CN101657206A - 利用胎盘干细胞治疗炎性疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用胎盘干细胞或脐带干细胞治疗患有免疫相关疾病、障碍或病状的个体的方法，例如：炎性肠病、移植物抗宿主疾病、多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(阿－巴二氏综合症)或硬皮病。

Description

利用胎盘干细胞治疗炎性疾病
本申请要求2007年2月12日提交的美国临时申请号60/901,067的优先权，其通过引用被全文纳入于本说明书中。
1.发明领域
本发明提供了利用人胎盘干细胞治疗患有疾病、障碍或病状的个体的方法，所述疾病、障碍或病状是由不希望或有害的免疫反应导致，或者与不希望的或有害的免疫反应相关，例如：炎性肠病、移植物抗宿主疾病、多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)或硬皮病。
2.发明背景
人类干细胞是全能或多能前体细胞，能够产生多种成熟的人细胞系。现有证据证实，许多种组织(即使不是所有组织)都能使用干细胞重建，并恢复生理学和组织学功能。
已经表征了多种不同类型的哺乳动物干细胞。参见例如：Caplan等人，美国专利号5,486,359(人间充质干细胞)；Boyse等人，美国专利号5,004,681(胎儿和新生儿造血干细胞和前体细胞)；Boyse等人，美国专利号5,192,553(同上)；Beltrami等人，Cell 114(6)：763-766(2003)(心肌干细胞)；Forbes等人，J.Pathol.197(4)：510-518(2002)(肝脏干细胞)。脐带血和来自脐带血的全部有核细胞已被用于移植，在已进行了剥除疗法(ablative therapy)的患者中部分或完全恢复造血功能。
胎盘是特别有吸引力的干细胞来源。由于哺乳动物胎盘来源充足，并且通常作为医学废物丢弃，它们代表了可用于医疗的干细胞的独特来源。本发明提供了这样的分离的胎盘干细胞、胎盘干细胞群，和利用上述细胞治疗疾病、障碍或病状的方法，所述疾病、障碍或病状是由不想要或有害的免疫反应导致的，或者与不想要或有害的免疫反应相关的，例如：炎性肠病、移植物抗宿主疾病、多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)或硬皮病。
3.发明概述
本发明提供了治疗、控制、改善或预防与免疫反应相关、或由免疫反应导致的疾病、障碍和/或病状(例如：与炎症相关、导致炎症或由炎症导致的疾病、障碍和/或病状)的方法。在一个实施方案中，本发明提供了治疗已患有或有风险患有疾病、障碍或病状的个体的方法，所述疾病、障碍或病状是与有害的、不利的、不合适或不希望的免疫反应相关或由其导致的，例如炎症，所述方法包括向个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或被胎盘干细胞条件化的培养基，其中治疗有效量是足以可检测地改善所述疾病、障碍或病状的一种或多种症状或者减缓一种或多种症状的发展的量。本发明还提供了胎盘干细胞在制备下述药物中的用途，所述药物用于治疗、控制、改善或预防与免疫反应相关、或由免疫反应导致的疾病、障碍和/或病状，例如：与炎症相关、导致炎症或由炎症导致的疾病、障碍和/或病状。在一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD10+、CD34-、CD105+、CD200+的胎盘干细胞。在另一个实施方案中，所述胎盘干细胞表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105，并且当含有所述胎盘干细胞的干细胞群在允许胚状体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞利于在所述胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体，或者所述胎盘干细胞表达OCT-4并且当含有所述胎盘干细胞的干细胞群在允许胚状体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞利于在所述胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体。在一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞抑制免疫细胞的活性，例如抑制T细胞的增殖。
在一个具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是炎性肠病。在一个更具体的实施方案中，所述炎性肠病是克隆氏病。在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是胃十二指肠的克隆氏病。在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是空肠回肠炎。在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是回肠炎。在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是回肠结肠炎。在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是克隆氏结肠炎。在另一个更具体的实施方案中，所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。
在另一个更具体的实施方案中，所述炎性肠病的症状是部分胃肠道的一处或多处炎症和肿大、腹痛、肠道的频繁排空、腹泻、直肠出血、贫血、体重减轻、关节炎、皮肤问题、发热、小肠壁增厚、肠道疤痕组织形成、肠道中形成疮和溃疡、肠壁形成一处或多处瘘管、形成一处或多处肛门裂、发展成营养不良、发展成肾结石、发展成胆结石、发展成肝或胆系统的疾病、出血性腹泻、恶心、腹部绞痛、贫血、疲劳、体重减轻、胃口丧失、体液或营养物丧失、皮肤损害、关节痛、生长迟缓、发展成骨质疏松、或眼部炎症。
在另一个更具体的实施方案中，所述炎性肠病的症状是一处或多处搔痒或刺痛的皮疹、发热、泛发性红皮病、脱皮、胆红素水平升高(例如：高于正常)、谷丙转氨酶(ALT)的水平升高、谷草转氨酶(AST)的水平升高、碱性磷酸酶(AP)的水平升高、腹泻、肠道出血、痉挛、腹痛和肠梗阻，眼烧灼感、眼刺激、畏光、由于眼泪分泌减少导致眼睛疼痛、口干、对酸或辣食物敏感、腹痛、吞咽困难、吞咽痛、体重减轻、阻塞性肺病、肌无力、神经性疼痛或肌痉挛。
在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是移植物抗宿主疾病。在更具体的实施方案中，所述移植物抗宿主疾病发生在同种异体骨髓移植之后。在另一个更具体的实施方案中，所述移植物抗宿主疾病发生在实体器官移植之后。在另一个更具体的实施方案中，所述移植物抗宿主疾病发生在复合组织同种异体移植之后。在另一个更具体的实施方案中，通过所述施用，所述移植物抗宿主疾病减轻至少一个级别。在另一个更具体的实施方案中，作为所述施用的结果，在移植后100天内，所述移植物抗宿主疾病的发展不超过II级。在另一个更具体的实施方案中，作为所述施用的结果，在移植后100天内，所述移植物抗宿主疾病的发展不超过I级。
在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是类风湿性关节炎(RA)。在更具体的实施方案中，所述施用在患RA的个体的至少一个关节中，足以可检测地改善一种或多种RA症状，或足以可检测地降低一种或多种RA症状的发生。在另一个更具体的实施方案中，所述施用在患RA的个体的至少一处非关节组织中，足以可检测地改善一种或多种RA症状，或足以可检测地降低一种或多种RA症状的发生。在更具体的实施方案中，所述非关节组织是皮肤(真皮)、肺、自身免疫系统或血液、肾组织、心血管组织、眼组织或神经组织。在更具体的实施方案中，所述RA症状是RA的并发病状。在更具体的实施方案中，所述RA的并发病状是坏疽性脓皮症、嗜中性白细胞皮肤病、斯威特氏综合征(Sweet′s syndrome)、病毒感染、结节性红斑、小叶性脂膜炎、肢端皮肤萎缩、掌红斑、弥漫性变薄(米纸皮肤)、皮肤脆弱、在外表面的皮下结节(例如肘部)、肺纤维变性(例如：甲氨蝶呤治疗所导致的)、卡普兰氏结节、血管炎性障碍、甲褶梗死、神经病、肾病、淀粉样变性、假性肌肥大、心内膜炎、左心室衰竭、血管炎、巩膜软化、多发性单神经炎、寰枢椎不全脱位。在本发明方法的另一个具体的实施方案中，多个胎盘或脐带干细胞被遗传改造以表达包含IL-1Ra和DHFR的融合蛋白。
在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是多发性硬化。在更具体的实施方案中，所述多发性硬化是复发/缓解型多发性硬化、继发进行性多发性硬化、原发进行性多发性硬化，或进行性/复发性多发性硬化。在另一个更具体的实施方案中，所述多发性硬化的症状是四肢的一处或多处感觉障碍、视神经机能障碍、锥体束机能障碍、膀胱机能障碍、肠机能障碍、性障碍、共济失调或复视。
在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是红斑狼疮。在更具体的实施方案中，所述红斑狼疮的症状是一处或多处面颊疹、蝶形疹、盘状狼疮、脱发，口、鼻或阴道溃疡，皮肤损害、关节痛贫血和/或铁缺乏、低于正常的血小板和白血细胞计数、抗磷脂抗体综合征、血液中出现抗心磷脂抗体、心包炎、心肌炎、心内膜炎、肺和/或胸膜炎症、胸膜炎、胸膜渗漏、狼疮性肺炎、慢性弥漫性肺间质病、肺动脉高血压、肺栓塞、肺出血、无痛性血尿或蛋白尿、狼疮性肾炎、肾衰竭，和/或出现具有“线环状”异常的膜性肾小球肾炎；神经病变(例如：癫痫、精神病、脑脊液异常)；T-细胞异常(例如：CD45磷酸酶缺乏和/或CD40配体表达增加)；和/或非特异性病变(例如：狼疮性胃肠炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳疾病、副交感神经障碍、视网膜脉管炎、系统性脉管炎、FcεRIγ表达增加、T细胞内钙水平升高和维持、血中三磷酸肌醇升高、蛋白激酶C磷酸化降低、Ras-MAP激酶信号的降低，和/或蛋白激酶AI活性的缺陷)。
在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是硬皮病。在更具体的实施方案中，硬皮病是弥漫性硬皮病。在更具体的实施方案中，硬皮病是局限性硬皮病(CREST综合症)。在更具体的实施方案中，硬皮病是斑状/线状硬皮病。在另一个更具体的实施方案中，其中所述症状是面部皮肤的一处或多处硬化、手指皮肤的硬化、雷诺综合症、不合适的肢体血管收缩、钙化、毛细管扩张、食道运动障碍、或血中出现抗着丝粒抗体或抗scl70/抗拓扑异构酶抗体。在另一个更具体的实施方案中，本发明方法包括向所述个体施用第二治疗剂。在另一个更具体的实施方案中，所述第二治疗剂是抗炎药、质子泵抑制剂、免疫抑制化合物或血管扩张剂。
在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)。在更具体的实施方案中，所述蕈样真菌病处于斑块期。在更具体的实施方案中，其中所述蕈样真菌病处于皮肤肿瘤期。在更具体的实施方案中，所述蕈样真菌病处于皮肤发红阶段(红皮病)。在更具体的实施方案中，所述蕈样真菌病处于淋巴结阶段。在更具体的实施方案中，所述症状是出现一处或多处瘙痒的扁平红斑；出现隆起且硬的扁平红斑(斑块)；出现隆起的肿块(结节)；在全身出现大的红色、瘙痒、鳞片区；手掌和脚掌裂开；手掌和脚掌皮肤增厚；开裂；或淋巴结炎症。在更具体的实施方案中，所述方法包括向所述个体施用第二治疗剂。在更具体的实施方案中，所述第二治疗剂是抗炎药、免疫抑制化合物、暴露于阳光、暴露于紫外线、外用类固醇、局部表面放疗、全皮肤电子束辐照、向被红皮病感染的皮肤施用有机蜂蜜、干扰素、维甲酸、rexinoid或vorinostat。
在另一个实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是糖尿病。在具体的实施方案中，所述糖尿病是1型糖尿病。
在另一个实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是牛皮癣。在更具体的实施方案中，所述牛皮癣是斑块状银屑病(寻常性牛皮癣)。在另一个更具体的实施方案中，所述牛皮癣是屈侧银屑病(皮褶牛皮癣)。在另一个更具体的实施方案中，所述牛皮癣是滴状牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中，所述牛皮癣是脓疱性牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中，所述牛皮癣是指(趾)甲牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中，所述牛皮癣是牛皮癣关节炎。在另一个更具体的实施方案中，所述牛皮癣是红皮性牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中，治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞，或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基是足以使牛皮癣区域严重性指数(Psoriasis Area Severity Index)降低5、10、15、20、25、30、35、40或更多点的量。在一个实施方案中，发明提供了向患有牛皮癣的个体施用有效剂量的胎盘干细胞，其中所述有效剂量是所述量的胎盘干细胞足以可检测地改善例如一种或多种牛皮癣症状、降低一种或多种牛皮癣症状的严重程度或减缓一种或多种牛皮癣症状的发展。在更具体的实施方案中，所述一种或多种症状是出现一处或多处被银白色鳞状皮肤覆盖的发炎皮肤的隆起区域；出现斑块；出现在皮肤皱褶处的皮肤光滑炎症斑；出现一处或多处小椭圆状丘疹；出现一处或多处脓包；一个或多个手指甲或脚趾甲外观的改变；甲松离；一个或多个指(趾)甲剥落；关节和结缔组织炎症；指(趾)炎；脊椎炎；大部分表皮肤的泛发炎症和表皮脱落；或者严重的瘙痒、肿大和/或疼痛。在另一个实施方案中，本发明的方法包括再施用一种或多种治疗剂或疗法，其中，所述治疗剂或疗法包括一种或多种包含皮质类固醇的乳膏或油膏、包含维生素D3类似物的乳膏或油膏、包含蒽啉的乳膏或油膏、包含坚果油的乳膏或油膏、包含类维生素A的乳膏或油膏、包含坚煤焦油的乳膏或油膏；在紫外线下暴露一次或多次，例如暴露约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20分钟，例如波长在约280nm至约315nm之间的UVB，特别是约311nm至约312nm的UVB；局部施用补骨脂素，结合UVA暴露；或者一次或多次系统性施用一种或多种氨甲蝶呤、环孢霉素、类维生素A、硫鸟嘌呤、羟基脲、硫氮磺胺吡啶、麦考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、口服他克莫司和/或延胡索酸酯。
在任何上述方法的另一个具体的实施方案中，所述方法包括向患有疾病、障碍或病状的个体施用第二治疗剂。在更具体的实施方案中，所述第二治疗剂是抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、镇痛药或抗生素。在更具体的实施方案中，所述第二治疗剂是免疫调节剂。在更具体的实施方案中，所述免疫调节剂是免疫抑制剂。在更具体的实施方案中，所述免疫抑制剂是抗CD3抗体(例如：OKT3，muronomab)、抗IL-2受体抗体(例如：巴利昔单抗(
Figure G200880011754XD00081
)和达珠单抗(
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))、抗T细胞受体抗体(例如：Muronomab-CD3)、硫唑嘌呤、神经钙蛋白抑制剂、皮质类固醇、环孢霉素、氨甲蝶呤、巯基嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、他克莫司或西罗莫司。在另一个更具体的实施方案中，所述第二治疗剂包括另一种类型的干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞、骨髓或造血干细胞。
3.1定义
如本文中使用的，术语“SH2”指与标志物CD105上的表位结合的抗体。因此，被称为SH2+的细胞是CD105+。
如本文中使用的，术语“SH3”和“SH4”指与标志物CD73上的表位结合的抗体。因此，被称为SH3+和/或SH4+的细胞是CD73+。
如本文中使用的，术语“分离的干细胞”指基本上与干细胞来源的组织(例如：胎盘)中的其它非干细胞分离的干细胞。如果至少去除了50％、60％、70％、80％、90％、95％，或至少99％的与干细胞天然相关的非干细胞(例如，在干细胞的收集和/或培养过程中)，则干细胞是“分离的”。
如本文中使用的，术语“分离的细胞群”意指基本上与细胞群来源的组织(例如：胎盘)中的其它细胞分离的细胞群。例如，如果至少去除了50％、60％、70％、80％、90％、95％，或至少99％的与干细胞群天然相关的细胞(例如，在干细胞群的收集和/或培养过程中)，则干细胞群是“分离的”。
如本文中使用的，术语“胎盘干细胞”指源自哺乳动物胎盘的干细胞或前体细胞，而不考虑形态学、细胞表面标志物、或原代培养后的传代数，其附着于组织培养基质上(例如：组织培养塑料或纤粘连蛋白包被的组织培养板)。然而，本文中使用的术语“胎盘干细胞”不是滋养层、细胞滋养层、生殖细胞或胚胎干细胞(如本领域技术人员所理解的那些细胞)。如果细胞保留了干细胞的至少一种属性，则认为该细胞是“干细胞”，例如：与一种或多种类型的干细胞相关的标志物或基因表达谱；在培养时复制至少10-40代的能力；多潜能，例如在体外、体内或两种情况下分化成三个胚层中的一层或多层细胞的能力；缺少成体(即，已分化)细胞的特征；等等。术语“胎盘干细胞”和“胎盘来源的干细胞”可以互换使用。除非另外注明，术语“胎盘”包括脐带。在一些实施方案中，本发明中披露的胎盘干细胞是体外多潜能的(即，在分化条件下细胞在体外分化)、体内多潜能的(即，细胞在体内分化)，或两者兼有。
如本文中使用的，当标志物可检测时，干细胞对该特定标志物是“阳性”的。例如，由于胎盘干细胞上存在可检测的CD73，它的量可检测地大于背景(例如，与同种型对照相比)，胎盘干细胞就是CD73阳性。在下述情况下细胞也是标志物阳性的：所述标志物可用于区分所述细胞与至少一种其它类型细胞，或者当存在于该细胞或被该细胞表达时所述标志物可用于选择或分离所述细胞。
如本文中使用的，“免疫调节作用”和“免疫调节”指导致或能够导致免疫应答可检测的改变，以及导致免疫应答可检测的改变的能力。
如本文中使用的，“免疫抑制”和“免疫抑制性”意指导致，或具有能力导致免疫应答的可检测的降低，以及导致免疫应答的可检测的抑制的能力。
4.附图说明
图1：来自灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带干细胞(E)的胎盘干细胞的活力。X-轴上的数字表示获得干细胞的胎盘。
图2：由FACSCalibur确定的来自灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带干细胞(E)的HLAABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞的百分比。X-轴上的数字表示获得干细胞的胎盘。
图3：由FACS Aria确定的来自灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带(E)的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞的百分比。X-轴上的数字表示获得干细胞的胎盘。
图4：源自胎盘灌流液的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图5：源自羊膜的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图6：源自绒毛膜的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图7：源自羊膜-绒毛膜盘的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图8：源自脐带的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图9：源自灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带(E)的干细胞中，HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200表达的平均表达。
图10A和10B：混合淋巴细胞反应(MLR)是原始免疫应答模型，被胎盘干细胞抑制。通过门控的“活的”且CD8+和CD4+的T细胞门，监控羧基荧光素琥珀酰酯(CFSE)Low细胞的百分比(分别是图10A和10B)。该百分比在6天MLR(图10C和10D，MLR道)后增加，且在添加胎盘干细胞(图3C和3D，PMLR道)后，在CD8+和CD4+T细胞室中效果被逆转。
图11：来自羊膜绒毛膜盘(AC)和脐带基质(UC)的胎盘来源的干细胞抑制同种异体-MLR。用CD4+T细胞或CD8+T细胞，或者等量的CD4+T细胞和CD8+T细胞实施MLR。横坐标：增殖的抑制百分比。
图12：胎盘干细胞和脐带干细胞抑制同种异体-MLR。在圆底96孔板的孔中进行6天实验。胎盘细胞∶T细胞∶树突细胞＝约1∶10∶1。干细胞获自羊膜绒毛膜(AC)、羊膜(AM)或脐带(UC)。FB＝成纤维细胞。BM＝骨髓来源的间充质干细胞。
图13：来自不同供体的胎盘干细胞不同程度地抑制同种异体-MLR。该图比较了来自两个胎盘供体的胎盘干细胞对MLR的抑制，所述供体为61665和63450。来自胎盘63450的干细胞表现出比来自胎盘61665的干细胞更大程度的MLR抑制。
图14：17天回归测定和被修饰的胎盘干细胞的回归测定。X轴表示测定中添加的胎盘干细胞数。Y轴上测量了存活的CD23+LCL细胞数(淋巴母细胞系，人工创建的转化的B细胞系)。
图15：在6天回归测定中胎盘干细胞对T细胞增殖的抑制。利用CFSE染色的T细胞建立回归测定。6天后，评定T细胞增殖。显示了来自羊膜-绒毛膜(AC)、脐带(UC)、羊膜(AM)或骨髓(BM)的干细胞对T细胞增殖的相对抑制。
图16：在MLR中，在引入跨膜插入物时抑制的百分比变化，其中将胎盘细胞与T细胞隔离，但允许培养基的交换。在25,000、50,000、75,000或100,000个脐带干细胞/反应时，显示相对高程度的抑制，以及为了实现抑制在高滴度中对细胞-细胞接触的相对高程度的需要。
图17：添加12,500(UC OP/TW 12.5)至100,000(UC OP/TW 100)的脐带基质干细胞(UC)，通过膜将其与MLR分离(TW)或与MLR(OP)接触。使用等量的CD4+T细胞和CD8+T细胞，计算MLR的百分比抑制(％CFSELow＝89％)。
图18：胎盘干细胞剂量和细胞-细胞接触依赖性之间的关系是非线性的。根据图17给出的值计算在引入插入物时MLR抑制的改变。
图19：胎盘干细胞和BMSC对T细胞应答的差异抑制。通过比较CFSELow门中的MLR T细胞(高于70％)与贴壁细胞MLR中T细胞的百分比来计算胎盘干细胞或BMSC产生的抑制程度。MLR与贴壁细胞分离(跨膜)，或在开放孔中实施(开放)。X轴给出了贴壁细胞数，单位为千，添加至500,000T细胞和50,000DC细胞中。贴壁细胞与T细胞的比为1∶5至1∶40。
图20：对于胎盘干细胞和骨髓-来源的干细胞免疫抑制的差异性细胞-细胞接触需求。根据图15中给出的抑制数据，计算接触依赖性，以贴壁细胞/T细胞的比例来显示(n＝3，除了UC：n＝2)。
图21：胎盘干细胞-介导的T细胞抑制不需要T调节细胞。利用全PBMC或去除T调节细胞的PBMC来实施抑制测定，CFSE染色，在一些条件下加入UC胎盘干细胞。N＝1。
图22：在次级MLR中CFSEHigh细胞的增殖。从使用了CFSE染色细胞的胎盘干细胞MLR中，在FACS Aria上分离CFSEHigh T细胞。所述细胞用于MLR。N＝1。
图23：在75％替换时，来自抑制的干细胞MLR的上清液不抑制MLR。实施了UC(PUC)、AC(PAC)和BMSC(PBM)MLR，都抑制MLR超过50％。用来自实验的上清液替换200μl用于新鲜MLR的培养基中的10-150μl。作为对照，以相同的方式使用来自T细胞和AC(T/AC)或T细胞和骨髓-来源的干细胞(T/BM)的共培养物的培养基(N＝2)。
图24A和24B：预孵育的T细胞和贴壁细胞不影响MLR抑制。在两个独立实验中使用来自2个供体的T细胞。在添加DC(第0天，A)或CFSE+CD3+T细胞(B，从而开始MLR)前，将成熟的DC(A)或CFSE染色的CD3+T细胞(B)与脐带干细胞(UC)或骨髓-来源的干细胞孵育指定的天数。然后，如常的进行贴壁细胞MLR 6天。N＝2。
图25A和25B：A.MLR中分泌的MIP-1α和MIP-1β，胎盘干细胞或骨髓-来源的干细胞的MLR与MLR抑制反向相关。B：来自相同实验的T细胞和NK细胞CFSE数据。从图14B显示的MLR中收获上清液，分析MIP-1α和MIP-1β。B：如上述实施MLR，观察到平均55％(T细胞)或83％(NK细胞)CFSELow细胞。计算干细胞添加的抑制效应。N＝2(NK部分：N＝1)。
图26：在修饰的回归测定和MLR上清液中，测量了MCP-1。MLR的胎盘干细胞抑制和回归测定与化学趋化物MCP-1分泌相关。AC：来自羊膜-绒毛膜盘的干细胞。UC：来自脐带的干细胞。浅色条：MLR测定结果。深色条：回归测定结果。Y轴：检测溶液中的MCP-1的pg。
图27：在修饰的MLR和回归测定的上清液中，IL-6的测量。修饰的MLR和回归测定的胎盘干细胞抑制与IL-6分泌相关。AC：来自羊膜-绒毛膜盘的干细胞。UC：来自脐带的干细胞。浅色条：MLR测定结果。深色条：回归测定结果。Y轴：检测溶液中的IL-6的pg。
5.详细说明
本发明提供了治疗患有疾病、障碍或病状的个体的方法，所述疾病、障碍或病状是与不合适的、不需要的、有害的或不利的免疫反应相联系的、由其产生的或相关的，例如自体免疫性疾病，所述方法包括向患有疾病、障碍或病状的个体施用一次或多次剂量的胎盘干细胞和/或脐带干细胞。下文将详细讨论用于治疗此类个体的方法，以及单独施用此类干细胞或与其它疗法组合的方法。
5.1.利用胎盘干细胞的免疫调节
本发明提供了通过将免疫细胞与多个胎盘干细胞接触，调节(例如：抑制)免疫细胞或多个免疫细胞的活性(例如：增殖)的方法。这样的免疫调节可用于治疗患有疾病、障碍或病状的个体，所述疾病、障碍或病状是由不需要的或有害的免疫反应导致的、或与其相关的，例如炎性肠病、移植物抗宿主疾病、多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)或硬皮病。此类免疫调节还可用于例如降低或消除抗同种异体组织的宿主免疫应答，所述组织例如移植的器官，复合组织同种移植物等。
在一个实施方案中，本发明提供了抑制免疫应答的方法，包括将多个免疫细胞与多个胎盘干细胞接触一段时间，所述时间足够使所述胎盘干细胞可检测地抑制免疫反应，其中所述胎盘干细胞可检测地抑制混合淋巴细胞反应(MLR)测定或回归测定中的T细胞增殖。
胎盘干细胞是例如本文中别处描述的胎盘干细胞(参见5.2节)。用于免疫抑制的胎盘干细胞可以源自或获自单个胎盘或多个胎盘。用于免疫抑制的胎盘干细胞还可以源自单个物种，例如预定接受者的物种，或者其功能需要被降低或抑制的免疫细胞的物种，或者可以源自多个物种。
在所述方法的描述中，“免疫细胞”指免疫系统的任何细胞，特别是T细胞和NK(天然杀伤)细胞。因此，在所述方法的不同实施方案中，胎盘干细胞接触多个免疫细胞，其中所述多个免疫细胞是或者包括多个T细胞(例如：多个CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)和/或天然杀伤细胞。在所述方法的描述中，“免疫反应”可以是免疫细胞对免疫细胞通常接受的刺激的任何反应，例如：对存在抗原的反应。在不同实施方案中，所述免疫反应可以是T细胞(例如：CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)响应外来抗原的增殖，例如存在于灌流液或移植物中的抗原，或自身抗原(如在自身免疫性疾病中)。免疫反应还可以是移植物所含T细胞的增殖。所述免疫反应还可以是天然杀伤细胞的任何活动、树突细胞的成熟，等等。所述免疫反应还可以是一类或多类免疫细胞活性的局部的、组织-特异性或器官-特异性效应或全身效应，例如免疫反应可以是移植物抗宿主病、炎症、炎症-相关疤痕组织的形成、自体免疫病状(例如：类风湿性关节炎、I型糖尿病、红斑狼疮等)等。
在本文中，“接触”涵盖了在单个容器(例如：培养皿、瓶、小瓶等)中，或在体内，例如同一个体(例如：哺乳动物如人)，将胎盘干细胞和免疫细胞置于一起。在优选的实施方案中，接触足够长的时间并接触足够数量的胎盘干细胞和免疫细胞，使得免疫细胞的免疫功能的改变可检测。更优选的，在多个实施方案中，与不存在胎盘干细胞的免疫功能相比，所述接触足以抑制至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％的免疫功能(例如响应抗原的T细胞增殖)。可以在体外测定中确定体内环境中的此类抑制(参见下文)；也就是说，对于接受者个体中的特定胎盘干细胞数和免疫细胞数，从体外测定中的抑制程度可以外推至个体中的抑制程度。
在一些实施方案中，本发明提供了在体外利用胎盘干细胞调节免疫反应的方法，或调节一类或多类的多个免疫细胞的活性的方法。胎盘干细胞和多个免疫细胞的接触可以包括在相同物理空间中合并胎盘干细胞和免疫细胞，使多个胎盘干细胞中的至少一部分与多个免疫细胞中的至少一部分接触；将胎盘干细胞和免疫细胞保持在具有相同培养基的分离的物理空间中；或者可以包括将来自胎盘干细胞或免疫细胞的一种培养物的培养基与另一类型的细胞接触(例如：从胎盘干细胞培养物获得培养基，并将分离的免疫细胞重悬在该培养基中)。在具体的实施例中，在混合淋巴细胞反应(MLR)中进行所述接触。在另一个具体的实施方案中，在回归测定中进行所述接触。
