ES2296413T3

ES2296413T3 - Regulacion de la diferenciacion de celulas madre hematopoyeticas por el uso de celulas madre mesenquimaticas humanas.

Info

Publication number: ES2296413T3
Application number: ES99955496T
Authority: ES
Inventors: Mark A. Thiede; Gabriel Mbalaviele
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2019-06-08
Also published as: EP1084230A2; CA2680649A1; CA2330190C; WO1999064565A3; JP2003505006A; CA2330190A1; WO1999064565A9; US6255112B1; DE69937347T2; WO1999064565A2; AU4336499A; ATE375799T1; CY1107121T1; PT1084230E; EP1084230B1; DE69937347D1; DK1084230T3

Abstract

Un método para producir osteoclastos in vitro que comprende co-cultivar células madre mesenquimáticas con células madre hematopoyéticas de modo que las células madre hematopoyéticas produzcan osteoclastos.

Description

Regulación de la diferenciación de células madre hematopoyéticas por el uso de células madre mesenquimáticas humanas.

La presente invención se refiere a células madre hematopoyéticas y más particularmente a un proceso y composición para diferenciar células madre hematopoyéticas humanas en un linaje de osteoclastos comprometido en ausencia de factores inductores exógenos de la osteoclastogénesis. La presente invención se refiere adicionalmente a células madre hematopoyéticas modificadas genéticamente en presencia de células madre mesenquimáticas humanas, de modo que cuando las células madre hematopoyéticas se diferencian en osteoclastos, los osteoclastos sean capaces de expresar el producto del gen introducido por transducción.

Antecedentes de la invención

Los osteoclastos son células hematopoyéticas diferenciadas de forma terminal responsables de la resorción ósea fisiológica. La disfunción en la diferenciación y/o actividad de los osteoclastos es la causa de una diversidad de enfermedades óseas metabólicas humanas incluyendo la osteoporosis (para una revisión véase Teitelbaum et al., 1995). La osteoporosis, o pérdida ósea progresiva, se atribuye a un cambio en el equilibrio crítico de las actividades de los osteoclastos y los osteoblastos responsable de la integridad apropiada del esqueleto. Los osteoblastos, que construyen los huesos, son un linaje diferenciado de forma terminal que desciende de células madre mesenquimáticas.

Los progenitores hematopoyéticos de la médula ósea se dirigen al linaje celular de osteoclastos bajo la influencia de factores reguladores locales. Están presentes diversos tipos celulares incluyendo células estromales, que surgen de células madre mesenquimáticas (MSC), en la médula ósea. Las células estromales han demostrado producir factores que regulan la fisiología de los osteoclastos (para una revisión véase Mundy et al., 1995). Las imágenes histológicas de hueso muestran una estrecha cercanía entre células estromales medulares y células hematopoyéticas. Además, la relación entre el estado diferenciado de las células estromales de médula ósea y su potencial para regular los progenitores de osteoclastos adyacentes está mal documentada. Se ha informado de la importancia de las interacciones célula-célula heterotípicas mediadas por la cadherina-6 entre células estromales y progenitores de osteoclastos usando un modelo de ratón de osteoclastogénesis (Mbalaviele et al., 1998). Varios estudios demostraron que la diferenciación de osteoclastos requería la presencia de células estromales/osteoblastos (Takahashi et al., 1988; Mbalaviele et al., 1995). Recientes estudios usando células derivadas de médula de roedor han demostrado que el ligando osteoprotegerina (OPGL) expresado en la membrana de células estromales es un factor clave de la osteoclastogénesis (Lacey et al. 1998; Kong et al. 1999). Sin embargo, también se ha informado de que las células osteoclásticas humanas se diferenciaban a partir de células progenitoras en presencia de cócteles de citoquinas y que las células estromales no eran necesarias (Matayoshi et al., 1996). Se ha informado de la formación de células osteoclásticas humanas (Ocl) que presentaban actividad de resorción ósea. (Takahashi et al., 1995; James et al., 1996; Sarma et al., 1996; Quinn et al., 1997), sin embargo, no están claros acontecimientos críticos que tienen lugar durante la
osteoclastogénesis.

Además, estudios han demostrado que los osteoclastos se generan en co-cultivos de osteoblastos/células estromales con células hematopoyéticas (Martin y Ng., Journal of Cellular Biochemistry 56, páginas 357 a 366 (1994)).

El hueso es una matriz compuesta constituida de elementos tanto inorgánicos como orgánicos. La fase orgánica contiene proteínas, mientras que el componente inorgánico contiene sales de calcio. Se sabe que durante la resorción ósea osteoclástica, la disolución de la fase inorgánica precede la de la fase orgánica y que se liberan elevadas concentraciones de calcio (>40 mM) de forma local desde la matriz ósea. A su vez, concentraciones de calcio aumentadas tienen un retorno negativo sobre la función de los osteoclastos, un mecanismo regulador para evitar la resorción ósea excesiva. Se sabe que el calcio regula la expresión de varios genes. Recientemente, se ha caracterizado un elemento de respuesta a calcio que potencia la expresión génica de queratina-1 humana después de la exposición de queratinocitos a calcio extracelular (0,6 mM).

Los osteoclastos no se aíslan fácilmente debido a su baja cantidad celular in vivo, su fragilidad y tendencia a adherirse a otras células óseas. Por tanto, existe una necesidad de un método para producir de forma eficaz cantidades de osteoclastos para facilitar, por ejemplo, el diseño de compuestos terapéuticos eficaces dirigidos a prevenir la osteolisis anormal.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método eficaz para producir osteoclastos in vitro.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para producir y mantener osteoclastos in vitro sin la adición de factores de crecimiento exógenos en cantidades suficientes para proporcionar una fuente en desarrollo de osteoclastos, por ejemplo, para administrar osteoclastos a un individuo que lo necesite.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es regular la diferenciación de células madre hematopoyéticas hacia células osteoclásticas en ausencia de factores de crecimiento, citoquinas y hormonas exógenos.

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Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar un método para producir osteoclastos a partir de células hematopoyéticas modificadas genéticamente de modo que cuando las células hematopoyéticas se diferencian en osteoclastos, los osteoclastos expresen en producto génico de interés.

Sumario de la invención

En la presente invención se ha descubierto que las células madre mesenquimáticas soportan la diferenciación celular en osteoclastos de células madre hematopoyéticas.

