JP6114840B2 - ヒトｃｄ３４陰性前駆細胞による免疫に媒介される細胞傷害性反応からの血管内皮の保護 - Google Patents

ヒトｃｄ３４陰性前駆細胞による免疫に媒介される細胞傷害性反応からの血管内皮の保護 Download PDF

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Description

本発明は、臨床症状の治療における医学的利用のためのヒトCD34陰性前駆細胞に関する。
ヒト成人CD34陰性前駆細胞は、自己再生並びに造血性、内皮及び間葉系系統（variety）の様々な組織への多系列分化についての能力を有する多能性細胞である。CD34陰性前駆細胞は免疫調節／再生能と関連しており、そのためそれら細胞はヒト疾患の治療における細胞治療薬としての使用に興味深いものとなっている。
例えば、特許文献1は、胃腸障害、糖尿病、筋ジストロフィーの治療、及び手術又は身体的外傷における急性創傷治癒における非遺伝子組換えCD34陰性幹細胞の医学的利用を開示している。Singer及びCaplanは、炎症におけるヒト間葉系幹細胞の推定作用機序を記載している（非特許文献1）。Tolarらは、MSC生物学、前臨床モデルにおけるMSCによるアロ応答（alloresponses）の調節、及びMSC注入を用いる臨床経験についての論議及び最近の洞察を概説している（非特許文献2）。Roemeling-van Rhijnらは、固形臓器移植における前臨床及び臨床MSC研究からの結果を提供している（非特許文献3）。同様に、Hoogduijnらは、臨床臓器移植における間葉系幹細胞治療の進歩を評価している（非特許文献4）。LeBlanc及び共同研究者らは、間葉系幹細胞が、造血幹細胞移植後の移植片対宿主病（GvHD）を寛解させることができるかを調べた（非特許文献5）。Pati及び共同研究者らは、MSCが、出血性ショックによって誘発される、肺における局所及び全身作用を介する、血管透過性と炎症とを治療的に標的にすることができることを示唆した（非特許文献6）。Charbordは、損傷組織修復の機構の多用途性を説明する可能性がある、間質及び免疫調節性能力を含む骨髄間葉系幹細胞の複数の特徴を概説している（非特許文献7）。
国際公開第2008/150368号
N. G. Singer and A. I. Caplan: "Mesenchymal Stem Cells:Mechanisms of Inflammation", Annual Review of Pathology: Mechanisms ofDisease, 2011, 457-478 J. Tolar, K. Le Blanc, A. Keating, B. R. Blazar: "ConciseReview: Hitting the Right Spot with Mesenchymal Stromal Cells", Stem Cells2010, 28, 1446-1455 M. Roemeling-van Rhijn, W. Weimar, M. J. Hoogduijn: "MesenchymalStem Cells: Application for Solid Organ Transplantation", Current Opinionin Organ Transplantation, 2012, 17, 55-62 M. J. Hoogduijn, F. C. Popp, A. Grohnert, M. J. Crop, M. van Rhijn,A. T. Rowshani, E. Eggenhofer, P. Renner, M. E. Reinders, T. J. Rabelink, L. J.van der Laan, F. J. Dor, J. N. Ijzermans, P. G. Genever, C. Lange, A. Durrbach,J. H. Houtgraaf, B. Christ, M. Seifert, M. Shagidulin, V. Donckier, R. Deans, O.Ringden, N. Perico, G. Remuzzi, A. Bartholomew, H. J. Schlitt, W. Weimar, C. C.Baan, M. H. Dahlke, and the MISOT study group: "Advancement of MesenchymalStem Cell Therapy in Solid Organ Transplantation (MISOT)",Transplantation, 90, 2010, 124-126 K. Le Blanc, F. Frassoni, L. Ball, F. Locatelli, H. Roelofs, I.Lewis, E. Lanino, B. Sundberg, M. E. Bernardo, M. Remberger, G. Dini, R. M.Egeler, A. Bacigalupo, W. Fibbe, O. Ringden, Developmental Committee of the European Groupfor Blood and Marrow Transplantation: "Mesenchymal Stem Cells forTreatment of Steroid Resistant, severe, acute Graft-versus-Host-Disease: APhase Two Study", Lancet, 2008, 371, 1579-86 S. Pati, M. H. Gerber, T. D. Menge, K. A. Wataha, Y. Zhao, J. A.Baumgartner, J. Zhao, P. A. Letourneau, M. P. Huby, L. A. Baer, J. R. Salsbury,R. A. Kozar, C. A. Wade, P. A. Walker, P. K. Dash, C. S. Cox Jr, M. F.Doursout, J. B. Holcomb: "Bone marrow derived mesenchymal stem cellsinhibit inflammation and preserve vascular endothelial integrity in the lungsafter hemorrhagic shock", PLoS One, 2011, 6, e25171 P. Charbord: "Bone marrow mesenchymal stem cells: historicaloverview and concepts", Human Gene Therapy, 2010, 21, 1045-56