这样的接触可以发生在为确定特定的多个胎盘干细胞免疫调节(如免疫抑制)的程度而设计的实验设定中。此类实验设定可以是例如混合淋巴细胞反应(MLR)或回归测定。实施MLR和回归测定的方法是本领域普遍已知的。参见例如：Schwarz，“The Mixed Lymphocyte Reaction：An In Vitro Test forTolerance，”J.Exp.Med.127(5)：879-890(1968)；Lacerda等人，“Human Ep-stein-Barr Virus(EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially toand Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoprolif-erations in Xenografted CB-17 Scid/Scid Mice，”J.Exp.Med.183：1215-1228(1996)。在优选的实施方案中，实施的MLR中多个胎盘干细胞与多个免疫细胞接触(例如：淋巴细胞，如CD3+、CD4+和/或CD8+T淋巴细胞)。
MLR可用于确定多个胎盘干细胞的免疫抑制能力。例如，可以在MLR中测试这样的多个胎盘干细胞，所述MLR包括以约10∶1∶2的比例组合CD4+或CD8+T细胞、树突细胞(DC)和胎盘干细胞，其中T细胞用染料(例如CFSE，其分配至子细胞中)染色，并使T细胞增殖约6天。如果与存在DC但不存在胎盘干细胞的条件下的T细胞增殖相比，在存在胎盘干细胞的条件下，6天的T细胞增殖可检测地降低，则多个胎盘干细胞是免疫抑制的。在这样的MLR中，胎盘干细胞是解冻的或从培养物中收获的。约20,000个胎盘干细胞重悬在100μl的培养基(RPMI 1640，1mM HEPES缓冲液，抗生素和5％合并的人血清)中，使它们与孔底贴壁2小时。利用Miltenyi磁珠从全外周血单核细胞中分离CD4+和/或CD8+T细胞。所述细胞是CFSE染色的，每孔添加总量100,000个T细胞(仅CD4+T细胞，仅CD8+T细胞，或等量的CD4+和CD8+T细胞)。将孔内体积补至200μl，进行MLR。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了抑制免疫反应的方法，包括包括将多个免疫细胞与多个胎盘干细胞接触一段时间，所述时间足够使所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定或回归测定中可检测地抑制T细胞增殖。在一个实施方案中，在MLR中使用的所述胎盘干细胞表示来自更大胎盘干细胞群的胎盘干细胞样品或等份。
从不同胎盘或同一胎盘的不同组织获得的胎盘干细胞群，调节免疫细胞活性的能力可以不同，例如：抑制T细胞活性或增殖或NK细胞活性的能力可以不同。因此，理想地在使用前确定具体胎盘干细胞群的免疫抑制能力。例如，可以通过在MLR或回归测定中检测胎盘干细胞群的样品，确定这种能力。在一个实施方案中，用样品实施MLR，并确定该测定中胎盘干细胞群所导致的免疫抑制程度。然后，该免疫抑制的程度可以归因于样本来源的胎盘干细胞群。因此，MLR可以作为确定具体胎盘干细胞群抑制免疫功能的绝对能力和相对能力的方法使用。可以改变MLR的参数来提供更多的数据，或更好地确定胎盘干细胞样品免疫抑制的能力。例如，由于胎盘干细胞的免疫抑制与测定中存在的胎盘干细胞数大致成比例地增加，在一个实施方案中，MLR可以用两个或多个数目的胎盘干细胞实施，例如1×103、3×103、1×104和/或3×104胎盘干细胞/反应。还可以改变相对于测定中T细胞数的胎盘干细胞数。例如，测定中的胎盘干细胞和T细胞可以以任何比例存在，例如约10∶1至约1∶10，优选约1∶5，但也可以使用相对更多的胎盘干细胞数或T细胞数。
可以以相似的方式使用回归测定。
本发明提供了在体内使用胎盘干细胞调节免疫反应或者调节一类或多类的多个免疫细胞的活性的方法。可以在例如接受了多个胎盘干细胞的接受者个体中使胎盘干细胞和免疫细胞相接触。在一个实施方案中，当在个体中进行接触时，所述接触是在外源性胎盘干细胞(即，不是来自该个体的胎盘干细胞)和该个体的内源性多个免疫细胞之间。在具体的实施方案中，个体体内的免疫细胞是CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或NK细胞。
对由不适当的或不理想的免疫反应导致、使恶化或相关的任何病状，利用胎盘干细胞的上述免疫抑制是有利的。例如，胎盘干细胞-介导的免疫调节，例如免疫抑制，可用于抑制由于个体的免疫系统抗一种或多种自身组织所导致的免疫失调反应。因此，在多个实施方案中，本发明提供了抑制免疫反应的方法，其中所述免疫反应是自体免疫性疾病，例如：红斑狼疮、糖尿病、类风湿性关节炎或多发性硬化。
多个胎盘干细胞与一种或多种类型的多个免疫细胞的接触可以在例如向接受者个体植入或移植的一种或多种类型的组织的情形下在体内发生或相伴进行。此类组织可以是例如骨髓或血液；器官；特定组织(例如：皮肤移植物)；复合组织同种异体移植物(即，包括两种或多种不同组织类型的移植物)等。在这方面，胎盘干细胞可用于抑制接受者个体内、移植的组织或移植物内、或两者内含有的一种或多种免疫细胞的一种或多种免疫反应。所述接触可以发生在植入或移植之前、过程中和/或之后。例如，可以在移植或植入时施用胎盘干细胞。胎盘干细胞还可以，或可选的，在移植或植入前施用，例如，在移植或植入的1、2、3、4、5、6或7天前。胎盘干细胞还可以，或可选的，在移植或植入后施用，例如，在移植或植入的1、2、3、4、5、6或7天后。优选的，在免疫反应的任何可检测的迹象或症状可被检测出之前，将多个胎盘干细胞与多个免疫细胞接触，所述迹象或症状是接受者个体的或移植的组织或植入物的，例如移植物抗宿主疾病的可检测的迹象或症状，或可检测的炎症。
在另一个实施方案中，个体内的接触主要是在外源性胎盘干细胞和外源性前体细胞或干细胞之间，例如：分化为免疫细胞的外源性前体细胞或干细胞。例如，个体接受部分或全部免疫消融(immunoablation)或骨髓消融(myeloablation)作为癌症辅助治疗后，可以接受胎盘干细胞与一种或多种类型的干细胞或前体细胞的组合。例如，胎盘干细胞可以与多个CD34+细胞组合，如CD34+造血前体细胞。此类CD34+细胞可以是例如来自组织来源的CD34+细胞，如外周血、脐带血、胎盘血或骨髓。CD34+细胞可以从此类组织来源被分离出来，或者整个组织来源(例如：脐带血单位或骨髓单位)或所述组织来源的部分纯化制品(例如：来自脐带血的白血细胞)可以和胎盘干细胞组合。胎盘干细胞与脐带血的组合、或与来自脐带的干细胞的组合，描述在Hariri，美国申请公开号2003/0180269中。
可以按比例向个体施用胎盘干细胞，所述比例对于个体中已知的或预期的免疫细胞(如：T细胞)数是约10∶1至约1∶10，优选1∶5。然而，在非限制性的实例中，可以以约10,000∶1、约1,000∶1、约100∶1、约10∶1、约1∶1、约1∶10、约1∶100、约1∶1,000或约1∶10,000的比例，向个体施用多个胎盘干细胞。通常，可以施用约1×105至约1×108胎盘干细胞/接受者千克，优选约1×106至约1×107胎盘干细胞/接受者千克，来产生免疫抑制。在多个实施方案中，向个体或对象施用的多个胎盘干细胞包括至少、大约、或不多于1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、3×109胎盘干细胞，或更多。
胎盘干细胞还可以与一种或多种第二类型的干细胞施用，例如来自骨髓的间充质干细胞。此类第二干细胞可以按与胎盘干细胞的比例向个体施用，例如，约10∶1至约1∶10。
为了便于在体内使胎盘干细胞和免疫细胞接触，可以通过任何途径向个体施用胎盘干细胞，所述途径足以使胎盘干细胞与免疫细胞彼此接触。例如，胎盘干细胞可以经静脉内、肌肉内、腹膜内、眼内、胃肠道外向个体施用，或直接施用到器官例如胰腺内。对于体内施用，可以将胎盘干细胞配制成药物组合物，如下文5.6.1节所述。
免疫抑制的方法还可以包括添加一种或多种免疫抑制剂，特别是在体内的环境。在一个实施方案中，多个胎盘干细胞在个体体内与多个免疫细胞接触，并向个体施用包含免疫抑制剂的组合物。免疫抑制剂是本领域普遍已知的，包括例如抗T细胞受体抗体(单克隆或多克隆，或其抗体片段或衍生物)、抗IL-2受体抗体(例如：巴利昔单抗(
Figure G200880011754XD00211
)或达(克)珠单抗(ZENAPAX))和T细胞受体抗体(例如：鼠单克隆抗体-CD3)、硫唑嘌呤、皮质激素、环孢霉素、他克莫司、麦考酚酸吗乙酯、西罗莫司、神经钙蛋白抑制剂，等。在具体的实施方案中，免疫抑制剂是巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α或MIP-1β的中和抗体。优选的，抗MIP-1α或MIP-1β抗体的施用量足以可检测地降低所述个体内MIP-1α和/或MIP-1β的量，例如在移植时。
5.2胎盘干细胞和胎盘干细胞群
本发明提供的免疫抑制方法使用胎盘干细胞，即可从胎盘或其部分获得的干细胞，其(1)附着于组织培养底物；(2)具有分化为非胎盘细胞类型的能力；和(3)在足够的数量下，具有可检测地抑制免疫功能的能力，例如在混合淋巴细胞反应测定或回归测定中的CD4+T和/或CD8+T细胞增殖。胎盘干细胞不源自血液，例如，胎盘血或脐带血。在本发明提供的方法和组合物中使用的胎盘干细胞具有抑制个体免疫功能的能力，并依据它们的上述能力进行选择。
胎盘干细胞可以源自胎儿或母体(即，可以具有母亲或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群，或含有胎盘干细胞的细胞群，可包含在起源上仅为胎儿的胎盘干细胞或在起源上仅为母体的胎盘干细胞，或者可以包含胎儿和母体起源的胎盘干细胞的混合群体。可以通过下文描述的形态学、标志物和培养特征鉴别和选择胎盘干细胞以及含有胎盘干细胞的细胞群。
5.2.1物理和形态学特征
本发明所使用的胎盘干细胞当在原代培养或细胞培养时，附着于组织培养底物上，例如组织培养容器的表面(如组织培养塑料)。培养中的胎盘干细胞一般呈现成纤维细胞样、星状外观，从中央细胞体延伸出大量胞质突起。然而，胎盘干细胞与在相同条件下培养的成纤维细胞在形态学上不同，胎盘干细胞表现出的胞质突起多于成纤维细胞的此类突起。形态学上，胎盘干细胞也可与造血干细胞相区分，其在培养中通常呈现出更圆的或鹅卵石状的形态。
5.2.2细胞表面、分子和遗传标志物
本发明的方法和组合物中有效的胎盘干细胞和胎盘干细胞群表达多种标志物，可用于鉴别和/或分离干细胞或包含干细胞的细胞群。本发明的胎盘干细胞和干细胞群(即，两种或多种胎盘干细胞)包括从胎盘或其任意部分(例如：羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜盘、胎盘小叶、脐带，等)直接获得的干细胞和含有干细胞的细胞群。胎盘干细胞群还包括培养中的胎盘干细胞群(即，两种或多种干细胞)，和容器(例如袋子)中的群体。然而，胎盘干细胞不是滋养层。
胎盘干细胞一般表达标志物CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4，不表达CD34、CD38，或CD45。胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。这些标志物可用于鉴别胎盘干细胞，以区别胎盘干细胞和其它干细胞类型。由于胎盘干细胞可以表达CD73和CD105，其可具有间充质干细胞样特征。然而，由于胎盘干细胞可以表达胎儿特异性标志物CD200和HLA-G，其可以与间充质干细胞区分，例如骨髓来源的间充质干细胞既不表达CD200也不表达HLA-G。以相同的方式，由于不表达CD34、CD38和/或CD45，胎盘干细胞被确认为非造血干细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含多个CD200+、HLA-G+的免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述多个干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)中可检测地抑制T细胞增殖。在分离的群体的具体实施方案中，所述干细胞还是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在更具体的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+。在另一个实施方案中，当在允许胚状体形成的条件培养下时，所述分离的群体产生一个或多个胚状体。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含多个CD73+、CD105+、CD200+的免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)中可检测地抑制T细胞增殖。在所述群体的具体实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-或CD45-。在更具体的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+。在另一个具体的实施方案中，当在允许胚状体形成的条件下培养时，所述分离群体产生一个或多个胚状体。
可用于本发明提供的组合物和方法中的分离的细胞群可包含多个CD200+、OCT-4+、免疫抑制性的胎盘干细胞，其中所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-和CD45-。在更具体的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一个具体的实施方案中，当在允许胚状体形成的条件下培养时，所述分离群体产生一个或多个胚状体。
本发明还提供了包含多个CD73+、CD105+和HLA-G+、免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在上述多个所述细胞的特定实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还是OCT-4+。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还是CD200+。在更具体的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。
本发明还提供了包含多个免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群，所述干细胞是CD73+、CD105+干细胞，其中所述多个细胞在允许胚状体形成的条件下培养时形成一个或多个胚状体，并且所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还是OCT-4+。在更具体的实施方案中，所述干细胞还是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-。
本发明还提供了包含多个免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，所述胎盘干细胞是OCT-4+干细胞，其中所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时形成一个或多个胚状体，并且其中所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在多个实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％的所述分离的胎盘细胞是OCT-4+干细胞。在上述群体的具体实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体的实施方案中，所述干细胞是CD200+。在更具体的实施方案中，所述干细胞是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体的实施方案中，所述群体已被扩增，例如传代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次，或至少20次。
本发明提供的免疫抑制性胎盘干细胞包括分离的胎盘干细胞、分离的胎盘干细胞群体，或包含胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述胎盘干细胞是CD10+、CD34-、CD105+和CD200+。
本发明还提供包含多个免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述胎盘干细胞是CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD 105+、CD200+、CD34-和CD133-。
在另一个实施方案中，本发明提供的组合物和方法中有用的干细胞是分离的胎盘干细胞，所述干细胞是HLA-A，B，C-、CD45-、CD133-和CD34-。本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中至少约70％、至少约80％、至少约90％，至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是HLA-A，B，C-、CD45-、CD133-和CD34-。在具体的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不表现上述特性的胎盘干细胞分离。在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得HLA-A，B，C-、CD45-、CD133-和CD34-的胎盘干细胞的方法，包括从胎盘灌流液中分离所述细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的胎盘干细胞，所述干细胞是CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-。本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-。在具体的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不表现这些特性的胎盘干细胞分离。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-的胎盘干细胞的方法，包括从胎盘灌流液中分离所述细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的胎盘干细胞，所述干细胞是CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-。本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中至少约70％、至少约80％、至少约90％，至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-。在具体的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不表现上述特性的胎盘干细胞分离。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-的胎盘干细胞的方法，包括从胎盘灌流液中分离所述细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供的是分离的胎盘干细胞，所述干细胞是CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-。本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-。在具体的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不表现上述特性的胎盘干细胞分离。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-的胎盘干细胞的方法，包括从胎盘灌流液中分离所述细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供的是分离的胎盘干细胞，所述干细胞是HLA-A，B，C-、CD45-、CD34-和CD133-，是CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G阳性的，和/或CD117阴性的。本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中所述干细胞是HLA-A，B，C-、CD45-、CD34-和CD133-，且群体中至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的干细胞是CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G阳性的，和/或CD117阴性的。在具体的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不表现上述特性的胎盘干细胞分离。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得HLA-A，B，C-、CD45-、CD34-和CD133-，且CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G阳性，和/或CD117阴性的胎盘干细胞的方法，包括从胎盘灌流液中分离所述细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的胎盘干细胞，所述干细胞通过抗体结合确定是CD200+和CD10+，并通过抗体结合和RT-PCR确定是CD117-。在另一个实施方案中，本发明提供分离的胎盘干细胞，所述干细胞是CD10+、CD29-、CD54+、CD200+、HLA-G+、I类HLA-和β-2-微球蛋白-。在另一个实施方案中，本发明提供了胎盘干细胞，其中至少一个标志物的表达比间充质干细胞(例如：骨髓来源的间充质干细胞)高至少2倍。在另一个实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的胎盘干细胞群，通过醛脱氢酶活性测定评定，其中多个胎盘干细胞是醛脱氢酶(ALDH)阳性的。此类测定是本领域已知的(参见例如：Bostian和Berts，Biochem.J.，173，787，(1978))。在具体的实施方案中，所述ALDH测定使用
Figure G200880011754XD00291
(Aldagen，Inc.，Ashland，Oregon)作为醛脱氢酶活性的标志物。在具体的实施方案中，所述多个指所述细胞群中约3％至约25％的细胞。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了脐带干细胞群，其中通过使用
Figure G200880011754XD00292
作为醛脱氢酶活性指示剂进行醛脱氢酶活性测定，多个所述脐带干细胞是醛脱氢酶阳性的。在具体的实施方案中，所述多个指所述细胞群中约3％至约25％的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞或脐带干细胞群体表现出的ALDH活性比相同条件下培养的相同数量的骨髓来源间充质干细胞群高至少3倍，或至少5倍。
对每种上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群，所述胎盘干细胞或胎盘干细胞群都可以是或者包含这样的干细胞，所述细胞已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次，或更多次，或扩增了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40，或更多的群体倍增数。
在任何上述胎盘细胞或细胞群的具体实施方案中，所述细胞的核型，或所述群体中至少约95％或至少约99％的细胞核型是正常的。在任何上述胎盘细胞或细胞群的另一个具体实施方案中，所述细胞或细胞群中的细胞是非母体起源的。
具有任何上述标志物组合的分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群，都可以以任何比例组合。可以分离或富集任何两个或多个上述胎盘干细胞群，以形成胎盘干细胞群。例如，包含由上述一种标志物组合定义的第一胎盘干细胞群的分离的胎盘干细胞群可以和由上述另一种标志物组合定义的第二胎盘干细胞群组合，其中所述第一胎盘干细胞群和第二胎盘干细胞群组合的比例是约1∶99、2∶98、3∶97、4∶96、5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2或约99∶1。以此方式，可以组合任何三种、四种、五种或多种上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群。
在上述胎盘干细胞的具体实施方案中，胎盘干细胞组成性地分泌IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)。
所述多个免疫抑制性的胎盘干细胞可以大约包含、至少包含、或包含不超过1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个胎盘干细胞。
5.2.3选择和制备胎盘干细胞群
在另一个实施方案中，本发明提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法，包括选择胎盘细胞群，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200+、HLA-G+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+的干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择还包括选择当在允许胚状体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚状体的多个胎盘干细胞。
在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是HLA-G+的干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择还包括选择当在允许胚状体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚状体的胎盘细胞群。
在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200+、OCT-4+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是HLA-G+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+的胎盘干细胞。
在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+和HLA-G+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD200+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+的胎盘干细胞。
在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+胎盘干细胞，并且其中所述多个细胞当在允许胚状体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚状体的胎盘细胞群。在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是OCT-4+的胎盘干细胞。在更具体的实施方案中，所述选择包括选择还是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。
在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述分离的胎盘干细胞是OCT-4+干细胞，并且其中所述多个细胞当在允许胚状体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚状体的胎盘细胞群。在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD200+的胎盘干细胞。在更具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。
根据本发明提供的方法，可以制备免疫抑制性胎盘干细胞群或多个胎盘干细胞。例如，本发明提供了制备细胞群的方法，包括选择任意上述多个胎盘干细胞，并从其它细胞(例如，其它胎盘细胞)中分离多个胎盘干细胞。在具体的实施方案中，本发明提供了制备细胞群的方法，包括选择胎盘细胞，其中所述胎盘细胞(a)附着于底物；(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105并且当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体，或表达OCT-4并且当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，有利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)或回归测定中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；以及从其它细胞中分离所述胎盘细胞来形成细胞群。
在更具体的实施方案中，可以通过这样的方法制备免疫抑制性胎盘干细胞群，所述方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD200和HLA-G；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一个具体的实施方案中，所述方法包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD73、CD105和CD200，和(c)在MLR中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了制备细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD200和OCT-4，和(c)在MLR中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了制备细胞群的方法，所述方法包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD73和CD105，(c)当在允许胚状体形成的条件下培养时形成胚状体，和(d)在MLR中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一个具体的实施方案中，所述方法包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD73、CD105和HLA-G，且(c)在MLR中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。制备细胞群的方法包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达OCT-4，(c)当在允许胚状体形成的条件下培养时形成胚状体，和(d)在MLR中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。