Por tanto, en un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para inducir la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas in vitro en células osteoclásticas, que comprende co-cultivar las células hematopoyéticas con células madre mesenquimáticas humanas.

Cuando las células progenitoras hematopoyéticas se co-cultivaron con células madre mesenquimáticas, las células progenitoras hematopoyéticas se diferenciaron hacia células osteoclásticas que se identificaron por la expresión de marcadores característicos de osteoclastos incluyendo multinuclearidad, receptores de calcitonina y vitronectina, y más importante, actividad de resorción ósea.

Se ha descubierto adicionalmente que la diferenciación de las células madre hematopoyéticas sucedía en ausencia de factores de crecimiento, citoquinas y hormonas exógenos (añadidos) que se sabe que son necesarios para inducir la diferenciación de células madre hematopoyéticas.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un método para producir osteoclastos in vitro que comprende co-cultivar células madre hematopoyéticas con células madre mesenquimáticas humanas. En una realización preferida, las células se co-cultivan en el mismo recipiente de cultivo de modo que sucedan interacciones célula-célula físicas entre las células progenitoras hematopoyéticas y las células madre mesenquimáticas.

También se ha descubierto que cuando las células madre hematopoyéticas, que se han modificado para portar material genético exógeno de interés, se co-cultivan con células madre mesenquimáticas, las células madre hematopoyéticas transducidas se diferenciaban en osteoclastos que también portaban el nuevo material genético. Estas células osteoclásticas transducidas son capaces de expresar el producto génico exógeno. Los progenitores osteoclásticos transducidos y los osteoclastos diferenciados a partir de los mismos pueden usarse para aplicaciones donde es beneficioso el tratamiento usando dichos osteoclastos modificados, por ejemplo, en el alivio de los efectos de la
osteoporosis.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para obtener osteoclastos modificados genéticamente, que comprende transducir células progenitoras hematopoyéticas con material genético exógeno y colocar las células hematopoyéticas transducidas en condiciones adecuadas para la diferenciación de las células madre hematopoyéticas en células osteoclásticas que contienen el material genético exógeno.

En una realización, el método para producir osteoclastos comprende co-cultivar células madre hematopoyéticas transducidas con células madre mesenquimáticas de modo que después de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas en osteoclastos, los osteoclastos también contengan el material genético exógeno.

La invención se refiere adicionalmente a células madre hematopoyéticas que se transducen con un polinucleótido que codifica un producto que regula negativamente la diferenciación y/o actividad de los osteoclastos, y el uso de los mismos.

En una realización particularmente preferida, el producto génico expresado regula negativamente la diferenciación y/o actividad de los osteoclastos. Las células madre hematopoyéticas se transducen con un vector retroviral que contiene un tándem de un elemento de respuesta a calcio, el promotor de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) (específicamente expresado en osteoclastos) y una secuencia de ácido nucleico que codifica un factor de actividad anti-osteoclastos (por ejemplo, una secuencia antisentido a M-CSF, IL1 o IL6; un inhibidor tal como un anticuerpo intracelular contra IL6, contra M-CSF, contra GM-CSF, contra IL1, o contra el Factor Inhibidor de Leucemia; o, un factor apoptótico). La expresión de esta secuencia se desencadena por el aumento local en la concentración de calcio debido a la resorción ósea osteoclástica.

Se ha descubierto adicionalmente que aunque las células madre mesenquimáticas regulaban positivamente la diferenciación de células progenitoras CD34^{+} hacia células osteoclásticas, las MSC que habían comenzado la diferenciación en células osteoblásticas inhibían este proceso. En presencia de células madre mesenquimáticas osteogénicas, los niveles de expresión de OPGL disminuían y se descubrió que la expresión de osteoprotegerina (OPG) aumentaba. Por tanto, también se contempla que el cultivo de células madre hematopoyéticas en presencia de células madre mesenquimáticas diferenciadas puede servir para regular negativamente la diferenciación y/o actividad de los osteoclastos. Por consiguiente, las poblaciones celulares co-cultivadas de la invención pueden usarse como parte de un tratamiento para aliviar los síntomas de la osteoporosis.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra la tinción TRAP de células CD34^{+} cultivadas en ausencia de células madre mesenquimáticas (MSC).

La Figura 1B muestra la tinción TRAP de células CD34^{+} cultivadas en presencia de MSC. Se formaron muchas células TRAP^{+} multinucleadas (TRAP+MNC) (flecha) así como células TRAP^{+} mononucleadas en presencia de MSC que aparecen como una capa confluyente de células con forma de huso (cabeza de flecha). Las flechas pequeñas y el asterisco indican grupos de núcleos.

La Figura 1C muestra la tinción de células CD34^{+} cultivadas en presencia de fibroblastos cutáneos humanos (células SK1087; cabeza de flecha). No se formaron TRAP+MNC.

La Figura 1D muestra la tinción de células CD34^{+} cultivadas en presencia de células renales humanas (293T; cabeza de flecha). No se formaron TRAP+MNC.

La Figura 2A muestra la tinción inmunocitoquímica de co-cultivos de CD34^{+} y MSC con anticuerpos de control negativo.

La Figura 2B muestra la tinción inmunocitoquímica de co-cultivos de CD34^{+} y MSC con anticuerpos que reconocen el receptor de vitronectina.

La Figura 3 muestra la RT-PCR de ARN purificado a partir de co-cultivos de MSC y células CD34^{+} (carriles 2-3) o cultivos de MSC sin células CD34^{+} (carriles 4-5). Los receptores de calcitonina (carriles 2 y 4) y TRAP (carriles 3 y 5) solamente se detectaron en muestras de co-cultivos de MSC y células CD34^{+}. La región conservada y no sometida a corte y empalme de la familia del receptor de calcitonina se eligió para diseñar cebadores. Carril 1, ADN ladder de 1 kb; parte inferior, \beta2-microglobulina.

La Figura 4A muestra la formación de orificios en co-cultivos de células CD34^{+} y MSC (flechas).

La Figura 4B muestra la formación de orificios en cultivos de células CD34^{+} sin MSC. Se tiñeron cortes con azul de toluidina y se visualizaron en microscopía óptica. Aumento X200.

La Figura 4C muestran la cuantificación de orificios en co-cultivos de células CD34^{+} y MSC (barra cerrada) o en cultivos de células CD34^{+} sin MSC (barra abierta). *p<0,01 frente a cultivos de células CD34^{+} sin MSC.