CD34陰性前駆細胞の治療能のより良好な理解及びこれら多機能性細胞のより階層化した医学的利用に対する強い必要性に伴い、CD34陰性前駆細胞への臨床上の関心が増している。
本発明は、血管炎症性疾患のリスクがある又は血管炎症性疾患に罹患している対象の免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護することにおける使用のためのヒトCD34陰性前駆細胞を提供する。
本発明は、上記使用のためのヒトCD34陰性前駆細胞を産生する方法であって、以下の方法工程：
a）前記CD34陰性前駆細胞を単離する工程と、
b）前記CD34陰性前駆細胞を少なくとも12日間、細胞増殖培地中で増殖する（expanding）工程と、
c）前記CD34陰性前駆細胞を収集する工程と、
を含む、方法も提供する。
本発明は、内皮標的細胞、細胞傷害性CD8+Tリンパ球及びCD34陰性前駆細胞を含むサンプルと、内皮標的細胞及び細胞傷害性CD8+Tリンパ球を含み、CD34陰性前駆細胞を含まない参照サンプルとを調製することと、該サンプル及び該参照サンプルにおける内皮標的細胞の溶解を比較することとによる、免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護するCD34陰性前駆細胞の能力を決定する方法を更に提供する。
免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護するCD34陰性前駆細胞の能力を決定する方法の、代表的実験計画を示すブロック図である。 異なるドナーからの骨髄間葉系幹細胞／間質細胞を用いる、CD34陰性前駆細胞による、同種CD8+細胞傷害性Tリンパ球による特異的溶解からの内皮細胞の保護の結果を示す。 内皮細胞の同種CD8+CTLによる溶解が、MHCクラスI拘束性であり、かつナチュラルキラー細胞又はリンホカイン活性化キラー細胞活性とは独立したものであることを示す。 同種CD8+細胞傷害性Tリンパ球による溶解からの内皮細胞の保護が骨髄MSC（BM-MSC）に特異的であり、一方、サイズを一致させた（size-matched）対照細胞は保護効果を示さないことを示す。 様々な組織由来の間葉系幹細胞／間質細胞を用いる、CD34陰性前駆細胞による内皮保護のレベルの比較の結果を示す。
用語及び定義
本出願において、すべてが以下に示す意味を有するいくつかの用語が使用される。
本明細書において使用される場合、細胞は、その細胞、又はその細胞の前駆細胞のいずれかが、同じ種の他の対象からのものである場合、対象に関して「同種」である。
本明細書において使用される場合、「CD34陰性前駆細胞」は、その表面上にCD34を欠く幹細胞を意味する。CD34陰性前駆細胞はまた、それ自体がCD34陰性幹細胞／間質細胞を生じさせることができ、又はCD34陰性幹細胞／間質細胞へと分化することができる。CD34陰性前駆細胞は、造血性、内皮及び／又は間葉系子孫を含むことができる。いくつかの好ましい実施形態において、「CD34陰性前駆細胞」は、CD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞（MSC）を意味し、一方、造血性前駆細胞及びまた内皮前駆細胞は、最終的にはCD34及びその他の同時（concurrent）マーカーを成熟の間に発現し始める。
本明細書において使用される場合、「血管内皮」は、血管の内側表面を覆う細胞を限定的に含む。特に、血管内皮は、血液と直接接触する内皮細胞を含む。
本明細書において使用される場合、「免疫に媒介される細胞傷害性反応」は、限定されないが、免疫応答が向けられている標的細胞の損傷又は死を導く、細胞に媒介される免疫応答を意味する。いくつかの実施形態において、免疫に媒介される細胞傷害性反応は、MHC媒介性細胞性免疫を含む。
本明細書において使用される場合、「CD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞」は、International Society forCellular Therapyによって提案されている以下の3つの最低基準を満たす幹細胞を意味する：（1）組織培養フラスコを用いる標準的培養条件に維持された場合のプラスチック接着性；（2）フローサイトメトリーによって測定される、CD105、CD73及びCD90の発現、並びにCD45、CD34、CD14又はCD11b、CD79a又はCD19の発現の欠如；（3）標準的in vitro分化条件下で、骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨芽細胞へと分化する能力（M. Dominici, K. Le Blanc, I. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, F.Marini, D. Krause, R. Deans, A. Keating, Dj. Prockop, E. Horwitz: "Minimalcriteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The InternationalSociety for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy, 2006, 8,315-7）。