在制备免疫抑制性胎盘干细胞群的方法的具体实施方案中，所述MLR中存在的所述T细胞和所述胎盘细胞的比例是约5∶1。所述方法使用的胎盘细胞可以源自完整胎盘，或主要来自羊膜，或羊膜和绒毛膜。在另一个具体的实施方案中，与缺少所述胎盘干细胞的条件下MLR中T细胞增殖的量相比，所述MLR中的胎盘细胞抑制至少50％、至少75％、至少90％或至少95％的CD4+或CD8+T细胞增殖。所述方法还包括选择和/或制备能够免疫调节(例如抑制其它免疫细胞的活性，如天然杀伤(NK)细胞的活性)的胎盘干细胞群。
5.2.4培养基中的生长
对于任一哺乳动物细胞，本文描述的胎盘干细胞的生长部分地依赖于选择用于生长的特定培养基。在最优条件下，胎盘干细胞一般在3-5天内数量加倍。在培养过程中，本发明提供的胎盘干细胞附着在培养底物上，例如组织培养容器的表面(例如：组织培养皿塑料、纤粘连蛋白包被的塑料，等)，形成单层细胞。
分离的胎盘细胞群包括本发明提供的胎盘干细胞，当在合适的条件下培养时，形成胚状体，即，在附着的干细胞层上生长的三维细胞培养物。胚状体内的细胞表达与非常早期的干细胞相关的标志物，例如：OCT-4、Nanog、SSE3和SSE4。与本文描述的胎盘干细胞不同，胚状体内的细胞一般不附着在培养底物上，但是在培养过程中仍然附在贴壁细胞上。胚状体细胞的活力依赖于贴壁的胎盘干细胞，在缺少贴壁的干细胞时不形成胚状体。因此，贴壁的胎盘干细胞有利于在包含贴壁胎盘干细胞的胎盘细胞群中生长一个或多个胚状体。不希望受制于理论，认为胚状体细胞在贴壁的胎盘干细胞上的生长与胚胎干细胞在滋养层细胞上的生长相似。间充质干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞，在培养中不形成胚状体。
5.2.5分化
在治疗疾病、障碍或病状的方法中使用的所述胎盘干细胞可分化成不同的定向细胞系，所述疾病、障碍或病状与不适当的或有害的免疫反应相关，或由其导致，例如炎症。例如，胎盘干细胞可以分化成脂肪原性、软骨原性、神经原性或骨原性细胞系。例如，通过本领域已知的任何例如用于将骨髓来源的间充质干细胞分化成相似细胞系的方法，或本文中别处描述的方法，可以实现此类分化。
在体外、体内，或既在体外也在体内，本发明提供的胎盘干细胞和脐带干细胞可以表现出分化成特定细胞系的能力。在具体的实施方案中，当被置于导致或促进分化成特定细胞系的条件下时，本发明提供的胎盘干细胞和脐带干细胞可以在体外分化，但在体内不发生可检测的分化，例如在NOD-SCID小鼠模型中。
5.3获得胎盘干细胞的方法
5.3.1干细胞收集组合物
可以根据本发明提供的方法收集和分离胎盘干细胞。一般利用生理学可接受的溶液(例如，干细胞收集组合物)从哺乳动物胎盘获得干细胞。在2005年12月29日提交的名为“用于收集和保藏胎盘干细胞的改良组合物及利用组合物的方法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental StemCells and Methods of Using the Composition)”的相关美国临时申请号60/754,969中，详细描述了干细胞收集组合物。
干细胞收集组合物可以包括适合收集和/或培养干细胞的任何生理学可接受的溶液，例如，盐溶液(例如：磷酸缓冲盐溶液、Kreb氏液、修饰的Kreb氏液、Eagle氏液、0.9％NaCl，等)、培养基(例如：DMEM、HDMEM等)等。
干细胞收集组合物可以包括倾向于保存胎盘干细胞的一种或多种组分，即，从收集的时间到培养的时间，保护胎盘干细胞免于死亡，或延缓胎盘干细胞死亡，降低细胞群中胎盘干细胞的死亡数，等。此类组分可以是例如，凋亡抑制剂(例如：半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如：硫酸镁、抗高血压药物、心钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、皮质激素释放激素、亚硝基铁氰化钠、肼苯达嗪、三磷酸腺苷、腺苷、硫酸消炎痛或镁、磷酸二酯酶抑制剂，等)；坏死抑制剂(例如：2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如：全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。
干细胞收集组合物可以包括一种或多种组织降解酶，例如：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶，等。此类酶包括但不限于胶原酶(例如胶原酶I、II、III或IV，来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明质酸酶，等。
干细胞收集组合物可以包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的实施方案中，抗生素是大环内酯(例如：妥布霉素)、头孢菌素(例如：头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢罗齐、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉仙霉素、红霉素、青霉素(例如：青霉素V)或喹诺酮(例如：氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素，等。在具体的实施方案中，抗生素是抗革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌活性的，例如绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcusaureus)，等。
干细胞收集组合物还可以包括一种或多种下列化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方案中，以足够维持内皮完整性和细胞活性的量存在(例如：合成的或天然存在的胶体，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇以约25g/l至约100g/l，或约40g/l至约60g/l存在)；抗氧化剂(例如：叔丁对甲氧酚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以约25μM至约100μM存在)；还原剂(例如：N-乙酰半胱氨酸，以约0.1mM至约5mM存在)；防止钙进入细胞内的试剂(例如：维拉帕米，以约2μM至约25μM存在)；硝化甘油(例如：约0.05g/l至约0.2g/l)；抗凝剂，在一个实施方案中，存在足够帮助防止残留血液凝结的量(例如，浓度为约1000单位/l至约100,000单位/l存在的肝素或水蛭素)，或含有阿米洛利的化合物(例如：存在约1.0μM至约5μM的阿米洛利、异丙基阿米洛利乙酯、环己基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利)。
5.3.2胎盘的收集和处理
一般，在出生排出后立即回收人胎盘。在优选的实施方案中，在知会同意并采集患者与胎盘相关的完整医疗史后，从患者处回收胎盘。优选的，在回收后继续记录医疗史。此类医疗史可用于配合胎盘或从其收获的干细胞的后续应用。例如，根据医疗史，人胎盘干细胞可用于与胎盘相关的婴儿、或婴儿的父母、兄弟姐妹或其它亲戚的个体化药物。
在回收胎盘干细胞之前，去除脐带血和胎盘血。在一些实施方案中，在送达后回收胎盘中的脐带血。胎盘可以用传统的脐带血回收方法处理。一般使用针头或插管，在重力帮助下，将胎盘放血(参见例如：Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等人，美国专利号5,415,665)。针头或插管通常置于脐静脉内，可以轻柔的按摩胎盘帮助从胎盘放出脐带血。可以商业实施此类脐带血回收，例如LifeBank公司，Cedar Knolls，N.J.，ViaCord，Cord BloodRegistry and Cryocell。优选的，不进行其它操作，将胎盘重力放血，从而使脐带血回收过程中的组织破坏最小化。
典型的，为了脐带血回收和干细胞收集(例如，通过灌流或组织解离)，一般将胎盘从分娩室或初生室转移至另一个地点，例如实验室。优选在无菌、绝热(维持胎盘温度在20-28℃)的转移装置中转移胎盘，例如，将胎盘的脐带近端夹紧放置在无菌、夹拉链封闭的塑料袋中，然后将其放置在保温容器内。在另一个实施方案中，在基本根据2005年9月19日提交的待决美国专利申请号11/230,760中描述的脐带血收集试剂盒中转移胎盘。优选的，在分娩后4至24小时将胎盘递送至实验室。在一些实施方案中，优选的在脐带血回收前，在插入胎盘的4-5cm(厘米)范围内夹紧脐带残端。在其它实施方案中，在回收脐带血后但是在胎盘的其它处理前夹紧近端脐带。
在收集干细胞前，可以将胎盘储存在无菌条件下，并储存在室温或者5至25℃(摄氏度)的温度下。胎盘可以在灌流胎盘去除任何残留的脐带血前储存超过48小时的时间，优选的储存4至24小时。胎盘优选在5至25℃(摄氏度)下储存在抗凝剂溶液中。合适的抗凝剂溶液是本领域普遍已知的。例如，可以使用肝素或华法令钠(warfarin sodium)溶液。在优选的实施方案中，抗凝剂溶液含有肝素溶液(例如，在1∶1000溶液中1％w/w)。在收集胎盘干细胞前，除血的胎盘优选储存不超过36小时。
一旦如上述收集和制备，可以以任何本领域已知的方法处理哺乳动物胎盘或其部分，例如，可以灌流或解离(如，用一种或多种组织解离酶来解离)从而获得干细胞。
5.3.3胎盘组织的物理解离和酶消化
在一个实施方案中，通过物理解离器官，例如酶消化(例如使用5.3.1节所述肝细胞收集组合物)，从哺乳动物胎盘中收集干细胞。例如，可以在接触缓冲液、介质或干细胞收集组合物的同时，例如将胎盘或其部分压碎、剪碎、绞碎、切块、切细、浸软等，然后用一种或多种酶消化组织。还可以物理解离胎盘或其一部分，并用一种或多种酶消化，然后将获得的材料浸入缓冲液、介质或干细胞收集组合物或与之混合。如果通过例如台盼蓝不相容法确定解离方法使所述器官中大量的，更优选大多数的，更优选至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞存活，则可以使用该物理解离的方法。
在物理解离和/或酶消化和干细胞回收前，可以将胎盘分割成各组成部分。例如，可以从羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘绒毛叶、或它们的任意组合，或者脐带，或其任意组合中获得胎盘干细胞。优选的，从包含羊膜和绒毛膜、或羊膜-绒毛膜和脐带的胎盘组织获得胎盘干细胞。在一个实施方案中，从约1∶1重量比的羊膜-绒毛膜和脐带中获得干细胞。一般可以通过将胎盘组织分离为小块来获得胎盘干细胞，例如胎盘组织块的体积是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米。
优选的干细胞收集组合物包含一种或多种组织解离酶。酶消化优选使用酶组合，例如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合(如，胶原酶和分散酶组合)。在一个实施方案中，胎盘组织的酶消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明质酸的粘多糖酶的组合，例如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合或者LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.)和透明质酸酶的组合。可用于裂解胎盘组织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶。血清中的α2微球蛋白可以抑制丝氨酸蛋白酶，因此用于消化的培养基通常是无血清的。在酶消化过程中通常使用EDTA和DNA酶来增加细胞回收的效率。稀释消化物是优选的，从而避免干细胞陷入粘稠的消化物中。
可以使用任何组织消化酶的组合。组织消化酶的典型浓度包括例如：50-200U/ml的I型胶原酶和IV型胶原酶、1-10U/ml分散酶、和10-100U/ml弹性蛋白酶。可以组合使用蛋白酶，即，在同一消化反应中使用两种或多种蛋白酶，或者可以相继使用从而游离胎盘干细胞。例如，在一个实施方案中，首先用合适量的I型胶原酶在2mg/ml浓度下消化30分钟，然后用0.25％的胰蛋白酶在37℃消化10分钟。优选在其它酶的使用后再继续使用丝氨酸蛋白酶。
在另一个实施方案中，可以通过向含有干细胞的干细胞收集组合物中添加螯合剂(例如，乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’N’-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA))，或者在用干细胞收集组合物分离干细胞前，向解离和/或消化组织的溶液中添加所述螯合剂，进一步解离组织。
可以理解，当完整的胎盘或胎盘的一部分同时含有胎儿和母体细胞(例如，胎盘的一部分包含绒毛膜或绒毛小叶)时，收集的胎盘干细胞将同时包含源自胎儿和母体的胎盘干细胞的混合物。当胎盘的部分不含有或只含有可忽略量的母体细胞(例如，羊膜)时，收集的胎盘干细胞将几乎只含有胎儿的胚胎干细胞。
5.3.4.胎盘灌流
还可以通过灌流哺乳动物胎盘来获得胎盘干细胞。灌流哺乳动物胎盘获得干细胞的方法公开在例如Hariri，美国专利申请公开号2002/0123141中，和于2005年12月29日提交的，名为“用于收集胎盘干细胞和保存器官的改良基质(Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Or-gans)”的美国临时申请号60/754,969中。
可以利用例如干细胞收集组合物作为灌流液，通过灌流例如胎盘脉管系统收集胎盘干细胞。在一个实施方案中，通过使灌流液流经脐动脉和/或脐静脉来灌流哺乳动物胎盘。可以利用如重力流入胎盘来实现灌流液在整个胎盘的流动。优选的，利用泵(如，蠕动泵)迫使灌流液流经整个胎盘。例如，可以用套管(如，
Figure G200880011754XD00421
或塑料套管)对脐静脉插管，所述套管与无菌的连接装置(如，无菌管道)相连。无菌的连接装置与灌流歧管相连。
在准备灌流中，优选的按脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式来定位(如，悬挂)胎盘。可以通过灌流液(例如，所述干细胞收集组合物)在整个胎盘脉管系统、或在整个胎盘脉管系统和相邻组织中的流通，来灌流胎盘。在一个实施方案中，脐动脉和脐静脉同时连接移液器，后者通过柔性连接管与灌流液的储器相连。灌流液流入脐静脉和动脉。灌流液渗出和/或流经血管壁进入周围的胎盘组织，并从孕期附着在母亲子宫上的胎盘表面合适的开放脉管收集。还可以通过脐带开口导入灌流液，并允许从与母体子宫壁接触的胎盘壁内的开口流出或渗出。在另一个实施方案中，灌流液流经脐静脉并从脐动脉收集，或者流经脐动脉并从脐静脉收集。
在一个实施方案中，在灌流过程中夹紧脐带近端，更优选的，在插入胎盘的脐带插入物的4-5cm(厘米)范围内夹紧。
在除血过程中，从哺乳动物胎盘首先收集的灌流液一般都被脐带血和/或胎盘血残留的红血细胞着色。随着灌流继续和残留的脐带血细胞从胎盘中洗出，灌流液变得越来越无色。一般30至100ml(毫升)灌流液足以初步将胎盘除血，但根据观察的结果可以使用更多或较少的灌流液。
用于收集胎盘干细胞的灌流液体积可以根据待收集的干细胞数量、胎盘大小、单个胎盘的收集次数等来变化。在不同的实施方案中，灌流液的体积可以自50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL、或750mL至2000mL。一般地，在除血后用700-800mL灌流液灌流胎盘。
可以在数小时或数天的过程中多次灌流胎盘。当多次灌流胎盘时，可以在容器或其它合适的器皿中在无菌条件下维持或培养胎盘，并用干细胞收集组合物或标准灌流液(例如，普通的盐溶液如磷酸盐缓冲液(“PBS”))灌流，其中含有或不含抗凝剂(如，肝素、华法令钠、香豆素、双香豆素)，和/或含有或不含抗微生物剂(如，β-巯基乙醇(0.1mM)，以及抗生素如链霉素(如40-100μg/ml)、青霉素(如40U/ml)、两性霉素B(如0.5μg/ml))。在一个实施方案中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌流液，从而在灌流和收集灌流液前，维持或培养胎盘1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个小时，或者2或3或更多天。被灌流的胎盘可以被维持一次或多次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，再用例如700-800mL灌流液灌流第二次。可以灌流胎盘1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方案中，重复灌流胎盘和收集灌流液(如，干细胞收集组合物)，直到回收的有核细胞数低于100细胞/ml。可以分别进一步处理不同时间点的灌流液，来回收时间依赖性的细胞群(如，干细胞)。也可以混合不同时间点的灌流液。
不希望被任何理论约束，在除血并对胎盘灌流足够长时间后，认为胎盘干细胞迁移到被除血和灌流的胎盘微循环中，根据本发明的方法，在那里收集干细胞，优选通过灌流冲洗到收集器皿中。灌流被分离的胎盘不仅用来去除残留的脐带血，而且为胎盘提供了合适的营养，包括氧气。可以用与用来去除残留脐带血细胞的相似溶液来培养和灌流胎盘，优选不添加抗凝剂。
根据本发明的方法灌流，导致获得的胎盘干细胞数量显著多于未用所述溶液灌流哺乳动物胎盘、或者未对哺乳动物胎盘进行其它处理(例如，通过组织解离如酶消化)所获得的干细胞数量。在本文的上下文中，“显著多于”意指多至少10％。根据本发明的方法灌流产生的胎盘干细胞显著多于例如，从培养胎盘或其一部分的培养基中可获得的胎盘干细胞数量。
通过用包含一种或多种蛋白酶或其它组织解离酶的溶液灌流，可以从胎盘中分离干细胞。在具体的实施方案中，将胎盘或其一部分(例如，羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或绒毛小叶、脐带或任何上述的组合)的温度保持25-37℃，并在200mL培养基中用一种或多种组织解离酶孵育30分钟。收集灌流液中的细胞，降至4℃，并用包含5mM EDTA、2mM二硫苏糖醇和2mM β-巯基乙醇的冷却抑制剂混合物洗涤。数分钟后，用本发明的冷却的(如4℃)干细胞收集组合物洗涤干细胞。
可以理解，利用盘式法灌流(即，收集从胎盘的母体侧渗出的灌流液)获得的是胎儿和母体细胞的混合物。结果，通过该方法收集的细胞包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞混合群体。相反，仅通过胎盘脉管系统灌流，因为灌流液流经一根或两根胎盘血管，并仅通过其余血管收集，导致胎盘干细胞群的收集物几乎都是胎儿来源的。
5.3.5胎盘干细胞的分离、分类和鉴别
不论是否由灌流或酶消化获得的，可以通过聚蔗糖梯度离心从其它细胞中初步纯化(即，分离)来自哺乳动物胎盘的干细胞。此类离心可以遵循任意标准规程的离心速度等。例如，在一个实施方案中，在5000×g室温离心15分钟从灌流液中回收从胎盘收集的细胞，将细胞与例如污染的残渣和血小板分离开。在另一个实施方案中，将胎盘灌流液浓缩至约200ml，轻柔的铺在聚蔗糖上，在22℃以约1100×g离心20分钟，收集细胞的低密度中间层用于进一步处理。
可以将细胞沉淀重悬在新鲜的干细胞收集组合物或适合维持干细胞的培养基中，例如含有2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)。根据生产商的推荐程序，可以利用例如
Figure G200880011754XD00451
(Nycomed Pharma，Oslo，挪威)分离总单核细胞部分。
如本文中使用的，“分离”胎盘干细胞意指将一般与干细胞相关的完整哺乳动物胎盘中的细胞去除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。当细胞群包含少于50％的一般在完整器官内与干细胞相关的细胞时，来自该器官的干细胞就是“分离的”。
例如，通过灌流或消化获得的胎盘细胞可以进一步或初步的利用例如具有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶(Sigma，St.Louis MO)溶液通过差别胰酶消化来分离。由于胎盘干细胞一般在约5分钟内从塑料表面脱离，而其它贴壁的群体一般要消化超过20-30分钟，因此差别胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex)中和胰蛋白酶后，可以收获脱离的胎盘干细胞。在分离贴壁细胞的一个实施方案中，在每个T75瓶(优选纤连蛋白包被的T75瓶)中，放置等份的5-10×106个细胞。在此实施方案中，可以用商购的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)培养细胞，置于组织培养箱(37℃，5％CO2)中。10-15天后，用PBS洗涤从瓶中去除非贴壁细胞。然后用MSCGM替代PBS。优选每天检查瓶中不同贴壁细胞类型的存在，以特别鉴定和扩增成纤维样细胞簇。
可以通过如下方法监控从哺乳动物胎盘收集的细胞数量和类型，例如：利用标准的细胞检测技术，例如流式细胞仪、细胞分选、免疫细胞化学(例如用组织特异性或细胞标志物特异性抗体染色)荧光活化的细胞分选(FACS)、磁性活化细胞分选(MACS)来测量形态学和细胞表面标记物的变化；通过利用光学显微镜或共聚焦显微镜检查细胞的形态学；和/或利用本领域普遍已知的技术(例如PCR和基因表达谱)检测基因表达的改变。这些技术也可用于鉴别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞。例如，利用CD34的抗体，利用上述技术，可以确定细胞是否含有可检测量的CD34；如果是，则该细胞是CD34+。同时，如果细胞产生可被RT-PCR检测的足够多的OCT-4RNA，或者显著多于成体细胞的OCT-4RNA，则该细胞是OCT-4+。细胞表面标志物(例如CD标志物如CD34)的抗体，和干细胞特异性基因例如OCT-4的序列，也是本领域普遍已知的。
可以利用荧光活化细胞分选仪(FACS)分选胎盘细胞，特别是对已经经过聚蔗糖分离、差别附着、或两者的结合所分离的细胞。荧光活化细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光性质，用于分离颗粒(包括细胞)的普遍已知方法(Kamarch，1987，Methods Enzymol，151：150-165)。激光激发单个颗粒中的荧光部分，产生微小电荷，从而可以电磁分离混合物中的正电颗粒和负电颗粒。在一个实施方案中，用不同的荧光标签标记细胞表面标志物的特异性抗体或配体。细胞经过细胞分选仪，基于细胞与所用抗体的结合能力来分离细胞。经FACS分选的颗粒可以直接注入96-孔或384-孔板的单个孔中，以便分离和克隆。
在一个分选技术方案中，基于标志物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达来分选来自胎盘的干细胞。其可以通过结合下述方法来实现，即基于细胞在培养中的附着性质来选择干细胞。例如，可以在基于标志物表达进行分选之前或之后进行附着选择干细胞。例如，在一个实施方案中，首先基于CD34的表达分选细胞；保留CD34-的细胞，并将CD200+HLA-G+的细胞与所有其它CD34-细胞分离。在另一个实施方案中，基于标志物CD200和/或HLA-G的表达来分选胎盘细胞；例如，分离表现出任一上述两种标志的细胞供进一步使用。在具体的实施方案中，表达例如CD200和/或HLA-G的细胞可以基于CD73和/或CD105的表达来进一步分选，或基于抗体SH2、SH3或SH4识别的表位来进一步分选，或基于缺少CD34、CD38或CD45的表达来进一步分选。例如，在一个实施方案中，通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或缺失来分选胎盘细胞，将CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-和CD45-的细胞与其它胎盘细胞分离，供进一步使用。
在另一个实施方案中，可以使用磁珠分离细胞。可以利用磁性活化细胞分选(MACS)技术分选细胞，所述技术是基于颗粒结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力分选颗粒。对磁微珠可以实施多种有效的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后混合磁珠和细胞，使它们结合。然后将细胞通过磁场，分离出具有特定细胞表面标志物的细胞。在一个实施方案中，可以分离这些细胞，再与偶联了针对其它细胞表面标志物的抗体的磁珠混合。细胞再次通过磁场，分离结合了两种抗体的细胞。然后可以将此类细胞稀释入不同的盘中，例如微滴定盘中用于克隆分离。
还可以基于细胞形态学和生长特征来表征和/或分选胎盘干细胞。例如，胎盘干细胞可以被表征为在培养中具有成纤维细胞样表型，和/或基于成纤维细胞样表型来选择。胎盘干细胞还可以被表征为具有形成胚状体的能力，和/或基于上述能力来选择。在一个实施方案中，例如，将形状为成纤维细胞样，表达CD73和CD105，并在培养中产生一个或多个胚状体的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。在另一个实施方案中，将培养中产生一个或多个胚状体的OCT-4+胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。
在另一个实施方案中，可以通过集落生成单位试验来鉴别和表征胎盘干细胞。集落生成单位试验是本领域普遍已知的，例如MESEN CULTTM培养基(Stem Cell Technologies，Inc.，Vancouver British Columbia)。
利用本领域已知的标准技术，可以分析胎盘干细胞的活力、增殖潜力和寿命，例如台盼蓝不相容试验、醋酸荧光素摄取试验、碘化丙锭摄取试验(评估活力)；和胸腺嘧啶核苷摄取试验、MTT细胞增殖试验(评估增殖)。通过本领域普遍已知的方法可以确定细胞寿命，例如通过确定延长培养中群体倍增的最大数。
利用本领域已知的其它技术也可以分离胎盘干细胞和其它胎盘细胞，例如：所需细胞的选择性生长(阳性选择)；不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于混合群体与例如大豆凝聚素的差别细胞可凝集性的分离；冻融步骤；过滤；低速离心和区带离心；离心冲洗(逆流离心)；单位重力分离；逆流分布；电泳；等等。
5.4胎盘干细胞的培养
5.4.1培养基
分离的胎盘干细胞、胎盘干细胞群、或者从中可以生长出胎盘干细胞的细胞或胎盘组织可用于开始或接种细胞培养。细胞一般转移到无菌的组织培养容器内，所述容器用或未用胞外基质或配体包被，例如层粘连蛋白、胶原(如：天然的或变性的)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻璃体粘附蛋白和胞外膜蛋白(例如：MATRIGEL(BD Discovery Labware，Bedford，Mass.))。
可以在本领域认为适合干细胞培养的任何培养基和任何条件下培养胎盘干细胞。优选的，培养基包含血清。胎盘干细胞可以培养在例如：DMEM-LG(Dulbecco修饰的基础培养基，低糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基础培养基)，其含有ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1，和青霉素/链霉素；含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15％FBS的DMEM-HG；含有10％FBS、10％马血清和氢化可的松的IMDM(Iscove修饰的Dulbecco培养基)；含有10％FBS、EGF和肝素的M199；含有10％FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素的α-MEM(最低基础培养基)；含有10％FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素的DMEM，等。优选的培养基是含有2％FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。
可用于培养胎盘干细胞的其它培养基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle基础培养基、Ham的F10培养基(F10)、Ham的F12培养基(F12)、Iscove的修饰的Dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz的L-15培养基、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、改良的DMEM(Gibco)、DMIEM/MCDB201(Sigma)，和CELL-GRO FREE。
培养基可以添加一种或多种组分，包括例如：血清(如：胎牛血清(FBS)，优选的约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板衍生的生长因子(PDGF)、上皮生长因子(EGF)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素-样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)，和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸包括L-缬氨酸；和一种或多种用于控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌剂，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、和制霉菌素，单独或组合使用。