La Figura 5A muestra los efectos de las interacciones célula-célula en la formación de células osteoclásticas. Las células CD34^{+} y MSC se co-cultivaron en los mismos compartimientos (co-cultivos de contacto, barra cerrada) o separadas mediante filtros de 0,45 \mum (co-cultivos sin contacto): MSC en la parte superior y células CD34^{+} en la parte inferior, barra abierta; MSC en la parte inferior y células CD34^{+} en la parte superior, barra discontinua. *p<0,01 frente a co-cultivos sin contacto.

La Figura 5B muestra la cuantificación de factores secretados (IL-6, IL-11, LIF) en co-cultivos de células CD34^{+} con MSC. Los niveles de IL-6 y LIF pero no de IL-11 fueron aproximadamente 10 veces superiores en co-cultivos de MSC y células CD34^{+} en comparación con cultivos de MSC sin células CD34^{+}.

La Figura 6A y 6B muestra la inhibición de TRAP+MNC por MSC osteogénicas. La diferenciación osteogénica de MSC se indujo por el tratamiento con suplemento osteogénico (OS) durante 2, 3, 4, 5, 10 ó 13 días antes de añadir células CD34^{+}. *p<0,01 frente a co-cultivos de MSC tratadas con OS y células CD34^{+}.

La Figura 6C muestra que co-cultivos de MSC y células CD34^{+} producían niveles mayores de IL-6, IL-11 y LIF que co-cultivos de MSC osteogénicas y células CD34^{+}.

La Figura 6D muestra que la diferenciación osteogénica de MSC está asociada con una disminución en la expresión de ARNm de OPGL (panel izquierdo) y un aumento en la expresión de ARNm de OPG (panel derecho).

La Figura 7A muestra el análisis de citometría de flujo de células CD34^{+} transducidas con vector de control.

La Figura 7B muestra el análisis de citometría de flujo de células CD34^{+} transducidas con el vector de expresión de EGFP. Aproximadamente el 30% de las células CD34^{+} expresaba EGFP.

La Figura 7C muestra co-cultivos de MSC con células CD34^{+} transducidas con el vector de expresión de EGFP. EGFP se expresaba por osteoclastos así como por células mononucleadas.

La Figura 7D muestra co-cultivos de MSC con células CD34^{+} transducidas con el vector de expresión de EGFP teñidas para TRAP. La Fig. 7D es la vista aclarada de la Fig. 7C.

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La Figura 8A muestra la expresión del receptor de vitronectina (\alpha_{v}\beta_{3}) detectada por ELISA. Anticuerpo \alpha_{v}\beta_{3}, pocillos de la izquierda y barra cerrada; IgG de control, pocillos de la derecha y barra abierta.

La Figura 8B muestra la expresión en el transcurso del tiempo de \alpha_{v}\beta_{3}. Co-cultivos de células CD34^{+} y MSC (barras cerradas) o MSC sin células CD34^{+} (barras abiertas).

La Figura 9A muestra una estrategia para la regulación directa de la actividad de los osteoclastos.

La Figura 9B muestra que la adición de calcio a células cultivadas transfectadas con un sistema de expresión inducible con calcio inducía la expresión del gen informador.

La Figura 10 muestra el efecto de suero en medio de cultivo sobre la producción de osteoclastos en co-cultivos de MSC y células CD34^{+}.

La Figura 10A muestra las cantidades de osteoclastos en co-cultivos de células CD34^{+} y MSC en DMEM de bajo contenido de glucosa con FBS al 10%, barra abierta; y en DMEM de elevado contenido de glucosa sin suero, barra sólida.

La Figura 10B muestra co-cultivos de células 293 y células CD34^{+} en DMEM de elevado contenido de glucosa con FBS al 10%, barra sólida, y en DMEM de elevado contenido de glucosa sin suero, barra discontinua.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere en líneas generales al uso de células madre mesenquimáticas humanas para inducir la diferenciación de células CD34^{+} humanas en células osteoclásticas y composiciones que comprenden células CD34^{+} humanas y células madre mesenquimáticas humanas. Más particularmente, se ha descubierto que células madre mesenquimáticas humanas cultivadas en asociación con células CD34^{+} son útiles para inducir la diferenciación de células CD34^{+} en osteoclastos. Por tanto, las células CD34^{+} pueden mantenerse y utilizarse como una fuente de osteoclastos.

Para obtener células madre mesenquimáticas humanas objeto para los métodos descritos en este documento, pueden recuperarse células madre mesenquimáticas de la médula ósea u otra fuente de células madre mesenquimáticas. Las células de médula ósea pueden obtenerse de la cresta ilíaca, los fémures, las tibias, la columna, las costillas u otros espacios medulares. Otras fuentes de células madre mesenquimáticas humanas incluyen la placenta, el cordón umbilical, piel fetal y adolescente, y sangre. La presencia de células madre mesenquimáticas en las colonias de cultivo puede verificarse por marcadores de superficie celular específicos que se identifican con anticuerpos monoclonales únicos, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. Esta población de células mesenquimáticas aislada presenta características epitópicas asociadas solamente con células madre mesenquimáticas, tiene la capacidad de regenerarse en cultivo sin diferenciación y tiene la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimáticos específicos cuando se inducen in vitro o in vivo en el sitio de tejido dañado. Se sabe que las células madre mesenquimáticas humanas se diferencian en las condiciones apropiadas en múltiples linajes celulares, incluyendo osteoblastos, adipocitos y condrocitos (para una revisión véase Caplan et al., 1997).

Por consiguiente, puede utilizarse cualquier proceso que sea útil para recuperar células madre mesenquimáticas de tejido humano para obtener una población de células que comprenda células madre mesenquimáticas enriquecidas. En un aspecto, el método para aislar células madre mesenquimáticas humanas comprende las etapas de proporcionar una muestra tisular que contenga células madre mesenquimáticas, preferiblemente médula ósea; aislar las células madre mesenquimáticas de la muestra, por ejemplo, por centrifugación de densidad; añadir las células aisladas a un medio que contenga factores que estimulen el crecimiento de células madre mesenquimáticas sin diferenciación, y permita la adherencia selectiva de solamente las células madre mesenquimáticas a una superficie de sustrato en cultivo; cultivar la mezcla muestra-medio; y retirar la materia no adherente de la superficie de sustrato.