いくつかの実施形態において、「CD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞」は、ガンマ-IFNによる刺激の後にB7-H1（PD-L1）を発現するMSCを更に意味する（M. Najar, G. Raicevic, H.F. Kazan, C. De Bruyn, D. Bron, M.Toungouz, L. Lagneaux: "Immune-related antigens, surface molecules andregulatory factors in human-derived mesenchymal stromal cells: the expressionand impact of inflammatory priming", Stem Cell Rev. 2012, 8, 1188-98)、S. Tipnis, C. Viswanathan, A.S. Majumdar: "Immunosuppressiveproperties of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: role ofB7-H1 and IDO", Immunol Cell Biol., 2010, 88, 795-806、P. Fiorina, M. Jurewicz, A. Augello, A. Vergani, S. Dada, S. La Rosa,M. Selig, J. Godwin, K. Law, C. Placidi, R.N.Smith, C. Capella, S. Rodig, C.N.Adra, M. Atkinson, M.H. Sayegh, R. Abdi: "Immunomodulatory function ofbone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimental autoimmune type 1diabetes", J Immunol. 2009, 183, 993-1004、C.J.Chang, M.L. Yen, Y.C. Chen, C.C. Chien, H.I. Huang, C.H. Bai, B.L. Yen: "Placenta-derivedmultipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in thepresence of interferon-gamma", Stem Cells, 2006, 24, 2466-77）。
更なる断りのない限り、「血管炎症性疾患」は、限定されないが、大動脈及び小動脈、静脈並びにリンパ管を含む脈管組織（vasculartissue）の炎症を誘起する免疫応答を意味する。
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモット又はウサギ等のあらゆる動物を意味する。対象はヒトであるのが好ましい。
本明細書において使用される場合、「血管内皮を保護する」とは、あらゆる脈管組織に向けられた免疫に媒介される細胞傷害性反応の進行を遅くすること、止めること又は逆行させることを意味する。
発明の説明
血管内皮は、種々の血管炎症性障害における一次標的である。本発明の発明者らは、リスクに適合した、個別化された予防及び／又は治療介入の点から、内皮の特異的保護が、大きな臨床及び健康経済的価値があるであろうということに気付いた。
本発明者らは、血管内皮の活性化状態及び活力度の入念な研究を行い、CD34陰性前駆細胞が、内皮特異的細胞傷害性反応を、薬理学的使用において用量依存的に抑制することができるということを見出した。
それゆえ、第1の態様において、本発明は、血管炎症性疾患のリスクがある又は血管炎症性疾患に罹患している対象の免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護することにおける使用のためのヒトCD34陰性前駆細胞を提供する。
本発明の1つの実施形態において、血管炎症性疾患は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球によって引き起こされる血管内皮特異的細胞溶解を含む。本発明者らは、血管炎症性疾患のいくつかの状態において、内皮がCD8+細胞傷害性Tリンパ球についての直接の標的であることを明らかにした。CD34陰性前駆細胞の治療的使用は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球媒介性細胞傷害性反応を妨げることにおいて特に有効であった。
本発明の特定の実施形態において、CD8+細胞傷害性Tリンパ球は、CD27陰性かつCD28陰性である内皮特異的細胞傷害性Tリンパ球を含む。本発明者らは、驚くべきことに、CD27陰性かつCD28陰性であるとともに、造血性標的を認識しない、内皮特異的細胞傷害性Tリンパ球の存在の証拠を見出した。これらの細胞は、表現型的及び機能的に注目すべき特徴を示す。例えば、これらの細胞の溶解活性は、CD4+/CD25+/FoxP3+調節性Tリンパ球（TReg）によって増強される。本発明者らは、CD34陰性前駆細胞を投与した場合に、この特定のタイプのCTLによる内皮細胞溶解の著しい阻害を達成した。
本発明はそれゆえ、CD34陰性前駆細胞による、リスクに適合した、個別化された予防及び／又は治療を可能とする、CD34陰性前駆細胞の階層化した治療的使用を提供する。対応して、本発明によるCD34陰性前駆細胞の有利な医学的用途は、以下に規定する臨床症状を含む。
本発明の1つの実施形態において、血管炎症性疾患は、対象に関して同種である移植固形臓器（solidorgan transplant）の血管内皮に対するアロ反応（alloreaction）を含む。
別の実施形態において、血管炎症性疾患は、同種造血幹細胞移植後の移植関連合併症を含む。
例えば、移植関連合併症は、移植片対宿主病（GvHD）を含む。特に、移植片対宿主病は、消化管、肝臓、粘膜を含む皮膚、肺系（pulmonarysystem）、及びそれらの組合せの、主に選択的な損傷を特徴とすることができる。本発明のいくつかの実施形態において、移植片対宿主病は、ステロイド抵抗性急性又は慢性GvHDを含む。
移植関連合併症の別の例は、例えば、肝静脈閉塞症（VOD）等の微小血管障害性疾患（microangiopathic disease）である。
ヒトCD34陰性前駆細胞はまた、自己免疫応答の結果としての、急性、炎症性又はアレルギー性血管炎を含む、血管炎症性疾患において、血管内皮を保護するために使用することもできる。この使用は、限定されないが、アレルギー性肉芽腫症、巨細胞性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎病、閉塞性血栓血管炎（thromboangiitisobliterans）（バージャー病）、結節性多発動脈炎、チャーグストラウス症候群、顕微鏡的多発血管炎、クリオグロブリン血症性血管炎、蕁麻疹様血管炎、ベーチェット病、グッドパスチャー症候群、感染後血管炎及び薬剤誘発血管炎を含む。
別の実施形態において、血管炎症性疾患は、血管内皮の慢性炎症を含む。慢性炎症は、例えば、アテローム性動脈硬化を含むことができる。慢性炎症はまた、リウマチ様疾患と関連した血管炎を含むこともできる。