5.4.2胎盘干细胞的扩增和增殖
一旦胎盘干细胞或干细胞群被分离(例如，干细胞或干细胞群与至少50％一般与干细胞或干细胞群在体内相关的胎盘细胞分离)，就可以在体外增殖或扩增干细胞或干细胞群。例如，可以在组织培养容器(例如：皿、瓶、多孔板等)中培养胎盘干细胞群一段时间，使干细胞增殖至70-90％汇合度，即，直到干细胞及其后代占据组织培养容器的70-90％的培养表面区域。
胎盘干细胞可以以允许细胞生长的密度接种在培养容器内。例如，可以低密度(例如：约1,000至约5,000细胞/cm2)至高密度(例如：约50,000或更多细胞/cm2)接种细胞。在优选的实施方案中，在约0至约5％体积CO2的空气中培养细胞。在一些优选的实施方案中，在约2至约25％体积O2的空气中培养细胞，优选的在约5至约20％体积O2的空气中培养细胞。细胞优选的培养在约25℃至约40℃，优选的37℃。细胞优选的在培养箱中培养。培养基可以是静态或搅动的，例如，利用生物反应器。胎盘干细胞优选生长在低氧化压力下(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)。
一旦获得70％-90％汇合度，细胞就可以传代。例如，细胞可以利用本领域普遍已知的技术进行酶处理，例如胰蛋白酶消化，将其与组织培养表面分离。在移液去除细胞和计数细胞后，约20,000-100,000个干细胞，优选50,000个干细胞传代到含有新鲜培养基的新培养容器内。一般新培养基与移除干细胞的培养基是相同类型。本发明提供已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次的胎盘干细胞群，以及这些胎盘干细胞群的组合。
5.4.3胎盘干细胞群
本发明提供了胎盘干细胞的群体。胎盘干细胞群可以直接分离自一个或多个胎盘；即，胎盘干细胞群可以是包含胎盘干细胞的胎盘细胞群体，所述胎盘肝细胞获得自或包含于灌流液，或者获得自或包含于消化液(即，酶消化胎盘或其部分从中获得的细胞收集物)。还可以培养和扩增本发明的分离的胎盘干细胞来制备胎盘干细胞群。还可以培养和扩增包含胎盘干细胞的胎盘细胞群来制备胎盘干细胞群。
本发明的胎盘干细胞群包含胎盘干细胞，例如本文中描述的胎盘干细胞。在多个实施方案中，在分离的胎盘干细胞群中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞是胎盘干细胞。即，胎盘干细胞群可以包含例如多至1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％非干细胞。
本发明提供通过例如选择表达特定标志物和/或特定培养或形态学特征的胎盘干细胞(不论来自酶消化或灌流)，从而制备分离的胎盘干细胞群的方法。例如，在一个实施方案中，可以通过这样的方法制备细胞群，所述方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于底物，且(b)表达CD200和HLA-G；并将所述细胞与其它细胞分离，形成细胞群。在另一个实施方案中，制备细胞群的方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于底物，且(b)表达CD73、CD105和CD200；并将所述细胞与其它细胞分离，形成细胞群。在另一个实施方案中，制备细胞群的方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于底物，且(b)表达CD200和OCT-4；并将所述细胞与其它细胞分离，形成细胞群。在另一个实施方案中，制备细胞群的方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于底物，(b)表达CD73和CD105，且(c)当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，利于在含有所述干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体；并将所述细胞与其它细胞分离，形成细胞群。在另一个实施方案中，生产细胞群的方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于底物，和(b)表达CD73、CD105和HLA-G；并将所述细胞与其它细胞分离，形成细胞群。在另一个实施方案中，生产细胞群的方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于底物，(b)表达OCT-4，且(c)当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，利于在含有所述干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体；并将所述细胞与其它细胞分离，形成细胞群。在任意上述实施方案中，所述方法还可以包括选择表达ABC-p(胎盘特异性ABC转运蛋白；参见例如：Allikmets等人，Cancer Res.58(23)：5337-9(1998))的胎盘细胞。所述方法还可以包括选择表现出至少一种对例如间充质干细胞特异性的特征的细胞，例如：表达CD29、表达CD44、表达CD90，或上述组合的表达。
在上述实施方案中，所述底物可以是任何表面，其上可以实现细胞(例如胎盘干细胞)的培养和/或选择。典型底物是塑料，例如组织培养皿或多孔板塑料。组织培养塑料可以用生物分子例如层粘连蛋白或纤连蛋白包被。
可以通过细胞选择领域任何已知的方法选择形成胎盘干细胞群的细胞(例如胎盘干细胞)。例如，可以利用针对一种或多种细胞表面标志物的抗体选择细胞，例如，通过流式细胞仪或FACS进行选择。利用与磁珠连接的抗体可以实现选择。特异性针对一些干细胞相关标志物的抗体是本领域已知的。例如，抗OCT-4抗体(Abcam，Cambridge，MA)、CD200抗体(Abcam)、HLA-G抗体(Abcam)、CD73抗体(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)、CD105抗体(Abcam；BioDesign International，Saco，ME)等。其它标志物的抗体也是可商购的，例如：可以从如StemCell Technologies或BioDesign International获得CD34、CD38和CD45抗体。
分离的胎盘干细胞群可以包括非干细胞的胎盘细胞，或者非胎盘细胞的细胞。
分离的胎盘干细胞群可以结合一个或多个非干细胞或非胎盘细胞的群体。例如，分离的胎盘干细胞群可以结合血液(例如：胎盘血或脐带血)、血液来源的干细胞(例如：来自胎盘血或脐带血的干细胞)、血液来源的有核细胞群体、骨髓来源的间充质细胞、骨来源的干细胞群、原始骨髓、成人(成体)干细胞、包含在组织内的干细胞群、培养的干细胞、完全分化的细胞群体(例如：软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌细胞、心肌细胞等)等。分离的胎盘干细胞群内的细胞可以结合另一种类型的多个细胞，比较每个群体中有核细胞的总数，结合比例为约100,000,000∶1、50,000,000∶1、20,000,000∶1、10,000,000∶1、5,000,000∶1、2,000,000∶1、1,000,000∶1、500,000∶1、200,000∶1、100,000∶1、50,000∶1、20,000∶1、10,000∶1、5,000∶1、2,000∶1、1,000∶1、500∶1、200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1；1∶2、1∶5、1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1,000、1∶2,000、1∶5,000、1∶10,000、1∶20,000、1∶50,000、1∶100,000、1∶500,000、1∶1,000,000、1∶2,000,000、1∶5,000,000、1∶10,000,000、1∶20,000,000、1∶50,000,000，或约1∶100,000,000。在分离的胎盘干细胞群中的细胞也可以与多个细胞类型的多个细胞结合。
在一个实施方案中，分离的胎盘干细胞群与多个造血干细胞结合。此类造血干细胞可以是例如，包含在未处理的胎盘、脐带血或外周血中的造血干细胞；来自胎盘血、脐带血或外周血总有核细胞的的造血干细胞；来自胎盘血、脐带血或外周血的分离的CD34+细胞群中的造血干细胞；来自未处理的骨髓中的造血干细胞；来自骨髓总有核细胞中的造血干细胞；来自骨髓的分离的CD34+细胞群中的造血干细胞；等等。
5.5胎盘干细胞的保存
胎盘干细胞可以被保存，即，将其置于允许长期储存的条件下，或置于抑制细胞死亡(如凋亡或坏死)的条件下。
可以利用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物保存胎盘干细胞，如2005年12月25日提交的名为“用于收集和保藏胎盘干细胞的改良组合物及利用组合物的方法(Improved Composition for Collectingand Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)”的相关美国临时申请号60/754,969中描述的。在一个实施方案中，本发明提供了保存干细胞群的方法，包括将所述干细胞群接触含有凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的干细胞收集组合物，与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，其中所述凋亡抑制剂存在的量和时间足够降低或预防干细胞群凋亡。在一个具体的实施方案中，所述凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。在另一个具体的实施方案中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更具体的实施方案中，所述JNK抑制剂不调节所述干细胞的分化或增殖。在另一个实施方案中，所述干细胞收集组合物在分离的相中包含所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一个实施方案中，所述干细胞收集组合物在乳剂中包含所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一实施方案中，所述该细胞收集组合物还包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一个实施方案中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在接触干细胞时处于约0℃和约25℃之间。在另一个更具体的实施方案中，在接触干细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳处于约2℃和约10℃之间，或约2℃和约5℃之间。在另一个更具体的实施方案中，所述接触是在转移所述干细胞群的过程中实施的。在另一个更具体的实施方案中，所述接触是在冷冻和融化所述干细胞群的过程中实施的。
在另一个实施方案中，本发明提供了保存胎盘干细胞群的方法，包括将所述干细胞群接触凋亡抑制剂和器官防腐化合物，与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，其中所述凋亡抑制剂存在的量和时间足够降低或预防干细胞群中的凋亡。在具体的实施方案中，器官防腐化合物是UW溶液(描述在美国专利号4,798,824中；也被称为ViaSpan；还参见Southard等人，Transplantation49(2)：251-257(1990))或者在Stern等人，美国专利号5,552,267中描述的溶液。在另一个实施方案中，所述器官防腐化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖，或其组合。在另一个实施方案中，干细胞收集组合物还包含位于两相或位于乳剂中的携氧全氟化碳。
在本发明方法的另一个实施方案中，胎盘干细胞在灌流过程中接触包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官防腐化合物、或其组合的干细胞收集组合物。在另一个实施方案中，所述干细胞在组织破坏过程中(例如，酶消化)接触所述干细胞收集组合物。在另一个实施方案中，在灌流、或在组织破坏(例如，酶消化)收集所述胎盘干细胞后，所述胎盘干细胞接触所述干细胞收集化合物。
典型的，在胎盘细胞收集、富集和分离过程中，优选最小化或消除由缺氧和机械压力导致的细胞应激。因此，在本发明方法的另一个实施方案中，在收集、富集和分离过程中，干细胞或干细胞群在保存中暴露在低氧条件下少于6个小时，其中所述低氧条件是氧浓度低于正常的血氧浓度。在更具体的实施方案中，所述干细胞群在保存中暴露在所述低氧条件下少于2个小时。在另一个更具体的实施方案中，在收集、富集和分离过程中，所述干细胞群暴露在所述低氧条件下少于1个小时，或少于30分钟，或不暴露于低氧条件下。在另一个具体的实施方案中，在收集、富集和分离过程中，所述干细胞群不暴露在剪切应力下。
本发明的胎盘干细胞可以冷冻保存，例如置于小容器(如安瓿瓶)中的冷冻保存培养基中。合适的冷冻保存培养基包括但不限于培养基，包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如可商购的细胞冷冻培养基，例如：C2695、C2639或C6039(Sigma)。冷冻保存培养基优选包含DMSO(二甲亚砜)，浓度为例如约10％(v/v)。冷冻保存培养基可以包含其它试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。在冷冻保存过程中，胎盘干细胞优选以约1℃/分钟冷却。优选的冷冻保存温度是约-80℃至约-180℃，优选约-125℃至约-140℃。在解冻使用前，冷冻保存的细胞可以转移到液氮中。例如，在一些实施方案中，一旦安瓿瓶达到约-90℃，就转移至液氮储存区域。冷冻保存的细胞优选在温度约25℃至约40℃、优选在温度约37℃解冻。
5.6胎盘干细胞的用途
5.6.1包含胎盘干细胞的组合物
本发明的免疫抑制方法可以使用包含胎盘干细胞或其来源的生物分子的组合物。以相同的方式，本发明的多个胎盘干细胞和胎盘干细胞群可以结合任何生理学可接受的、或医学可接受的化合物、组合物或仪器在例如研究或治疗中使用。
5.6.1.1冷冻保存的胎盘干细胞
可以保存(例如冷冻保存)本发明的免疫抑制性胎盘干细胞和细胞群供以后使用。冷冻保存细胞(例如干细胞)的方法是本领域普遍已知的。胎盘干细胞群可以制备成易于向个体施用的形式。例如，本发明提供了包含在适合医学使用的容器内的胎盘干细胞群。此类容器可以是例如，无菌的塑料袋、瓶、罐，或其它可以方便配制的胎盘干细胞群容器。例如，容器可以是血袋或其它塑料的、医学可接受的袋，适合向接受者静脉施用液体。容器优选是允许冷冻保存组合的干细胞群的容器。
冷冻保存的免疫抑制性胎盘干细胞群可以包括源自单个供体、或多个供体的胎盘干细胞。胎盘干细胞群可以与目标接受者HLA完全匹配，或者HLA部分不匹配或HLA完全不匹配。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了位于容器中的包含免疫抑制性胎盘干细胞群的组合物。在具体的实施方案中，干细胞群是冷冻保存的。在另一个具体的实施方案中，容器是袋、瓶或罐。在更具体的实施方案中，所述袋是无菌塑料袋。在更具体的实施方案中，所述袋适合、允许或有利于所述胎盘干细胞群的静脉施用。所述袋可以包括相互连接的多个内腔或隔室，允许在施用前或施用过程中混合胎盘干细胞和一种或多种其它溶液，例如药物。在另一个具体的实施方案中，组合物包括利于冷冻保存组合干细胞群的一种或多种化合物。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群被包含在生理上可接受的水溶液中。在一个更具体的实施方案中，所述生理上可接受的水溶液是0.9％NaCl溶液。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群包含与所述干细胞群的接受者HLA匹配的胎盘细胞。在另一个具体的实施方案中，所述组合的干细胞群包括与所述干细胞群的接受者至少部分HLA不匹配的胎盘细胞。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞源自多个供体。
5.6.1.2药物组合物
可以将免疫抑制性的胎盘干细胞群或包含胎盘干细胞的细胞群配制成体内使用的药物组合物。此类药物组合物在药物接受的载体(例如：用于体内给药的盐溶液或其它生理学可接受的溶液)中包含胎盘干细胞群、或包含含有胎盘干细胞的细胞群。本发明的药物组合物可以包含本文描述的任何胎盘干细胞群、或胎盘干细胞类型。所述药物组合物可以包含胎儿胎盘干细胞、母体胎盘干细胞，或同时包含胎儿胎盘干细胞和母体胎盘干细胞。本发明的药物组合物还可以包含源自单个个体或胎盘的胎盘干细胞，或源自多个个体或胎盘的胎盘干细胞。
本发明的药物组合物可以包含任意数量的免疫抑制性胎盘干细胞。例如，在不同的实施方案中，单个单位剂量的胎盘干细胞可以包含大约、至少、或不超过约1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个胎盘干细胞。
本发明提供的药物组合物包含含有50％或更多活细胞的细胞群(即，群体中至少50％的细胞是有功能的或活的)。优选的，群体中至少60％的细胞是活的。更优选的，药物组合物的群体中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞是活的。
本发明提供的药物组合物可以包括一种或多种例如有利于植入的化合物(例如：抗-T细胞受体抗体、免疫抑制剂等)；稳定剂例如白蛋白、葡聚糖40、明胶、羟乙基淀粉等。
5.6.1.3胎盘干细胞条件培养基
本发明提供的胎盘干细胞可用于制备免疫抑制性的条件化培养基，即，含有干细胞分泌或排出的一种或多种生物分子的培养基，所述生物分子对多个一种或多种类型的免疫细胞具有可检测的免疫抑制性效果。在多个实施方案中，条件化培养基包括胎盘干细胞已经在其中生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在其它实施方案中，条件培养基包括胎盘干细胞已经在其中生长至至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合度，或高达100％汇合度的培养基。此类条件化培养基可用于支持不同胎盘干细胞群、或另一类干细胞的培养。在另一个实施方案中，条件化培养基包括其中的胎盘干细胞已经分化为成体细胞类型的培养基。在另一个实施方案中，本发明的条件化培养基包括其中已经培养了胎盘干细胞和非胎盘干细胞的培养基。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含来自胎盘干细胞培养物的培养基的组合物，其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105并且当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，利于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体，或表达OCT-4并且当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，有利于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖，其中所述胎盘干细胞培养物已经在所述培养基中培养了24小时或更久。在具体的实施方案中，所述组合物还包含多个所述胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中，所述组合物包含多个非胎盘细胞。在更具体的实施方案中，所述非胎盘细胞包括CD34+细胞，例如造血前体细胞，如外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞、或胎盘血造血祖细胞。非胎盘细胞还可以包含其它干细胞，例如间充质干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞。非胎盘细胞还可以是一种或多种类型的成体细胞或细胞系。在另一个具体的实施方案中，组合物包含抗增殖剂，例如，抗MIP-1α抗体或抗MIP-1β抗体。
5.6.1.4包含胎盘干细胞的基质
本发明还提供了包含免疫抑制性胎盘干细胞(例如免疫抑制性的胎盘干细胞群)的基质、水凝胶、支架等。
本发明的胎盘干细胞可以种植在天然基质上，例如胎盘生物材料，如羊膜材料。此类羊膜材料可以是例如：直接从哺乳动物胎盘切下的羊膜；固定的或热处理的羊膜、基本干燥(即，＜20％H2O)的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜，等。可以种植胎盘干细胞的优选的胎盘生物材料描述在Hariri，美国申请公开号2004/0048796中。
本发明提供的胎盘干细胞可以悬浮在适合例如注射的水凝胶溶液中。适合此类组合物的水凝胶包括自组装的肽，例如RAD16。在一个实施方案中，包含所述细胞的水凝胶溶液可以在例如模具中硬化，从而形成具有细胞分散在其中的、用于移植的基质。在此类基质中的胎盘干细胞也可以被培养，从而在移植前分裂扩增。水凝胶是例如通过共价键、离子键或氢键交联的有机聚合物，从而产生三维开放的点阵结构，将水分子陷于其中形成凝胶。水凝胶形成材料包括多糖，例如褐藻胶及其盐、肽、聚膦嗪和离子交联的聚丙烯酸脂，或嵌段聚合物，例如分别通过温度或pH交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在一些实施方案中，本发明的水凝胶或基质是可生物降解的。
在本发明的一些实施方案中，剂型包含原位的可聚合凝胶(参见例如：美国专利申请公开号2002/0022676；Anseth等人，J.Control Release，78(1-3)：199-209(2002)；Wang等人，Biomaterials，24(22)：3969-80(2003)。)
在一些实施方案中，所述聚合物在水性溶液(例如水、缓冲盐溶液或乙醇水溶液)中至少部分溶解，所述聚合物具有带电的侧基或其单价离子盐。具有酸性侧基、可以与阳离子反应的聚合物实例是聚(膦嗪)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)和磺化聚合物，例如磺酸化聚苯乙烯。还可以使用通过丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯醚单体或聚合物反应形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基、磺酸基、卤代醇基(优选氟代)、酚OH基和酸性OH基。
本发明的胎盘干细胞或其共培养物可以被种植在三维框架或支架上，并植入体内。此类框架可以与任意一种或多种生长因子、细胞、药物或其它组分组合植入，刺激组织形成或者增强或改善本文描述的治疗方法的实践。
本文描述的治疗方法中可以使用的支架的实例包括非织造物垫、多孔泡沫，或自组装肽。非织造物垫可以利用含有合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(例如：PGA/PLA)的纤维形成(VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)。也可以使用泡沫作为支架，例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物通过例如冷冻干燥或低压冻干处理形成的泡沫(参见例如：美国专利号6,355,699)。
在另一个实施方案中，所述支架是或包括纳米纤维的支架，例如电纺丝纳米纤维支架。在更具体的实施方案中，所述纳米纤维支架包括聚(L-乳酸)(PLLA)、I型胶原、偏二氟乙烯和三氟乙烯的共聚物(PVDF-TrFE)、聚己内酯、聚(L-环二酯-共聚-ε-己内酯)[P(LLA-CL)](例如：75∶25)，和/或聚(3-羟丁酸-共聚-3-羟缬氨酸)(PHBV)和I型胶原的共聚物。在另一个具体的实施方案中，所述支架促进胎盘干细胞分化成软骨细胞。生产纳米纤维支架例如电纺丝纳米纤维支架的方法是本领域已知的。参见例如：Xu等人，Tissue Engineering 10(7)：1160-1168(2004)；Xu等人，Biomaterials 25：877-886(20040；Meng等人，J.Biomaterials Sci.，Polymer Edition 18(l)：81-94(2007))。
本文描述的胎盘干细胞，例如免疫抑制性胎盘干细胞，还可以种植在生理学可接受的陶瓷材料上，或与生理学可接受的陶瓷材料接触，所述生理学可接受的陶瓷材料包括但不限于：磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙和磷酸四钙、羟磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、碳酸镁钙、生物学活性玻璃例如
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及其混合物。目前可商购的多孔生物相容性陶瓷材料包括
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(CanMedicaCorp.，Canada)、(Merck Biomaterial France，France)、
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(Mathys，AG3 Bettlach，Switzerland)，和矿化胶原骨骼移植产品，例如HEALOSTM(DePuy，Inc.，Raynham，MA)和RHAKOSSTM和
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(Orthovita，Malvern，Pa.)。框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺合物或复合材料。
在另一个实施方案中，胎盘干细胞可以种植在毡上，或与毡接触，所述毡可以是由生物可吸收性材料制成的复丝构成，例如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物，或透明质酸。
在另一个实施方案中，本文描述的胎盘干细胞可以种植在泡沫支架上，该泡沫支架可以是复合结构。此类泡沫支架可以铸造成有效的形状，例如需要修复、取代或强化的机体特定结构的一部分。在一些实施方案中，在接种免疫抑制性胎盘干细胞前，用例如0.1M乙酸处理框架，再将框架孵育在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中，从而增加细胞附着。可以修饰基质的外表面来改善细胞的附着或生长以及组织的分化，例如通过血浆包被基质，或添加一种或多种蛋白质(例如：胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、葡萄糖胺聚糖(例如：硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素，等)、细胞基质，和/或其它材料，例如但不限于明胶、褐藻胶、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
在一些实施方案中，所述支架包括使其不形成血栓的材料，或用上述材料处理。这类处理和材料还可以促进和维持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。这类材料和处理的实例包括但不限于天然材料例如基膜蛋白(如层粘连蛋白和IV型胶原)、合成材料例如EPTFE，和含硅的嵌段聚氨酯脲例如PURSPANTM(The Polymer Technology Group，Inc.，Berkeley，Calif.)。支架还可以包含抗血栓形成剂例如肝素；还可以在接种胎盘干细胞之前处理支架来改变表面电荷(例如用血浆包被)。
5.6.2遗传修饰的胎盘干细胞
在另一个方面，本发明提供了遗传修饰的胎盘干细胞和脐带干细胞，例如：用于制备感兴趣的核酸或多肽。使用例如基于病毒的载体可以实现遗传修饰，所述载体包括但不限于非整合性复制载体，例如乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；整合性病毒载体如逆转录病毒或腺相关病毒载体；或复制缺陷性病毒载体。其它向细胞引入DNA的方法包括使用脂质体、电穿孔、基因枪、直接DNA注射等。
可以用DNA转化或转染干细胞，所述DNA由一个或多个合适的表达控制元件控制或与其可操作的连接，例如，启动子或增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点、内核糖体进入位点。优选的，此类DNA整合了选择性标志物。在引入外源DNA后，改造的干细胞可以例如生长在富集培养基中，然后转入选择性培养基。在一个实施方案中，用于改造胎盘干细胞的DNA包括编码目标多肽的核苷酸序列，例如细胞因子、生长因子、分化剂或治疗性多肽。
用于改造干细胞的DNA可以包括本领域已知的任何用于在哺乳动物细胞，例如人细胞内驱动核苷酸序列表达的启动子。例如，启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40启动子、乳头瘤病毒启动子、埃-巴二氏病毒启动子、弹性蛋白基因启动子等。在具体的实施方案中，启动子是可调控的，使核苷酸序列仅在需要时才表达。启动子可以是诱导型的(例如：与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的)或组成型的。
在另一个具体的实施方案中，启动子是组织特异性的或表现出组织特异性。此类启动子的实例包括但不限于：髓鞘碱性蛋白基因控制区域(Readhead等人，1987，Cell 48：703)(少突神经胶质细胞)；弹性蛋白酶I基因控制区域(Swit等人，1984，Cell 38：639；Ornitz等人，1986，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol 50：399；MacDonald，1987，Hepatology 7：425)(胰腺腺泡细胞)；胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature 315：115)(胰腺β细胞)；肌球蛋白轻链-2基因控制区域(Shani，1985，Nature 314：283)(骨骼肌)。
