perfusion extraction method for non-embryonic pluripotent stem cells
NZ727755A (en) 2006-01-23 2023-01-27 Abt Holding Co Mapc therapeutics without adjunctive immunosuppressive treatment
JP5733894B2 (ja) * 2006-03-23 2015-06-10 プルリステム リミテッド 細胞を拡大培養するための方法ならびに該方法によって作製される細胞および馴化培地の治療のための使用
EP1845154A1 (en) 2006-04-12 2007-10-17 RNL Bio Co., Ltd. Multipotent stem cells derived from placenta tissue and cellular therapeutic agents comprising the same
CN101501185A (zh) * 2006-06-09 2009-08-05 人类起源公司 胎盘巢(placental niche)及其培养干细胞的用途
US20070287176A1 (en) 2006-06-13 2007-12-13 Alireza Rezania Chorionic villus derived cells
WO2008003042A2 (en) 2006-06-28 2008-01-03 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Amnion-derived stem cells and uses thereof
US7993918B2 (en) 2006-08-04 2011-08-09 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using placental stem cells
WO2008021391A1 (en) * 2006-08-15 2008-02-21 Anthrogenesis Corporation Umbilical cord biomaterial for medical use
US20120269774A1 (en) * 2006-09-21 2012-10-25 Medistem Laboratories, Inc Allogeneic stem cell transplants in non-conditioned recipients
US20080131522A1 (en) 2006-10-03 2008-06-05 Qing Liu Use of placental biomaterial for ocular surgery
WO2008060377A2 (en) 2006-10-04 2008-05-22 Anthrogenesis Corporation Placental or umbilical cord tissue compositions
CA2665369C (en) 2006-10-06 2023-01-10 Anthrogenesis Corporation Human placental collagen compositions, and methods of making and using the same
CN104099290A (zh) 2006-10-23 2014-10-15 人类起源公司 用胎盘细胞群治疗骨缺损的方法和组合物
US9102915B2 (en) 2006-11-13 2015-08-11 DePuy Synthes Products, Inc. In vitro expansion of postpartum-derived cells using microcarriers
AU2008216748A1 (en) 2007-02-12 2008-08-21 Anthrogenesis Corporation Hepatocytes and chondrocytes from adherent placental stem cells; and CD34+, CD45- placental stem cell-enriched cell populations
WO2009042201A1 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Celgene Cellular Therapeutics Angiogenic cells from human placental perfusate
WO2009045360A2 (en) 2007-09-28 2009-04-09 Celgene Cellular Therapeutics Tumor suppression using human placental perfusate and human placenta-derived intermediate natural killer cells
KR20160040739A (ko) 2007-11-07 2016-04-14 안트로제네시스 코포레이션 조산 합병증의 치료에 있어서의 제대혈의 용도
NZ591294A (en) * 2008-08-20 2012-10-26 Anthrogenesis Corp Treatment of stroke using isolated placental cells
KR20210010648A (ko) * 2008-08-20 2021-01-27 안트로제네시스 코포레이션 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법
RU2011110736A (ru) * 2008-08-22 2012-09-27 Антродженезис Корпорейшн (Us) Способы и композиции для лечения костных дефектов с помощью плацентарных клеточных популяций
RU2015130665A (ru) 2008-11-19 2018-12-24 Антродженезис Корпорейшн Амниотические адгезивные клетки
NZ602569A (en) 2008-11-21 2014-03-28 Anthrogenesis Corp Treatment of diseases, disorders or conditions of the lung using placental cells
US20100323446A1 (en) 2009-06-05 2010-12-23 Jill Renee Barnett Method of collecting placental cells
CA2767014C (en) 2009-07-02 2022-01-25 Anthrogenesis Corporation Method of producing erythrocytes without feeder cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell Research, Vol.15, No.7, pp.539-547 (2005)*
Experimental Hematology, Vol.32, pp.657-664 (2004)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018008941A1 (ko) 2016-07-04 2018-01-11 주식회사 강스템바이오텍 연골 무세포 파쇄물 및 줄기세포를 포함하는 연골분화 촉진용 복합체 및 그의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008100498A3 (en) 2008-10-30
MX2009008563A (es) 2009-10-19
SI2120977T1 (sl) 2014-01-31
IL262075B (en) 2021-12-01
IL233376A0 (en) 2014-08-31
US20170007648A1 (en) 2017-01-12
MX349225B (es) 2017-07-19
ME01562B (me) 2014-09-20
EP3103462A1 (en) 2016-12-14
WO2008100498A2 (en) 2008-08-21
JP2010518096A (ja) 2010-05-27
IL200338A (en) 2014-07-31
US20080226595A1 (en) 2008-09-18
CN101657206A (zh) 2010-02-24
EP2915537A2 (en) 2015-09-09
IL262075A (en) 2018-11-29
EP3763376A1 (en) 2021-01-13
US11723930B2 (en) 2023-08-15
US20200397830A1 (en) 2020-12-24
CY1114301T1 (el) 2016-08-31
IL233377A (en) 2016-11-30
NZ578819A (en) 2012-02-24
ES2425181T3 (es) 2013-10-11
PL2120977T3 (pl) 2013-12-31
HRP20130765T1 (hr) 2013-10-25
US20110280843A1 (en) 2011-11-17
EP2915537A3 (en) 2015-10-28
HK1214530A1 (zh) 2016-07-29
US8460650B2 (en) 2013-06-11
JP2014221790A (ja) 2014-11-27
CA2677397A1 (en) 2008-08-21
RS52921B (en) 2014-02-28
CN103356710A (zh) 2013-10-23
US20110280845A1 (en) 2011-11-17
AU2008216749A1 (en) 2008-08-21
JP5979811B2 (ja) 2016-08-31
IL233377A0 (en) 2014-08-31
EP2687220A3 (en) 2014-05-14
US20130344037A1 (en) 2013-12-26
ZA200905376B (en) 2011-03-30
EP2687220A2 (en) 2014-01-22
ZA201008540B (en) 2012-11-28
KR20150039214A (ko) 2015-04-09
EP2120977B1 (en) 2013-05-15
KR20090109575A (ko) 2009-10-20
PT2120977E (pt) 2013-09-16
EP2120977A2 (en) 2009-11-25
HK1135328A1 (en) 2010-06-04
NZ597779A (en) 2013-07-26
IL233376A (en) 2015-10-29
EP2630959A1 (en) 2013-08-28
NZ612888A (en) 2015-02-27
CN103356711A (zh) 2013-10-23
US8916146B2 (en) 2014-12-23
AU2008216749B2 (en) 2014-03-13
CA2677397C (en) 2016-04-05
DK2120977T3 (da) 2013-08-12
US20150190433A1 (en) 2015-07-09
CN101657206B (zh) 2013-07-03
IL200338A0 (en) 2010-04-29
IL248463A0 (en) 2016-11-30
US8753883B2 (en) 2014-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11723930B2 (en) Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
US9539288B2 (en) Immunomodulation using placental stem cells
AU2014203165B2 (en) Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
AU2018232953A1 (en) Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
AU2020200467A1 (en) Immunomodulation using placental stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
E801 Decision on dismissal of amendment
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181025

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191029

Year of fee payment: 5