本発明の好ましい実施形態において、CD34陰性前駆細胞は、CD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞を含む。CD34陰性前駆細胞は、例えば、骨髄、臍帯、胎盤及び脂肪組織のCD34陰性前駆細胞、並びにそれらの組合せを含む群から選択することができる。本発明の好ましい実施形態において、CD34陰性前駆細胞は、骨髄のCD34陰性前駆細胞である。特に好ましいのは、骨髄のCD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞である。
CD34陰性前駆細胞は、血管内皮細胞に対する免疫に媒介される細胞傷害性反応を、CD34陰性前駆細胞によって保護されない内皮細胞と比較して少なくとも50 %低下させる能力を有するのが好ましい。本発明による免疫に媒介される細胞傷害性反応の低下の決定に適した方法を、以下に更に記載する。
ヒトCD34陰性前駆細胞は、好ましくは、しかし限定されるものではないが、例えば、かかる細胞を対象の静脈又は動脈の1つに注射によって導入することによる、対象の血流への注射に適合している。かかる投与はまた、例えば、1回若しくは複数回及び／又は1若しくは複数の長期間をかけて行うこともできる。単回注射が好ましいが、場合によっては、長い時間をかけた反復注射が必要であることもある。
CD34陰性前駆細胞は、医薬上許容される担体と混合するのが好ましい。医薬上許容される担体は当業者によく知られており、これらに限定されないが、0.01モル濃度（molar）〜0.1モル濃度、好ましくは0.05モル濃度のリン酸緩衝液又は0.8 %生理食塩水が含まれる。さらに、かかる医薬上許容される担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液とすることができ、非水性溶媒の例としては、プロピレン、グリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油及びオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。水性担体には、水、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、アルコール性／水性溶液、乳濁液並びに懸濁液が含まれる。非経口媒体には、フッ化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液（ringer's dextrose）、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液並びに不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体には、ブドウ糖加リンゲル液（ringer'sdextrose）、ブドウ糖加リンゲル液に基づくもの等の、液体（fluid）及び栄養分補充液、電解質補充液等が含まれる。静脈内投与に一般に使用される液体は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20thedition, page 808, Lippincott、Williams and Wilkins(2000)においてみられる。
様々な投与計画を使用することができる。ヒトCD34陰性前駆細胞は、治療的有効量での対象の血流への注射に適合しているのが好ましい。治療的有効量は、例えば体重1キログラム当たり1×102〜約1×108の細胞、体重1キログラム当たり約1×103〜約10×107の細胞、体重1キログラム当たり約1×104〜約1×106の細胞、体重1キログラム当たり約1×104〜約1×105の細胞、体重1キログラム当たり約1×105〜約1×106の細胞、体重1キログラム当たり約5×104〜約0.5×105の細胞、体重1キログラム当たり約1×103の細胞、体重1キログラム当たり約1×104の細胞、体重1キログラム当たり約5×104の細胞、体重1キログラム当たり約1×105の細胞、体重1キログラム当たり約5×105の細胞、体重1キログラム当たり約1×106の細胞、及び体重1キログラム当たり約1×107の細胞という範囲を含むことができる。これらの値はCD34陰性前駆細胞の移植において治療的に特に有効であることが見出された。
本発明の変形形態において、CD34陰性前駆細胞は、血管炎症性疾患のリスクがある対象の血管内皮を保護するために予防的に使用される。本明細書において使用される場合、予防的使用には、限定されないが、対象に関して同種である固形臓器移植を受けようとしている対象への細胞の投与が含まれる。別の例において、予防的使用は、同種造血幹細胞移植を受けようとしている対象へCD34陰性前駆細胞を投与することを含む。予防的使用の更なる例は、同種移植を既に受けたが内皮合併症を未だ発症していない対象へCD34陰性前駆細胞を投与することを含む。血管炎症性疾患のリスクは、例えば、遺伝性障害、自己免疫疾患、癌、喫煙、アルコール依存症、及びそれらの組合せもまた含むことができる。本発明者らは、リスクに適合した、個別化された予防の意味での血管内皮の標的化保護は、臨床及び健康経済的価値が高いことに気付いた。
かかるリスクに応じて階層化した使用は、例えば、限定されないが、移植後に内皮合併症を発症するリスクがある患者が、予防的に、即ちあらかじめCD34陰性前駆細胞を受けることを含むことができる。例えば、CD34陰性前駆細胞は、介入、例えば、同種細胞若しくは臓器移植の直前、介入の最中及び／又は介入前約6週間以内及び／又は介入後に対象に投与することができる。CD34陰性前駆細胞の投与は、内皮合併症の急性期及び／又は慢性期にかけて、介入の約100日後まで延長させることもできる。さらに、CD34陰性前駆細胞は、内皮合併症及び／又はそれに特徴的な症状の発症時の対象、又は内皮合併症及び／又はそれに特徴的な症状を現在発症している対象に治療的に投与することができる。
CD34陰性前駆細胞は対象に関して同種のものとすることができる。CD34陰性前駆細胞は対象に関して自己のものとすることもできる。代替的に、同種CD34陰性前駆細胞と自己CD34陰性前駆細胞との組合せを使用することができる。