可以改造胎盘干细胞，“敲除”或“降低”一个或多个基因的表达。通过例如同源重组使基因完全失活来抑制表达，可以消除细胞天然基因的表达。在一个实施方案中，例如，通过阳性选择标志物如NEO，阻断编码蛋白质的重要区域的外显子，或所述区域5’的外显子，阻止靶基因生产正常的mRNA，导致基因失活。还可以通过去除基因的一部分或删除整个基因来失活该基因。通过利用具有两个区域的构建体(所述区域与靶基因同源但在基因组上相隔较远)可以删除插入两个区域之间的序列(Mombaerts等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88：3084)。还可以使用抑制靶基因表达的反义核酸、DNA酶、小干扰RNA和核酶分子，来降低干细胞内的靶基因水平。例如，就免疫反应而言，抑制主要组织相容基因复合体(HLA)表达的反义RNA分子已经表现出多种用途。在减低靶基因活性水平中可以使用三螺旋分子。参见例如L.G.Davis等人(编著)，1994，BASIC METHODS IN MOLECULAR BI-OLOGY，第2版，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.，其通过引用被纳入本文中。
在具体的实施方案中，可以用包含编码目标多肽的核苷酸序列的核酸分子来遗传修饰胎盘或脐带干细胞，其中目标多肽的表达可以通过外源因子来控制，例如多肽、有机小分子等。此类多肽可以是治疗性多肽。在更具体的实施方案中，目标多肽是IL-12或白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)。在另一个更具体的实施方案中，目标多肽是白介素-1受体拮抗剂和二氢叶酸还原酶(DHFR)的融合肽，外源因子是抗叶酸剂，例如氨甲蝶呤。通过接触氨甲喋呤，此类构建体可用于改造胎盘干细胞或脐带干细胞表达IL-1Ra、或IL-1Ra和DHFR的融合肽。此类构建体可用于例如治疗类风湿性关节炎。在该实施方案中，暴露于抗叶酸剂如氨甲喋呤后，翻译性上调IL-1Ra和DHFR的融合肽。因此，在另一个具体的实施方案中，用于遗传改造胎盘干细胞或脐带干细胞的核酸可以包括编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一多肽和第二多肽作为融合蛋白表达，在存在外源因子的条件下被翻译性上调。可以瞬时地或长期地(例如：数周或数月的过程)表达多肽。
此类核酸分子还可以包括编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽允许阳性选择经改造的干细胞，或使经改造的干细胞可视化。在另一个更具体的实施方案中，核苷酸序列编码的多肽例如在合适的可视化条件下(如荧光素酶(Luc))发出荧光。在更具体的实施方案中，此类核酸分子可以包括IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IRES是内核糖体进入位点。
5.6.3永生化的胎盘干细胞系
通过用任何含有促生长基因的合适的载体转染，可以使哺乳动物胎盘细胞条件化永生，所述促生长基因编码在合适条件下促进转染细胞生长的蛋白质，使促生长蛋白质的生成和/或活性可以通过外部因子进行调控。在优选的实施方案中，促生长基因是原癌基因，例如但不限于v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多形瘤大T抗原、E1a腺病毒或人乳头瘤病毒的E7蛋白。
通过将促生长基因置于外部可调控启动子的控制之下，例如该启动子的活性可以通过调节被转染细胞的温度或调节与被转染细胞接触的培养基的组成来控制，以实现促生长蛋白的外部调控。在一个实施方案中，可以使用四环素(tet)-控制的基因表达系统(参见Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551，1992；Hoshimaru等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1518-1523，1996)。在缺少tet的条件下，该载体内的tet-控制的反式作用子(tTA)强烈地活化来自phCMV*-1的转录，后者是与tet操纵子序列融合的人巨细胞病毒的最小启动子。tTA是大肠杆菌转座子-10-来源的tet抗性操纵子的阻遏物(tetR)与单纯性疱疹病毒VP16的酸性结构域的融合蛋白。低毒、无毒浓度的tet(例如：0.01-1.0μg/mL)几乎完全消除了tTA的反式激活。
在一个实施方案中，所述载体还包括编码选择性标志物的基因，例如产生药物抗性的蛋白质。细菌的新霉素抗性基因(neoR)是一个此类标志物，可以在本文描述的方法中使用。通过本领域普通技术人员已知的方法可以选择携带neoR的细胞，例如向生长培养基中添加如100-200μg/mL的G418。
可以通过本领域普通技术人员已知的多种不同方法实施转染，包括但不限于逆转录病毒感染。一般而言，可以通过与收集的条件培养基的混合物孵育来转染细胞培养物，所述培养基收集自用于制备载体的制备细胞系和含有N2添加物的DMEM/F12。例如，在体外，可以通过在1体积的条件化培养基和2体积含有N2添加物的DMEM/F12中孵育约20小时，5天之后上述制备的胎盘细胞培养物被感染。然后，可如上述选择携带选择性标志物的转染的细胞。
转染后，将培养物传代至允许增殖的表面，例如允许至少30％的细胞在24小时期间内倍增。优选的，底物是聚鸟氨酸/层粘连蛋白底物(其由聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)包被的组织培养塑料构成)、聚鸟氨酸/层粘连蛋白底物底物、或纤粘连蛋白处理的表面。然后，每3-4天加入生长培养基到培养物中，所述培养基可以添加或不添加一种或多种促增殖因子。当培养物低于50％汇合度时，可以向生长培养基中添加促增殖因子。
条件化的永生胎盘干细胞系可以使用标准技术传代，例如当80-95％汇合度时，通过胰酶消化。在一些实施方案中，维持选择直到约第20代时是有利的(例如，对于含有新霉素抗性的基因，添加G418)。还可以在液氮中冷冻细胞供长期储存。
可以从如上述制备的条件化的永生人胎盘干细胞系中分离克隆细胞系。一般而言，可以利用标准技术分离此类克隆细胞系，例如通过有限稀释或利用克隆环，并扩增。通常可以如上所述培养和传代克隆细胞系。
条件化的永生人胎盘干细胞系可以是克隆的，但不是必需，其通常可以通过在有利于分化的培养条件下抑制促生长蛋白的生成和/或活性，来被诱导分化。例如，如果编码促生长蛋白的基因是可由外部-可调控启动子控制，则可以改变条件(例如温度或培养基组成)来抑制促生长基因的转录。对于上述四环素控制的基因表达系统，可以通过添加四环素来抑制促生长基因的转录从而实现分化。一般而言，4-5天用1μg/mL四环素足以启动分化。为了促进进一步的分化，生长培养基中可以包含其它试剂。
5.6.4测定
在测定中，可以使用胎盘干细胞来确定培养条件、环境因子、分子(例如：生物分子、小无机分子等)等对干细胞增殖、扩增和/或分化的影响(与不暴露在下述条件下的胎盘干细胞相比)。
在一个实施方案中，可以将胎盘干细胞与分子接触，测定胎盘干细胞在增殖、扩增或分化中的改变。例如，在一个实施方案中，本发明提供了鉴别调节多个胎盘干细胞增殖的化合物的方法，包括将所述多个干细胞和所述化合物在允许增殖的条件下接触，其中，与不接触所述化合物的多个干细胞相比，如果所述化合物导致所述多个干细胞增殖改变，则鉴别所述干细胞是调节胎盘干细胞的增殖的化合物。在具体的实施方案中，鉴别所述化合物是增殖的抑制剂。在另一个具体的实施方案中，鉴别所述化合物是增殖的增强剂。
在另一个实施方案中，可以鉴别调节多个胎盘干细胞扩增的化合物，包括将所述多个干细胞和所述化合物在允许扩增的条件下接触，其中，与不接触所述化合物的多个干细胞相比，如果所述化合物导致所述多个干细胞扩增改变，则鉴别所述干细胞是调节胎盘干细胞的扩增的化合物。在具体的实施方案中，鉴别所述化合物是扩增的抑制剂。在另一个具体的实施方案中，鉴别所述化合物是扩增的增强剂。
在另一个实施方案中，可以鉴别调节多个胎盘干细胞分化的化合物，包括将所述多个干细胞和所述化合物在允许分化的条件下接触，其中，与不接触所述化合物的多个干细胞相比，如果所述化合物导致所述多个干细胞分化改变，则鉴别所述干细胞是调节胎盘干细胞的分化的化合物。在具体的实施方案中，鉴别所述化合物是分化的抑制剂。在另一个具体的实施方案中，鉴别所述化合物是分化的增强剂。
5.6.5胎盘干细胞库
可以用多种不同的方式培养来自产后胎盘的干细胞，制备一组多批次的胎盘干细胞，例如一组可独立施用的胎盘干细胞制剂。例如，此类批次可以获自来自胎盘灌流液或酶消化的胎盘组织的干细胞。从多个胎盘获得的多组多批次胎盘干细胞，可以置于胎盘干细胞库中，用于例如长期储存。通常，来自胎盘材料初始培养物的贴壁干细胞用于形成种子培养物，所述种子培养物在受控的条件下扩增，经过几乎等量的倍增后形成细胞群。优选胎盘干细胞批次来自单个胎盘组织，但也可以来自多个胎盘组织。
在一个实施方案中，如下所述获得干细胞批次。首先裂解胎盘组织，例如通过绞碎、用合适的酶如胶原酶消化(参见上文5.2.3节)。胎盘组织优选包含例如来自单个胎盘的完整羊膜、完整绒毛膜、或完整羊膜和完整绒毛膜，但也可以仅包含羊膜或绒毛膜的一部分。培养消化的组织例如约1-3周，优选约2周。在去除不贴壁细胞后，通过例如胰酶消化来收集形成的高密度克隆。在适宜体积的培养基中收集并重悬这些细胞，定义为第0代细胞。
使用第0代细胞接种扩增培养。扩增培养可以是任意排列的分离的细胞培养装置，例如：NUNCTM的Cell Factory。第0代的细胞可以任意程度的再分，从而用例如1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104或10×104的干细胞接种扩增培养。优选的，使用约2×104至约3×104个第0代细胞接种各扩增培养。扩增培养的数量可依赖于第0代细胞的数量，并根据获得干细胞的特定胎盘，数量可以更大或更小。
扩增培养生长直到培养中的细胞密度达到一定值，例如约1×105细胞/cm2。此时，可以收集或冷藏细胞，或如上述传代到新的扩增培养中。在使用前，细胞可以传代例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在扩增培养期间，优选持续记录群体倍增的累计数。细胞从第0代培养可以扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次倍增，或多达60次倍增。然而，优选在将细胞群分为个体剂量前，群体倍增的次数在约15和约30次之间，优选约20次倍增。细胞可以在整个扩增过程持续培养，或者可以在扩增过程中一个或多个时间点被冷冻。
用作单个制剂的细胞可以被冷冻，例如冷藏保存供以后使用。单个制剂可以包括例如约1百万至约1亿个细胞/ml，可以包括共计约106至约109个细胞。
在方法的具体的实施方案中，培养第0代细胞约4次倍增，然后冷冻为第1细胞库。解冻来自第1细胞库的细胞并用来接种第2细胞库，所述细胞再经过约8次倍增。收集该阶段的细胞并冷冻，用来接种新的扩增培养，允许再进行约8次额外的倍增，使累计的细胞倍增数达到约20次。可以冷冻在传代中间点的细胞，单位为约100,000至约1千万个细胞/ml，优选约1百万个细胞/ml供后续扩增培养中使用。在约第20次倍增时的细胞可以冷冻成约1百万至约1亿个细胞/ml的单个制剂，以供施用或用于制备含有干细胞的组合物。在一个实施方案中，在10％HAS、10％DMSO的plasmalyte中稀释细胞至约2百万/ml。
在优选的实施方案中，对获得胎盘的供体(例如：母体)测试至少一种病原体。如果母体对测试的病原体呈阳性，则抛弃来自所述胎盘的整个批次。在制备胎盘干细胞批次过程中的任何时间点都可以实施此类测试，包括在建立第0代细胞之前或之后，或在扩增培养的过程中。测试存在的病原体可以包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷性病毒(I型和II型)、巨细胞病毒、疱疹病毒等。
5.6.6疾病的治疗
本发明提供了治疗患有疾病、障碍或病状的个体的方法，其中所述疾病、障碍或病状与不合适或不希望的免疫反应相关或由其导致的，例如通过免疫抑制可以有利地治疗的疾病、障碍或病状，包括向个体施用胎盘干细胞。在具体的实施方案中，所述量是足以可检测地抑制个体内免疫反应的量。此类免疫反应可以是例如用所述个体的T细胞实施的MLR或回归测定中的T细胞增殖。
可以用多个胎盘干细胞，和任选的一种或多种治疗剂，在疾病发展过程中的任何时间治疗患有与不合适或不希望的免疫反应相关的、或由其导致的疾病、障碍或病状的个体，例如：患有或有风险发生多发性硬化的个体；患有或有风险发生炎性肠病的个体，如克隆氏病或溃疡性结膜炎；患有或有风险发生移植物抗宿主疾病的个体；患有或有风险发生硬皮病的个体；患有或有风险发生类风湿性关节炎的个体；患有或有风险发生糖尿病的个体；患有或有风险发生牛皮癣的个体；患有或有风险发生蕈样真菌病的个体；等。例如，可以在诊断后立即治疗个体，或在诊断的1、2、3、4、5、6天内，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多周内，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年内治疗所述个体。在疾病的临床过程中，可以治疗所述个体1次或多次。可以在急性发作期间、缓解期间或慢性退行性阶段内治疗所述个体。
用于治疗此类疾病、障碍或病状的胎盘干细胞可以是本文中公开的任何胎盘干细胞。在具体的实施方案中，胎盘干细胞表达CD200和HLA-G；表达CD73、CD105和CD200；表达CD200和OCT-4；表达CD73、CD105和HLA-G；表达CD73和CD105，并且当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，利于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体；或表达OCT-4，并且当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时，有利于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体；或任意前述的组合。在具体的实施方案中，胎盘干细胞是CD10+、CD105+、CD200+、CD34-的胎盘干细胞。在具体的实施方案中，胎盘干细胞是CD117-。
在一个实施方案中，施用于个体的剂量是约3亿个胎盘干细胞。然而可以根据个体的生理学特征，例如体重，来改变剂量，范围可以从1百万至100亿胎盘干细胞/剂，优选的在1千万和10亿/剂之间，或在1亿和5千万胎盘干细胞/剂之间。优选静脉内施用，但也可以是用于活细胞给药的任何医学可接受的途径，例如：肠道外、皮下、肌肉内、腹膜内、眼内等。在一个实施方案中，胎盘干细胞来自细胞库。在一个实施方案中，在适合弹丸注射或通过导管给药的血袋或类似的袋中含有来自例如羊膜、羊膜/绒毛膜、绒毛膜或脐带的胎盘干细胞的制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有疾病、障碍或病状的个体的方法，其中所述疾病、障碍或病状是与不合适或不希望的免疫反应相关的或由其导致，例如通过免疫抑制可以有利地治疗的疾病、障碍或病状，包括向个体施用已经被胎盘干细胞条件化的培养基，所用量足以可检测地抑制个体内免疫反应。此类免疫反应可以是例如在利用来自个体的T细胞实施的MLR或回归测定中的T细胞增殖。
胎盘干细胞或脐带干细胞，或被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，可以单次剂量施用，或以多次剂量施用。当以多次剂量施用胎盘干细胞时，所述剂量可以是治疗性技术方案的一部分，所述方案被设计用来缓解疾病、障碍或病状的一种或多种急性症状，其中所述疾病、障碍或病状是与不合适或不希望的免疫反应相关或由其导致的，或者可以是长期治疗方案的部分，所述方案设计为防止或减轻此类疾病、障碍或病状的慢性过程的严重程度。
5.6.7治疗多发性硬化
在一个方面，本发明提供了治疗患有多发性硬化的个体，或与多发性硬化相关的症状的方法，包括向所述个体施用多个胎盘干细胞，或被胎盘干细胞条件化的培养基，施用的量和时间足以可检测地调节(例如抑制)该个体中的免疫反应。
多发性硬化(MS)是中枢神经系统的慢性、复发性炎症疾病。该疾病损伤围绕CNS和PNS轴突的髓鞘、少突胶质细胞和神经细胞自身。该疾病是通过自体反应性T细胞，特别是CD4+T细胞介导的，所述细胞在细胞附着分子和原炎症细胞因子的影响下扩增、穿过血脑屏障并进入CNS。MS的症状包括四肢的感觉障碍、视神经障碍、锥体束障碍、膀胱障碍、肠道障碍、性障碍、共济失调和复视。
已经鉴别了4种不同类型或临床进程的MS。第一种，复发/缓解型MS(RRMS)，特征是表现为急性神经障碍的自限性发作，持续数天至数周的过程，后续持续数月的恢复期，有时恢复不完全。第二种类型，继发进行性多发性硬化(SPMS)，以RRMS开始，但之后的变化使临床过程的特征变为与急性发作无关的持续性功能破坏。第三种，原发进行性多发性硬化(PPMS)，特征是从开始即功能持续衰退，没有急性发作。第四种类型，进行性/复发性多发性硬化(PRMS)，也是以进行性过程开始，在功能衰退过程中偶有发作。
通常利用运动技能评估来评定患有MS的人，任选的使用MRI。例如如下所述的运动技能评估、扩展的残疾状态评分、对病患个体的能力的分数评级：
0.0正常的神经性检查
1.0无残疾，一种FS的最小信号
1.5无残疾，多于一种FS的最小信号
2.0一种FS的最小残疾
2.5一种FS的轻微残疾或两种FS的最小残疾
3.0一种FS的中等残疾，或者三种或四种FS的轻微残疾。完全能走动的。
3.5完全能走动的，但具有一种FS的中等残疾，以及若个其它FS的最小以上的残疾
4.0虽然有相对严重的残疾，但是每天约12小时或以上，在不辅助的条件下完全能走动的，自理的；不需要帮助或休息能够步行超过500米
4.5每天大部分的时间不需要帮助完全能走动的，能够工作整天，但在全面活动力中可以具有一些局限性，或需要最小的帮助；特征是相对严重的残疾；不需要帮助或休息能够步行约300米。
5.0不需要帮助或休息能够走动约200米；残疾严重足以损害全天日常活动(在没有特别规定的条件下工作全天)
5.5不需要帮助或休息能够走动约100米；残疾严重足以妨碍全天日常活动
6.0步行约100米，需要间歇或单侧持续的帮助(手杖、撑拐、支架)，需要或不需要休息
6.5步行约20米，需要持续的双侧帮助(手杖、撑拐、支架)，不需要休息
7.0即使有帮助也不能步行超过约5米，基本局限在轮椅上；在标准轮椅中自己旋转并移动；在轮椅中一天活动约12小时
7.5不能走出数步；局限于轮椅；可能移动需要帮助；在标准轮椅中可自己旋转但不能坚持一整天；可能需要助动轮椅
8.0基本局限于床或椅子或在轮椅中徘徊，但可以在一天的大部分时间在床以外；保留了大部分的自理功能；通常具有手臂的有效使用
8.5一天的大部分时间基本局限于床；具有手臂的一些有效使用，保留了一些自理功能
9.0局限在床上；但仍可以交流和进食
9.5完全无助的卧床患者；不能有效交流或进食/吞咽
10.0死于MS
在上述评分系统中，“FS”指测量的8种功能系统，包括椎体、小脑、脑干、感觉、肠和膀胱、视觉、大脑和其它系统。
已知其它相似的评分系统，包括Scripps神经评定量表、步行指数和多发性硬化功能性复合评分(MSFC)。
还通过确定发作率评估MS的进程。
还通过磁共振成像评估MS的进程，其可以确定与MS相关的神经损伤(例如：新损伤、增加的损伤或组合的特殊活性损伤)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有MS的个体，和确诊患有MS的个体的方法，包括向个体施用足以在个体内有效地可检测地抑制免疫反应的多个胎盘干细胞。在具体的实施方案中，MS是复发/缓解型。在另一个具体的实施方案中，MS是继发进行性多发性硬化。在另一个具体的实施方案中，MS是原发进行性多发性硬化。在另一个具体的实施方案中，MS是进行性/复发性多发性硬化。在另一个具体的实施方案中，所述施用可检测地改善了个体内MS的一种或多种症状。在更具体的实施方案中，所述症状是例如：四肢的一处或多处感觉障碍、视神经机能障碍、锥体束机能障碍、膀胱机能障碍、肠机能障碍、性障碍、共济失调或复视。在另一个具体的实施方案中，所述给药导致EDSS评分改善至少0.5点。在另一个具体的实施方案中，根据至少一个MS评分系统，在病程的例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，所述施用导致功能的维持。在另一个具体的实施方案中，所述施用导致EDSS评分改善至少1.0点。在另一个具体的实施方案中，所述施用导致EDSS评分改善至少2.0点。在其它具体的实施方案中，所述施用可检测地改善多发性硬化评分或MRI。合适时，可以在急性发作期间、恢复期间或慢性退行性阶段期间治疗个体。在另一个实施方案中，产后向患有MS的女性施用胎盘干细胞，维持在怀孕期间经历的恢复或减少发生的状态。
本发明还提供了治疗患有MS的个体，和确诊患有MS的个体的方法，包括向个体施用足以在个体内有效地可检测地抑制免疫反应的多个胎盘干细胞，以及一种或多种治疗剂，其中施用可检测地改善个体内的一种或多种MS症状。在一个实施方案中，所述治疗剂是糖皮质激素。在具体的实施方案中，所述糖皮质激素是促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲基泼尼松龙或地塞米松。在另一个实施方案中，所述治疗剂是免疫调节剂或免疫抑制剂。在不同的实施方案中，所述免疫调节剂或免疫抑制剂是IFNβ-1a、IFN-1b、醋酸格拉替雷、环磷酰胺、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环孢霉素或米托蒽醌。在其它实施方案中，治疗剂是静脉免疫球蛋白、血浆交换或柳氮磺胺吡啶。在另一个实施方案中，给予个体任何上述治疗剂的组合。
5.6.8炎性肠病的治疗
在一个实施方案中，使用胎盘干细胞、胎盘干细胞群和/或含有胎盘干细胞或胎盘干细胞群的组合物，治疗患有或有风险患上炎性肠病(IBD)，例如克隆氏病或溃疡性结肠炎。因此，在另一个方面，本发明提供了治疗患有炎性肠病的个体或与炎性肠病相关的症状的方法，包括向个体施用多个胎盘干细胞，或施用被胎盘干细胞条件化的培养基，施用的量和时间足以可检测地调节(例如抑制)个体中的免疫反应。
克隆氏病。在一个实施方案中，所述炎性肠病是克隆氏病，有时称为回肠炎或肠炎。克隆氏病是导致消化道(也称为胃肠道，或GI道)炎症的慢性疾病。克隆氏病可以影响胃肠道的任何部分，从口到肛门，但通常大部分影响小肠的下段，也称为回肠。已知5种类型的克隆氏病。胃十二指肠的克隆氏病影响胃和十二指肠(小肠的最前部分)。空肠回肠炎是空肠回肠的克隆氏病，空肠回肠是小肠的最长的部分。回肠炎是回肠的克隆氏病，是小肠最低的部分。回肠结肠炎是最常见的克隆氏病，影响回肠和结肠。最后，克隆氏结肠炎(肉芽肿性结肠炎)影响结肠，与溃疡性结肠炎的区别是，在克隆氏病中，患病组织之间通常存在健康的组织，且克隆氏结肠炎可以仅涉及结肠，不涉及直肠。认为克隆氏病源自机体免疫系统对胃肠道内抗原不希望的反应，包括例如食物、益生菌等，导致血白细胞在小肠内膜积累。与克隆氏病相关的炎症还归因于细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)的作用。
溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述IBD是溃疡性结肠炎。溃疡性结肠炎是导致直肠和/或结肠内膜炎症和疮(溃疡)的疾病。炎症杀死通常排列在结肠中的细胞后形成溃疡；溃疡通常流血并产生pus。当炎症在直肠和下结肠发生时，该疾病被称为溃疡性直肠炎。如果感染了整个结肠，则疾病被称为全结肠炎。如果仅感染结肠的左侧，则该疾病被称为局部或远端结肠炎。溃疡性结肠炎的症状包括但不限于腹痛、血性腹泻、发热、恶心、腹部绞痛、贫血、疲劳、体重减轻、胃口丧失、直肠出血、体液或营养物丧失、皮肤损害、关节痛、和生长迟缓(儿童中)。溃疡性结肠炎还可以导致并发症，例如眼部炎症、肝病和骨质疏松。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有炎性肠病的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞，其中所述治疗有效量是足以可检测地改善导致上述炎性肠病(IBD)的至少一种症状的量。在具体的实施方案中，所述IBD是克隆氏病。在具体的实施方案中，所述克隆氏病是胃十二指肠的克隆氏病、空肠回肠炎、回肠炎、回肠结肠炎或克隆氏结肠炎。在另一个更具体的实施方案中，所述症状是克隆氏病的症状。在更具体的实施方案中，所述克隆氏病的症状是部分GI道的炎症和水肿，腹痛、肠道的频繁排空和/或腹泻。在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病的症状是直肠出血、贫血、体重减轻、关节炎、皮肤问题、发热、小肠壁增厚、肠道疤痕组织形成、肠道中形成疮和溃疡、肠壁形成一处或多处瘘管、肛门形成一处或多处龟裂、出现营养不良(例如：蛋白质、卡路里、维生素中一种或多种缺乏)、出现肾结石、出现胆结石、出现肝或胆系统的疾病。
在另一个更具体的实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎。在更具体的实施方案中，所述溃疡性结肠炎是溃疡性直肠炎、全结肠炎、局部或远端结肠炎。在另一个更具体的实施方案中，所述症状是溃疡性结肠炎的症状。在更具体的实施方案中，所述症状是腹痛、血性腹泻、发热、恶心、腹部绞痛、贫血、疲劳、体重减轻、胃口丧失、直肠出血、体液或营养物丧失、皮肤损害、关节痛，和生长迟缓(儿童)。在另一个更具体的实施方案中，症状是骨质疏松、眼部炎症或肝病。
在另一个具体的实施方案中，对所述施用了胎盘干细胞的个体还施用一种或多种第二治疗，其中所述第二治疗包括抗炎剂、甾类激素、免疫抑制剂和/或抗生素。用于治疗克隆氏病或溃疡性结肠炎的抗炎药物的实例包括但不限于：美沙拉嗪、5-ASA(5-氨基水杨酸)试剂(例如：
Figure G200880011754XD00801
(美沙拉嗪，缓释)、DIPENTUM(Osalazine)、
Figure G200880011754XD00802
(美沙拉嗪控制-释放)、柳氮磺胺吡啶(5-ASA和磺胺吡啶的组合)、抗炎抗体(例如：英夫利昔单抗(
Figure G200880011754XD00803
)))，等。用于治疗克隆氏病或溃疡性结肠炎的甾类激素的实例包括但不限于：可的松、氢化可的松、泼尼松、甲基泼尼松等。典型的，如本领域实践的，甾类激素的剂量首先递送相对大剂量，再在炎症消退时使用较小剂量。用于治疗克隆氏病或溃疡性结肠炎的免疫抑制剂的实例包括但不限于：环孢霉素A、6-巯基嘌呤或硫唑嘌呤。在克隆氏病治疗中可以使用任何抗生素，包括例如：青霉素、磺胺、头孢菌素、四环霉素和/或甲硝唑。在另一个具体的实施方案中，第二治疗是施用猪鞭虫，例如猪鞭虫的卵巢。
5.6.9移植物抗宿主疾病的治疗
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有移植物抗宿主病(GVHD)、或正在经历(GVHD)症状、或有风险出现GVHD的个体(例如移植接受者或将接受移植的个体)的方法，包括向该个体施用治疗有效量的胎盘干细胞，或被胎盘干细胞条件化的培养基，其中治疗有效量是足以可检测地改善GVHD的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低GVHD的一种或多种症状。
GVHD通常在完全或部分的同种异体组织移植后出现，或作为其结果出现，特别是在同种异体造血干细胞移植后，可以包括通常在移植的5-100天内出现的一种或多种皮炎、肠炎和肝炎。GVHD可以是急性的或慢性的。急性GVHD的特征可以是搔痒或刺痛，通常在移植后5-47天出现。超急性GVHD还可以伴随发热、泛发性红皮病和脱皮。还可以涉及肝脏，表现为胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(AP)水平升高。急性GVHD还可以涉及结肠，导致腹泻、内出血、痉挛、腹痛和肠梗阻。慢性GVHD可以发生在已经经历了急性GVHD的移植患者中，或原来无症状的个体中。慢性GVHD的表现包括眼内的烧灼感、眼涩、畏光和由于眼泪分泌减少导致的眼疼痛；口干、对辛辣或酸性食物敏感、腹痛、吞咽困难(难以吞咽)、吞咽痛(吞咽时疼痛)、体重减轻、阻塞性肺疾病、肌无力、神经性疼痛和/或肌肉痉挛。
因此，在本发明方法的具体实施方案中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以可检测地改善导致急性GVHD的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低急性GVHD的一种或多种症状的发生。在更具体的实施方案中，所述一种或多种症状包括皮炎、皮肤瘙痒、皮疹、肠炎、肝炎、发热、红皮病、脱皮、升高水平的ALT、升高水平的AST、升高水平的AP；升高水平的胆红素；腹痛、痉挛、内出血或肠梗阻。在该方法的另一个更具体的实施方案中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以可检测地改善慢性GVHD的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低慢性GVHD的一种或多种症状的发生，其中所述症状包括眼内的烧灼感、眼涩、眼泪生成减少、畏光和由于眼泪分泌减少导致的眼疼痛；口干、对辛辣或酸性食物敏感、腹痛、吞咽困难(难以吞咽)、吞咽痛(吞咽时疼痛)、体重减轻、阻塞性肺疾病(包括任何哮喘性呼吸困难和/或慢性咳嗽)、肌无力、神经性疼痛和/或肌肉痉挛。在方法的另一个具体的实施方案中，急性GVHD和/或慢性GVHD的症状包括高胆红素血、黄疸、门静脉高血压、肝硬化、出血性结膜炎、形成假膜、兔眼、慢性角膜结膜炎、干燥、间断角膜病、口腔粘膜萎缩、红斑、颊或唇缘粘膜出现苔藓样破损、闭塞性细支气管炎、阴道炎、阴道狭窄、自身免疫性血小板减少症和/或贫血。
本发明方法不限于供体和或接受者的性质。移植可以跨越物种界限。在优选的实施方案中，供体和接受者是同一物种，例如都是人。移植接受者可以与供体是完全或部分同种异体的。移植可以是自体的。移植接受者或供体年龄可以小于5岁，从1到10岁、从5到15岁、从10到20岁、从15到25岁、从20到30岁、从25到35岁、从30到40岁、从35到45岁、从40到50岁、从45到55岁、从50到60岁、从55到65岁、从60到70岁，或70岁，或更老。
GVHD通常通过症状的严重程度评分。例如，在一个实施方案中，对GVHD的症状进行阶段划分，根据皮肤、肝和/或肠道症状，将GVHD分为0(无GVHD)至IV级(威胁生命的GVHD)，如表1和2所示：
表1.急性移植物抗宿主病的阶段划分
表2.急性GVHD的分级
Figure G200880011754XD00832
