JP2003505006A - ヒト間葉幹細胞の使用による造血幹細胞分化の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、造血幹細胞をヒト間葉幹細胞と共に培養し、また望ましい実施例では外因性サイトカインを使用せずに培養することにより破骨細胞に分化する造血幹細胞の誘導に関する。間葉幹細胞の破骨細胞への分化は造血幹細胞の破骨細胞への分化を阻害した。加えて、造血幹細胞は対象となる遺伝子をとりわけ生理的活性タンパク質の発現のために運ぶように遺伝子をとりわけ生理的活性タンパク質の発現のために運ぶように遺伝子操作することとができる。間葉幹細胞の存在下で、形質導入細胞は新しい遺伝物質を運び骨吸収を調節するのに使用できる遺伝産物を発現する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

この発明は造血幹細胞に関し、より詳細には、ヒト造血幹細胞を外因性破骨細
胞形成誘導因子の不在下で拘束破骨細胞系統に分化するためのプロセスと組成物
に関する。この発明は更に、造血幹細胞が破骨細胞に分化する時に破骨細胞が形
質導入遺伝子の産物を発現できるように、ヒト間葉幹細胞の存在下での遺伝子修
飾された造血幹細胞に関する。

【０００２】

【背景の技術】

破骨細胞は生理的骨吸収の原因となる末端分化した造血細胞である。破骨分化
およびもしくは活性の機能不全は骨粗鬆症を含む色々なヒト代謝骨疾病の原因と
なる（検討のためタイテルバウム他、１９９５年を参照されたい）。骨粗鬆症、
すなわち進行性骨欠損は適切な骨格の完全性に責任のある破骨細胞と骨芽細胞の
重大なバランスの移動（ずれ）に起因する。骨を作り上げる骨芽細胞は間葉幹細
胞から子孫に伝わる末端分化された一つの系統である。

【０００３】 骨髄内の造血前駆細胞は局所調節因子の影響下で破骨細胞系統内に押込まれる
。間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）から生じるストローマ細胞を含む異なった細胞型は骨
髄に存在する。ストローマ細胞は破骨生理機能を調節する因子を産生することが
示された（検討のためマンディ他，１９９５年を参照されたい）。骨の組織図は
骨髄ストローマ細胞と造血細胞の間の密接な近接性を示している。さらに、骨髄
ストローマに細胞の分化状態と近接破骨前駆細胞を調節するその潜在能力との間
の関係は殆ど実証されていない。ストローマ細胞と、破骨細胞形成のマウスモデ
ルに使用する破骨前駆細胞の間でカドへリン−６で媒介される異型細胞間相互作
用の重要性が報告された（ムバラビール他、１９９８年）。破骨細胞分化はスト
ローマ細胞／骨芽細胞の存在を必要としたことをいくつかの研究が論証した（高
橋他、１９８８年、ムバラビール他、１９９５年）。齧歯類動物骨髄から誘導さ
れる細胞を使用する最近の研究は、ストローマ細胞の膜に発現されるオステオプ
ロトゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）が破骨細胞形成の主要因子であることを論証し
た（レイシー他、１９９８年）。しかしヒト破骨細胞がサイトカインのカクテル
（薬剤混合体）の存在下で前駆細胞から分化したこと、またストローマ細胞が必
ずしも必要でなかったことも報告された（又吉他、１９９６年）。骨吸収活性を
示すヒト破骨細胞（Ｏｃｌ）の形成は報告された（高橋他、１９９５年；ジェー
ムズ他、１９９６年；サーマ他、１９９６年；クイン他，１９９７年）が、破骨
細胞形成時に起こる重大な事態は不明瞭である。

【０００４】 骨は無機と有機の要素両方からなる複合基質である。有機相はタンパク質を含
み、一方無機質成分はカルシウム塩を含む。破骨細胞骨吸収の間に、無機質相の
溶解が有機相の溶解に先行し、また高濃度（＞４０ｍＭ）のカルシウムが骨基質
から局所的に放出されることは公知である。交替で、カルシウム濃度の増加は、
過剰な骨吸収を予防する調節機構である破骨細胞の機能に負の供給材料を持つ。
カルシウムはいくつかの遺伝子の発現を調節することで知られている。最近角化
細胞（ケラチノサイト）の細胞外カルシウム（０．６ｍＭ）への露出後にヒトケ
ラチン１遺伝子の発現を高めるカルシウム応答要素が特性付けられている。

【０００５】 破骨細胞はそれが生体内で細胞数が低く、その脆さと他の骨細胞に付着する傾
向があるため、容易に分離されない。かくして、例えば異常な骨溶解を予防する
目的で有効な治療の設計を促進するために多量の破骨細胞を効果的に産生する方
法が必要とされる。

【０００６】 従って、試験管内で破骨細胞を産生するための有効な方法を提供することがこ
の発明の目的である。

【０００７】 更に例えば破骨細胞をそれを必要とする個体に投与するために、進行中の破骨
細胞の源を提供するのに十分な数の外因性成長因子の追加をすることなく、試験
管内で破骨細胞を産出し維持する方法を提供することがこの発明の目的である。

【０００８】 従って、外因性成長因子、サイトカインおよびホルモンの存在下で、破骨細胞
に向かう造血幹細胞分化を調節することがこの発明の目的である。

【０００９】 更に造血細胞が破骨細胞に分化する時に、破骨細胞が対象となる遺伝産物を発
現するように遺伝子修飾造血細胞から破骨細胞を産生する方法を提供することが
この発明の目的である。

【００１０】

【発明の概要】

この発明者は間葉幹細胞が造血細胞の破骨細胞分化を支持することを発見した
。

【００１１】 かくして、この発明の一つの見地において、造血細胞とヒト間葉幹細胞の共存
培養よりなる、造血前駆細胞の試験管内での破骨細胞への分化を誘導する方法が
提供される。

【００１２】 造血前駆細胞が間葉幹細胞と共存培養された時、造血前駆幹細胞は破骨細胞に
向かい分化したが、これは多核性、カルシニトン、ビトロネクチンなどの受容体
、またより重要には骨吸収活性を含む破骨細胞に特徴的なマーカーの発現により
確認された。

【００１３】 更に造血幹細胞の分化が、造血幹細胞の分化を誘導するのに必要であるとして
知られている外因性（付加）成長因子、サイトカインおよびホルモンの不在下で
生じたことが発見された。

【００１４】 従って、この発明の一つの見地は、造血幹細胞をヒト間葉幹細胞と共存培養す
ることよりなる試験管内で破骨細胞を産生する方法を提供する。望ましい実施例
において、細胞は、物理的細胞間相互作用が造血前駆細胞と間葉幹細胞の間で起
こるように、同一培養容器内で共存培養される。