En un aspecto adicional de la presente invención, puede utilizarse cualquier proceso que sea útil para recuperar células madre hematopoyéticas de tejido humano para producir una población de células compuesta principalmente de células hematopoyéticas. Las células madre pueden recuperarse de diversos tipos de tejido tal como médula ósea y sangre, incluyendo sangre periférica. Las células madre hematopoyéticas humanas pueden recogerse de aspirados de médula ósea o sangre periférica y aislarse usando anticuerpos disponibles en el mercado que se unen a antígenos superficiales de células madre hematopoyéticas, por ejemplo CD34, usando métodos conocidos para los especialistas en la técnica, véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 4.714.680. Como alternativa, las células madre hematopoyéticas pueden recuperarse por eliminación, es decir, seleccionando células que expresen marcadores encontrados en otras células. Los anticuerpos usados para estos procedimientos pueden conjugarse a perlas magnéticas y pueden utilizarse procedimientos inmunogénicos para recuperar el tipo celular deseado.

Las células madre mesenquimáticas humanas y las células madre hematopoyéticas se co-cultivan en condiciones de cultivo apropiadas de modo que las células madre mesenquimáticas se adhieran a una superficie de sustrato y formen una monocapa. Las células madre mesenquimáticas se siembran en placas a una densidad en un intervalo de aproximadamente 3 x 10^{3} a aproximadamente 5 x 10^{3} células por cm^{2}. Las células CD34^{+} están preferiblemente a una densidad celular de aproximadamente 5 x 10^{4} células por cm^{2}.

De acuerdo con el método de la presente invención, las células madre mesenquimáticas aisladas y las células progenitoras hematopoyéticas aisladas, preferiblemente células CD34^{+}, se expanden cada una en cultivo en medios apropiados, es decir, se cultivan por métodos que usan condiciones que son evidentes para los especialistas en la técnica que favorecen el crecimiento celular y la producción de poblaciones celulares homogéneas.

Las dos poblaciones celulares después se co-cultivan en un medio que promueve el crecimiento de las células madre mesenquimáticas humanas y no afecta de forma adversa al mantenimiento de las células madre hematopoyéticas. Los medios deben también sostener la población de células CD34^{+} y soportar la inducción de la diferenciación de células CD34^{+} en células osteoclásticas. Los medios adecuados se describen por ejemplo en la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359.

En una realización preferida, las células madre mesenquimáticas humanas y las células madre hematopoyéticas se co-cultivan en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco de Bajo Contenido en Glucosa (DMEM-LG Nº 11885 Life Technologies, Gaithersburg, MD). El medio contiene preferiblemente FBS al 10%. En una realización particularmente preferida, las células madre mesenquimáticas humanas y las células madre hematopoyéticas se co-cultivan en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco de Elevado Contenido en Glucosa (DMEM-HG Nº 11995 Life Technologies, Gaithersburg, MD) sin FBS.

Las células madre hematopoyéticas producidas de acuerdo con los métodos descritos en este documento pueden usarse para proporcionar una fuente fiable y constante de células osteoclásticas. Estos osteoclastos podrían usarse en la determinación de los efectos de factores osteotrópicos sobre el desarrollo y tratamiento de la osteoporosis. Se contempla que un suministro preparado de osteoclastos sería útil para ensayos de exploración para el desarrollo de fármacos de molécula pequeña, por ejemplo, basados en la expresión del receptor de superficie celular de integrina \alpha_{v}\beta_{3} por los osteoclastos. Se cree que estas células, que no se han tratado con factores de crecimiento in vitro, tendrán características más parecidas a los osteoclastos encontrados in vivo que las que se han obtenido hasta
ahora.

Después de la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas en células osteoclásticas como se describe en este documento, la mezcla de células progenitoras hematopoyéticas, osteoclastos y células madre mesenquimáticas puede separarse para obtener una población de células compuesta en gran medida por las células osteoclásticas. Esto puede conseguirse por selección positiva y/o negativa de células hematopoyéticas usando anticuerpos para identificar marcadores superficiales de células hematopoyéticas u otros marcadores de tipo celular.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la introducción de genes foráneos en las células progenitoras hematopoyéticas de modo que la descendencia de las células, los osteoclastos, porten el nuevo material genético.

Por tanto, de acuerdo con este aspecto de la invención, las células progenitoras hematopoyéticas pueden modificarse con material genético de interés. Las células CD34^{+} modificadas después pueden co-cultivarse in vitro con células madre mesenquimáticas e introducirse para diferenciarse en células osteoclásticas. Las células osteoclásticas son capaces de expresar el producto de la expresión génica o secretar el producto de expresión. Estas células modificadas después pueden administrarse a un tejido diana, por ejemplo, médula ósea, donde el producto expresado tendrá un efecto beneficioso.

Las células progenitoras hematopoyéticas transducidas pueden inducirse in vivo a diferenciarse en osteoclastos que expresarán el producto génico. Por ejemplo, las células progenitoras hematopoyéticas transducidas en combinación con células madre mesenquimáticas pueden administrarse para inducir la producción de osteoclastos que tienen el gen introducido por transducción. Las células pueden administrarse en mezcla entre sí o por separado y pueden suministrarse a un área diana.

Por tanto, los genes pueden introducirse en células que después se devuelven al donante antólogo o un receptor alogénico donde la expresión del gen tendrá un efecto terapéutico. Por ejemplo, los osteoclastos pueden modificarse genéticamente para que tengan actividad reducida in vivo. Los genes apropiados incluirían los que desempeñan un papel en la regulación de la osteoporosis, en áreas tales como sensibilidad a calcio sérico, secreción de estrógenos y resorción ósea.

Las células madre hematopoyéticas pueden modificarse genéticamente (transducirse o transformarse o transfectarse) en presencia de las células madre mesenquimáticas humanas, donde las células madre mesenquimáticas aumentan la eficacia de la transducción génica de las células madre hematopoyéticas. Como alternativa, las células madre hematopoyéticas pueden transducirse en ausencia de las células madre mesenquimáticas humanas.

Las células madre hematopoyéticas pueden modificarse genéticamente por incorporación de material genético en las células, por ejemplo usando vectores de expresión recombinantes.