1つの例において、CD34陰性前駆細胞は、移植固形臓器に関して自己であり、対象に関して同種である。別の例において、CD34陰性前駆細胞は、移植造血幹細胞に関して同種であり、対象に関して自己である。CD34陰性前駆細胞が、対象、及び移植固形臓器又は移植造血幹細胞に関して同種である場合もまた含まれる。
1つの実施形態において、CD34陰性前駆細胞は、少なくとも1つの更なる活性成分と組み合わせて使用される。例えば、前記少なくとも1つの更なる活性成分が、抗炎症活性、抗虚血活性、抗血栓活性、及びそれらの組合せを含む群から選択される薬理活性を有することができる。追加的又は代替的に、少なくとも1つの更なる活性成分は、内皮細胞をアロ認識及び／又は溶解から防ぐ能力を有することができる。いくつかの例において、少なくとも1つの更なる活性成分は、デソキシリボ核酸誘導体、例えば、デフィブロチドを含む。
第２の態様において、本発明は、以下の方法工程：a）前記CD34陰性前駆細胞を単離する工程と、b）前記CD34陰性前駆細胞を少なくとも12日間、細胞増殖培地中で増殖する工程と、c）前記CD34陰性前駆細胞を収集する工程と、を含む、上記のいずれかの使用のためのヒトCD34陰性前駆細胞を産生する方法を提供する。
1つの実施形態において、方法工程a）において、前記CD34陰性前駆細胞を、骨髄、臍帯、胎盤及び脂肪組織、又はそれらの組合せを含む群の組織から単離する。本発明者らは、これらの組織源からの前駆細胞が血管炎症性疾患において血管内皮を保護するのに特に適していることを見出した。CD34陰性前駆細胞はCD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞であるのが好ましい。骨髄からのCD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞がもっとも好ましい。
本方法の更なる実施形態によれば、方法工程b）の前記細胞増殖培地が、
直径が0.22 μmより大きい固形物を含まないヒト血小板溶解産物であって、前記細胞増殖培地の総容積の2 %〜15 %を構成する、ヒト血小板溶解産物と、
直径が0.22 μmより大きい固形物を含まないヒト新鮮凍結血漿（FFP）濾液であって、前記細胞増殖培地の総容積の1 %〜10 %を構成する、ヒト新鮮凍結血漿（FFP）濾液と、
前記細胞増殖培地の0 U/ml〜10 U/mlの濃度のヘパリンと、
0.5 mM〜10 mMの濃度のL-グルタミンと、
哺乳類細胞増殖に適した無血清、低グルコース培地であって、前記細胞増殖培地の総容積の75 %〜97 %を構成する、無血清、低グルコース培地と、
を含む培地を含む。
本明細書において、ヒト新鮮凍結血漿とは、遠心分離され、分離され、そして-18℃又はそれより低温で収集時間内に凍結固化された、ヒト血液の液体部分のことをいう。本発明者らは、免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護することにおいて特に強力なCD34陰性前駆細胞のこの培地中での増殖を達成した。以下において、この培地を「Bio-1」培地と称する。
好ましい実施形態において、細胞培養皿又は細胞培養容器の壁等の、細胞培養培地と接触している表面上に主に接着して増殖する、CD34陰性前駆細胞を、方法工程c）において収集する。
方法工程a）からc）は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（GMP）及び／又は現行医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（cGMP）の下で行うのが好ましい。
これらの方法により、本発明者らは、特に高い血管内皮保護能力を有する、より良好に規定された、高度に移植可能な細胞の、in vitro増殖及び正の選択を達成したが、一方、従来の方法では典型的には、CD34陰性前駆細胞内の異なる亜集団の不均一な混合物が生じる。
第３の態様において、本発明は、内皮標的細胞、細胞傷害性CD8+Tリンパ球及びCD34陰性前駆細胞を含むサンプルと、内皮標的細胞及び細胞傷害性CD8+Tリンパ球を含み、CD34陰性前駆細胞を含まない参照サンプルとを調製することと、前記サンプル及び前記参照サンプルにおける内皮標的細胞の溶解を比較することとによる、免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護するCD34陰性前駆細胞の能力を決定する方法を提供する。
1つの実施形態において、内皮標的細胞及び／又はCD34陰性前駆細胞は、CD8+Tリンパ球に関して同種である。
別の実施形態では、内皮標的細胞及び前記CD8+Tリンパ球を含む、前記サンプルと前記参照サンプルとを調製する前に、インターロイキン-2（IL-2）の存在下で、前記CD8+Tリンパ球を同種内皮細胞と共存培養する。共存培養は、例えば、少なくとも1日間、好ましくは少なくとも3日間、より好ましくは少なくとも5日間、もっとも好ましくは少なくとも7日間維持することができる。
別の実施形態において、少なくとも1つの更なる活性成分を、サンプル及び／又は参照サンプルに添加する。例えば、少なくとも1つの更なる活性成分は、抗炎症活性、抗虚血活性、抗血栓活性、及びそれらの組合せを含む群から選択される薬理活性を有するものとすることができる。追加的又は代替的に、少なくとも1つの更なる活性成分は、内皮細胞をアロ認識及び／又は溶解から防ぐ能力を有するものとすることができる。いくつかの例において、少なくとも1つの更なる活性成分は、デソキシリボ核酸誘導体、例えば、デフィブロチドを含む。
本方法により、本発明者らは、様々な源からのCD34陰性前駆細胞の血管内皮を保護する能力について評価する効力アッセイを達成した。さらに、CD34陰性前駆細胞のin vivo治療効果の積極的予測のためのin vitro試験が実現される。
本方法はまた、移植を受ける及び／又は内皮合併症を発症する前、その最中及び／又はその後に、内皮細胞傷害性CD8+Tリンパ球の存在及び／又は病態生理学的活性について対象の血液を分析するために使用することもできる。
例えば、対象に関して同種である固形臓器移植の場合には、内皮標的細胞は固形臓器ドナーに由来する細胞を含むものとすることができる。対象に関して同種である固形臓器移植の別の場合には、CD34陰性前駆細胞は、固形臓器ドナーに由来する細胞を含むものとすることができる。対象に関して同種である固形臓器移植のいくつかの場合では、内皮標的細胞及びCD34陰性前駆細胞の両方を、固形臓器ドナーに由来する細胞を含むものとすることができる。追加的又は代替的に、CD34陰性前駆細胞はまた、対象又は固形臓器ドナーのいずれでもない少なくとも1名の第3者ドナーに由来する細胞を含むものとすることもできる。