【００１５】 更に対象となる外因性遺伝物質を運ぶように修飾された造血幹細胞が間葉幹細
胞と共存培養される時、形質導入造血幹細胞が破骨細胞に分化し、またその破骨
細胞も新しい遺伝物質を運んだことが発見された。形質導入されたこれらの破骨
細胞は外因性遺伝産物を発現することができる。形質導入破骨前駆細胞およびそ
れから分化した破骨細胞はそのような修飾破骨細胞を用いる処置が例えば骨粗鬆
症の作用の軽減に有益である特定用途に使用することとができる。

【００１６】 従って、この発明は、造血前駆細胞を外因性遺伝物質で形質導入し、形質導入
された造血細胞を外因性遺伝物質を含む破骨細胞に分化するのに適した条件下に
委ねることよりなる遺伝子修飾破骨細胞を獲得する方法を提供する。

【００１７】 一つの実施例では、破骨細胞を産生する方法は、造血幹細胞の破骨細胞への分
化の後、破骨細胞も外因性遺伝物質を含むように形質導入造血幹細胞を間葉幹細
胞と共存培養することよりなる。

【００１８】 この発明は更に破骨細胞分化およびもしくは活性およびその使用を下方調節す
る産物をコード化するポリヌクレオチドで形質導入される造血幹細胞に関する。

【００１９】 特に望ましい実施例において、発現された遺伝産物は破骨細胞の分化およびも
しくは活性を下方調節する。造血幹細胞はカルシウム応答要素、酒石酸耐性酸性
ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）プロモーター（破骨細胞内で特異的に発現されたも
の）および抗破骨細胞活性因子をコード化する核酸配列（例えばＭ−ＣＳＦ，Ｉ
Ｌ１もしくはＩＬ−６に対するアンチセンス配列；ＩＬ６，Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ−
ＣＳＦ，ＩＬ−１あるいは白血病阻害因子に対する細胞内抗体などの阻害物質；
もしくはアポートシス因子）の一組を含むレトロウイルスベクターで形質導入さ
れる。この配列の発明は破骨細胞骨吸収の故で局所的なカルシウム濃度の増加に
より誘導される。

【００２０】 間葉幹細胞が破骨細胞に向けてＣＤ３４＋前駆細胞の分化を調節した一方、骨
芽細胞内に分化を開始したＭＳＣｓがこのプロセスを阻害したことも発見された
。骨形成間葉幹細胞の存在下で、ＯＰＧＬ発現水準は低下しオステオプロトゲリ
ン（ＯＰＧ）の発現は増加したことがわかった。かくして、分化した間葉幹細胞
の存在下での造血幹細胞の培養が破骨細胞分化およびもしくは活性を下方調節す
るのに役立つことも考慮される。従って、この発明の共存培養細胞集団は骨粗鬆
症を軽減する処置の一部として使用される。

【００２１】

【発明の開示】

この発明は一般にヒトＣＤ３４＋細胞の破骨細胞への分化を誘導するためのヒ
ト間葉幹細胞の使用に関し、またヒトＣＤ３４＋細胞とヒト間葉幹細胞よりなる
組成物に関する。より詳細には、ＣＤ３４＋細胞と共同して培養されたヒト間葉
幹細胞がＣＤ３４＋細胞の破骨細胞への分化を誘導するのに有用であることを発
明者は発見した。かくしてＣＤ３４＋細胞は破骨細胞の源として維持し利用する
ことができる。

【００２２】 ここに記載の方法のための主題のヒト間葉幹細胞を得るために、間葉幹細胞は
骨髄あるいは他の間葉幹細胞源から回収される。骨髄細胞は腸骨稜、大腿骨、脛
骨、脊髄、肋骨あるいは他の骨髄腔から得ることができる。ヒト間葉幹細胞の他
の源は、胚卵黄包、胎盤、臍帯、胎仔および青年期の皮膚および血液を含む。培
養コロニーでの間葉幹細胞の存在はユニークなモノクロ−ナル抗体で同定される
特異的細胞表面マーカーにより立証される。合衆国特許番号第４，５８６，３５
９号を参照されたい。これらの分離間葉細胞集団は間葉幹細胞とのみ関連するエ
ピトープ特性を示し、分化することなく培養で再生する能力を持ち、また損傷組
織の部位で試験管内あるいは生体内のいずれかに導入された時に特異的な間葉系
統に分化する能力を持つ。ヒト間葉幹細胞は適切な条件下で骨芽細胞、脂肪細胞
、軟骨細胞を含む多くの細胞系統に分化することで公知である（キャプラン他、
１９９７年を参照されたい）。

【００２３】 従って、ヒト組織から間葉幹細胞を回収するのに有用ないずれのプロセスも富
化された間葉幹細胞よりなる細胞の集団を得るように利用される。一つの見地に
おいて、ヒト間葉幹細胞を分離する方法は、間葉幹細胞、望ましくは骨髄を含む
組織標本を提供し、例えば密度勾配遠心法により標本から間葉幹細胞を分離し、
分化なしで間葉幹細胞成長を刺激する因子を含み、また、培養基質表面に間葉幹
細胞のみの選択的付着を許す培地に分離細胞を加え、標本培地混合物を培養し、
かつ基質表面から非付着性物質を除去して間葉幹細胞の分離集団を生む、これら
の段階を含む。

【００２４】 この発明の更なる見地おいて、ヒト組織から造血幹細胞を回収するのに有用で
あるいずれのプロセスも大抵の造血細胞よりなる細胞の集団を生むのに利用され
る。幹細胞は各種の組織、例えば骨髄および末梢血を含む血液から回収すること
ができる。ヒト造血幹細胞は骨髄吸引液あるいは末梢血から回収することができ
、例えば合衆国特許番号第４，７１４，６８０号参照し当業者に公知の方法を用
いて例えばＣＤ３４などの造血幹細胞表面抗原と結合する商業的に利用可能な抗
体を使用して分離することができる。選択肢として、造血幹細胞は枯渇により、
すなわち他の細胞で見出されるマーカーを発現する細胞を選び出すことにより回
収することができる。これらの手順に使用される抗体は磁気ビードに接合され、
また免疫を生じる手順は望ましい細胞型を回収するために利用されるであろう。

【００２５】 ヒト間葉幹細胞と造血細胞は間葉細胞が基質表面に付着し単層を形成するよう
に適切な培養条件下で共存培養される。間葉幹細胞はｃｍ²当り約３×１０³乃至
５×１０³細胞の範囲での密度で平板培養される。ＣＤ３４＋細胞は望ましくは
ｃｍ²当り約５×１０⁴細胞の細胞密度にある。