Como se usa en este documento "vectores de expresión recombinantes" se refiere a una unidad transcripcional que comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de inicio y terminación de la transcripción. Las unidades estructurales pretendidas para su uso en sistemas de expresión eucariotas preferiblemente incluyen una secuencia líder que posibilita la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. Como alternativa, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un resto de metionina N-terminal. Este resto puede o no escindirse posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

Las células progenitoras hematopoyéticas humanas, por tanto, pueden haber integrado de forma estable una unidad transcripcional recombinante en el ADN cromosómico o portar la unidad transcripcional recombinante como un componente de un plásmido residente. Las células pueden modificarse con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo, por ejemplo. Las células pueden modificarse por procedimientos conocidos en la técnica por el uso de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido.

Los retrovirus de los que pueden obtenerse los vectores plasmídicos retrovirales mencionados anteriormente en este documento incluyen, aunque sin limitación, Virus de la Leucemia Murina de Moloney, virus de necrosis esplénica, retrovirus tales como Virus del Sarcoma de Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia del gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, Virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus de tumores mamarios. En una realización, el vector plasmídico retroviral es MGIN, derivado de células madre embrionarias murinas. Respecto a la transferencia génica mediada por retrovirus en líneas generales, véase McLachlin et al. (1990).

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, aunque sin limitación, el promotor de TRAP, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral; el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de la metalotioneína; promotores de choque térmico; el promotor de la albúmina; el promotor de ApoAI; promotores de globina humana; promotores de la timidina quinasa viral, tal como el promotor de la timidita quinasa del virus del Herpes Simple; LTR retrovirales; ITR; el promotor de la \beta-actina; y promotores de la hormona del crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla el gen que codifica el polipéptido. Estos vectores también hacen posible regular la producción del polipéptido por las células progenitoras modificadas. Por ejemplo, para propósitos de la presente invención, el vector puede contener un elemento de respuesta a calcio. La selección de un promotor adecuado será evidente para los especialistas en la técnica.

También es posible usar vehículos diferentes a retrovirus para diseñar o modificar genéticamente las células madre hematopoyéticas. La información genética de interés puede introducirse mediante cualquier virus que pueda expresar el nuevo material genético en dichas células. Por ejemplo, pueden usarse SV40, herpesvirus, adenovirus y papilomavirus humanos para este propósito. También pueden usarse métodos para introducir ADN eucarióticos clonados en células de mamífero cultivadas, por ejemplo, el material genético a transferirse a células madre puede estar en forma de ácidos nucleicos virales.

Además, los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células transformadas tales como resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina.

Las células progenitoras hematopoyéticas pueden transfectarse a través de otros medios conocidos en la técnica. Dichos medios incluyen, aunque sin limitación, transfección mediada por fosfato cálcico o DEAE-dextrano; transfección mediada por el policatión Polibreno; fusión de protoplastos; electroporación; liposomas, a través de encapsulación de ADN o ARN en liposomas, seguido por la fusión de los liposomas con la membrana celular o, puede introducirse ADN recubierto con un lípido catiónico sintético en células por fusión.

Es posible modificar genéticamente células progenitoras hematopoyéticas humanas de tal modo que produzcan, in vitro o in vivo,osteoclastos que produzcan polipéptidos, hormonas y proteínas no producidas normalmente en osteoclastos humanos en cantidades biológicamente significativas o producidas en pequeñas cantidades pero en situaciones en las que la expresión reguladora conduciría a un beneficio terapéutico. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas podrían modificarse con un gen que exprese una molécula que inhiba específicamente la resorción ósea, pero que por lo demás no impida la unión de los osteoclastos al hueso. Como alternativa, las células podrían modificarse de modo que una proteína normalmente expresada se expresara a niveles mucho menores. Estos productos después se secretarían en los medios adyacentes o se purificarían de las células. Las células osteoclásticas humanas formadas de este modo pueden servir como sistemas de producción continua a corto o largo plazo de la sustancia
expresada.

Esta tecnología puede usarse para producir copias adicionales de genes esenciales para permitir la expresión aumentada por los osteoclastos de ciertos productos génicos in vivo. Estos genes pueden ser, por ejemplo, hormonas, proteínas de matriz, proteínas de membrana celular, citoquinas, moléculas de adhesión, proteínas de "reconstrucción" importantes en la reparación de tejidos. La expresión del material genético exógeno in vivo, a menudo se menciona como "terapia génica". Las patologías y procedimientos para los que tienen aplicación dichos tratamientos incluyen trastornos y enfermedades genéticas del sistema óseo y el inmune. El suministro celular de las células transformadas puede realizarse usando diversos métodos e incluye la infusión e inyección directa prolongada en sitios del periostio, de la médula ósea y subcutáneos.

Además, como se ha descrito anteriormente en este documento, las células transducidas pueden usarse para la producción in vitro de proteína(s) deseada(s). Las células transducidas pueden usarse adicionalmente en ensayos de exploración para el descubrimiento de fármacos.

En una realización preferida, las células madre hematopoyéticas se transducen con un vector retroviral que contiene un elemento de respuesta a calcio, el promotor de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y un ADNc que codifica un factor anti-osteoclastos.

Después de la modificación de las células hematopoyéticas como se ha descrito en este documento y la inducción de la diferenciación en osteoclastos, la mezcla de células hematopoyéticas, osteoclastos y células madre mesenquimáticas puede separarse para obtener una población de células en gran medida compuesta por los osteoclastos transducidos. Esto puede conseguirse por selección positiva y/o negativa de las células hematopoyéticas transducidas usando anticuerpos para identificar marcadores superficiales de células hematopoyéticas.

La descripción anterior de la invención y los siguientes ejemplos son solamente a modo de ilustración. Los especialistas en la técnica preverán fácilmente otras permutaciones y prácticas de la invención en vista de lo anterior junto con los dibujos adjuntos. Por lo tanto, dichas permutaciones y variaciones están dentro del alcance de la presente invención.

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Ejemplos

Análisis Estadístico Todos los datos se analizaron por un ensayo t para muestras relacionadas. Las muestras se procesaron por triplicado y los datos mostrados eran medias + SE.

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Ejemplo 1

Aislamiento de Células Se recogieron muestras de médula ósea de donantes humanos sanos en la Johns Hopkins University según un protocolo aprobado por el Institutional Review Board. Las células madre mesenquimáticas (MSC) se aislaron y se cultivaron de acuerdo con métodos conocidos (Majumdar et al., 1998). Cuando los cultivos alcanzaron un 90% de confluencia, las células adherentes se recuperaron por la adición de una solución que contenía tripsina al 0,25%-EDTA (Life Technologies) y se volvieron a sembrar a una densidad de 1 x10^{6} células por matraz de 185 cm^{2} como células de pase 1.