因此，在本发明方法的另一个实施方案中，治疗有效量的胎盘干细胞是足以改善个体的移植物抗宿主疾病的一种或多种症状的量，例如，已经接受移植的个体(移植接受者)，使所述移植物抗宿主疾病的分级降低至少一级。在具体的实施方案中，所述移植物抗宿主病从IV级降低至III级；从IV级降低至II级；从IV级降低至I级；从IV级降低至0级；从III级降低至II级；从III级降低至I级；从III级降低至0级；从II级降低至I级；从II级降低至0级；或从I级降低至0级。在本发明方法的另一个实施方案中，胎盘干细胞的治疗有效量是这样的量，在移植后的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100天内，所述量使所述个体中的移植物抗宿主病发展不超过0级、I级、II级或III级。
在不同的具体实施方案中，患有或有风险出现GVHD的个体是这样的个体，所述个体是接受同种异体造血细胞移植的个体(例如：没有接受任何GVHD预防处理的个体；大龄个体；HLA-不完全匹配的造血干细胞的受体；来自异体敏感供体的移植物的受体；无血缘关系供体移植物的受体)；接受实体器官移植的个体，特别是包括淋巴组织的器官移植，例如小肠移植；和接受未经照射的血液产品的个体(例如：新生儿和胎儿，具有先天性免疫缺陷综合征的个体，接受免疫抑制化疗的个体，接受来自HLA-部分匹配、HLA-同源个体直接供血的个体)，接受复合组织同种异体移植物的个体(即，具有超过一种组织类型的同种异体移植物)；等。GVHD还可以发生在自体移植或同系造血细胞移植之后。在另一个具体的实施方案中，作为移植的附属物，个体已经接受了亚致死或致死剂量的照射(例如：已经过辐射)。
在具体的实施方案中，在移植前的14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天前，向个体施用胎盘干细胞或脐带干细胞。在另一个具体的实施方案中，在移植的同时施用胎盘或脐带干细胞。在另一个具体的实施方案中，在移植的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内施用胎盘或脐带干细胞。可以多次实施胎盘或脐带干细胞给药，例如在移植前、移植中或移植后多次施用，或其任意的组合。在另一个实施方案中，当个体(移植接受者)表现出II级或更严重的移植物抗宿主病时，可以在移植后的任何时间施用脐带或胎盘干细胞。
在本发明方法的另一个实施方案中，向个体，例如移植接受者或即将接受移植的个体，施用胎盘干细胞或脐带干细胞和另外的至少一种其它的治疗剂。在具体的实施方案中，所述治疗剂是抗胸腺细胞球蛋白、麦考酚酸吗乙酯、西罗莫司、Campath-IH、角质化细胞生长因子(KGF)、辛二酰替苯胺异羟肟酸(SAHA)、可的松、氢化可的松、泼尼松或甲基泼尼松。在另一个具体的实施方案中，所述治疗剂是免疫抑制剂或免疫调节剂。可用于GVHD的免疫抑制剂和免疫调节剂是本领域已知的，包括但不限于：氨甲蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环胞素A、大环内酯类抗生素(例如，FK506(他克莫司))、甲泼尼龙(MP)、皮质激素、类固醇、麦考酚酸莫酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(例如，来氟米特)、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂、肽模拟物和抗体(例如，人的、人源化的、嵌合的、单克隆、多克隆、Fvs、ScFvs、Fab或F(ab)2片段或表位结合片段)、核酸分子(例如，反义核酸分子和三螺旋)、小分子、有机化合物，和无机化合物。特别的，免疫调节剂包括但不限于：甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环磷酰胺(Cytoxan)、硫唑嘌呤(Immuran)、环胞素A、米诺环素、硫唑嘌呤、抗生素(例如，FK506(他克莫司))、甲泼尼龙(MP)、皮质激素、类固醇、麦考酚酸莫酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(例如，来氟米特)、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。T细胞受体调节剂的实例包括但不限于：抗T细胞受体抗体(例如，抗CD4抗体(如，cM-T412(Boehringer)、IDEC-CE9.Is(IDEC和SKB)、mAb 4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗CD3抗体(如，Nuvion(Product Design Labs)、OKT3(Johnson & Johnson)或Rituxan(IDEC))、抗CD5抗体(如，抗CD5连接蓖麻毒素的免疫缀合物)、抗CD7抗体(如，CHH-380(Novartis))、抗CD8抗体、抗CD40配体单克隆抗体(如，IDEC-Bl(IDEC))、抗CD52抗体(如，1H(Ilex))、抗CD2抗体、抗CD 1a抗体(如，Xanelim(Genentech))和抗B7抗体(如，IDEC-114)(IDEC)))、CTLA4-免疫球蛋白、撒利多迈德胺，或5.6.6节中的化合物之一。在具体的实施方案中，T细胞受体调节剂是CD2拮抗剂。在其它实施方案中，T细胞受体调节剂不是CD2拮抗剂。在另一个具体的实施方案中，试剂是抗体MEDI-501(T10B9)。在另一个具体的实施方案中，T细胞受体调节剂是CD2结合分子，优选MEDI-507。在其它实施方案中，T细胞受体调节剂不是CD2结合分子。可以施用适合治疗GVHD或GVHD症状的上述治疗剂任意组合。此类治疗剂可以与胎盘干细胞或脐带干细胞以任意组合，同时施用或作为独立的治疗分别进行。
5.6.10类风湿性关节炎的治疗
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有类风湿性关节炎(RA)、或正在经历RA症状、或有风险患RA的个体的方法，包括向个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞，或施用被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，其中所述治疗有效量是足以可检测地改善RA的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低RA的一种或多种症状发生的量。类风湿性关节炎是慢性、炎性自体免疫综合症，其中机体的免疫系统通常攻击机体的关节和其它组织。
在具体的实施方案中，在患RA的个体的至少一个关节中，所述施用足以可检测地改善RA的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低RA的一种或多种症状发生。在另一个具体的实施方案中，在患RA的个体的至少一种非关节组织中，所述施用足以可检测地改善RA的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低RA的一种或多种症状发生。RA可以影响的非关节组织的实例包括但不限于：皮肤(表皮)、肺、自体免疫系统或血液、肾组织、心血管组织、眼组织或神经组织。
在具体的实施方案中，RA的症状是但不限于：晨间强直(例如持续超过1小时)、一处或多处关节或关节群的软组织肿胀、关节痛、皮下结节、类风湿因子高于95％，或提示关节受损的放射学变化。
在具体的实施方案中，所述施用足以可检测地改善一种或多种RA并发症，或足以可检测地降低一种或多种RA并发症的发生。此类病状的实例包括但不限于：坏疽性脓皮症、嗜中性白细胞皮肤病、斯威特氏综合征(Sweet′s syndrome)、病毒感染、结节性红斑、小叶性脂膜炎、肢端皮肤萎缩、掌红斑、弥漫性变薄(米纸皮肤)、皮肤脆弱、在外表面的皮下结节(例如肘部)、肺纤维变性(例如：甲氨蝶呤治疗所导致的)、卡普兰氏结节、血管炎性障碍、甲褶梗死、神经病、肾病、淀粉样变性、假性肌肥大、心内膜炎、左心室衰竭、血管炎、巩膜软化、多发性单神经炎、寰枢椎不全脱位等等。
在本发明方法的另一个实施方案中，向患有RA的个体施用胎盘干细胞或脐带干细胞和另外至少一种其它治疗剂。在具体的实施方案中，所述治疗剂是例如止痛剂，或抗炎剂。在另一个具体的实施方案中，所述治疗剂是缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)。在更具体的实施方案中，DMARD是一种或多种异型生物质(例如：硫唑嘌呤、环胞素A、D-青霉胺、金盐、羟氯喹、)或生物学试剂(例如：肿瘤坏死因子α(TNF-α)阻断剂，如依那西普(
Figure G200880011754XD00871
)、英夫利昔单抗(
Figure G200880011754XD00872
)、阿达木单抗(
Figure G200880011754XD00873
)，或上文5.6.8节公开的化合物之一；白介素-1阻断剂；抗B细胞(CD20)抗体(例如：利妥昔单抗或
Figure G200880011754XD00881
)；或T细胞活化的阻断剂(例如：阿巴西普或))。在另一个更具体的实施方案中，镇痛剂或抗炎剂是糖皮质激素、非固醇类抗炎药、对乙酰氨基酚、布洛芬、阿司匹林、鸦片剂或利多卡因(局部的)。可以施用适合治疗GVHD或GVHD症状的上述治疗剂的任意组合。此类治疗剂可以与胎盘干细胞或脐带干细胞以任意组合，同时施用或作为独立的治疗过程进行。
在具体的实施方案中，向患有RA的个体施用的多个胎盘干细胞或脐带干细胞已经被遗传改造，以表达治疗RA的多肽。在更具体的实施方案中，治疗RA的多肽是IL-1Ra(白介素-1受体拮抗剂)。在另一个更具体的实施方案中，治疗RA的多肽是含有IL-1Ra和DHFR(二氢叶酸还原酶)的融合蛋白。在更具体的实施方案中，用编码IL-1Ra-DHFR融合蛋白的核酸转化胎盘干细胞或脐带干细胞，其中通过抗叶酸剂，例如氨甲喋呤，增加融合蛋白的表达。在另一个更具体的实施方案中，向患有RA的个体施用多个第二类型的干细胞，其中，所述多个第二类型的干细胞已经被遗传改造，表达治疗RA的多肽，例如任何上文公开的多肽。在更具体的实施方案中，核酸编码IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IRES是内核糖体进入位点，Luc是荧光素酶。在另一个更具体的实施方案中，所述核酸包括能够控制IL-1Ra或IL-1Ra-DHFR融合多肽表达的核苷酸序列。
用于治疗RA的经遗传改造的胎盘干细胞、脐带干细胞或其它类型的干细胞，可以与未经过遗传改造的此类干细胞以任意组合向患有RA的个体施用。
5.6.11硬皮病的治疗
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有硬皮病、正在经历症状硬皮病、或有硬皮病风险的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞，或施用被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，其中治疗有效量是足以可检测地改善硬皮病的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低硬皮病的一种或多种症状发生。
硬皮病是慢性疾病，其特征是胶原在皮肤或其它器官中的过度沉淀。硬皮病可以是局部的或全身的。硬皮病的局部形式是致残的，但不趋向致死。硬皮病的全身形式表现为弥漫性硬皮病或系统性硬化，由于心、肾、肺或肠的破坏，导致该疾病可以是致死的。硬皮病的三种类型是弥漫性硬皮病、局限性(CREST综合征)硬皮病(也是全身性的)，和硬斑/线形硬皮病(其局限于皮肤)。弥漫性硬皮病是最严重的形式，受害者发病迅速、皮肤广泛硬化、内脏(特别是肺和胃肠道)损害严重。
硬皮病的局限性形式比较温和，发病和发展缓慢。局限性硬皮病的皮肤硬化通常限于手和面部，相比弥漫性硬皮病，其对内脏器官的损害较不严重。通常，雷诺现象(Reynaud′s phenomenon)可以经过数年发展成为硬皮病。雷诺现象的原因是在寒冷中，裸露体表的小动脉血管收缩，特别是在手和足，典型表现为是三相变色：首先白色，然后是蓝色和最后回暖后的红色。局限性硬皮病形式常被称为CREST综合征，其中“CREST”是五种主要特征的首字母缩写：钙化(calcinosis，软组织的钙沉淀，例如皮肤)、雷诺氏综合征(Raynaud’s syndrome)、食道运动障碍(esophageal dysmotility)、指端硬化(sclerodactyly，手指的硬皮病)，和毛细管扩张(telangiectasia，蛛网静脉)。
硬皮病的发展与存在自身抗体相关，特别是抗着丝粒和抗scl70/抗拓扑异构酶抗体。多达90％的患者都有可检测到的抗核抗体。抗着丝粒抗体在局限性硬皮病(80-90％)中比在全身性硬皮病(10％)中更常见，而抗scl70则在弥漫性硬皮病(30-40％)和非洲-美洲患者中更常见。
因此，本发明提供的治疗方法中，施用胎盘干细胞或脐带干细胞抑制了硬皮病的一种或多种症状的发展，降低了其严重程度，或减慢了硬皮病的一种或多种症状的进展。在一个实施方案中，硬皮病是局限性硬皮病。在另一个实施方案中，硬皮病是弥漫性硬皮病。在另一个实施方案中，硬皮病是硬斑病。在另一个具体的实施方案中，所述症状是面部皮肤的一处或多处硬化、手指皮肤的硬化、雷诺综合症、加压素极度失当、钙化、毛细管扩张、食道运动障碍。在另一个具体的实施方案中，施用胎盘干细胞或脐带干细胞可检测地降低了个体一毫升血液中一种或多种抗核抗体的量或浓度，例如，抗着丝粒抗体或抗拓扑异构酶抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供的治疗方法包括施用第二疗法或治疗剂，其中所述第二疗法或治疗剂是抗炎药，例如，甾类抗炎药物或非甾类抗炎药物(NSAID)、对乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、阿斯匹林等。在更具体的实施方案中，施用NSAID，还施用质子泵抑制剂(PPI)，例如，奥美拉唑。在另一个实施方案中，所述第二疗法是免疫抑制化合物，例如麦考酚酸吗乙酯、环磷酰胺或氨甲喋呤。在另一个实施方案中，患者具有手指溃疡和肺动脉高血压，向其施用血管扩张剂例如前列环素(伊洛前列素)。
在另一个实施方案中，所述第二疗法是第二种类型的细胞，例如造血干细胞如CD34+造血干细胞，以一种或多种剂量(约105细胞/kg至约109细胞/kg)。在具体的实施方案中，所述第二类型的干细胞是间充质干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞。所述第二类型的干细胞，例如造血干细胞或间充质干细胞，可以与胎盘干细胞以任意比例施用，例如，约100∶1、75∶1、50∶1、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶50、1∶75或1∶100。此类间充质干细胞可以商业获得或自原始来源获得，例如骨髓、骨髓吸出物、脂肪组织等。
可以施用适合治疗硬皮病或硬皮病症的上述治疗剂的任意组合。此类治疗剂可以与本发明的胎盘干细胞或脐带干细胞以任何组合，同时施用或作为独立的治疗过程进行。
向患有硬皮病的个体施用的胎盘干细胞或脐带干细胞可以是药物组合物的形式，例如适合如静脉内、肌肉内或腹腔内注射的药物组合物。
5.6.12治疗牛皮癣
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有牛皮癣、正在经历牛皮癣症状、或有风险患牛皮癣的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞，或施用被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，其中所述治疗有效量是足以可检测地改善牛皮癣的一种或多种症状的量，或足以可检测地降低硬皮病的一种或多种症状发生的量。
牛皮癣是影响皮肤和关节的疾病，通常导致皮肤上出现红色的有鳞斑块，称为牛皮癣斑。牛皮癣斑是炎性和皮肤过度生成的结果。皮肤在这些位置快速积累，并呈现银白色外观。斑通常发生在肘和膝盖的皮肤，但也可以影响任何区域，包括头皮和生殖器。推测牛皮癣是免疫介导的。
已经鉴别了一些不同类型的牛皮癣，如下：
斑块状牛皮癣(寻常性牛皮癣)是最常见形式的牛皮癣，通常表现为升高的发炎皮肤区域，覆盖了银白色鳞状皮肤，称为斑。
屈侧银屑病(皮褶牛皮癣)表现为发生在皮肤褶皱处的光滑的发炎皮肤块，例如围绕生殖器(在大腿和鼠蹊之间)、腋下、超重的胃部下方和乳房下方的光滑发炎皮肤块。
滴状牛皮癣表现为在大面积的躯体(例如躯干、四肢和头皮)上出现大量小圆点(泪滴状的)。滴状牛皮癣与链球菌咽部感染相关。
脓疱性牛皮癣表现为充满非感染性脓液的升高的肿块(脓疱)。脓疱性牛皮癣可以是局部的，通常在手和足(掌跖牛皮癣)，或全身性的，具有在机体任何部分随机发生的广泛的斑块。
指(趾)甲牛皮癣使手指和脚趾甲的外观产生多种改变，包括甲板下变色、指甲凹陷、跨越指甲的横线、指甲下方皮肤增厚，和指甲的松动(甲松离)和碎裂。
牛皮癣关节炎涉及关节和结缔组织炎症，例如，在手指和脚趾的关节中，可以导致手指和脚趾的香肠样肿大，称为指炎。牛皮癣关节炎还可以影响臀部、膝关节和脊柱(脊椎炎)。
红皮性牛皮癣表现为在大部分躯体表面皮肤的广泛炎症和剥落。可以伴随严重的瘙痒、肿胀和疼痛。通常是不稳定的斑块状牛皮癣恶化的结果，特别是在突然停止系统治疗后。由于极端的炎症和剥落破坏了机体调节体温的能力以及皮肤实施屏障功能的能力，该类型的牛皮癣可以是致死的。
在一个实施方案中，本发明提供了向患有牛皮癣的个体施用治疗有效量的胎盘干细胞，其中所述治疗有效量是足以可检测地改善例如上文列举的牛皮癣的一种或多种症状、降低其严重程度或降低其进展的量。
可以通过例如牛皮癣区域严重程度指数(PASI)，来评估牛皮癣的严重程度。PASI将损伤的严重程度和受影响区域的评估组合，在0(无病)至72(最大程度的疾病)范围内打一个分数。
为了计算PASI，躯体被划分为四个部分：大腿、身体(躯干区域：胃、胸、背，等)、手臂和头。每个上述区域分别评分，然后将四个分数组合，形成最终PASI。对于每个部分，评定受牛皮癣影响的皮肤面积的百分比，然后转化成0-6级，如下：
Figure G200880011754XD00931
通过四种不同的参数评估严重程度，分为0-4级：瘙痒(itching)、红斑(erythema，发红)、鳞状剥落(scaling)和增厚(thickness)。然后计算每一部分皮肤所有四种严重程度参数的总和，乘以相应区域的面积分数，并乘以各部分的权重(头0.1、手臂0.2、身体0.3和大腿0.4)。实例：(I身体+E身体+S身体+T身体)×A身体×0.3＝总和身体。最后，总PASI计算为所有四个皮肤部分的PASI的总和。
还可以通过对患牛皮癣的个体照相，通过计算机计算被牛皮癣损伤所覆盖的躯体面积百分比，来评估严重程度。
因此，在本发明提供的治疗方法的具体实施方案中，牛皮癣是斑块状牛皮癣(寻常性牛皮癣)、屈侧牛皮癣(皮褶牛皮癣)、滴状牛皮癣、脓疱性牛皮癣、指(趾)甲牛皮癣、牛皮癣关节炎或红皮性牛皮癣。在本发明方法的具体实施方案中，治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基是足以改善牛皮癣的一种或多种症状的、推迟其发作，或减轻其进展的量，其中所述一种或多种症状是皮肤的鳞状剥落、皮肤发红、皮肤增厚、形成斑块、甲板下变色、指甲凹陷、跨越指甲的横线、指甲下方皮肤增厚、甲松离、出现脓包、关节和结缔组织炎症、皮肤炎症或皮肤剥落。在另一个实施方案中，治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞是足以使牛皮癣区域严重性指数降低5、10、15、20、25、30、35、40或更多的量。
在另一个实施方案中，治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，与第二疗法结合施用。所述第二疗法可以是局部的，例如乳膏或油膏，其包含类固醇(例如：去羟米松)、维生素D3类似物(例如：钙泊三醇)、地蒽酚、坚果油、维甲酸或煤焦油中的一种或多种。在另一个具体的实施方案中，所述第二疗法包括一次或多次曝光于紫外光下，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20分钟，例如波长在约280nm至约315nm之间的UVB，特别是约311nm至约312nm之间的UVB。在另一个具体的实施方案中，所述第二疗法包括局部施用补骨脂内酯结合曝露于UVA光下。在另一个具体的实施方案中，所述第二疗法包括一种或多种以下物质的一次或多次系统性给药，所述物质例如是氨甲蝶呤、环孢菌素、维甲酸、硫鸟嘌呤、羟基脲、柳氮磺胺吡啶、麦考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、口服他克莫司和/或延胡索酸酯。
5.6.13治疗红斑狼疮
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有红斑狼疮(LE)、或正在经历LE症状、或有风险出现LE的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞，或施用被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，其中治疗有效量是足以可检测地改善LE的一种或多种症状、足以可检测地降低LE的一种或多种症状发生、或足以减慢LE的进展的量。
LE有许多症状，并且在不同的个体中，疾病可以进展不同。所述症状可以包括皮肤病表现形式(例如：面颊疹(也称蝶形疹)，盘状狼疮(皮肤上的增厚、红色鳞状斑块)，脱发，口、鼻或阴道溃疡，和/或皮肤损害)；肌肉和骨骼的表现形式(例如：关节痛)；血液病的表现形式(例如：贫血和铁缺乏、低于正常血小板和白血细胞计数、抗磷脂抗体综合征(血栓性脉管炎，其中患者血清中存在针对磷脂的自身抗体)，和/或血液中出现抗心磷脂抗体)；心脏病的表现形式(例如：心包炎、心肌炎和/或心内膜炎)；肺病的表现形式(例如：肺和/或胸膜炎症、胸膜炎、胸膜渗漏、狼疮性肺炎、慢性弥漫性肺间质病、肺动脉高血压、肺栓子和/或肺出血)；肝病的表现形式(例如：自身免疫性肝炎；黄疸；在血流中存在抗核抗体(ANA)、平滑肌抗体(SMA)、肝/肾微粒体抗体(LKM-I)和/或抗线粒体抗体(AMA))；肾病的表现形式(例如：无痛性血尿或蛋白尿、狼疮性肾炎、肾衰竭，和/或出现具有“环状”异常的膜性肾小球肾炎)；神经病的表现形式(例如：癫痫、精神病、脑脊液异常)；T-细胞异常(例如：CD45磷酸酶缺陷和/或CD40配体表达增加)；和/或非特异性表现形式(例如：狼疮性胃肠炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳疾病、副交感神经障碍、视网膜脉管炎、系统性脉管炎、FcεRIγ表达增加、T细胞内钙水平升高并保持升高、血中三磷酸肌醇升高、蛋白激酶C磷酸化降低、Ras-MAP激酶信号的降低，和/或蛋白激酶AI活性的缺陷)。
因此，在具体的实施方案中，所述治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基是足以可检测地改善LE的一种或多种症状、足以可检测地降低LE的一种或多种症状发生、或足以减慢LE的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括一种或多种LE的皮肤、血液、肌肉和骨骼、神经、肾、肝或T细胞的表现形式。在另一个具体的实施方案中，所述治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基是足以可检测地改善LE的一种或多种症状、足以可检测地降低LE的一种或多种症状发生、或足以减缓LE的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括面颊疹、蝶形疹、盘状狼疮、脱发，口、鼻或阴道溃疡，皮肤损害、关节痛贫血和/或铁缺乏、低于正常血小板和白血细胞计数、抗磷脂抗体综合征、血液中出现抗心磷脂抗体、心包炎、心肌炎、心内膜炎、肺和/或胸膜炎症、胸膜炎、胸膜渗漏、狼疮性肺炎、慢性弥漫性肺间质病、肺动脉高血压、肺栓子、肺出血、自身免疫性肝炎；黄疸；在血流中存在抗核抗体(ANA)、平滑肌抗体(SMA)、肝/肾微粒体抗体(LKM-I)和/或抗线粒体抗体(AMA)，无痛性血尿或蛋白尿、狼疮性肾炎、肾衰竭，和/或出现具有“环状”异常的膜性肾小球肾炎；神经病变(例如：癫痫、精神病、脑脊液异常)；T-细胞异常(例如：CD45磷酸酶缺陷和/或CD40配体表达增加)；和/或非特异性病变(例如：狼疮性胃肠炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳疾病、副交感神经障碍、视网膜脉管炎、系统性脉管炎、FcεRIγ表达增加、T细胞内钙水平升高并保持、血中三磷酸肌醇升高、蛋白激酶C磷酸化降低、Ras-MAP激酶信号的降低，和/或蛋白激酶AI活性的缺陷)。
向患有红斑狼疮的个体施用的胎盘干细胞或脐带干细胞可以是药物组合物的形式，例如适合如静脉内、肌肉内或腹腔内注射的药物组合物。
5.6.14治疗蕈样真菌病
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有蕈样真菌病、正在经历蕈样真菌病症状、或有风险患蕈样真菌病的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞，或施用被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，其中所述治疗有效量是量足以可检测地改善蕈样真菌病的一种或多种症状、足以可检测地降低蕈样真菌病的一种或多种症状发生、或足以减缓蕈样真菌病的进展的量。
蕈样真菌病是最常见的皮肤T细胞淋巴瘤，一组生长在皮肤内的罕见癌症。在所有蕈样真菌病例中的约5％发生Sezary综合征，是T细胞影响外周血和皮肤的更罕见的形式。蕈样真菌病的发展阶段通常用皮肤症状限定：(1)斑块期(patch phase)，其中皮肤出现扁平红斑，或在深色皮肤的个体中出现非常浅或非常深色的斑块，很瘙痒，升高且坚硬(斑块)；(2)皮肤肿瘤期，出现红-紫色的、升高的肿块(结节)，其可以是半球形(类似蘑菇)或溃疡样的；(3)皮肤发红阶段(红皮病)，其中，个体的皮肤出现大面积红色区域，非常瘙痒且有鳞片状脱落，其中手掌和脚掌皮肤增厚并脱落；和(4)淋巴结阶段，其中蕈样真菌病通过淋巴结开始转移到身体的其它部分，使其开始发炎，并通常是癌性的，可以扩散到肝、肺或骨髓。
因此，在具体的实施方案中，所述治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基是足以可检测地改善蕈样真菌病的一种或多种症状、足以可检测地降低蕈样真菌病的一种或多种症状发生、或足以减慢蕈样真菌病的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括一种或多种蕈样真菌病的皮肤病、血液病、肌肉和骨骼、神经、肾、肝或T细胞的表现形式。在另一个具体的实施方案中，所述治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基是足以可检测地改善蕈样真菌病的一种或多种症状、足以可检测地降低蕈样真菌病的一种或多种症状发生、或足以减慢蕈样真菌病的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括皮肤上的瘙痒的浅色或深色斑、皮肤斑块、皮肤肿瘤、升高的肿块、发红、鳞状剥落和瘙痒、手掌和脚掌皮肤增厚、手掌和脚掌皮肤脱落；或淋巴结炎症。
在另一个具体的实施方案中，治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞或者被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基与第二疗法或第二治疗剂结合施用。在更具体的实施方案中，所述第二疗法或第二治疗剂是将所述个体的患病皮肤区域一次或多次暴露于阳光或紫外光、局部类固醇、局部表层放射治疗、全皮肤电子束照射、向患有红皮病的皮肤施用有机(Manuka)蜜，或生物学疗法。在更具体的实施方案中，所述生物学疗法包括向所述个体施用一种或多种干扰素、维甲酸、rexinoid、vorinostat(例如
Figure G200880011754XD00981
)。
5.6.15治疗糖尿病
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有糖尿病、正在经历糖尿病症状、或有风险患糖尿病的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或脐带干细胞、或被胎盘干细胞或脐带干细胞条件化的培养基，其中所述治疗有效量是足以可检测地改善糖尿病的一种或多种症状、足以可检测地降低糖尿病的一种或多种症状发生、或足以减缓糖尿病进展的量。在具体的实施方案中，糖尿病是糖尿病I型，也称为1型糖尿病、I型糖尿病、TID，或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。
在病程中，可以一次或多次施用胎盘干细胞。优选的，在首次诊断的1、2、3、4、5或6天内，或1周内施用干细胞。在一个实施方案中，所述治疗有效量的干细胞是足以逆转、降低1型糖尿病的严重程度，或者减轻其症状(包括异常的高血糖、经葡萄糖耐量试验确定的胰岛素耐受性缺少、疲劳或意识丧失)的量。
胎盘干细胞可以与第二疗法结合施用，例如：胰腺组织和/或胰岛细胞移植；自体或同种异体干细胞疗法等。
5.6.16第二治疗性组合物和第二疗法
在任意上述治疗方法中，本发明方法可以包括施用第二治疗性组合物或第二疗法。上文中，在治疗特定疾病的方法中引用的特定第二治疗性组合物或第二疗法并非意在排他。例如，可以使用本文描述的任意抗炎性化合物或免疫抑制性化合物来治疗本文中讨论的任意疾病、障碍或病状。在施用胎盘干细胞和第二治疗剂、或第二类型的干细胞的实施方案中，胎盘干细胞和第二治疗剂、和/或第二类型的干细胞可以同时或不同时施用，例如：胎盘干细胞以及第二治疗剂和/或第二类型的干细胞的施用可以相继发生在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50分钟内，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或22小时内，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天内。
在具体的实施方案中，对与不恰当、不利或有害的免疫反应相关，或由其导致的疾病、障碍或病状的治疗，包括施用第二类型的干细胞、或第二类型的干细胞的群体。在具体的实施方案中，所述第二类型的干细胞是间充质干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞。在其它实施方案中，所述第二类型的干细胞是多能干细胞、全能性干细胞、前体细胞、造血干细胞(例如CD34+造血干细胞)、成体干细胞、胚胎干细胞或胚胎生殖细胞。所述第二类型的干细胞，例如间充质干细胞，可以与胎盘干细胞或脐带干细胞以任意比例施用，例如，比例为约100∶1、75∶1、50∶1、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶50、1∶75或1∶100。间充质干细胞可以商业获得或自原始来源获得，例如获自骨髓、骨髓吸出物、脂肪组织等。