【００２６】 この発明の方法に従って、分離間葉幹細胞と分離造血前駆細胞、望ましくはＣ
Ｄ３４＋細胞はそれぞれ適切な培地で培養拡張され、すなわち当業者にとっては
明らかであり細胞成長と物質細胞集団の産生に有利な条件を使用する方法で培養
される。

【００２７】 ２個の細胞集団が次いでヒト間葉幹細胞の成長を促進しまた造血幹細胞の維持
に悪影響を与えない培地で共存培養された。この培地はまたＣＤ３４＋細胞集団
を支持しＣＤ３４＋細胞の破骨細胞への分化の誘導を指示することは間違いない
。適切な培地は例えば合衆国特許番号５，４８６，３５９号に記載されている。

【００２８】 望ましい実施例において、ヒト間葉幹細胞と造血幹細胞はダルベッコイーグル
培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ，＃１１８８５，メリーランド，ゲイザー
ズバーグ，ライフ・テクノロジーズ）で共存培養される。培地は望ましくは１０
％のＦＢＳを含む。とりわけ望ましい実施例において、ヒト間葉幹細胞と造血幹
細胞はダルベッコイーグル中間−高グルコース（ＤＭＥＭ−ＨＧ，＃１１９９５
，メリーランド，ゲイザーズバーグ，ライフ・テクノロジーズ）で共存培養され
る。

【００２９】 ここで記載された方法に基づいて産生された造血幹細胞は破骨細胞の信頼すべ
き定常源を提供するのに使用することができる。これらの破骨細胞は骨粗鬆症の
成長と処置に対する骨栄養因子の作用を決定するために使用することができた。
破骨細胞の即座の供給は例えば破骨細胞によるインテグリンαｖβ３細胞表面受
容体の発現に基づく小分子量薬剤開発のスクリーニング検定にとっては有用とな
るであろうということが考慮される。試験管内で成長因子で処置されなかったこ
れらの細胞はこれまでに獲得されたもの以上に生体内で発見された破骨細胞状の
特徴を持つであろう。

【００３０】 ここで記載された造血前駆細胞の破骨細胞への分化の後、造血前駆細胞、破骨
細胞、間葉幹細胞の混合物は主として破骨細胞よりなる細胞の集団を得るために
分離される。これは造血細胞表面マーカーあるいは他の細胞型マーカーを識別す
る抗体を使用して造血細胞の正およびもしくは員の選択により達成することがで
きる。

【００３１】 この発明のも一つの見地は細胞の子孫である破骨細胞が新しい遺伝物質を運ぶ
ように外部遺伝子の造血幹細胞への導入に関する。

【００３２】 かくして発明のこの見地に従って、造血幹細胞は対象となる遺伝物質で修飾す
ることができる。修飾されたＣＤ３４＋細胞は次いで間葉幹細胞で試験管内で共
存培養され破骨細胞に分化するよう誘導することができる。破骨細胞は遺伝子発
現の産物を発現し、あるいは発現産物を分泌することができる。これらの修飾細
胞は次いで発現産物が有益な作用を与える標的組織、例えば骨髄に対し投与でき
る。

【００３３】 更なる実施例において、形質導入造血前駆細胞は遺伝産物を発現すると考えら
れる破骨細胞に分化するため生体内で誘導することができる。例えば間葉幹細胞
と組合わせた形質導入前駆細胞は、形質導入遺伝子を持つ破骨細胞の産生を誘導
するために投与される。細胞はお互いに混合されあるいは別個に投与され、また
標的領域に送達される。選択肢として、造血前駆細胞は単独で使用され、生体内
に存在する間葉幹細胞により生体内での分化を引き起こす。

【００３４】 かくして、遺伝子は細胞内に導入され、それは次いで自己由来供与体あるいは
同種異系受容体に戻されそこで遺伝子の発現が治療作用を持つことになる。例え
ば造血幹細胞は生体内で変化した活性を持つように遺伝子操作される。適切な遺
伝子は例えば血清カルシウム応答性、エストロゲン分泌および骨吸収などの領域
で骨粗鬆症の調節で役割を果たすものを含むであろう。

【００３５】 造血幹細胞はヒト間葉幹細胞の存在下で遺伝子修飾（形質導入あるいは形質転
換もしくは形質移入）される。ここで間葉幹細胞は造血幹細胞の遺伝子形質導入
の効率を高める。選択肢として、造血幹細胞はヒト間葉幹細胞の不在下で形質導
入される。

【００３６】 造血幹細胞は例えば組換え発現ベクターを使用し、遺伝物質を細胞内にとり込
むことにより遺伝子修飾される。

【００３７】 ここで使用されるように「組換え発現ベクター」という用語は、（１）遺伝子
発現に調節役割を持つ遺伝因子、例えばプロモーターあるいはエンハンサー、（
２）ｍＲＮＡに転写されタンパク質に翻訳される構造配列あるいはコード配列お
よび、（３）適切な転写開始配列と終結配列、のアセンブリーよりなる転写ユニ
ットを引用する。真核発現システムでの使用を意図した構造ユニットは宿主細胞
により翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。選択肢と
して、組換えタンパク質がリーダー配列あるいは輸送配列なしで発現される場合
には、それはＮ末端メチオニン残基を含む。この残基は最終産物を提供するため
に続いて切断されたり切断されなかったりする。

【００３８】 ヒト造血幹細胞はかくして組換え転写ユニットを染色体ＤＮＡに安定して組込
み、あるいはレジデントプラスミドの成分として組換え転写ユニットを運ぶ。細
胞は例えば生体外でポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド（ＤＮＡある
いはＲＮＡ）で操作される。細胞はポリペプチドをコード化するＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子の使用により従来の技術で公知の手順で操作することかできる
。

【００３９】 前に言及したレトロウイルスプラスミドベクターからのレトロウイルスは必ず
しもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス
、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白
血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイ
ルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳腺癌ウイルス、などを含む。一つの実施例で
は、レトロウイルスプラスミドベクターはマウス胚性幹細胞から誘導されるＭＧ
ＩＮである。一般にレトロウイルス媒介遺伝子導入に関してはマクラッハリン他
、１９９０年を参照のこと。