同種造血幹細胞移植の場合には、内皮標的細胞は、対象、即ち、移植レシピエントに由来する細胞を含むものとすることができる。同種造血幹細胞移植の別の場合には、CD34陰性前駆細胞は、移植レシピエントに由来する細胞を含むものとすることができる。同種造血幹細胞移植のいくつかの場合では、内皮標的細胞及びCD34陰性前駆細胞の両方を、移植レシピエントに由来する細胞を含むものとすることができる。追加的又は代替的に、CD34陰性前駆細胞はまた、移植レシピエント又は造血幹細胞ドナーのいずれでもない少なくとも1名の第3者ドナーに由来する細胞を含むものとすることもできる。
このようにして、本方法は、上記で特定した、ケースに特有の内皮標的細胞と組み合わせて、対象の血液に由来する細胞傷害性CD8+Tリンパ球を用いて、個人ベースで免疫に媒介される細胞傷害性反応を発症する対象の易罹患性を決定するために使用することができるだけでなく、内皮標的細胞の特に強力な保護を示すCD34陰性前駆細胞を選択するために使用することもできる。
結果として、患者を、例えば、血管炎症性疾患のリスクに応じて階層化することができる。さらに、個別化予防及び／又は治療を考案することができる。
実施形態の詳細な説明
以下の実施例において、本発明のいくつかの実施形態を図面及び実験データを参照して更に詳細に説明する。実施例及び図面は具体的詳細に関して限定する意図のものではない。
実施例1:実験計画細胞傷害性アッセイ
以下の実施例は、免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護することに関してCD34陰性前駆細胞の能力を評価するために、本発明者らによって計画された実験設定を記載する。
図1は、本発明の細胞傷害性アッセイの1つの代表的実施形態を図示するブロック図である。末梢血の単核細胞（PBMC、10）を細胞傷害性（cytotoxic）細胞の源として使用することができる。PBMCは、例えば、健康な第3者ドナー由来のものとすることができる。代替的に、治療される対象のPBMCを使用することができる。
次に、PBMCをCD8+Tリンパ球について更に選択することができる（11）。CD8+Tリンパ球の選択は、例えば、免疫分離によるPBMCからのCD8+Tリンパ球の濃縮を含むことができる。免疫分離は、例えば、非CD8+Tリンパ球を除去することによる、CD8+Tリンパ球の負の選択を含むことができる。CD8+Tリンパ球の濃縮に適した方法は、例えば、免疫磁気微小粒子を介した非標識（untouched）選択である。望まれない細胞は、例えば、CD4、CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD66B、CD123、TCRγ/δ、グリコホリンAを認識する抗体複合体及びデキストラン-被覆磁性粒子による除去についての標的とすることができる。その後、選択した細胞の表現型純度を、例えば、フローサイトメトリーによって確認することができる。選択した細胞の大部分がCD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL、12）であるのが好ましい。
次の段階において、CD8+CTLとCD8+CTLに関して同種である内皮刺激細胞13との共存培養14を維持することができる。内皮刺激細胞は有糸分裂を行うことができないものであるのが好ましい。適した細胞株は、例えば、SV40ラージT抗原形質転換毛細血管内皮細胞株CDC/EU.HMEC-1（HMEC）である。内皮刺激細胞とCD8+CTLとの共存培養は、例えば、約7日間維持することができる。共存培養は、CD8+CTLをインターロイキン-2で刺激することを更に含むのが好ましい。
内皮標的細胞17の調製物は、標識化工程18に供することができ、標識化工程18において内皮標的細胞17を、内皮標的細胞をその他の非標的細胞から識別可能とする第1の標識で標識する。例えば、かかる標識は、細胞の細胞膜中に存在する場合に、細胞膜の外側に存在する場合とは異なる発光特徴を有する蛍光性化合物を含むことができる。適した化合物は、例えば、3,3'-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（DIOC183）である。標的細胞は、例えば、移植組織からの内皮細胞とすることができる。標的細胞は、内皮細胞株、例えば、毛細血管内皮株CDC/EU.HMEC-1とすることができる。
次の段階において、サンプル22を、標識した標的細胞の第1部分20、エフェクター細胞の第1部分16、及びCD34陰性前駆細胞21を合わせることによって調製する。CD34陰性前駆細胞は、例えば、内皮標的細胞及びエフェクター細胞に関して同種のものとすることができる。内皮標的細胞とCD34陰性前駆細胞との比は、例えば、5:1とすることができる。エフェクター細胞と内皮標的細胞との比は、例えば、20:1、10:1又は5:1とすることができる。参照サンプル22'を、CD34陰性前駆細胞を含めずに、標識した標的細胞の第2部分20'及びエフェクター細胞の第2部分16'を、サンプルと同じ比で合わせることによって調製する。
サンプル及び参照サンプルのインキュベーションを維持する（23、23'）。インキュベーションは、例えば、約4時間維持することができる。
その後、サンプル及び参照サンプル中の溶解した内皮標的細胞の量を決定する（24、24'）。この目的のため、溶解した内皮標的細胞を、溶解した標的細胞を溶解していない標的細胞から識別可能とする第2の標識で標識することができる。かかる第2の標識は、例えば、死細胞を陽性に染色するのに適した染色剤とすることができる。例えば、ヨウ化プロピジウム等の蛍光染色剤（fluorochromatic stain）を使用することができる。溶解した内皮標的細胞の量を決定するのに適した方法は、例えば、フローサイトメトリーとすることができる。例えば、溶解した細胞のパーセンテージは、第1の標識、例えば、DIOC183を保有する細胞の全集団中の、第1の標識及び第2の標識、例えば、DIOC183及びPIの両方を保有する細胞の量を、フローサイトメトリーによって決定することにより決定することができる。