在另一个具体的实施方案中，所述第二疗法包括免疫调节性化合物，其中免疫调节性化合物是3-(4-氨基-1-酮-1，3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮；3-(4′-氨基异吲哚啉酮-1′-酮)-1-哌啶-2，6-二酮；4-(氨基)-2-(2，6-二氧(3-哌啶))-异吲哚啉酮-1，3-二酮；或α-(3-氨基苯二酰亚氨基)戊二酰亚胺。在更具体的实施方案中，所述免疫调节性化合物是具有以下结构的化合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体，或其立体异构体的混合物：
Figure G200880011754XD01001
其中，X和Y之一是C＝O，X和Y的另一个是C＝O或CH2，R2是氢或低级烷基。在另一个更具体的实施方案中，所述免疫调节性化合物是具有以下结构的化合物，或其药学上可接受的盐、水化物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体，或其立体异构体的混合物：
Figure G200880011754XD01002
其中，X和Y之一是C＝O，另一个是C＝O；
R1是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、苯基、芳香基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)异环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)异芳香基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3′、C(S)NR3R3′或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；
R2是H、F、苯甲基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；
R3和R3’分别是(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苯甲基、芳香基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)异环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)异芳香基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5或C(O)OR5；
R4是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苯甲基、芳香基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)异环烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)异芳香基；
R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苯甲基、芳香基或(C2-C5)异芳香基；
每个R6各自独立的是H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苯甲基、芳香基、(C2-C5)异芳香基，或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5，或R6基团可以连接形成异环烷基；
n是0或1；和
*代表手性碳中心。在另一个更具体的实施方案中，所述免疫调节性化合物是具有以下结构的化合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体，或其立体异构体的混合物：
Figure G200880011754XD01011
其中，X和Y之一是C＝O，另一个是CH2或C＝O；
R是H或CH2OCOR；
(i)R1、R2、R3或R4各自独立的是卤素、1-4碳原子的烷基、或1-4碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、R3或R4之一是氮或-NHR5，其余的R1、R2、R3或R4是氢；
R5是氢或1-8碳的烷基；
R6是氢、1-8碳原子的烷基、苯并、氯或氟；
R’是R7-CHR10-N(R8R9)；
R7是间亚苯基或对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n为0-4；R8和R9各自独立的是氢或1-8碳原子的烷基，或R8和R9一起形成环丁烷基、环戊烷、环己烷或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1是-O-、-S-或-NH-；
R10是氢、1-8碳原子的烷基或苯基；和
*代表手性碳中心。
可以施用适合治疗炎性肠病或炎性肠病症状的任意组合的上述治疗剂。此类治疗剂可以与胎盘干细胞或脐带干细胞以任意组合，同时施用或作为独立的治疗过程进行。
向患有IBD的个体(例如：克隆氏病)施用的胎盘干细胞或脐带干细胞可以是药物组合物的形式，例如适合如静脉内注射、肌肉内注射或腹腔内注射的药物组合物。胎盘干细胞可以以单次剂量或多次剂量施用。当以多次剂量施用胎盘干细胞时，所述剂量可以是为缓解IBD(例如：克隆氏病)的一种或多种急性症状设计的治疗方案的一部分，也可以是长期治疗方案的一部分，所述长期治疗方案被设计用于预防或减轻该疾病的慢性病程的严重程度。在施用胎盘干细胞和第二治疗剂或第二类型的干细胞的实施方案中，胎盘干细胞和第二治疗剂以及/或第二类型的干细胞可以同时或不同时施用，例如：可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50分钟内相继施用，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或22小时内相继施用，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天内相继施用。
6.实施例
6.1 实施例1：分离贴壁的胎盘干细胞
该实施例说明了对贴壁的胎盘干细胞的收集和分离。
材料和方法：从在私人脐带血库项目中登记的待产妇中征集胎盘供体，提供知会同意，同意在回收了脐带血后将排尽血的胎盘用于研究目的。这些个体同意使用从常规处理她们的冷冻脐带血样品中产生的盲数据。从而能够比较收集的脐带血组成以及利用下文描述的实验方法回收的流出灌流液。
在脐带和胎盘排尽血后，在室温下将胎盘置于无菌隔热容器中，并在分娩后4小时内送至实验室。如果经检查，胎盘有物理伤害的证据例如器官碎片化或脐血管撕裂，则抛弃胎盘。在室温(23±2℃)或冷藏(4℃)下维持胎盘，在无菌容器中放置2-20小时。在25±3℃的无菌生理盐水中周期性浸泡和洗涤胎盘，去除任何可见的表面血液或碎片。从插入胎盘处约5cm处横切脐带，用TEFLON或聚丙烯导管插入脐血管，所述导管与无菌的液体通路相连，允许对胎盘进行双向灌流并回收流出液。这里使用的系统使得条件化、灌流和流出液收集的所有方面都可以在受控的环境大气条件下进行，并且可以实时监控脉管内压和流速、核心和灌流液温度以及回收的流出液体积。在24小时的产后期中评估一系列条件化程序，并通过流式细胞仪、光学显微镜和克隆形成单位实验来分析流出液的细胞组成。
胎盘条件化：将胎盘维持在不同条件下，以试图刺激和维持增殖和收集胎盘干细胞的生理相容性环境。用含有2U/ml肝素(EJkins-Sinn，N.J.)的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)冲洗导管。以50mL/分的速度实施胎盘灌流，直到收集了约150mL灌流液。将该灌流液体积标记为“早期部分”。以相同流速灌流胎盘，再收集约150mL的第二部分，标记为“后期部分”。在处理过程中，轻柔地按摩胎盘，帮助灌流过程，辅助细胞材料的回收。同时通过重力排出和动脉导管抽吸，从灌流回路收集流出液体。
在获得父母的书面同意后，从递送室获得胎盘以及脐带血，在递送后12-24小时内在室温下处理。在处理前，去除膜，并洗净母体位置的残留血液。用20号Butterfly针头制成的导管对脐血管插管，用于血样收集。然后用肝素化(2U/mL)的Dulbecco修饰的Eagle培养基(HDMEM)灌流胎盘，以流速15mL/分钟灌流10分钟，从母体位置收集1小时内的灌流液，计数有核细胞。重复灌流和收集过程1或2次，直到回收的有核细胞数低于100/μL。倒出灌流液，轻离心去除血小板、残片和去核的细胞膜。然后，通过聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心分离有核细胞，洗涤后，重悬在HDMEM中。为了分离贴壁细胞，将等分的5-10×106细胞置于各个T-75瓶中，用自BioWhittaker商购的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)培养，置于组织培养孵育箱中，37℃，5％CO2。在10-15天后，用PBS洗涤去除未贴壁细胞，然后用MSCGM替换。每天检查培养瓶中存在的不同类型贴壁细胞，特别是鉴定和扩展成簇的成纤维细胞样细胞。
细胞回收和分离：在室温下，约200×g离心15分钟，从灌流液中回收细胞。该过程用于从被残片和血小板污染的样本中分离细胞。将细胞团块重悬在含有2U/ml肝素和2mM EDTA(GibcoBRL，NY)的IMDM-无血清培养基中。根据生产商的推荐方法，利用
Figure G200880011754XD01051
(Nycomed Pharma，Oslo，挪威)分离总单核细胞部分，并将单核细胞部分重悬。利用血球计数器计数细胞。通过台盼蓝排除实验评估活力。利用含0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶(Sigma)溶液，通过差别胰酶消化来分离间充质干细胞。由于胎盘干细胞一般在约5分钟内从塑料表面脱离，而其它贴壁的细胞群体一般要求孵育超过20-30分钟，因此差别胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，BioWhitaker)中和胰蛋白酶后，收获脱离的胎盘干细胞。用HDMEM洗涤细胞，并重悬于MSCGM中。基于骨髓来源MSC(间充质干细胞)的已知标志物，选择FITC和PE标记的单克隆抗体，利用Becton-Dickinson FACSCalibur仪器，进行细胞的流式细胞计数。抗体购自B.D.和Caltag实验室(South San Francisco，Calif.)，从AM.Cul.获得生成SH2、SH3和SH4抗体的杂交瘤，并通过FITC或PE标记的F(ab)’2羊抗小鼠抗体检测上述抗体在其培养上清液中的活性。利用可商购的诱导和维持培养基(BioWhittaker)进行种系分化，根据生产商的指导说明使用。
胎盘干细胞的分离：显微镜检查培养瓶中的贴壁细胞，揭示形态学不同的细胞类型，包括纺锤体形的细胞、具有大核和多个核周小囊泡的圆形细胞、以及具有数个突起物的星形细胞，细胞通过其中一个突起物附着在瓶上。对这些贴壁细胞的类型不作进一步鉴定，因为在骨髓、脐带血和外周血培养中可以观察到相似的非干细胞。但是，通过差别胰酶消化分离成纤维细胞样细胞，并在次级瓶中亚培养，所述细胞最后表现为成簇，且视觉观察与骨髓来源的间充质干细胞相似。细胞在胰酶消化后外观变圆，相差显微镜显示它们是高度颗粒化的，与实验室制备或购自BioWhittaker的骨髓来源的MSC相似。
亚培养时，这些贴壁胎盘细胞与其早期相反，在数小时内贴壁，表现出特征性的成纤维细胞样细胞外形，生长模式与对照的骨髓来源的MSC相似。此外，在亚培养和重新饲喂的过程中，洗去松散结合的单核细胞，保持培养物均质，避免任何视觉可见的非成纤维细胞样细胞的污染。
在下列实验中，表征了自不同灌流实验获得的这些贴壁细胞的细胞表面标志物表型，或在OCT-4的情况下，表征了基因的表达表型。下表3中显示了这些实验的结果：
Figure G200880011754XD01071
6.2实施例2：胎盘干细胞的培养
从产后的哺乳动物胎盘，通过灌流或物理破坏(例如酶消化)获得胎盘干细胞。细胞培养在含有以下成分的培养基中：60％DMEM-LG(Gibco)、40％MCDB-201(Sigma)；2％胎牛血清(Hyclone Labs.)；1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)；1×亚麻酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；10-9M地塞米松(Sigma)；10-4M抗坏血酸2-磷酸(Sigma)；上皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&DSystems)；血小板衍生生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems)，和100U青霉素/1000U链霉素。
如下准备培养细胞的培养瓶。向瓶内添加含有5ng/ml人纤粘连蛋白(FN)(Sigma F0895)的5mL PBS，用FN包被T75瓶。将含有FN溶液的培养瓶置于37℃下30分钟。然后，在细胞培养前去除FN溶液。在处理后不需要干燥培养瓶。可选的，将培养瓶在4℃下与FN溶液接触过夜或更久；在培养前，温暖培养瓶并去除FN溶液。
通过灌流分离胎盘干细胞
如下形成来自胎盘灌流液的胎盘干细胞培养物。来自聚蔗糖梯度的细胞被接种在如上制备的FN包被的T75瓶中，密度为15ml培养基中50-100×106个细胞/瓶。典型的，接种5至10瓶。在37℃孵育培养瓶12-18小时，使贴壁细胞附着。每个瓶添加10ml温暖的PBS，去除悬浮细胞，并轻柔混合。然后去除15ml培养基，并用15ml新鲜培养基换液。在开始培养后，3-4天更换所有的培养基。之后在培养基更换中，去除50％或7.5ml培养基。
从约第12天开始，在显微镜下检查培养物，检查贴壁细胞克隆的生长。当细胞培养物形成约80％汇合度时，一般在开始培养后第13至18天之间，通过胰酶消化收获贴壁细胞。从这些原代培养中收获的细胞命名为0代(零代)。
通过物理解离和酶消化分离的胎盘干细胞
如下从消化的胎盘组织建立胎盘干细胞培养。将灌流后的胎盘的母体面向上置于无菌纸片上。用刀片刮去胎盘母体侧约0.5cm的表层，并用刀片切除约1×2×1cm的胎盘组织块。然后将该胎盘组织切碎成约1mm3的小片。将这些小片收集在50ml的Falcon管中，并用胶原酶IA(2mg/ml，Sigma)消化30分钟，再用胰酶-EDTA(0.25％，GIBCO BRL)在37℃水浴中处理10分钟。获得的溶液在400g室温离心10分钟，去除消化溶液。将细胞沉淀重悬在约10倍体积的PBS中(例如，5ml的细胞沉淀用45ml PBS重悬)，上述管在400g室温离心10分钟。组织/细胞沉淀重悬在130mL培养基中，在每个纤粘连蛋白包被的T-75瓶中接种13ml细胞。细胞在37℃和5％CO2的湿润空气下孵育。任选的，在该阶段冷冻保存胎盘干细胞。
胎盘干细胞的亚培养和扩增
在37℃水浴中快速解冻冷冻保存的细胞。用10ml温暖的培养基迅速从冷冻管中移出胎盘干细胞，并转移至15ml无菌管中。细胞在400g室温离心10分钟。通过吹打将细胞轻柔地重悬在10ml温暖的培养基中，通过台盼蓝排除实验确定活细胞数。然后，以约6000-7000个细胞/cm2将细胞接种在如上准备的FN-包被瓶中(约5×105细胞/T-75瓶)。细胞在37℃、5％CO2和90％湿度下孵育5分钟。当细胞达到75-85％汇合度时，从瓶中无菌地去除并抛弃所有使用过的培养基。加入3ml的0.25％胰蛋白酶/EDTA(w/v)溶液覆盖细胞层，在37℃、5％CO2和90％湿度下孵育细胞5分钟。轻叩瓶一次或两次促进细胞脱离。一旦＞95％的细胞变圆并脱离，就向每个T-75瓶中加入7ml温暖的培养基，并通过移液吹打将溶液分散在整个细胞层表面若干次。
如上计数细胞并确定活力后，在室温下1000RPM离心细胞5分钟。用培养基轻柔地重悬一个T-75瓶中的细胞沉淀，并将细胞平均置于两个FN-包被的T-75瓶中，进行细胞传代。
利用上述方法，鉴别表达CD105、CD117、CD33、CD73、CD29、CD44、CD10、CD90和CD133标志物，并且不表达CD34和CD45标志物的贴壁胎盘干细胞群。这些胎盘干细胞的一部分而非全部培养物表达HLA-ABC和/或HLA-DR。
6.3实施例3：从胎盘结构中分离胎盘干细胞
6.3.1材料和方法
6.3.1.1感兴趣表型的分离
从正常足月妊娠胎盘中获得五个不同的胎盘细胞群。所有供者均提供了对其胎盘供研究目的使用的完整的书面同意。检查了五个胎盘细胞群，分别来自：(1)胎盘灌流液(来自胎盘脉管系统的灌流)、(2)羊膜的酶消化物、(3)绒毛膜的酶消化物、(4)羊膜-绒毛膜盘的酶消化物、以及(5)脐带的酶消化物。在无菌PBS(Gibco-Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中清洁不同的胎盘组织，并将其置于分别的无菌Petri皿中。用无菌外科手术刀切碎各组织，并置于50mL Falcon锥形管内。用1×胶原酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在37℃水浴中消化切碎的组织20分钟，离心，然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco-Invitrogen Corp)在37℃水浴中消化10分钟。消化后离心各组织，并用无菌PBS(Gibco-Invitrogen Corp)漂洗一次。然后过滤重新溶解的细胞两次，一次用100μm细胞过滤器，一次用30μm分离滤器，去除任何残留的胞外基质或细胞碎片。
6.3.1.2细胞活力评估和细胞计数
在消化后使用人工台盼蓝排除方法计算细胞数和评估细胞活力。细胞按1∶1的比例与台盼蓝染料(Sigma-Aldrich)混合，利用血球计数器确定细胞活力。
6.3.1.3细胞表面标志物表征
选择HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+的细胞用于表征。通过两台Becton-Dickinson流式细胞仪鉴别、定量和表征具有该表型的细胞，所述流式细胞仪是FACSCalibur和FACS Aria(Becton-Dickinson，San Jose，CA，USA)。以约10μL抗体/1百万个细胞的比例对不同的胎盘细胞染色，在室温下摇床上染色30分钟。使用下列抗人抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗HLA-G单克隆抗体(Serotec，Raleigh，NC)、抗CD10单克隆抗体(BDImmunocytometry Systems，San Jose，CA)、抗CD44单克隆抗体(BDBiosciences Pharmingen，San Jose，CA)和抗CD105单克隆抗体(R&DSystems Inc.，Minneapolis，MN)；藻红蛋白(PE)偶联的抗CD44、CD200、CD117和CD13单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；藻红蛋白-Cy5(PE Cy5)偶联的抗生物素蛋白链菌素和抗CD117单克隆抗体(BD Biosci-ences Pharmingen)；藻红蛋白-Cy7(PE Cy7)偶联的抗CD33和CD10单克隆抗体(BD Biosciences)；别藻蓝蛋白(APC)偶联抗生物素蛋白链菌素和抗CD38单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；和生物素化的CD90(BD Biosciences Pharmingen)。在孵育后，漂洗细胞一次，去除未结合的抗体，用4％多聚甲醛(USB，Cleveland，OH)在4℃固定过夜。第二天，漂洗细胞两次，通过30μm分离滤器过滤，在流式细胞仪上计数。
用抗小鼠IgG抗体(BD Biosciences Pharmingen)染色的样本作为阴性对照，调节光电倍增管(PMTs)。用抗人抗体单次染色的样本作为阳性对照，调节光谱重叠/补偿。
6.3.1.4细胞分选和培养
用7-氨基放线菌素D(7AAD；BD Biosciences Pharmingen)和特异性针对目标表型的单克隆抗体对一组胎盘细胞染色。以约10μL抗体/1百万个细胞的比例对不同的胎盘细胞染色，在室温下摇床上染色30分钟。然后，在BD FACS Aria上阳性分选这些细胞中表达目标表型的活细胞，并铺盘培养。将分选的(目标群体)和“所有”(未分选的)的胎盘细胞群铺盘，用于比较。以表4中列举的细胞密度(细胞/cm2)将细胞铺在纤粘连蛋白(Sigma-Aldrich)包被的96孔板上。根据表达目标表型的细胞数来确定和管理细胞密度，以及是以两次重复还是三次重复来将细胞类型铺盘。
表4：细胞种植密度
Figure G200880011754XD01121
向96孔板的每个孔加入完全培养基(60％DMEM-LG(Gibco)和40％MCDB-201(Sigma)；2％胎牛血清(Hyclone Labs.)；1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)；1×亚麻酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；10-9M地塞米松(Sigma)；10-4M抗坏血酸2-磷酸(Sigma)；上皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&DSystems)；和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems))，将平板置于5％CO2/37℃孵育箱中。在第7天，向每个孔中加入100μL完全培养基。监控96孔板约2周，在第12天完成培养物的最终评估。
6.3.1.5数据分析
利用标准的脉冲选通技术(gating technique)在FlowJo(Tree Star，Inc)中分析FACSCalibur数据。利用FACSDiva软件(Becton-Dickinson)分析BDFACS Aria数据。利用偶极甄别脉冲选通和标准脉冲选通技术分析FACS Aria数据，使偶极最小化。所有结果均汇编于Microsoft Excel中，所有数值在本文中均呈现为平均值±标准差(数字，均值的标准误)。
6.3.2结果
6.3.2.1细胞活力
利用人工台盼蓝排除方法评估消化后的活力(附图1)。获自大部分的消化组织(来自羊膜、绒毛膜或羊膜-绒毛膜盘)的细胞的平均活力约为70％。获自羊膜的细胞平均活力为74.35％±10.31％(n＝6，SEM＝4.21)，获自绒毛膜的细胞平均活力为78.18％±12.65％(n＝4，SEM＝6.32)，获自羊膜-绒毛膜盘的细胞平均活力为69.05％±10.80％(n＝4，SEM＝5.40)，获自脐带的细胞平均活力为63.30％±20.13％(n＝4，SEM＝10.06)。获自灌流，但未经过消化的细胞保留了最高的平均活力，为89.98％±6.39％(n＝5，SEM＝2.86)。
6.3.2.2细胞定量
分析了五个不同的来自胎盘的细胞群，来确定HLAABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞的数量。根据BD FACSCalibur数据的分析结果，观察到羊膜、灌流液和绒毛膜分别含有最大总数的这些细胞：30.72±21.80个细胞(n＝4，SEM＝10.90)，26.92±22.56个细胞(n＝3，SEM＝13.02)，和18.39±6.44个细胞(n＝2，SEM＝4.55)。羊膜-绒毛膜盘和脐带分别含有最少总数表达目标表型的细胞：4.72±4.16个细胞(n＝3，SEM＝2.40)和3.94±2.58个细胞(n＝3，SEM＝1.49)(数据未显示)。
相似的，当分析表达目标表型的总细胞百分比时，观察到羊膜和胎盘灌流液含有表达该表型的最高百分比，分别是0.0319％±0.0202％(n＝4，SEM＝0.0101)和0.0269％±0.0226％(n＝3，SEM＝0.0130)(附图2)。虽然脐带含有较少数量表达目标表型的细胞(附图2)，但是它含有第三高百分比表达目标表型的细胞：0.020％±0.0226％(n＝3，SEM＝0.0131)(附图2)。绒毛膜和羊膜-绒毛膜盘含有最低百分比表达目标表型的细胞：分别是0.0184％±0.0064％(n＝2，SEM＝0.0046)和0.0177％±0.0173％(n＝3，SEM＝0.010)(附图2)。
与BD FACSCalibur分析的结果一致，BD FACS Aria数据也显示羊膜、灌流液和绒毛膜比其它来源提供更高数量的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞。在羊膜、灌流液和绒毛膜中表达目标表型的细胞平均总数分别是：126.47±55.61个细胞(n＝15，SEM＝14.36)，81.65±34.64个细胞(n＝20，SEM＝7.75)和51.47±32.41个细胞(n＝15，SEM＝8.37)。羊膜-绒毛膜盘和脐带含有最小总数表达目标表型的细胞，分别是44.89±37.43个细胞(n＝9，SEM＝12.48)和11.00±4.03个细胞(n＝9，SEM＝1.34)(数据未显示)。
BD FACS Aria数据揭示了B和A细胞来源含有最高百分比的HLAABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞，分别是0.1523±0.0227％(n＝15，SEM＝0.0059)和0.0929±0.0419％(n＝20，SEM＝0.0094)(附图3)。D细胞来源含有第三高百分比表达目标表型的细胞，为0.0632±0.0333％(n＝9，SEM＝0.0111)(附图3)。C和E细胞来源含有最低百分比表达目标表型的细胞，分别是0.0632±0.0249％(n＝15，SEM＝0.0064)和0.0457±0.0055％(n＝9，SEM＝0.0018)(附图3)。
在对每种细胞来源的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞鉴别和定量后，还进一步分析和表征了它们的细胞表面标志物HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200和CD105的表达。
6.3.2.3胎盘灌流液来源的细胞
胎盘灌流液来源的细胞是HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的(附图4)。对于灌流液来源的细胞，每种标志物的平均表达如下：37.15％±38.55％(n＝4，SEM＝19.28)的细胞表达HLA-G；36.37％±21.98％(n＝7，SEM＝8.31)的细胞表达CD33；39.39％±39.91％(n＝4，SEM＝19.96)的细胞表达CD117；37.15％±38.55％(n＝4，SEM＝19.28)的细胞表达HLA-G；54.97％±33.08％(n＝4，SEM＝16.54)的细胞表达CD10；36.79％±11.42％(n＝4，SEM＝5.71)的细胞表达CD44；41.83％±19.42％(n＝3，SEM＝I 1.21)的细胞表达CD200；74.25％±26.74％(n＝3，SEM＝15.44)的细胞表达CD90；35.10％±23.10％(n＝3，SEM＝I 3.34)的细胞表达CD38；22.87％±6.87％(n＝3，SEM＝3.97)的细胞表达CD105；和25.49％±9.84％(n＝3，SEM＝5.68)的细胞表达CD13。
6.3.2.4羊膜来源的细胞
羊膜来源的细胞是HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的(附图5)。对于羊膜来源的细胞，每种标志物的平均表达如下：57.27％±41.11％(n＝3，SEM＝23.73)的细胞表达HLA-G；16.23％±15.81％(n＝6，SEM＝6.46)的细胞表达CD33；62.32％±37.89％(n＝3，SEM＝21.87)的细胞表达CD117；9.71％±13.73％(n＝3，SEM＝7.92)的细胞表达CD10；27.03％±22.65％(n＝3，SEM＝13.08)的细胞表达CD44；6.42％±0.88％(n＝2，SEM＝0.62)的细胞表达CD200；57.61％±22.10％(n＝2，SEM＝15.63)的细胞表达CD90；63.76％±4.40％(n＝2，SEM＝3.11)的细胞表达CD38；20.27％±5.88％(n＝2，SEM＝4.16)的细胞表达CD105；和54.37％±13.29％(n＝2，SEM＝9.40)的细胞表达CD13。
6.3.2.5绒毛膜来源的细胞
绒毛膜来源的细胞是HLA-G、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38和CD13一致阳性的，而CD33和CD105的表达不同(附图6)。对于绒毛膜来源的细胞，每种标志物的平均表达如下：53.25％±32.87％(n＝3，SEM＝18.98)的细胞表达HLA-G；15.44％±11.17％(n＝6，SEM＝4.56)的细胞表达CD33；70.76％±11.87％(n＝3，SEM＝6.86)的细胞表达CD117；35.84％±25.96％(n＝3，SEM＝14.99)的细胞表达CD10；28.76％±6.09％(n＝3，SEM＝3.52)的细胞表达CD44；29.20％±9.47％(n＝2，SEM＝6.70)的细胞表达CD200；54.88％±0.17％(n＝2，SEM＝0.12)的细胞表达CD90；68.63％±44.37％(n＝2，SEM＝31.37)的细胞表达CD38；23.81％±33.67％(n＝2，SEM＝23.81)的细胞表达CD105；和53.16％±62.70％(n＝2，SEM＝44.34)的细胞表达CD13。
6.3.2.6羊膜-绒毛膜盘来源的细胞
羊膜-绒毛膜盘来源的细胞是HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的(附图7)。对于羊膜-绒毛膜盘来源的细胞，每种标志物的平均表达如下：78.52％±13.13％(n＝2，SEM＝9.29)的细胞表达HLA-G；38.33％±15.74％(n＝5，SEM＝7.04)的细胞表达CD33；69.56％±26.41％(n＝2，SEM＝18.67)的细胞表达CD117；42.44％±53.12％(n＝2，SEM＝37.56)的细胞表达CD10；32.47％±31.78％(n＝2，SEM＝22.47)的细胞表达CD44；5.56％(n＝1)的细胞表达CD200；83.33％(n＝1)的细胞表达CD90；83.52％(n＝1)的细胞表达CD38；7.25％(n＝1)的细胞表达CD105；和81.16％(n＝1)的细胞表达CD13。