【００４０】 ポリペプチドをコード化する核酸配列は適切なプロモーターの制御下にある。
採用される適切なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、ＴＲＡＰプロ
モーター、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモ
ーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸合胞体細胞ウイル
ス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター、例えばＭＭＴプロモーター、
メタロチオネインプロモーターなど；熱ショックプロモーター；アルブミンプロ
モーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミ
ジンキナーゼプロモーター、例えば単純性ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ
ー；レトロウイルスＬＴＲｓ；ＩＴＲｓ；βアクチンプロモーター；およびヒト
成長ホルモンプロモーターを含む。プロモーターは更にポリペプチドをコード化
する遺伝子を制御する天然プロモーターであることもある。これらのベクターは
更に遺伝子操作前駆細胞によりポリペプチドの産生を調節することも可能である
。例えばこの発明の目的のために、ベクターはカルシウム応答要素を含むことが
できる。適切なプロモーターの選択は当業者には明らかなものである。

【００４１】 造血幹細胞を遺伝子操作あるいは修飾するためにレトロウイルス以外のベクタ
ーを使用することも可能である。対象の遺伝情報はそのような細胞内で新しい遺
伝物質を発現できるいずれかのウイルスにより導入することができる。例えばＳ
Ｖ４０，ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ヒト乳頭種ウイルスはこの目的に
使用することができる。クローン真核ＤＮＡを培養哺乳類細胞に導入するために
他の方法も使用できる。例えば幹細胞に移入された遺伝物質はウイルス核酸の形
態にある。

【００４２】 加えて、発現ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼあるいはネオマイシン耐性
などの形質転換細胞選択のための表現型形質を提供するために１個もしくはそれ
以上の選択マーカー遺伝子を含む。

【００４３】 造血前駆細胞は従来技術で公知のもの以外の手段で形質移入される。このよう
な手段は必ずしもそれに限定されないが、リン酸カルシウムあるいはＤＥＡＥデ
キストランを媒介する形質移入；ポリカチオンポリブレンを媒介する形質移入；
プロトプラスト融合法；電気窄孔；リポソーム内でＤＮＡあるいはＲＮＡの被包
を通じ、次いでリポソームを細胞膜と融合させるか、もしくは合成カチオン脂質
で被覆したＤＮＡが融合により細胞内に導入できるようにしたリポソーム、など
である。

【００４４】 この発明は更に、ヒト造血前駆細胞が生物学的に有意な量でヒト破骨細胞を正
常に産生するかあるいは僅かな量で産生されるのではなくて、調節発現が治療利
益に導くような状況でポリペプチド、ホルモンおよびタンパク質を試験管内ある
いは生体内で産生する破骨細胞を産生するやり方でヒト造血幹細胞を遺伝子操作
することを可能にする。例えば造血幹細胞は骨吸収を特異的に阻害する分子を発
現する遺伝子で操作することができるが、破骨細胞の骨との結合は妨げない。選
択肢として、細胞は正常に発現されたタンパク質が可成り低い水準で発現される
ように修飾することができる。これらの産物は次いで取りかこむ培地に分泌され
るかあるいは細胞から精製される。このようなやり方で形成されたヒト破骨細胞
は発現物質の連続した短期あるいは長期の産生システムとして役立つことができ
る。

【００４５】 生体内である遺伝産物の破骨細胞の増強を可能にするため、この技術が必須遺
伝子の追加のコピーを産生するのに使用される。これらの遺伝子は例えばホルモ
ン、成長因子、基質タンパク質、細胞膜タンパク質、サイトカイン、付着分子、
組織修飾に重要な「再建」タンパク質などを発現することができる。外因性生体
内遺伝物質の発現はしばしば「遺伝子治療」として引用される。そのような処置
が適用される疾病状態と手順は骨および免疫系の遺伝疾患と疾病を含む。形質転
換細胞の細胞送達は各種の方法で実行される。それは骨膜、骨髄および皮下の各
部位への注入と直接蓄積注射を含む。

【００４６】 加えて、前に記載のように、形質導入細胞は望ましいタンパク質の試験管内産
生に使用することができる。形質導入細胞は更に薬剤発見のためのスクリーニン
グ検定にも使用される。

【００４７】 望ましい実施例において、造血幹細胞はカルシウム応答要素、酒石酸耐性酸性
ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）プロモーターおよび抗破骨細胞因子をコード化する
ｃＤＮＡを含むレトロウイルスベクターで形質導入される。

【００４８】 ここに記載された造血細胞の修飾と、破骨細胞への分化の誘導の後に、造血幹
細胞、破骨細胞、間葉幹細胞の混合物は殆どが形質導入破骨細胞よりなる細胞の
集団を得るために分離される。これは造血細胞表面マーカーを識別する抗体を使
用する形質導入造血細胞の正およびもしくは負の選択により達成することができ
る。

【００４９】 この発明の前の記載と以下の実施例は説明のみによるものである。この発明の
変形と実例は以下の図面と組合せた前記の説明の見地から当業者により容易に予
見されるであろう。従って、このような変形と変更はこの発明の範囲内にある。

【００５０】

【発明を実施するための最良の形態】

統計分析 すべてのデータは一対のｔ検定で分析された。標本は３組で行われデータは平
均値＋ＳＤ（標準偏差）であった。

【００５１】 実施例１ 細胞分離 骨髄標本はインスティチューショナル・レビュー・ボード承認のプロトコルの
下でジョンズ・ホプキンズ大学で健康なヒト供与体から集められた。間葉幹細胞
（ＭＳＣｓ）は分離され公知の方法（マジャンダー他１９９８年）に従って培養
された。培養が９０％密集に達した時、付着細胞は０．２５％トリプシン−ＥＤ
ＴＡ（ライフテクノロジーズ）を含む溶液の追加で回収され、継代１細胞として
１８５ｃｍ²フラスコ当り１×１０⁶細胞密度で再平板培養された。健全な患者の
骨髄から分離されたＣＤ３４＋細胞（メリーランド，ゲイザーズバーグ，ポイエ
テック・テクノロジーズ，インコーポレイテッド）が獲得された。この細胞は磁
気ビードに接合されたＣＤ３４に対する抗体（ＣＤ３４＋細胞分離カラム：カリ
フォルニア，オーバーン，ミルテニィ・バイオテック，Ａｂ：ＱＢＥＮＤ．１０
）を利用して９５％まで免疫精製され冷凍保存された。

【００５２】 共存培養 初期継代（２乃至３）のＭＳＣｓがｃｍ²当り３×１０³細胞細胞で平板培養さ
れ、ＤＭＥＭ−ＬＧプラス１０％ＦＢＳで亜密集になるまで培養された。ＣＤ３
４＋細胞は次いでｃｍ²当り５×１０⁴でＭＳＣ培養に加えられた。培養は３週間
３７℃で空気９５％炭酸ガス５％で維持され、３日毎にｈＭＳＣ培地を供給され
た。大抵のＣＤ３４＋細胞が最初の２週間非付着のままであったので、培養培地
の半分は非付着細胞を攪拌することなくゆっくり吸引され、新鮮培地で置換され
た。