さらに、エフェクター細胞によって特異的に溶解された標的細胞のパーセンテージは、ランダムに溶解した細胞のパーセンテージを差し引くことによって補正することができる。この目的のため、標識した標的細胞19の、エフェクター細胞とCD34陰性前駆細胞とのいずれも含有しない第3部分25を調製する。第3部分を更にサンプル及び参照サンプルと同様にして処理し（25）、その後、第3部分中のランダムに溶解した内皮標的細胞の量26を上記のようにして決定する。
実施例2:第3者CD34陰性前駆細胞は内皮細胞を同種CD8+CTLによる溶解から保護する
実施例1に記載した細胞傷害性アッセイを使用して、第3者由来CD34陰性前駆細胞有り及び無しで、同種細胞傷害性Tリンパ球による内皮標的細胞（HMEC）の溶解を評価した。この場合では、骨髄から単離したCD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞を使用した。BM-MSCをBio-1培地中で増殖させた結果、幹細胞の特徴、細胞の生存能及び免疫に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護する能力を維持することについて、治療的使用に有利な細胞集団が得られた。
20:1、10:1及び5:1の様々な比のエフェクター細胞と標的細胞とを調製した。各比について、骨髄MSCを有さない6の個別サンプルと骨髄MSC（BM-MSC）を有する6の個別サンプルとを調製した。後者では、標的細胞を、エフェクター細胞の添加前に1名のドナーのBM-MSCとともに24時間インキュベートした。
実験の結果を図2に示す。グラフはBM-MSC無し（菱形の印）、及びBM-MSC有り（正方形の印）のサンプルについて、それぞれのエフェクター／標的細胞比にわたるパーセントにおける標的細胞の特異的溶解を示す。データは6の個別の実験の平均値及び標準偏差を表す。BM-MSCは、試験したすべてのE/T比において高度な有意性をもって、CD8+CTLによる同種内皮細胞の溶解を阻害することが判明した（*、**、***:p＜0.001）。平均すると、同種内皮標的細胞の特異的溶解は、CD34陰性骨髄間葉系幹細胞／間質細胞の添加により、およそ65 %、即ち28.3±5.8 %から9.7±8.3 %に低下した。
実施例3:CD34陰性前駆細胞の免疫調節性作用は内皮特異的である
対照として、CD34陰性BM-MSCを内皮細胞に添加しないが、エフェクター細胞とともにプレインキュベートし、その後除去した点で実施例2とは異なる実験を実施例2に記載のようにして行った。この場合、BM-MSCとともにプレインキュベートしなかったエフェクター細胞と比較して、エフェクター細胞をBM-MSCとともにプレインキュベートした場合に、内皮標的細胞の特異的溶解の低下は観察されなかった。それゆえBM-MSCの免疫調節性活性はBM-MSCと内皮標的細胞との特異的相互作用に関連していると結論づけることができる。
実施例4:同種CD8+CTLによる内皮標的細胞溶解はMHCクラスI拘束性であるとともにナチュラルキラー細胞又はリンホカイン活性化キラー細胞活性と独立している
更なる対照として、同種CD8+細胞傷害性Tリンパ球エフェクター細胞の溶解活性がアロ抗原のMHCクラスI提示に拘束されることによって抗原特異的であるか否かを調べた。この目的のため、内皮標的細胞を実施例2と同様にして、ただし中和MHCクラスI抗体（W6/32）の存在下で、CD8+エフェクター細胞に供した。さらに、エフェクター細胞はナチュラルキラー細胞又は非特異的リンホカイン活性化キラー細胞の活性と対応する活性を有さないことを示すべきであった。この対照は、実施例2と同様にして、ただし、内皮標的細胞を、ナチュラルキラー細胞についての対照標的細胞株（K562）に置換して実験を行うことによって達成した。
これらの対照実験の結果を図3に要約する。カラムはそれぞれ4名の個別のBM-MSCドナーを用いる4つの独立した実験の、エフェクター／標的比20での標的細胞の特異的溶解の算術平均及び標準偏差を表す。結果は、中和抗MHCクラスI抗体の存在が、標的細胞の特異的溶解を有意に低下させることを示し（*、**:p＜0.001）、これはエフェクター細胞の溶解活性はアロ抗原特異的であることを確認するものである。さらに、対照標的K562の溶解は有意に低下し（***:p＜0.002）、これは細胞傷害性Tリンパ球エフェクター細胞が、ナチュラルキラー細胞又は非特異的リンホカイン活性化キラー細胞の活性に対応する活性を有さないことを実証している。
実施例5:内皮標的細胞のCD8+CTLエフェクター細胞による溶解からの保護はCD34陰性前駆細胞に特異的である
骨髄由来CD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞等のCD34陰性前駆細胞は比較的大きな細胞である。それゆえ、内皮標的細胞のBM-MSCによる保護は、BM-MSCの免疫調節性能力に基づくものであるか否かではなく、CD8+Tリンパ球エフェクター細胞の内皮細胞への接近からのBM-MSCによる立体阻害に基づくものであるか否かを評価すべきであった。実験計画は実施例2と類似のものとしたが、ただし、ヒト心臓組織からの線維芽細胞様細胞をBM-MSCの代わりに内皮標的細胞に添加した。線維芽細胞様細胞はBM-MSCとサイズを一致させた。
結果を図4に示す。カラムは、それぞれ3名の異なるBM-MSCドナーを用いる3つの独立した実験の、保護されない内皮細胞の溶解に対してパーセントにおいて正規化した、内皮標的細胞の特異的溶解の算術平均及び標準偏差を表す。内皮標的細胞についての保護効果はサイズを一致させた対照細胞の添加からは観察されず（**:有意性無し）、これは内皮標的細胞のBM-MSCによる保護は、免疫学的に関連するものであって、立体阻害に起因するのではないことを実証している。
実施例6:CD34陰性幹細胞は免疫学的に無感作である
CD34陰性前駆細胞自体は免疫原性ではないことは重要である。この理由のために、骨髄CD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞の免疫原性を調べた。実験は実施例2に記載のようにして、ただし内皮細胞ではなく、骨髄間葉系幹細胞／間質細胞を標的細胞として使用して内皮細胞の非存在下で行った。同種CD8+細胞傷害性Tリンパ球エフェクター細胞の溶解活性は、BM-MSCが標的として提示された場合には観察されなかった。この知見は、CD34陰性前駆細胞、特に間葉系幹細胞／間質細胞の免疫無感作性（immunologic naivety）と一致している。
実施例7:様々な源からのCD34-前駆細胞の内皮保護能力