Las células CD34^{+}, aisladas de médula ósea de pacientes sanos se obtuvieron de Poietic Technologies, Gaithersburg, MD. Se inmunopurificaron a un 95% de pureza usando anticuerpos contra CD34 conjugados a perlas magnéticas (columna de separación de células CD34^{+}: Miltenyi Biotec, Auburn, CA Ab:QBEND.10) y se crioconservaron.

Co-cultivos Se sembraron MSC de pase temprano (2 a 3) en placas a 3 x 10^{3} células por cm^{2} y se cultivaron hasta sub-confluencia en DMEM LG+FBS al 10%. Las células CD34^{+} después se añadieron a 5 x 10^{4} células por cm^{2} a cultivos de MSC. Los cultivos se mantuvieron durante 3 semanas a 37ºC en una atmósfera del 95% de aire/5% de CO_{2} y se alimentaron cada tres días con el medio. Como la mayoría de las células CD34^{+} permanecían no adherentes, la mitad del medio de cultivo se aspiraba suavemente sin agitar las células no adherentes y se remplazaba con medio reciente.

Tinción TRAP Después de tres semanas, las células se fijaron en acetona al 60% en tampón citrato (pH 5,4) durante 30 segundos, se lavaron dos veces con agua destilada, se secaron al aire, y se tiñeron para fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP), un marcador citoquímico ampliamente usado de osteoclastos de ratón (Wijngaert y Burger, 1986), usando un kit disponible en el mercado (Sigma, St. Louis, MO). Los cultivos teñidos se examinaron en microscopía óptica a un aumento de X200. Se contaron los osteoclastos multinucleados (tres o más núcleos) TRAP-positivos (tinción roja) en cada pocillo por exploración manual a través del pocillo completo de un modo sistemático (Mbalaviele et al., 1998).

Las células CD34^{+} cultivadas en ausencia de MSC o citoquinas/factores de crecimiento no lograron formar células multinucleadas que expresaran fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP+MNC) (Figura 1A). Las MSC soportaban la diferenciación de células CD34^{+} co-cultivadas hacia células osteoclásticas (Figura 1B). En contraste, los fibroblastos cutáneos humanos (células SK1087) o células renales humanas (293T) no lograban soportar la formación de TRAP+MNC (Figuras 1C y 1D, respectivamente). El tratamiento de células CD34^{+} con IL-1, IL-3 y GM-CSF en ausencia de MSC produjo la formación de células osteoclásticas, pero las cantidades de estas células fueron inferiores en comparación con las presentes en co-cultivos de CD34^{+}/MSC (datos no mostrados).

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Ejemplo 2

Inmunocitoquímica Se fijaron las células CD34^{+} y MSC co-cultivadas durante tres semanas con una solución reciente de formaldehído al 3,7% (p./vol.) en PBS, se bloquearon con suero de caballo al 1,5%, se incubaron con el anticuerpo monoclonal contra integrina humana \alphav\beta3 (Dr. Horton, The Rayne Institute, Londres, Inglaterra) a dilución 1:50 en PBS que contenía suero de caballo al 0,15%. Las células después se incubaron con anticuerpo secundario de cabra conjugado con glucosa oxidasa usando el kit Vectastain ABC-GO (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente durante 30 minutos seguidas de lavado 3 veces con PBS. Los resultados se muestran en la Figura 2. Las células osteoclásticas (flecha negra) y sus precursores (cabeza de flecha) se tiñeron por el anticuerpo contra receptores de vitronectina pero no por el anticuerpo de control. Las MSC no mostraron ninguna tinción con el anticuerpo contra receptor. Se observaron células multinucleadas que expresan bajos niveles de receptores de vitronectina en co-cultivos (Figura 2B, flecha blanca).

Preparación de ARN y RT-PCR Se extrajo el ARN total de cultivos de MSC o co-cultivos de CD34^{+} y MSC usando el kit High Pure RNA Isolation adquirido de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). La PCR se realizó durante 30 ciclos sobre ADNc monocatenario transcrito de forma inversa de las preparaciones de ARN total (1 \mug) usando el método GeneAmp RT-PCR según las condiciones descritas por el proveedor (Perkin Elmer, Foster City, CA) con las siguientes modificaciones: desnaturalización a 95ºC durante 20 segundos, hibridación a 55ºC durante 20 segundos, polimerización a 72ºC durante 30 segundos y elongación a 72ºC durante 10 minutos. Los cebadores cadena arriba y cadena abajo, respectivamente, se diseñaron del siguiente modo: TRAP: 5'-CGATCACAATCTGCAGTACC-3' (SEC ID Nº 1) y 5'-ACCCAGTGAGTCTTCAGTCC-3' (SEC ID Nº 2), tamaño de producto de PCR = 150 pb; receptor de calcitonina (CTR): 5'-TTTCCAGGGCTTCTTTGTT-3' (SEC ID Nº 3) y 5'-CTTGGTTGTTGGCTGGTTC-3' (SEC ID Nº 4), tamaño de producto de PCR = 205 pb. Los productos de PCR se fraccionaron por tamaño por electroforesis en gel de agarosa al 1%.

El análisis de RT-PCR mostró la expresión de TRAP y receptores de calcitonina por células derivadas de células CD34^{+}, el linaje de los osteoclastos (Carriles 2 y 3 de la Figura 3). Estas proteínas no se expresaron por las
MSC.

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Ejemplo 3

Ensayo de formación de orificios Para confirmar adicionalmente la presencia de células osteoclásticas en los cultivos, se examinó la capacidad de las células producidas en co-cultivos de células CD34^{+} y MSC de formar orificios, una indicación de resorción ósea osteoclástica. Se esterilizaron cortes de colmillo de elefante ablandados con etanol de graduación del 100%, se secaron al aire y se lavaron varias veces con PBS. Las MSC se sembraron a 3 x 10^{3} células por cm^{2} en los cortes de colmillo (4 x 4 x 0,1 mm) en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante una semana en medio hMSC pH 7,4. Después se añadieron células CD34^{+} a 5 x 10^{4} células por cm^{2}. Se usaron discos osteoclásticos, análogos artificiales de hueso (Millenium Biologix Inc., Ontario, Canadá) para establecer las condiciones óptimas del ensayo. Al final del periodo de cultivo de tres semanas, se tiñeron las células de los cortes para TRAP, se contaron, después se retiraron con NaOH 0,1 M en agua seguido por ultrasonicación durante 2 minutos. Los cortes de hueso se tiñeron durante 5 minutos con azul de toluidina al 1% preparado en agua destilada que contenía borato sódico al 1%. Se contaron las cantidades de orificios en un microscopio óptico como se ha descrito previamente (Prallet et al., 1992). Se encontraron auténticos orificios de resorción sobre el análogo óseo así como sobre los cortes de colmillo de elefante cuando se co-cultivaron células CD34^{+} con MSC (Figura 4).