【００５３】 ＴＲＡＰ染色 ３週後に細胞はクエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）の６０％アセトンで３０秒固定
され、蒸留水で２回洗浄され、空気乾燥され、商業利用てきるキット（ミズーリ
，セントルイス，シグマ）を使いマウス破骨細胞の広く使用される細胞化学マー
カーである酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）（ベインゲルトとバーガ
ー，１９８６年）で染色された。染色された培養は２００倍の倍率の顕微鏡の下
で検査された。各ウエルのＴＲＡＰ正（赤色染色）多核（３個もしくはそれ以上
）破骨細胞が体系的な仕方で全ウエルの端から端まで手動スキャニングにより計
数された（ムバラビール他，１９９８年）。

【００５４】 ＭＳＣｓあるいはサイトカイン／成長因子不在の下で培養されたＣＤ３４＋細
胞は酒石酸耐性酸性ホスファターゼを発現する多核細胞（ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓ）
を形成することができなかった（図１Ａ）。ＭＳＣｓは共存培養ＣＤ３４＋細胞
の破骨細胞への分化を支持した（図１Ｂ）。これとは逆に、ヒト皮膚線維芽細胞
（ＳＫ１０８７細胞）あるいはヒト腎臓細胞（２９３Ｔ）はＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓ
の形成を支持することができなかった（それぞれ図１Ｃと図１Ｄ）。ＭＳＣｓの
不在下でＣＤ３４＋細胞をＩＬ−１，ＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦで処置すると破骨
細胞の形成を産出したが、これらの細胞はＣＤ３４＋／ＭＳＣｓ共存培養で存在
したものと比較すると少なかった（データはしめされていない）。

【００５５】 実施例２ 免疫細胞化学 ３週間共存培養されたＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓはＰＢＳ内で３．７％（重量
／容積）のホルムアルデヒド新鮮溶液で固定され、ウマ血清１．５％で阻止され
、０．１５％のウマ血清を含むＰＢＳ内で１：５０の希釈でヒトインテグリンα
ｖβ３に対するモノクローナル抗体（英国、ザ・レイン・インスティチュート、
ホートン博士）と共に保温された。細胞は次いでベクタスティンＡＢＣ−ＧＯキ
ット（カリフォルニア、バーリンゲーム、ベクター・ラボラトリーズ，インコー
ポレイテッド）を用いてグルコースオキシダーゼ複合ヤギ第二抗体で保温された
。すべての保温は室温で３０分、次いで３回ＰＢＳで洗浄されて行われた。結果
は図２で示される。破骨細胞（黒矢印）とその前駆細胞（矢じり）は対照抗体で
なくビトロネクチン受容体抗体で染色された。ＭＳＣｓは受容体抗体では何らの
染色も示さなかった。低水準のビトロネクチン受容体を発現する多核細胞が共存
培養で見られた（図２Ｂ，白矢印）。

【００５６】 ＲＮＡ調製とＲＴ−ＰＣＲ 全ＲＮＡはベーリンガー・マンハイム（インディアナ，インディアナポリス）
から購入した高純度ＲＮＡ分離キットを用いてＭＳＣからあるいはＣＤ３４＋と
ＭＳＣｓの共存培養から抽出された。ＰＣＲが供給業者により記載された条件下
でジーンアンプＲＴ−ＰＣＲ法（カリフォルニア，フォスターシティ，パーキン
・エルマー）を用いて全ＲＮＡ調合物（１μｇ）から逆転写一体鎖ｃＤＮＡのい
ずれかで３０サイクルで行われた。但し以下の修飾が行われた。変性は９５℃、
２０秒、アニーリングは５５℃、２０秒、重合７２℃、３０秒、伸長７２℃、１
０分。上流および下流プライマーはそれぞれ以下のように設計された： TRAP:5′-CGATCACAATCTGCAGTACC-3′(配列識別番号１)および 5′-ACCCAGTGAGTCTTCAGTCC-3′(配列識別番号２), PCR産物サイズ＝１５０塩基対；カルシトニン受容体（ＣＴＲ）： 5′-TTTCCAGGGCTTCTTTGTT-3′(配列識別番号３) および 5′-CTTGGTTCTTGGCTGGTTC-3′(配列識別番号４)，ＰＣＲ産物サイズ＝
２０５塩基対。ＰＣＲ産物は１％のアガロースゲル電気泳動でサイズ分留された
。

【００５７】 ＲＴ−ＰＣＲ分析はＣＤ３４＋細胞、破骨細胞系統（図３のレーン２とレーン
３）から誘導された細胞によりＴＲＡＰとカルシトニン受容体の発現を示した。
これらのタンパク質はＭＳＣｓでは、発現されなかった。

【００５８】 実施例３ ピット形成検定 更に破骨細胞の培養物での存在を確認するために、ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓ
の共存培養で産生された細胞のピットを形成する能力、破骨細胞吸収の指示が試
験された。ゾウの平滑化牙切片が２００プルーフエタノールで無菌化され、空気
乾燥され、ＰＢＳで数回洗浄された。ＭＳＣｓが９６ウエル平板で牙切片（４×
４×０．１ｍｍ）上でｃｍ²当り３×１０³細胞で平板培養され、ｈＭＳＣｓ培地
、ｐＨ７．４で１週間培養された。ＣＤ３４＋細胞は次いでｃｍ²当り５×１０⁴ 細胞で加えられた。人造骨類似体である骨格円板（カナダ、オンタリオ、ミレニ
アム・バイオロジクス・インコーポレイテッド）がこの検定の最適条件を確立す
るために使用された。３週培養期の終りに、切片上の細胞がＴＲＡＰを染色され
、計数され、次いで水の中で０．１ＭのＮａＯＨで除去され、次いで２分超音波
処置された。骨切片は１％のホウ酸ナトリウムを含む蒸留水に調合された１％ト
ルイジンブルーで５分染色された。ピット数は前に記載（プラレット他、１９９
２年）のとおり顕微鏡下で計数された。真正吸収ピットはＣＤ３４＋細胞がＭＳ
Ｃｓと共存培養された時に骨類似体にもゾウ牙切片にも同様に発見された（図４
）。