CD8+CTL媒介性溶解からの内皮標的細胞の保護における、様々な組織源由来のCD34陰性前駆細胞の有効性を比較した。実験は、実施例2に記載のようにして、ただし、CD34-前駆細胞（21）を骨髄由来MSC（BM-MSC、9の個別サンプル）、臍帯由来MSC（UC-MSC、4の個別サンプル）、又は羊膜由来MSC（AMC-MSC、3の個別サンプル）のいずれかとして行った。これら実験の結果を図5に要約する。各カラム対は、MSC保護無し（中実のカラム）及びMSC保護有り（斜線カラム）でのMSC源に応じたパーセントでの特異的内皮標的細胞溶解の算術平均及び標準偏差を示す。すべての試験したMSCは内皮標的細胞をCD8+CTL媒介性溶解から保護することができた。最も強力な保護はBM-MSCによって観察され、BM-MSCでは、内皮細胞溶解はMSC保護の無い対照と比較して平均すると72.3 %低下していた。AMC-MSCは内皮細胞溶解を平均するとおよそ53.2 %低下させ、UC-MSCもまた内皮細胞溶解を平均するとおよそ39.5 %低下させた。本実施例はまた、様々な源からの細胞の保護能を評価し、かつCD34陰性前駆細胞のin vivoでの効果を積極的に予測するために、血管内皮を免疫に媒介される細胞傷害性反応から保護するCD34陰性前駆細胞の能力を決定する本発明の方法の重要性を強調する。

Claims (20)

  1. ヒトCD34陰性間葉系幹細胞を含む、血管炎症性疾患のリスクがある又は血管炎症性疾患に罹患している対象のCD8+細胞傷害性Tリンパ球に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護するための薬剤。
  2. 薬物治療に使用される薬剤であって、該治療がCD34陰性前駆細胞の投与を含み、該CD34陰性前駆細胞がCD34陰性間葉系幹細胞からなる、請求項1に記載の薬剤。
  3. 薬剤が、医薬上許容される担体を含む混合物として投与され、該混合物がCD34陰性前駆細胞を含み、該CD34陰性前駆細胞がCD34陰性間葉系幹細胞からなる、請求項1又は2に記載の薬剤。
  4. 前記対象が移植後の内皮合併症の発症のリスクがある、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
  5. 前記CD8+細胞傷害性Tリンパ球が、CD27陰性及びCD28陰性である内皮特異的細胞傷害性Tリンパ球を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の薬剤。
  6. 前記血管炎症性疾患が、前記対象に関して同種である移植固形臓器の血管内皮に対するアロ反応を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薬剤。
  7. 前記血管炎症性疾患が、同種造血幹細胞移植後の移植関連合併症を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薬剤。
  8. 前記移植関連合併症が、移植片対宿主病（GvHD）を含む、請求項7に記載の薬剤。
  9. 前記移植関連合併症が、微小血管障害性疾患を含む、請求項7に記載の薬剤。
  10. 前記血管炎症性疾患が、自己免疫応答の結果としての、急性、炎症性又はアレルギー性血管炎を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薬剤。
  11. 前記急性、炎症性又はアレルギー性血管炎が、アレルギー性肉芽腫症、巨細胞性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎病、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、結節性多発動脈炎、チャーグストラウス症候群、顕微鏡的多発血管炎、クリオグロブリン血症性血管炎、蕁麻疹様血管炎、ベーチェット病、グッドパスチャー症候群、感染後血管炎又は薬剤誘発血管炎を含む、請求項10に記載の薬剤。
  12. 前記血管炎症性疾患が、血管内皮の慢性炎症を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薬剤。
  13. 前記ヒトCD34陰性間葉系幹細胞が、骨髄、臍帯、胎盤及び脂肪組織のCD34陰性前駆細胞、又はそれらの組合せを含む群から選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の薬剤。
  14. 前記ヒトCD34陰性間葉系幹細胞が、CD105、CD73及びCD90の発現、並びにCD45、CD34、CD14又はCD11b、CD79a又はCD19の発現の欠如を特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項に記載の薬剤。
  15. 前記CD34陰性間葉系幹細胞が、骨髄CD34陰性間葉系幹細胞／間質細胞である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の薬剤。
  16. 前記CD34陰性間葉系幹細胞が、少なくとも1つの更なる薬理活性成分と組み合わせて使用される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の薬剤。
  17. 前記少なくとも1つの更なる薬理活性成分が、抗炎症活性、抗虚血活性、抗血栓活性、及びそれらの組合せを含む群から選択される薬理活性を有する、請求項16に記載の薬剤。
  18. 内皮標的細胞、細胞傷害性CD8+Tリンパ球及びCD34陰性間葉系幹細胞を含むサンプルと、内皮標的細胞及び細胞傷害性CD8+Tリンパ球を含み、CD34陰性間葉系幹細胞を含まない参照サンプルとを調製することと、該サンプル及び該参照サンプルにおける内皮標的細胞の溶解を比較することとによる、CD8+細胞傷害性Tリンパ球に媒介される細胞傷害性反応から血管内皮を保護するCD34陰性間葉系幹細胞の能力を決定する方法。
  19. 内皮標的細胞及び前記CD8+Tリンパ球を含む、前記サンプルと前記参照サンプルとを調製する前に、インターロイキン-2の存在下で、前記CD8+Tリンパ球を同種内皮細胞と共存培養する、請求項18に記載の方法。
  20. 少なくとも1つの更なる薬理活性成分を、前記サンプル及び／又は前記参照サンプルに添加する、請求項18又は19に記載の方法。
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