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Ejemplo 4

Efectos de interacciones célula-célula Las células CD34^{+} y MSC se cultivaron en el mismo compartimiento (co-cultivos de contacto) o en dos compartimientos diferentes (co-cultivos sin contacto) separados por insertos de prueba de cultivo con una membrana porosa de 0,45 \mum (Becton Dickinson, Bedford, MA) para investigar las interacciones físicas célula-célula. Los resultados mostrados en la Figura 5A indicaron que se formaban células osteoclásticas en los cultivos de contacto, y había aproximadamente dos tercios menos de células osteoclásticas en cultivos sin contacto, independientemente de en qué compartimiento (superior o inferior) se sembraban las MSC o células
CD34^{+}.

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Ejemplo 5

Interacciones a través de factores secretados Las células CD34^{+} se co-cultivaron con MSC. Se recogieron medios condicionados después de dos días desde el cultivo de MSC en ausencia o presencia de células CD34^{+}. Se midieron los niveles de proteína de citoquinas IL-1\alpha, IL-6, IL-11, factor de estimulación de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) y factor inhibidor de leucemia (LIF) secretados en los co-cultivos de células madre hematopoyéticas y células madre mesenquimáticas usando un kit Quantikine (R&D Systems, Minneapolis, MN).

La Figura 5B muestra los niveles de IL-6, IL-11 o LIF en co-cultivos de células CD34^{+} y MSC. Los niveles de IL-1\alpha y GM-CSF fueron indetectables. Los niveles de IL-6 y LIF fueron aproximadamente 10 veces mayores en co-cultivos de MSC y células CD34^{+} en comparación con cultivos de MSC sin células CD34^{+}. Los niveles de IL-1\alpha y GM-CSF fueron indetectables.

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Ejemplo de Referencia 6

Efectos de MSC osteogénicas (MSC diferenciadas) La diferenciación osteogénica de MSC se indujo tratando MSC con suplemento osteogénico (OS) que contenía dexametasona 100 mM, \beta-glicerofosfato 10 mM y ácido L-ascórbico-2 fosfato 50 \muM durante 2, 3, 4, 5, 10 ó 13 días. En el momento del co-cultivo con células CD34^{+}, se remplazó el medio que contenía OS con medio sin OS. Las Figuras 6A y 6B muestran que las MSC osteogénicas inhibían la formación de TRAP+MNC en comparación con MSC. La Figura 6C muestra los niveles de IL-6, IL-11 o LIF en co-cultivo. Los niveles de IL-6, IL-11 y LIF eran mayores en co-cultivos de MSC con células CD34^{+} en comparación con co-cultivos de MSC osteogénicas y células CD34^{+}.

Preparación de ARN y RT-PCR Se realizó el aislamiento y el análisis por RT-PCR del ARN total como se ha descrito en el ejemplo 2. Los cebadores cadena arriba y cadena abajo, respectivamente, para OPG eran 5'-ACCAC
TACTACACAGACAGC-3' (SEC ID Nº 5) y 5'-AGGAGACCAAAGACACTGCA-3' (SEC ID Nº 6); para OPGL 5'-TTCTATTTCAGAGCGCAGAT-3' (SEC ID Nº 7) y 5'-AGTCATGTTGGAGATCTTGG-3' (SEC ID Nº 8). La Figura 6D muestra que el tratamiento de MSC con OS durante 4, 8, ó 15 días disminuyó la expresión de ARNm de OPGL. En contraste, el tratamiento de MSC con OS durante 4, 8 ó 15 días aumentó la expresión de ARNm de OPG.

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Ejemplo 7

Transducción de células CD34^{+} Se ha informado previamente de la construcción del vector retroviral MGIN que expresa el gen de la proteína verde fluorescente potenciado (EGFP) y la producción de los sobrenadantes retrovirales (Cheng et al., 1997). En resumen, MGIN es un vector basado en virus de células madre embrionarias murinas que contiene el gen de EGFP y el sitio de entrada de ribosomas interno (IRES). Se prepararon sobrenadantes anfotrópicos producidos por células empaquetadoras PA317 a partir de productores seleccionados después de la infección por soluciones madre de virus ecotrópicos BOSC23. Para la transducción, se mezclaron sobrenadantes del vector congelados previamente a una proporción 1:1 con medio que contenía células CD34^{+} en presencia de 8 \mug/ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO), interleuquina-3 (IL-3) e IL-6 (10 ng/ml, cada una), factor de células madre (SCF) y Flk2 (FL) (100 ng/ml, cada uno). Las células de control se transdujeron con vector que no expresa EGFP. La mezcla de transducción después se centrifugó a 1800 g a 32-35ºC. Después de una "espinoculación" de 4 horas las células se lavaron una vez y se cultivaron durante 24 horas en medio que contenía los anteriores factores de crecimiento. Después de que la transducción se repitiera una vez más, se analizó una fracción celular por citometría de flujo para ensayar la eficacia de transducción mientras que las células restantes se usaron paras el ensayo de osteoclastogénesis. Las células CD34^{+} transducidas se co-cultivaron durante tres semanas sin factores añadidos. Los co-cultivos se tiñeron para TRAP como se ha descrito en el ejemplo 1. Las células se visualizaron con un microscopio de fluorescencia para detectar EGFP o en microscopio óptico para detectar TRAP.

Los resultados del análisis de citometría de flujo se muestran en la Figura 7. El análisis de FACS mostró que el 30% de las células CD34^{+} transducidas con el vector de EGFP expresaban el transgén (Figura 7B). Co-cultivos de células CD34^{+} transducidas con MSC producían osteoclastos que expresaban tanto EGFP (Figura 7C) como TRAP (Figura 7D).