【００５９】 実施例４ 細胞間相互作用の影響 ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓは物理的細胞間相互作用を調べるために同じ区画で
培養される（接触共存培養）かあるいは０．４５μｍの多孔膜（マサチューセッ
ツ，ベッドフォード，ベクトン・ディキソン）を持つ培養不透性挿入片で隔離さ
れた異なった２区画で培養される（非接触共存培養）かのいずれかであった。図
５Ａで示された結果は、破骨細胞が接触培養で形成され、どちらの区画（上部あ
るいは底部）でＭＳＣｓあるいはＣＤ３４＋細胞が播種されたかに関係なく、非
接触培養物では破骨細胞が約２／３少なかったことを示した。

【００６０】 実施例５ 分泌因子を経由する相互作用 ＣＤ３４＋細胞がＭＳＣｓと共存培養された。ＣＤ３４＋細胞の不在下あるい
は存在下で培養されたＭＳＣｓから２日後に馴化培地が採取された。造血幹細胞
と間葉幹細胞共存培養に分泌されたサイトカインＩＬ−１α，ＩＬ−６，ＩＬ−
１１，顆粒球マイクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および白血病
阻害因子（ＬＩＦ）のタンパク質水準がクアンティカインキット（ミネソタ、ミ
ネアポリス、アールアンドディー・システムズ）を用いて測定された。

【００６１】 図５ＢはＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓのＩＬ−６，ＩＬ−１１あるいはＬＩＦ水
準を示す。ＩＬ−１αとＧＭ−ＣＳＦの水準は検知できなかった。ＩＬ−６とＬ
ＩＦの水準はＣＤ３４＋細胞なしでＭＳＣｓ培養物と比較するとＭＳＣｓとＣＤ
３４＋細胞の共存培養で約１０倍も大きかった。ＩＬ−１αとＧＭ−ＣＳＦの水
準は検知できなかった。

【００６２】 実施例６ 骨形成ＭＳＣｓ（分化ＭＳＣｓ）の作用 ＭＳＣｓの骨形成分は、ＭＳＣｓを、１００ｍＭデキサメタタゾン，１０ｍＭ
、β−グリセロールリン酸と５０μＭ，Ｌ−アスコビン酸−２リン酸を含む骨形
成補充剤（ＯＳ）で２，３，４，５，１０あるいは１３日処置されることで誘導
された。ＣＤ３４＋細胞との共存培養の時点で、ＯＳ含有培地はＯＳ無し培地で
置換された。図６Ａと６Ｂは骨成形ＭＳＣｓがＭＳＣｓのものと比べてＴＲＡＰ
とＭＮＣの形成を阻害したことを示す。図６Ｃは共同培養でのＩＬ−６，ＩＬ−
１１あるいはＬＩＦの水準を示す。ＩＬ−６，ＩＬ−１１，ＬＩＦの水準は骨形
成ＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養と比べてＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共
存培養でより高かった。

【００６３】 ＲＮＡ調製とＲＴ−ＰＣＲ 全ＲＮＡ分離とＲＴ−ＰＣＲ分析が実施例２に記載されたように実行された。
上流と下流プライマーはそれぞれＯＰＧに対しては5′-ACCACTACTACACAGACAGC-3
′（配列識別番号５）と5′-AGGAGACCAAAGACACTGCA-3′であり、またＯＰＧＬに
対しては、5′-TTCTATTTCAGAGCGCAGAT-3′（配列識別番号７）と5′-AGTCATGTTG
GAGATCTTGG-3′（配列識別番号８）であった。図６ＤはＭＳＣｓのＯＳでの４，
８，あるいは１５日の処置がＯＰＧＬ ｍＲＮＡ発現を減少させたことを示す。
これとは逆に、ＭＳＣｓのＯＳでの４，８，あるいは１５日の処置はＯＰＧ ｍ
ＲＮＡの発現を増加させた。

【００６４】 実施例７ ＣＤ３４＋細胞の形質導入 増強されたグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を発現するレトロウイ
ルスベクターＭＧＩＮの構築とレトロウイルス上澄みの産生はこれまでに報告さ
れている（チェン他、１９９７年）。要約すると、ＭＧＩＮはＥＧＰＦ遺伝子と
内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を含むマウス胚性幹細胞ウイルスベ
ースベクターである。ＰＡ３１７パッケージング細胞により産生された両栄養性
上澄みはＢＯＳＣ２３エコトロピックウイルス株による感染後に選択された製造
業者から作られた。形質導入のために、前もって凍結されたベクター上澄みが、
ＣＤ３４＋細胞を含む培地と１：１の比率で、８μｇ／ｍｌのポリブレン（ミズ
ーリ、セントルイス、シグマ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）とＩＬ−６
（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）とＦ１Ｋ２（ＦＬ）（それ
ぞれ１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で混合された。対照細胞は非ＥＧＦＰ発現ベク
ターで形質導入された。形質導入混合物は次いで１８００ｇ，３２−３５℃で遠
心分離された。４時間の「スピンオキュレーション」（遠心分離中の細胞のベク
ターでの形質導入）の後、細胞は１回洗浄され、２４時間前記成長因子を含む培
地で培養された。形質導入が再び１回繰返された後、細胞分画が形質導入効率を
試験するためフローサイトメトリーで分析され、一方残存細胞は破骨細胞形成検
定のために使用された。形質導入ＣＤ３４＋細胞は追加因子なしで３週間共存培
養された。共存培培養物は実施例１に記載の通りＴＲＡＰを染色された。細胞は
ＥＧＦＰを検出するために蛍光顕微鏡で、あるいはＴＲＡＰを検出するために顕
微鏡下で視覚化された。

【００６５】 フローサイトメトリー分析の結果は図７で示される。ＦＡＣＳ分析はＥＧＦＰ
ベクターで形質導入されたＣＤ３４＋細胞の３０％が形質導入遺伝子を発現した
ことを示した（図７Ｂ）。形質導入ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓの共存培養物はＥ
ＧＦＰ（図７Ｃ）とＴＲＡＰ（図７Ｄ）の両方を発現する破骨細胞を産出した。