6.3.2.7脐带来源的细胞
脐带来源的细胞是HLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的，而CD117、CD10、CD44和CD200的表达不同(附图8)。对于脐带来源的细胞，每种标志物的平均表达如下：62.50％±53.03％(n＝2，SEM＝37.50)的细胞表达HLA-G；25.67％±11.28％(n＝5，SEM＝5.04)的细胞表达CD33；44.45％±62.85％(n＝2，SEM＝44.45)的细胞表达CD117；8.33％±11.79％(n＝2，SEM＝8.33)的细胞表达CD10；21.43％±30.30％(n＝2，SEM＝21.43)的细胞表达CD44；0.0％(n＝1)的细胞表达CD200；81.25％(n＝1)的细胞表达CD90；64.29％(n＝1)的细胞表达CD38；6.25％(n＝1)的细胞表达CD105；和50.0％(n＝1)的细胞表达CD13。
附图9中显示了对所有标志物平均表达的总结。
6.3.2.8BD FACS Aria分选报告
用7AAD和抗HLA ABC、CD45、CD34和CD133的抗体对表达最大百分比HLA ABC、CD45、CD34和CD133的三种不同胎盘细胞群(来自灌流液、羊膜和绒毛膜的细胞)进行染色。阳性选择这三个群体中表达目标表型的活细胞。BD FACS Aria分选的结果如表5所示。
表5：
Figure G200880011754XD01181
将三种不同的阳性选择的细胞群(分选的)及其相应的未分选的细胞铺盘，并于第12天评估培养的结果(表3)。分选的灌流液来源的细胞，以40,600/cm2的密度铺盘，获得小、圆、未贴壁的细胞。三组未分选的灌流液来源的细胞中的两组，均以40,600/cm2的密度铺盘，获得大部分小、圆、未贴壁的细胞，以及围绕孔边缘分布的若干贴壁细胞。未分选的灌流液来源的细胞，以93,800/cm2的密度铺盘，获得大部分小、圆、未贴壁的细胞，以及围绕孔边缘分布的若干贴壁细胞。
分选的羊膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺盘，获得小、圆、未贴壁的细胞。未分选的羊膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺盘，获得小、圆、未贴壁的细胞。未分选的羊膜-来源的细胞，以62,500/cm2的密度铺盘，获得小、圆、未贴壁的细胞。
分选的绒毛膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺盘，获得小、圆、未贴壁的细胞。未分选的绒毛膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺盘，获得小、圆、未贴壁的细胞。未分选的绒毛膜-来源的细胞，以62,500/cm2的密度铺盘，获得小、圆、未贴壁的细胞。
在实施上述相关实验和进一步培养胎盘干细胞之后，确定抗CD117和CD133抗体的标记产生了足以产生阳性读数的显著背景，在所述标记中，抗生物素蛋白链菌素偶连的抗体标记了生物素偶连的藻红蛋白(PE)。起初，该背景导致胎盘干细胞被视为对两种标志物是阳性的。当使用不同标记物APC或PerCP时，降低了背景，从而正确地确定胎盘干细胞对CD117和CD133都是阴性的。
6.4实施例4：胎盘干细胞的分化
贴壁的胎盘干细胞分化为若干不同的细胞系。通过物理解离来自胎盘内的解剖学位点的组织，包括羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶或其任意组合，从胎盘分离出贴壁的胎盘干细胞，并通过物理解离脐带组织获得脐带干细胞。
在含有低浓度的胎牛血清和有限的生长因子的培养基中培养胎盘干细胞和脐带干细胞。流式细胞仪分析显示，胎盘干细胞典型地以≥70％的百分比呈现出CD200+CD105+CD73+CD34-CD45-表型。发现胎盘干细胞分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞系。
在含有IBMX、胰岛素、地塞米松和消炎痛的诱导培养基中，胎盘干细胞在3-5周内转变成脂肪超负载的脂肪细胞。在成骨诱导培养条件下，发现胎盘干细胞形成骨小结，并在其胞外基质中有钙沉积。胎盘干细胞的软骨分化在微丸(micropellet)状态下进行，并通过组织积聚中有糖胺聚糖形成加以了验证。
6.5实施例5：利用胎盘干细胞进行免疫调节
胎盘干细胞具有免疫调节效应，包括抑制T细胞和天然杀伤细胞的增殖。下列实验证实胎盘干细胞具有在混合淋巴细胞反应测定和回归测定这两种测定中调节T细胞应答刺激的能力。
6.5.1混合淋巴细胞反应测定
MLR测量效应子群体对靶群体的反应。所述效应子可以是淋巴细胞或纯化的亚群，例如CD8+T细胞或NK细胞。靶群体是经辐射的同种异体PBMS，或如在本研究中，是成熟的DC。所述应答子群体由异体特异性细胞组成，估计占总T细胞的20％。经改动的胎盘干细胞MLR在反应中使用胎盘干细胞。
胎盘干细胞被铺在96孔板的孔中，并加入了效应子群体。在添加靶群体(成熟的DC)前，胎盘干细胞和5(6)-羧基荧光素二醋酸N-琥珀酰酯(CFSE)染色的效应子被预孵育24小时。6天后，收获上清液和未贴壁的细胞。通过Luminex微珠实验分析上清液，并通过流式细胞仪分析细胞。
通常，CD4+和CD8+T细胞部分在MLR中都产生增殖性应答。当两个同种异体供体从未相互遭遇之前，该应答是天然的T细胞应答。在标准的MLR中，CD4+和CD8+T细胞都增殖活跃。当在MLR中添加了胎盘干细胞时，测量CFSELow应答子细胞的百分比，证实CD4+和CD8+T细胞的增殖都被抑制了。
在图10A和10B(PMLR道)和图11中可见向MLR(PMLR)中添加的胎盘干细胞的效应。不论只分别使用CD4+或CD8+T细胞，还是同时使用等量的CD4+T细胞和CD8+T细胞，结果都是相似的。获自羊膜-绒毛膜或脐带基质的胎盘干细胞抑制MLR的程度相似，并且没有观察到对CD4+T细胞和CD8+T细胞在抑制上的差异。大量T细胞(bulk T cell)反应的结果也是如此。
利用CD4+T细胞、CD8+T细胞，或CD4+T细胞和CD8+T细胞，以及同种异体的树突状细胞(DC)实施另外的MLR。将胎盘干细胞添加到该MLR中，评估T细胞增殖的程度，利用不添加胎盘干细胞的MLR作为对照。
根据生产商的说明，使用Miltenyi MACS柱和珠从血沉棕黄层中分离CD4+T细胞、CD8+T细胞、以及CD14+单核细胞。从以下培养物中获得树突细胞，所述培养物是单核细胞在添加了1％供体血浆、IL-4和GM-CSF的RPMI 1640中的6天培养物，以及在添加了IL-1β、TNF-α和IL-6的RPMI1640中的2天培养物。同种异体T细胞和DC以T∶DC＝10∶1的比例孵育，进行经典的6天MLR。在加入MLR检测前，用CFSE(羧基荧光素二醋酸琥珀酰酯)对T细胞染色来评估T细胞增殖。通过测量子代细胞群中染料的稀释，利用CFSE评估增殖的程度。
对于该测定，胎盘干细胞的添加比例是T∶DC∶PSC＝10∶1∶2。反应在96孔板中进行，终体积为添加了5％混合人血清(R5)的200μl RPMI 1640。6天后，将未贴壁细胞简单重悬，转移到5mL管中，用RPMI洗涤，并用CD4和CD8抗体染色。在BD FACSCalibur对CD4和CD8组分的增殖进行了评估。
胎盘干细胞：如上文实施例1和2所述获得胎盘干细胞。胎盘干细胞获自以下胎盘组织：羊膜(AM)或羊膜/绒毛膜(AC)。脐带干细胞获得自脐带(UC)。加入成纤维细胞(FB)和骨髓来源的间充质干细胞(BM)作为对照。
结果：当在MLR中添加胎盘干细胞时，抑制了T细胞增殖(图12)。图10反映的实验中使用的胎盘干细胞源自同一个胎盘，命名为61665。对于所有测试的胎盘干细胞，当使用CD4+T细胞和CD8+T细胞中的一种，但不同时使用CD4+T细胞和CD8+T细胞时，对CD4+T细胞的抑制程度大于对CD8+T细胞的抑制(图12A)。AM胎盘干细胞和UC胎盘干细胞对CD4+T细胞活化的抑制大致与MSC介导的抑制作用相等，约60％-75％的抑制。当同时利用CD4+T细胞和CD8+T细胞进行MLR时，胎盘干细胞对CD4+T细胞的抑制程度远大于对CD8+T细胞的抑制(图12B)。特别地，AM胎盘干细胞对CD4+T细胞增殖的抑制接近90％，超过了MSC显示的抑制作用。两种组分之间抑制作用的差异对AM胎盘干细胞和AC胎盘干细胞是最显著的。
在MLR中，来自不同供体的胎盘干细胞不同程度地抑制T细胞增殖(图13)。在MLR中，来自编号为65450的另一个胎盘的胎盘干细胞对CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的抑制不同于来自胎盘61665的胎盘干细胞。令人惊讶的是，来自胎盘65450的AC PSC和UC PSC抑制T细胞增殖80％-95％，超过该测定中MSC的抑制作用。然而，来自胎盘65450的AC胎盘干细胞对T细胞增殖的抑制没有达到理想的程度(比较图10A中AM胎盘干细胞的抑制)。
胎盘干细胞也抑制天然杀伤(NK)细胞在MLR中的活性。
6.5.2回归测定
在回归测定中，胎盘干细胞显示抑制了T细胞对表达埃-巴二氏病毒(EB病毒)抗原的B细胞系的应答。回归测定是对效应子T细胞机制的唤起测定，其中所述效应子T细胞机制是由在EBV-转化的B细胞的I类和II类MHC上呈递EBV抗原肽所引起的。该测定通过将T细胞与人为创造的转化B细胞系，来自相同供体的类淋巴母细胞系(LCL)混合来实施。LCL表达九种埃-巴二氏病毒抗原，可以在它们之间引发一系列适应性T和B细胞反应，但在经典的回归测定中，只测量T细胞效应子机制。考虑到LCL表达活化的B细胞标志物CD23，回归测定提供了方便的方法，测量针对天然存在病原体感染的靶标的细胞毒性。因此，在该测定中，通过计数CD23表达细胞来测量存活的LCL数目。
经典的17天回归测定所得结果与图14中第一簇条带中所观察的相似。未检测到CD23+细胞，因为它们都已被CD4+和CD8+T细胞杀死。如其后两簇条带所示，添加胎盘干细胞后，CD23+细胞的存活增加了。不希望受理论约束，可以对所观察到的结果给出两种解释。或者T细胞已经死亡，留下LCL任意扩增，或者主要是因为胎盘干细胞增加了LCL的寿命，而对T细胞影响较少。
在独立的回归测定中，自实验供体获得了T细胞和树突细胞。通过将外周血单核细胞(PBMC)与细胞溶解性EBV系B95.8上清液和环孢菌素A孵育2周，获得埃-巴二氏病毒转化的B细胞系，LCL。LCL表达9种EBV抗原。将过度生长的LCL系维持在添加了10％胎牛血清的RPMI 1640中。通过将CD4+T细胞和CD8+T细胞与自体LCL以T∶LCL＝10∶1比例混合，进行回归测定。在96孔板中，在添加了5％混合人血清(R5)的200μl RPMI 1640中进行测定。对于该测定，胎盘干细胞的添加比例是T∶LCL∶PSC＝10∶1∶2。测定进行6、10或17天。
利用CFSE标记的T细胞实施6天回归测定。来自胎盘65450的胎盘干细胞在回归测定中抑制T细胞增殖约65％至约97％，与PSC在MLR中的结果相对应(图15)。再一次证实，来自胎盘65450的UC和AC细胞系显著抑制T细胞增殖，同时65450AM PSC不抑制增殖。
在另一个试验中，证实在MLR和回归测定中天然杀伤细胞被抑制。当MLR或回归测定中包含50U/mlIL-2时，NK细胞的抑制效应约为45％(范围在约40％至约65％，SEM 5％)。
胎盘干细胞不是免疫原性的：在任何情况下，针对来自任何个体或任何胎盘解剖学部分的胎盘干细胞，观察到的背景T细胞增殖都不超过5％。
需要细胞-细胞接触：回归测定中的细胞毒性效应，和MLR中的异体识别，都依赖于靶标和效应细胞之间TCR(T细胞受体)：MHC的相互作用。利用跨膜(transwell)测定评估了胎盘干细胞介导的抑制对细胞-细胞接触的需要。在该测定中，用膜分隔T细胞和胎盘干细胞来实施MLR。如图16所示，MLR中使用的胎盘干细胞数量越高，抑制降低越多，暗示特别是在较高密度下，胎盘干细胞(UC)需要与T细胞显著接触来抑制T细胞增殖。
一个单独的测定验证胎盘干细胞对T细胞的免疫抑制至少部分涉及可溶因子。为了确定胎盘干细胞介导的免疫抑制是否依赖于细胞-细胞接触，进行了跨膜测定，其中，胎盘干细胞被置于插入物中，在该插入物的底部的膜仅允许可溶性因子通过。在孔的底部是MLR或T细胞，与胎盘干细胞分隔。为了确定观察到的效应是否依赖于胎盘干细胞的相对剂量，以对于T细胞和DC不同的相对密度添加干细胞。当脐带胎盘干细胞与MLR分隔时，抑制效应被部分消除。当胎盘干细胞的密度与与图11中所用密度相似时，对CD4+T细胞的MLR抑制消除为75％，对CD8+T细胞消除为85％(图17、图18)。当只使用四分之一剂量的胎盘干细胞时(UC OP25)，抑制效应仍然是66％，当添加12,500UC胎盘干细胞时抑制效应跌至背景水平。利用插入物分离时未观察到抑制的任何改变(图17)。在25,000胎盘干细胞时，除了抑制效应仍然显著，还观察到对引入的插入物的抑制作用相对下降最小(图18)。
6.6实施例6：胎盘干细胞免疫抑制的接触依赖不同于骨髓来源的间充质干细胞
确定免疫调节的接触依赖程度的实验显示，脐带干细胞的免疫调节对细胞-细胞接触的需要与骨髓来源的干细胞明显不同。特别地，胎盘干细胞更依赖细胞-细胞接触来产生免疫调节，尤其是较高数量的胎盘或间充质干细胞。
根据混合淋巴细胞反应测定(MLR)中贴壁细胞与T细胞的比例，骨髓来源的干细胞(BMSC)和脐带干细胞(UC)对细胞-细胞接触的需要不同。在跨膜实验中，MLR中的胎盘干细胞与T细胞和树突细胞(DC)是分隔的，两种类型的贴壁细胞之间抑制作用不同。图19相邻地显示了开放孔和跨膜的结果。当开放孔模式中，当使用约100,000或75,000UC或BMSC时，观察到了相似的抑制。然而，在跨膜模式中，与BMSC相比，UC抑制MLR的程度较低，表明在较高胎盘干细胞/T细胞比例下，接触依赖性更高。当胎盘干细胞/T细胞比例较低时，胎盘干细胞抑制性更强。
根据抑制数据，计算接触依赖性程度。图20显示UC和BMSC MLR的依赖性。在BM/T细胞比例较高时，骨髓来源的细胞对接触的依赖比UC低。换言之，对于重要的机制参数，对细胞-细胞接触的需要，UC胎盘干细胞和BMSC的行为不同。
调节性T细胞(Treg)是BMSC介导的T细胞抑制必需的。参见Aggarwal& Pittenger，″Human Mesenchymal Stem Cells Modulate Allogeneic Immune CellResponses，″Blood 105(4)：1815-1822(2004)。去除来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)的CD4+CD25+Treg，利用自体的EBV(埃-巴二氏病毒)转化的细胞实施回归测定。在一些条件下添加UC。如图21可见，不论是否存在Treg，在回归测定中，胎盘干细胞介导的T细胞应答抑制都没有差别。因此，虽然据报道T调节性T细胞是BMSC介导的T细胞抑制所必需的，但T调节性细胞在胎盘干细胞介导免疫抑制中似乎没有发挥作用。
实施了下述MLR，其中T细胞获自被胎盘干细胞抑制的MLR，加入新鲜的树突细胞。用CFSE染色T细胞，CFSE将在增殖过程中均等地分入子细胞中。CFSEHigh细胞是未增殖的T细胞(例如：图21图表中最左侧的峰)。通过在FACS Aria上分选染色的T细胞获得该群体。将这些细胞用于第二次MLR，使用新鲜的树突细胞。如图22中可见，未观察到持续抑制，因为原来被抑制的细胞对于DC增殖良好。CFSELow细胞(即，子细胞)似乎不是抑制的原因，因为这类细胞自身也随之增殖。CFSEHigh群体由对该DC供体不增殖的非异种特异性细胞以及被胎盘干细胞抑制的T细胞组成。一旦去除胎盘干细胞，被抑制的细胞即增殖。
当用BMSC MLR的上清液替换约10％的上清液时，BMSC抑制MLR。明显相反的，当用包含胎盘干细胞的MLR上清液替换上清液时，即使替换了75％的培养基时，也没有观察到T细胞增殖的改变(图23)。
在开始MLR前，DC或剩余的T细胞有可能受到与胎盘干细胞孵育时间不同的影响。因此，在开始测定前，通过将胎盘干细胞或BMSC与T细胞(图24A)或DC(图24B)孵育不同长度的时间，进行测试。预孵育T细胞和胎盘干细胞不明显改变抑制性表型(图20A)。然而，BMSC T细胞抑制依赖于DC/胎盘干细胞预孵育的长度而改变。如图20B中所示，当在T细胞1天后添加DC，BMSC的抑制是最强的。然而，当DC与T细胞同时添加时，表现出明显较弱的抑制。将DC与BMSC孵育更久可以逆转该抑制缺失。在预孵育第2天，抑制作用接近在T细胞后1天添加DC的方案(+1天)。胎盘干细胞介导的抑制没有观察到类似的趋势。
6.7实施例7：在MLR和回归测定中胎盘干细胞和脐带干细胞的细胞因子谱
确定了脐带干细胞(UC)和来自羊膜绒毛膜盘的胎盘干细胞(AC)向MLR培养基中分泌一些细胞因子。
在一些测定中，利用细胞因子阵列测量上清液中细胞因子和趋化因子的水平。发现一些因子被分泌到上清液中，与MLR和回归测定最相关的是巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α和MIP-1β。两种趋化因子都吸引T细胞，是CD8+T细胞在应答人免疫缺陷病毒(HIV)感染时分泌的。在MLR中进行测定时，这些趋化因子的分泌与胎盘干细胞和MSC对MLR的抑制反向相关(图25)。胎盘干细胞和MSC都不分泌MIP-1α和MIP-1β。
在另一项研究中，发现了MCP-1和IL-6分泌的相关性，两者都是重要的免疫调节因子(图26和图27；与图11相比)。胎盘干细胞本身不分泌IL-6和MCP-1，而抑制MLR和在回归测定中抑制T细胞增殖的UC和AC系，都分泌MCP-1和IL-6(图26和图27)。虽然，IL-6与促炎性作用最相关(参见例如：Kishimoto等人，Annu.Rev.Immunol.23：1-21(2005))，但它还具有其它功能，例如在小鼠的肝损伤过程中的保护作用(参见例如：Klein等人，J.Clin.Invest 115：860-869(2005))。
在独立的研究中，分析了在MLR或回归测定中使用的AC的细胞因子分泌。在Luminex系统中测量了来自6天干细胞培养物、干细胞MLR或干细胞回归测定中的细胞因子。MLR包括干细胞、树突细胞(DC)和T细胞，比例是2/1/10。埃-巴二氏病毒(EBV)回归测定包括干细胞、EBV肿瘤细胞(Ts)和T细胞，TS∶干细胞∶T的比例是2∶1∶10。
发现在干细胞单培养物、MLR和回归测定中，IL-6(11ng/ml)和IL-8(16ng/ml)的水平保持恒定。确定在干细胞单培养物和非抑制性对照的贴壁细胞MLR和回归测定中，MCP-1的浓度是约2ng/ml，但是在抑制的干细胞MLR和干细胞回归测定中增加到约10ng/ml。上述值落入报道的MCP-1血清水平内。
白介素-2(IL-2)是T细胞存活因子，也是CD4+CD25+T调节细胞的专性因子。该T细胞子集不是AC干细胞对T细胞抑制所必需的，但是在AC干细胞对MLR抑制的过程中IL-2水平持续下降。在缺少AC干细胞时，MLR上清液含有约35pg/ml IL-2，而含有AC干细胞的MLR则包含高达440pg/mlIL-2。
IL-2的浓度与抑制相关。例如，表现出85％抑制的CD4+T细胞MLR含有330pg/ml IL-2，而使用AC干细胞，表现出85％抑制的CD8+T细胞MLR含有66pg/ml IL-2。这些结果表示，传统上是免疫应答刺激因子的IL-2和MCP-1，在免疫抑制中也可以发挥作用。
6.8实施例8：生产冷冻保藏的干细胞产物和干细胞库
该实例展示了胎盘干细胞的分离，和制备冷冻的干细胞产品。
概述：将胎盘组织切成小块并消化，在原代培养和扩增培养后，获得了扩增的细胞制品，可以制备许多剂细胞。细胞被储存在两层的细胞库中，并被分装成冷冻的细胞产品。将源自单个供体胎盘的所有细胞制剂定义为一个批次，利用无菌技术在指定房间和Class 100层流室中，同时处理一个胎盘批次。将细胞产品限定为CD105+、CD200+、CD10+和CD34-，具有正常的核型，没有或基本没有母体细胞内容物。
6.8.1获得干细胞
组织解离和消化：在排出后24小时内获得胎盘。从羊膜、羊膜和绒毛膜的组合，或绒毛膜获得胎盘组织。将组织绞碎成小块，大小约1mm。在1mg/ml胶原酶1A中，在37℃下将绞碎的组织消化1小时，然后用胰蛋白酶-EDTA在37℃处理30分钟。在含5％FBS的PBS中洗涤三次，将组织重悬在培养基中。
在另一个实施方案中，在排出后24小时内获得胎盘。在洗净胎盘后，用止血钳夹在脐带远端。在与胎盘连接的地方切断脐带，并移至无菌皿中。在止血钳之下切断脐带后，按摩胎盘去除血凝块，并转移至含有庆大霉素和两性霉素B的500ml PBS中。使用5g该脐带。使用手术刀修剪剩余的胎盘材料，从脐带附着点切割约3英寸的半径，从剩余材料中排出血凝块，将以脐带根部为中心的5g的羊膜-绒毛膜转移至放置脐带的同一容器中。将脐带和羊膜-绒毛膜组织切片，然后绞碎成大小约1mm3的小片。然后用1mg/ml胶原酶IA(20ml/g组织)中，在37℃下消化组织1小时，然后再用胰蛋白酶-EDTA(20ml/g组织)在37℃处理30分钟。在含5％FBS的PBS中洗涤三次后，将组织重悬在培养基(20ml/g组织)中，并以约0.22ml/cm2转移至T瓶中。
原代培养：原代培养的目的是从消化的胎盘组织中建立细胞。将消化的组织悬浮在培养基中，置于Corning T瓶中，在湿润的腔室内在37℃5％CO2下孵育。在培养5天后补充一般的培养基。培养2周形成了高密度细胞克隆。用胰蛋白酶-EDTA收获克隆，然后用含2％FBS的PBS终止。离心细胞，重悬在培养基中用于接种扩增培养物。这些细胞定义为第0代，已倍增过0次。
扩增培养：从原代培养物中，或从扩增培养物中收获细胞，或从细胞库中解冻细胞，用于接种扩增培养。用含5％CO2的空气，以50ml/分/托盘的速度通过无菌滤器来处理Cell Factories(NUNCTM)10分钟，并在维持在37℃、5％CO2的湿润孵育箱中加温。用台盼蓝在血球计数器上计数种子细胞，记录细胞数、活力、传代数和累计倍增数。细胞以约2.3×104细胞/ml悬浮在培养基中，和110ml/托盘接种在Cell Factories中。在3-4天后以及培养的5-6天，去除培养基，并用新鲜培养基换液，再用含5％CO2的空气处理一次。当细胞达到约105细胞/cm2时，用胰蛋白酶-EDTA收获克隆，然后用含2％FBS的PBS终止。然后，离心细胞并重悬在培养基中。
冷冻保存：用于冷冻的细胞是用胰蛋白酶-EDTA从培养物中收获的(例如：0.44ml/cm2、5分钟)，用含2％FBS的PBS终止并在血球计数器上计数。离心后(例如300×g)，用含10％DMSO的FBS重悬细胞至浓度为约1百万细胞/ml，用于构建细胞库，和重悬细胞至浓度为1千万细胞/ml，用于单个的冷冻细胞制剂。在另一个实施方案中，细胞在10％HAS、10％DMSO的Plasmalyte中稀释至约2百万细胞/ml。将细胞溶液转移至冷冻容器中，置于-80℃冰箱的异丙醇浴中。第二天，细胞转移至液氮中。
6.8.2设计干细胞库
“批次”定义为源自单个供体胎盘的所有细胞制剂。在扩增培养过程中，细胞在超过8次传代和30次倍增的情况下，维持正常的生长、核型和细胞表面标志物表型。考虑到该限制，制剂包含来自5代和约20次倍增的细胞。为了供应等价细胞，在培养中扩增一个批次，并以冷冻制剂储存在两层的细胞库中。特别地，从原代培养收获的细胞定义为第0代细胞，经过0次倍增，用于起始扩增培养。在第一次传代后，发生了约4次倍增，而细胞冷冻在主细胞库(MCB)中。使用来自MCB的小瓶接种其它扩增培养。将解冻自MCB的细胞再传代2代后，将细胞冷冻至工作细胞库(WCB)中，约12次累计倍增。使用来自WCB的小瓶接种扩增培养，再传代2次，获得第5代细胞，约20次倍增，冷冻成单个制剂。
6.8.3解冻细胞用于培养
将细胞的冷冻容器置于密封的塑料袋中，浸泡在37℃水浴中。轻柔的转动容器，直到内容物融化至只有小块冰时。从密封塑料袋中取出容器，将10×体积的培养基缓慢加入到细胞中，轻柔混合。在血球计数器上计数样品，接种至扩增培养中。
6.8.4解冻细胞用于注射
将细胞的冷冻容器转移至液氮托中的施用位点，将容器置于密封的塑料袋中，浸泡在37℃水浴中。轻柔转动容器，直到内容物融化至只有小块冰时。从密封塑料袋中取出容器，并加入等体积的2.5％HAS/5％葡聚糖。注射细胞不需要进一步洗涤。
6.8.5测试和说明
所有的供体胎盘都附有母体血样。筛选样品的乙肝核心抗体和表面抗原、丙肝病毒抗体和核酸、以及HIV I和II抗体和核酸。在收到测试结果前开始处理胎盘和原代培养，但只继续处理所有病毒母体血样测试阴性的相关胎盘。如果供体对任何病原体测试阳性，则抛弃相应批次。此外，对MCB、WCB和来自WCB的小瓶的细胞制剂材料样品，实施表6中描述的测试。只有当满足所有说明时，才释放相应批次。
表6：细胞测试和说明
Figure G200880011754XD01321
*对于设计为40ml冷冻细胞/剂以及最大5EU/ml的产品，当受者的体重超过40kg时，细胞产品在5EU/kg/剂的上限以下。
6.8.6表面标志物的表型分析
将细胞置于含1％多聚甲醛(PFA)的PBS中20分钟，在染色前(共1周)储存在冰箱中。用含2％FBS、0.05％叠氮化物的PBS(染色缓冲液)洗涤细胞，然后重悬在染色缓冲液中。用下列抗体偶联物对细胞染色：CD105-FITC、CD200-PE、CD34-PECy7、CD10-APC。还用同种型对照染色细胞。在孵育30分钟后，洗涤细胞并用染色缓冲液重悬，再用流式细胞仪分析。与同种型对照相比，荧光增加的细胞作为标志物阳性来计数。
6.9利用胎盘干细胞或脐带干细胞治疗免疫相关疾病
这个实施例提供了免疫相关疾病或病状的治疗方案实例。
6.9.1治疗克隆氏病
患有回肠结肠炎的个体，形式为克隆氏病，经历腹痛、血样腹泻和发热。向该个体静脉内施用含1-5×108个CD10+CD34-CD105+CD200+胎盘干细胞和/或脐带干细胞的0.9％NaCl溶液。在随后两周监控该个体，评估一种或多种症状的降低。在下一年中监控个体，如需要，施用相同剂量的胎盘干细胞。
6.9.2治疗移植物抗宿主病
向等待同种异体骨髓移植的个体，在骨髓移植前24小时静脉内施用含5-10×108个CD10+CD34-CD105+CD200+胎盘干细胞和/或脐带干细胞的0.9％NaCl溶液。在骨髓移植后24小时内，重复施用所述干细胞。在之后的100天内监控该个体，施用后续剂量5-10×108个CD10+CD34-CD105+CD200+胎盘干细胞和/或脐带干细胞，所述个体GVHD发展和进展超过I级。
6.9.3治疗类风湿关节炎
个体在一个或多个关节存在类风湿关节炎。向该个体施用胎盘或脐带干细胞的组合，修饰胎盘干细胞生成包含IL-1Ra和DHFR的融合多肽，其中两种类型的干细胞施用比例是1∶1。工程改造的和非工程改造的细胞是0.9％NaCl溶液中的1-5×108个CD10+CD34-CD105+CD200+胎盘干细胞和/或脐带干细胞。给予该个体标准剂量的甲氨蝶呤，并监控关节炎症的减轻。
等同物：
本文公开的组合物和方法不受本文描述的具体实施方案的限制。实际上，除所描述的以外，根据上述说明书和其后附图，所述组合物和方法的不同改变形式对本领域技术人员都是显而易见的。此类改变形式意在落入所附权利要求范围内。
本文中引用了不同的出版物、专利和专利公开文本，其公开内容通过引用被全文纳入到本文中。

Claims (18)

1、治疗患有或有风险发展成疾病、障碍或病状的个体的方法，所述疾病、障碍或病状是与不合适或不希望的免疫反应相关或由其导致的，所述方法包括向个体施用治疗有效量的胎盘干细胞或被胎盘干细胞条件化的培养基，其中所述治疗有效量是足以可检测地改善所述疾病、障碍或病状的一种或多种症状的量。
2、权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞是CD10+、CD34-、CD105+、CD200+的胎盘干细胞。
3、权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞表达CD200和HLA-G，或者表达CD73、CD105和CD200，或者表达CD200和OCT-4，或者表达CD73、CD105和HLA-G，或者表达CD73和CD105，并且当含有所述胎盘干细胞的干细胞群在允许胚状体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞利于在所述胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体，或者所述胎盘干细胞表达OCT-4并且当含有所述胎盘干细胞的干细胞群在允许胚状体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞利于在所述胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体。
4、权利要求2的方法，其中所述疾病、障碍和/或病状是硬皮病。
5、权利要求4的方法，其中硬皮病是弥漫性硬皮病。
6、权利要求4的方法，其中硬皮病是局限性硬皮病(CREST综合征)。
7、权利要求4的方法，其中硬皮病是斑状/线状硬皮病。
8、权利要求4的方法，其中所述症状是以下症状中的一种或多种：面部皮肤的硬化、手指皮肤的硬化、雷诺综合症、不合适的肢体血管收缩、钙化、毛细管扩张、食道运动障碍、或血中出现抗着丝粒抗体或抗scl70/抗拓扑异构酶抗体。
9、权利要求4的方法，包括向所述个体施用第二治疗剂。
10、权利要求9的方法，其中所述第二治疗剂是抗炎药、质子泵抑制剂、免疫抑制化合物或血管扩张剂。
11、权利要求2的方法，其中所述疾病、障碍和/或病状是蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)。
12、权利要求11的方法，其中所述蕈样真菌病处于斑块期。
13、权利要求11的方法，其中所述蕈样真菌病处于皮肤肿瘤期。
14、权利要求11的方法，其中所述蕈样真菌病处于皮肤发红阶段(红皮病)。
15、权利要求11的方法，其中所述蕈样真菌病处于淋巴结阶段。
16、权利要求11的方法，其中所述症状是以下症状中的一种或多种：出现瘙痒的扁平红斑；出现隆起且硬的扁平红斑(斑块)；出现隆起的肿块(结节)；在全身出现大的红色、瘙痒、鳞片区；手掌和脚掌裂开；手掌和脚掌皮肤增厚；开裂；或淋巴结炎症。
17、权利要求11的方法，包括向所述个体施用第二治疗剂。
18、权利要求9的方法，其中所述第二治疗剂是抗炎药、免疫抑制化合物、暴露于阳光、暴露于紫外线、外用类固醇、局部表面放疗、全皮肤电子束辐照、向被红皮病感染的皮肤施用有机蜂蜜、干扰素、维甲酸、rexinoid或vorinostat。
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