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Ejemplo 8

Detección del receptor de vitronectina por ELISA Se sembraron MSC a 3 x 10^{3} células por cm^{2} y se cultivaron en medio hMSC hasta sub-confluencia. Las células CD34^{+} después se añadieron a 2,5 x 10^{4} células por cm^{2} a cultivos de MSC. Los cultivos se mantuvieron durante 1, 2 ó 3 semanas. Las células se fijaron con formaldehído al 3,6% y se bloquearon con suero de cabra al 10% durante 30 minutos, seguido por incubación con el anticuerpo contra el receptor de vitronectina (\alphav\beta3). Con lavados extensivos entre adiciones, se añadió un anticuerpo secundario marcado con biotina (IgG de cabra anti-ratón; Pierce, Rockford, IL) seguido por \beta-galactosidasa conjugada con estreptavidina (Gibco BRL) durante 1 hora. Después se añadió el sustrato soluble rojo de clorofenol-\beta-D-galactopiranósido (CPRG; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), y se leyó el desarrollo de color a 570 nm después de 30 minutos. También se procesaron los anticuerpos primarios de control para cada tratamiento y esta medida de fondo se restó de las lecturas para cada pocillo. Los resultados del ELISA se presentan en la Figura 8 como unidades de absorbancia media, con el fondo restado. El receptor de vitronectina (\alphav\beta3) se detectó por el anticuerpo específico pero no por el anticuerpo de control (Figura 8A). La expresión de \alphav\beta3 por el linaje celular de osteoclastos se indujo después de 1 semana de co-cultivos y se expresó menos por MSC (Figura 8B).

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Ejemplo 9

Células madre hematopoyéticas como dianas terapéuticas Las células madre hematopoyéticas (HSC) se transdujeron con un vector retroviral que contenía un elemento de respuesta a calcio, el promotor de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y un ADNc que codifica un factor anti-osteoclastos (antisentido, inhibidor, factor apoptótico) (véase la Figura 8). El promotor de TRAP se ha usado para dirigir específicamente el linaje celular de osteoclastos. Las HSC transducidas se infundieron a pacientes osteoporóticos. Llegan a la médula ósea, se injertan y se diferencian en osteoclastos. Los osteoclastos responden a elevadas concentraciones locales de calcio generadas por resorción ósea excesiva (etapas 1 y 2), expresando un factor anti-osteoclastos (etapa 3) que detiene la actividad de los osteoclastos (etapa 4). Uno de dichos factores es osteoprotegerina (OPG) que cuando se secreta ha demostrado disminuir la resorción ósea (osteopetrosis) y parece bloquear generalmente la osteoclastogénesis (Simonet (1997)). Las células hematopoyéticas transducidas también pueden inducirse a diferenciarse en osteoclastos ex vivo, y después se pueden infundir a pacientes osteoporóticos.

Se clonó el elemento de respuesta a calcio (CaRE) bajo el control del promotor de CMV en el vector pGL3 que contiene la luciferasa como gen informador (Promega Madison Wl) para producir pGL3-CaRE. pGL3 o pGL3-CaRE se introdujeron por transfección en la línea celular de riñón humano 293T usando un método de co-precipitación con fosfato cálcico. Las células después se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de calcio. La actividad luciferasa se evaluó usando el sistema de ensayo informador Dual-Luciferase^{TM} (Promega). Los datos muestran que calcio tan bajo como 0,1 mM inducía actividad luciferasa en pGL3-CaRE pero no en pGL3 (Figura 9B).

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Ejemplo 10

Efecto de suero en medio de cultivo Se estudiaron co-cultivos de MSC y células CD34^{+} para determinar el efecto del suero sobre la producción de osteoclastos. Se cultivaron co-cultivos de células CD34^{+} y MSC, en las condiciones descritas anteriormente, sin embargo, los medios ensayados fueron DMEM de bajo contenido en glucosa con FBS al 10% y DMEM de elevado contenido en glucosa sin suero. Los cultivos de control contenían células de la línea celular de riñón humano 293 co-cultivadas con células CD34^{+} en DMEM de elevado contenido en glucosa con y sin suero. Los cultivos se terminaron a los 12 días en lugar de 21 días como en los experimentos de los ejemplos anteriores.

Los resultados mostrados en la Figura 10 demuestran que el co-cultivo de MSC y células CD34^{+} en DMEM de elevado contenido en glucosa sin FBS producía una mayor cantidad de osteclastos que el co-cultivo en DMEM-LG convencional sin FBS al 10%.

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<110> Osiris Therapeutics, Inc.

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<120> Regulación de la Diferenciación de Células Madre Hematopoyéticas por el Uso de Células Madre Mesenquimáticas Humanas

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<130> 640100-333

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<140>

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<141>

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<150> 60/099.233

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<151> 04-09-1998

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<150> 60/088.431

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<151> 08-06-1998

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador de PCR

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<400> 1

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cgatcacaat ctgcagtacc

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20

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador de PCR

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<400> 2

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acccagtgag tcttcagtcc

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador de PCR

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tttccagggc ttctttgtt

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cttggttgtt ggctggttc

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accactacta cacagacagc

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador de PCR

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aggagaccaa agacactgca

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20

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<210> 7

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador de PCR

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<400> 7

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ttctatttca gagcgcagat

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20

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<210> 8

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador de PCR

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<400> 8

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agtcatgttg gagatcttgg

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20

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Claims

1. Un método para producir osteoclastos in vitro que comprende co-cultivar células madre mesenquimáticas con células madre hematopoyéticas de modo que las células madre hematopoyéticas produzcan osteoclastos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el co-cultivo se hace en ausencia de citoquinas exógenas.

3. El método de la reivindicación 1, en el que las células madre hematopoyéticas son células CD34^{+}.

4. El método de la reivindicación 1, en el que las células madre hematopoyéticas y las células madre mesenquimáticas están en contacto.

5. Un método para producir osteoclastos genéticamente modificados, que comprende transducir células progenitoras hematopoyéticas con material genético exógeno; y cultivar in vitro las células hematopoyéticas transducidas en presencia de células madre mesenquimáticas para inducir la diferenciación de las células hematopoyéticas transducidas en osteoclastos que contengan el material genético exógeno.

6. El método de la reivindicación 5, en el que las células madre hematopoyéticas transducidas son capaces de diferenciarse in vitro.

7. El método de la reivindicación 5, en el que las células madre hematopoyéticas transducidas son capaces de diferenciarse in vivo.