【００６６】 実施例８ ＥＬＩＳＡによるビトロネクチン受容体の検出 ＭＳＣｓがｃｍ²当り３×１０³細胞で平板培養され、亜密集になるまでｈＭＳ
Ｃｓ培地で培養された。ＣＤ３４＋細胞は次いでｃｍ²当り２．５×１０⁴細胞で
ＭＳＣ培養に加えられた。培養は１，２あるいは３週維持された。細胞は３．６
％のホルムアルデヒドで固定され、１０％ヤギ血清で３０分阻止され、次いでビ
トロネクチン受容体（αｖβ３）に対する抗体で保温された。追加の間に広範な
洗浄を行い、ビオチン標識第二抗体が加えられ（ヤギ抗マウスＩｇＧ；イリノイ
、ロックフォード、ピアス）、続いてストレプトアビジン複合β−ガラクトシダ
ーゼ（ジブコＢＲＬ）で１時間置かれた。可溶性基質であるクロロフェノールレ
ッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ；インディアナ、インディアナポ
リス、ベーリンガー・マンハイム）が次いで加えられ、５７０ｎｍで３０分後顕
色が読み取られた。対照一次抗体もまたそれぞれの処置で作動され、このバック
グラウンド測定は各ウエルに対する読み取りから抜き取られた。ＥＬＩＳＡの結
果は抜き取られたバックグラウンドと共に吸光度の単位として図８に提示される
。ビトロネクチン受容体（αｖβ３）は対照抗体によるのではなく特異的抗体に
より検出された（図８Ａ）。破骨細胞系統によるαｖβ３発現は１週あとに共存
培養で誘導され、ＭＳＣｓでの発現はより少なかった（図８）。

【００６７】 実施例９ 治療標的としての造血幹細胞 造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、カルシウム応答要素である酒石酸耐性酸性ホスフ
ァターゼ（ＴＲＡＰ）プロモーターと抗破骨細胞因子（アンチセンス、阻害剤、
アポトーシス因子）をコード化するｃＤＮＡを含むベクターで形質導入される（
図８参照）。ＴＲＡＰプロモーターは破骨細胞系列を特異的に標的にするために
使用されてきた。形質導入ＨＳＣｓは骨粗鬆症の患者に注入される。それは骨髄
に誘導され、破骨細胞に委嘱し分化する。破骨細胞は過剰な骨吸収で生成された
局所の高カルシウム濃度に反応し（ステップ１とスイップ２）、抗破骨細胞因子
を発現する（ステップ３）ことにより破骨細胞活性を停止させる（ステップ４）
ように反応する。このような因子の一つはオステオプロテグリン（ＯＰＧ）であ
り、これが分泌されると骨吸収（オステオペトローシス）（大理石骨病（原文通
り））を減少させることが実証され、一般に破骨細胞を阻止するように見える（
シモネット（１９９７年））。形質導入造血細胞は更に生体外で破骨細胞に分化
するように誘導することができる。

【００６８】 カルシウム応答要素（ＣａＲＥ）はレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを
含むｐＧＬ３ベクター（ウイスコンシン、マディソン、プロメガ）内でＣＭＶプ
ロモーターの制御の下でクローンされ、ｐＧＬ３−ＣａＲＥを産出した。ｐＧＬ
３あるいはｐＧＬ３−ＣａＲＥはリン酸カルシウム共同沈降法を用いてヒト腎臓
細胞系２９３Ｔに形質移入された。細胞は次いで増加するカルシウム濃度の存在
下で培養された。ルシフェラーゼ活性はデュワル−ルシフェラーゼ（商標）レポ
ータ検定システム（プロメガ）を使用して評価された。データは、０．１ｍＭ程
度の低い量のカルシウムがルシフェラーゼ活性をｐＧＬ３−ＣａＲＥに誘導した
がｐＧＬ３に導入しなかったことを示している（図９Ｂ）。

【００６９】 実施例１０ 培養培地での血清の作用 ＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養が破骨細胞の産生に対する血清の作用を
決定するために研究された。ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓの共存培養物が前に記載
の条件の通りに培養されたが、試験された培地は１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ−
低グルコースのものと血清なしのＤＭＥＭ−高グルコースのものであった。ヒト
腎臓細胞系２９３細胞を含む対照培養は血清ありもしくは無しでのＤＭＥＭ−高
グルコース内でＣＤ３４＋細胞と共存培養された。培養は前記実施例での実験で
みられるように２１日よりも１２日で終結した。

【００７０】 図１０で示される結果は、ＦＢＳ無しでＤＭＥＭ−高グルコースでのＭＳＣｓ
とＣＤ３４＋細胞の共存培養が、１０％のＦＢＳ入りの標準ＤＭＥＭ−低グルコ
ースでの共存培養よりもずっと大きな数の破骨細胞を産出したことを実証する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 １Ａは、間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）不在下で培養されたＣＤ３４＋
細胞のＴＲＡＰ染色を示す図、１Ｂは、ＭＳＣｓ存在下で培養されたＣＤ３４＋
細胞のＴＲＡＰ染色を示す図、多くの多核ＴＲＡＰ⁺細胞（ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓ
）（矢印）同じく単核ＴＲＡＰ⁺細胞は紡鐘形細胞（矢じり）の密集層として出
現したＭＳＣｓの存在下で形成された。小さい矢印と星印は核のクラスターを示
す。１Ｃは、ヒト皮膚線維芽細胞（ＳＫ１０８７細胞：矢じり）の存在下で培養
されたＣＤ３４＋細胞の染色を示す図。ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓは形成されなかった
。１Ｄは、ヒト腎臓細胞（２９３Ｔ；矢じり）の存在下で培養されたＣＤ３４＋
細胞の染色体を示す図。ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓは形成されなかった。

【図２】 ２Ａは、ＣＤ３４＋とＭＳＣｓを負の対照抗体と共存培養した時
の免疫細胞化学染色を示す図、２Ｂは、ＣＤ３４＋とＭＳＣｓをビトロネクチン
受容体を認識する抗体と共存培養した時の免疫細胞化学染色を示す図

【図３】 ＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養（レーン２−３）あるいは
ＣＤ３４＋細胞なしでのＭＳＣｓ培養（レーン４−５）から精製されたＲＮＡの
ＲＴ−ＰＣＲを示す図、カルシトニン受容体（レーン２と４）およびＴＲＡＰ（
レーン３と５）はＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養からの標本でのみ検出さ
れた。カルシトニン受容体ファミリーの保存非スプライシング領域が設計プライ
マーとして選ばれた。レーン１，１キロベースＤＮＡラダー；底部，β２−ミク
ログロブリン

【図４】 ４Ａは、ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓ（矢印）の共存培養でのピッ
ト形成を示す図、４Ｂは、ＭＳＣｓ無しでのＣＤ３４＋細胞培養でのピット形成
を示す図、スライスはトルイジンブルーで染色され顕微鏡で視覚化された。倍率
×２００。４Ｃは、ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓの共存培養（閉じた縦棒）でのピ
ットの計量とＭＳＣｓ無しでのＣＤ３４＋細胞の培養（開放縦棒）でのピットの
計量を示す図。＊ｐ＜０．０１対ＭＳＣｓ無しでのＣＤ３４＋細胞の培養。

【図５】 ５Ａは、破骨細胞形成での細胞間相互作用の効果を示す図、ＣＤ
３４＋細胞とＭＳＣｓは同一区画（接触共存培養、閉じた縦棒）で共存培養され
るか、あるいは０．４５μｍフィルターで隔離された（非接触共存培養）で共存
された：ＭＳＣｓが上部、ＣＤ３４＋細胞が底部のものは開放縦棒；ＭＳＣｓ底
部でＣＤ３４＋細胞が上部のものは斜線入り縦棒。＊ｐ＜０．０１対ＭＳＣｓ無
しでのＣＤ３４＋細胞の培養。５Ｂは、ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓの共存培養で
の分泌因子（ＩＬ−６，ＩＬ−１１，ＬＩＦ）の計量を示す図。ＩＬ−１１はそ
うではないがＩＬ−６とＬＩＦの水準はＣＤ３４＋細胞なしでのＭＳＣ培養に比
べてＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養では約１０倍であった。

【図６】 ６Ａ、６Ｂは、骨形成ＭＳＣｓによるＴＲＡＰとＭＮＳｃの阻害
を示す図、ＭＳＣｓの骨成分かはＣＤ３４＋細胞を加える前に骨形成補充剤（Ｏ
Ｓ）で２，３，４，５，１０あるいは１３日処置することで誘導された。＊ｐ＜
０．０１対ＭＳＣｓ無しでのＣＤ３４＋細胞の培養。６Ｃは、ＭＳＣｓとＣＤ３
４＋細胞の共存培養が骨形成ＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養よりも高水準
のＩＬ−６，ＩＬ−１１，ＬＩＦを産生したことを示す図、６ＤはＭＳＣｓの骨
形成分化がＯＰＧＬ ｍＲＮＡ発現の減少（左側パネル）とＯＰＧ ｍＲＮＡ発
現の増加（右側パネル）と関連することを示す図

【図７】 ７Ａは、対照ベクターで形質導入されたＣＤ３４＋細胞のフロー
サイトメトリー分析を示す図、７Ｂは、ＥＧＦＰ発現ベクターで形質導入された
ＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す図、約３０％のＣＤ３４＋細
胞がＥＧＦＰを発現した。７Ｃは、ＥＧＦＰ発現ベクターで形質導入されたＭＳ
ＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養を示す図、ＥＧＦＰは破骨細胞と同じく単核細
胞で発現された。７Ｄは、ＴＲＡＰで染色したＥＧＦＰ発現ベクターで形質導入
されたＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養を示す図。７Ｄは７Ｃを明るくした
図である。

【図８】 ８Ａは、ＥＬＩＳＡで検出されたビトロネクチン受容体（αｖβ
３）の発現を示す図。αｖβ３抗体，左側ウエルと閉じた棒；対照ＩｇＧ，右側
ウエルと開放棒、８Ｂは、αｖβ３の時間経過での発現を示す図。ＣＤ２３＋細
胞とＭＳＣｓの共存培養（閉じた棒）あるいはＣＤ３４＋細胞無しでのＭＳＣ（
開放棒）

【図９】 ９Ａは、破骨細胞活性の直接調節のための戦略、９Ｂは、カルシ
ウム誘導性発現システムで形質導入された培養細胞へのカルシウム追加でレポー
ター遺伝子の発現を誘導したことを示す図

【図１０】 ＭＳＣｓとＣＤ３４＋細胞の共存培養で培養培地の血清の破骨
細胞への効果を示す図。１０Ａは、ＦＢＳ１０％のＤＭＥＭ−低グルコース（開
放棒）と血清無しでのＤＭＥＭ−高グルコース（閉じた棒）でのＣＤ３４＋細胞
とＭＳＣｓの共存培養での破骨細胞数を示す図、１０Ｂは、ＦＢＳ１０％のＤＭ
ＥＭ−高グルコース（閉じた棒）と血清なしでのＤＭＥＭ−高グルコース（斜線
棒）での２９３細胞とＣＤ３４＋細胞の共存培養を示す図

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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ムバラビール，ガブリエル アメリカ合衆国，21045 メリーランド， コロンビア，グレイストーン レーン 8488，アパートメント １ジー Ｆターム(参考） 4B065 AA94X BB31 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA971 ZB212 4C087 BB44 BB64 NA14 ZA97 ZB21 ZC41

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 造血幹細胞が破骨細胞を産生するように間葉幹細胞を造血幹
   細胞と共存培養することよりなることを特徴とする試験管内で破骨細胞を産生す
   る一つの方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法であって、ここで共存培養が外因性サイ
   トカインの不在下で行なわれることを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の方法であって、ここで造血幹細胞がＣＤ３４
   ＋細胞であることを特徴とする方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の方法であって、ここで造血幹細胞と間葉幹細
   胞が接触していることを特徴とする方法。
5. 【請求項５】 造血前駆細胞を外因性遺伝物質で形質導入し、形質導入造血
   細胞の外因性遺伝物質を含む破骨細胞への分化を誘導するために間葉幹細胞の存
   在下で形質導入造血細胞を培養することよりなることを特徴とする遺伝子修飾破
   骨細胞を産生する一つの方法。
6. 【請求項６】 請求項５記載の方法であって、ここで形質導入造血幹細胞が
   試験管内で分化するように誘導されることを特徴とする方法。
7. 【請求項７】 請求項５記載の方法であって、ここで形質導入造血幹細胞が
   生体内で分化するように誘導されることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 造血前駆細胞を外因性遺伝物質で形質導入し、造血幹細胞の
   外因性遺伝物質を含む破骨細胞への分化に適した条件下に形質導入造血幹細胞ほ
   委ねることよりなることを特徴とする遺伝子修飾破骨細胞を獲得する一つの方法
   。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、ここで造血細胞が生体内で
   分化されることを特徴とする方法。
10. 【請求項１０】 請求項８記載の方法であって、ここで造血細胞がヒト間葉
    幹細胞と共に生体内で投与されることを特徴とする方法。
11. 【請求項１１】 遺伝子修飾破骨細胞よりなることを特徴とする一つの組成
    物。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の組成物であって、ここで遺伝子修飾破骨
    細胞が非形質転換細胞系からのものであることを特徴とする組成物。
13. 【請求項１３】 遺伝子修飾破骨前駆細胞よりなることを特徴とする一つの
    組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載の組成物であって、ここで遺伝子修飾破骨
    前駆細胞が非形質転換細胞系からのものであることを特徴とする組成物。
15. 【請求項１５】 破骨細胞形成を減少するように分化間葉幹細胞を造血幹細
    胞と共存培養することよりなることを特徴とする造血幹細胞の破骨細胞への分化
    を減少するための一つの方法。