CN105726571A - 一种用于治疗椎间盘退行性变的脂肪间充质祖细胞复合物 - Google Patents
一种用于治疗椎间盘退行性变的脂肪间充质祖细胞复合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及脂肪间充质祖细胞在预防或治疗椎间盘退行性变的用途。具体地，脂肪间充质祖细胞可用于制备治疗椎间盘退行性变的药物组合物。给需要的对象施用所述的药物组合物，可以使椎间盘厚度、腰椎疼痛、生活质量等指标改善，从而促进椎间盘软骨细胞的修复。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪干细胞应用领域，具体地，本发明提供了一种脂肪间充质祖细胞用于治疗椎间盘退行性变的用途。
背景技术
椎间盘退行性变(DegenerativeDiscDisease,DDD)是一种自然的衰老过程。随着年龄的增长，椎间盘逐渐失去柔韧性、弹性和减震的功能。椎间盘退行性变的确切机制还有待研究，但主要是由于机械、营养、生物等各种因素造成损伤，导致椎间盘细胞因子减少，炎症介质增多、基质金属蛋白酶和其它蛋白水解酶含量及活性增加，引起细胞外基质降解，髓核细胞数目减少，进而使蛋白多糖、胶原的合成减少，椎间盘类软骨细胞赖以生存的内环境被破坏，不能维持椎间盘内应有的张力，从而导致椎间盘的退行性变。椎间盘是一封闭结构，营养供应差，退行性变很难自行修复。
腰背痛疾病是目前常见病、多发病，椎间盘退行性变是腰背痛疾病的主要发病原因。据有关统计数据表明，美国每年因腰背痛疾病就诊者，仅次于上呼吸道感染而居第二位。在英国，每年2％的人口和25％左右的就业人员患有腰背痛疾病。
椎间盘退行性疾病应及时诊断和治疗，阻止病情的进展，防止更为严重的后遗症。目前，椎间盘退行性疾病的治疗方法主要有：(1)非手术治疗，如卧床休息、拉伸牵引、按摩、针灸理疗、药物治疗等；这类治疗无法从本质上延缓椎间盘退行性变，大多只能短时间内缓解症状；(2)手术治疗，如椎间盘切除、腰椎融合术、椎间关节融合、椎间盘内射频消融等。以缓解症状为目的的非手术，治疗见效较慢，需长期坚持。而以恢复椎体结构稳定性为目的的外科手术治疗结果不理想，主要原因有：○1椎间盘无血管和神经支配，阴阳靠椎体及其周围软组织通过软骨终板和外纤维环的渗透提供；○2软骨细胞以及类软骨细胞样的髓核细胞和纤维环细胞分裂增生能力较弱，自我修复能力差；3○临床就诊患者一般均处于整个病程的晚期，椎间盘的完整性有明显破坏，退行性变已经发展到不可逆转的程度。现在临床上严重椎间盘退变大多数采取手术治疗，手术治疗虽然能够有效的缓解临床症状，但未能从根本上解决椎间盘本身的病变问题，切除椎间盘还可因脊柱不稳而导致退变的进一步恶化。(3)细胞移植治疗：细胞移植治疗是将自体的椎间盘细胞再移植到退化的椎间盘，延缓椎间盘的进一步退化。但是自体来源的椎间盘细胞非常有限，无法满足自体椎间盘细胞再植入的要求。
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它在一定的环境下能分化为多种功能细胞。一直以来，骨髓都是用作造血祖细胞组织来源的金标准，但随着研究与应用越来越多，骨髓来源的干细胞在临床使用的不足之处亦越发突显，如从采集到临床使用的过程耗时过长，采集骨髓对供体本身的伤害，培养成本较高，较低的HLA配型成功率等，制约了其在临床治疗中的广泛应用。
综上所述，本领域迫切需要一种能够有效治疗椎间盘退行性变的手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够有效治疗椎间盘退行性变的手段。
本发明的第一方面，提供了一种脂肪间充质祖细胞的用途，所述的脂肪间充质祖细胞用于制备治疗椎间盘退行性变的药物组合物。
在另一优选例中，在所述药物组合物中，所述的脂肪间充质祖细胞的浓度为10±5×106cells/0.5ml。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是传代培养的脂肪间充质祖细胞。
在另一优选例中，所述的组合物中，所述脂肪间充质祖细胞的含量为1×106/ml-1×108/ml。
在另一优选例中，所述的组合物的体积为10-100μl。
在另一优选例中，在所述组合物中，主要活性成分仅为脂肪间充质祖细胞。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是通过SVF培养P3-P10代纯化扩增获得的细胞。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有分化为骨，软骨和脂肪的能力。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞为表达选自下组的表面标记的脂肪间充质祖细胞：CD29、CD73、CD90、CD49d。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞为不表达选自下组的表面标记的脂肪间充质祖细胞：CD34、CD45、CD14、HLA-DR、Actin。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还包括透明质酸。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括：脂肪间充质祖细胞，和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体为输液剂载体和/或注射剂载体，优选地选自下组：生理盐水、葡萄糖盐水。
在另一优选例中，所述的治疗包括选自下组的一项或多项指标改善：生活质量(优选通过生活质量评分表评估)，椎间盘厚度(优选通过影像学检查评估)，疼痛症状(优选通过疼痛评分表评估)。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(i)90％以上的细胞具有表面抗原CD29；
(ii)90％以上的细胞具有表面抗原CD73；
(iii)90％以上的细胞具有表面抗原CD49d；
(iv)90％以上的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD29。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD73。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD49d。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中，95-100％(优选98-100％，更优选99-100％)的细胞具有表面抗原CD29。
在另一优选例中，95-100％(优选98-100％，更优选99-100％)的细胞具有表面抗原CD73。
在另一优选例中，95-100％(优选98-100％，更优选99-100％)的细胞具有表面抗原CD49d。
在另一优选例中，95-100％(优选98-100％，更优选99-100％)的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(v)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD34；
(vi)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD45；
(vii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原Actin；
(viii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；
(ix)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD34。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD34。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原Actin。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原Actin。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中，0.01-5％(优选0.1-4％，更优选1-3％)的细胞具有表面抗原CD34。
在另一优选例中，0.01-1％(优选0.05-0.5％，更优选0.08-0.2％)的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中，0.01-3％(优选0.05-2％，更优选0.1-1％)的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中，0.01-1％(优选0.05-0.5％，更优选0.08-0.2％)的细胞具有表面抗原HLA-DR。
在另一优选例中，0.01-3％(优选0.05-2％，更优选0.1-1％)的细胞具有表面抗原Actin。
本发明的第二方面，提供了一种用于预防或治疗椎间盘退行性变的药物组合物，所述的药物组合物包括：有效量的脂肪间充质祖细胞，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的载体是输液剂载体和/或注射剂载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水(优选为生理盐水)、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、葡萄糖盐水、及其组合。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：生理盐水、葡萄糖盐水。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，脂肪间充质祖细胞的浓度为0.1-10×107个/ml，较佳地为0.5-5×107个/ml，更佳地为1-3×107个/ml。
在另一优选例中，所述的药物组合物中不含有SVF组分。
在另一优选例中，所述的注射试剂的体积为0.1-2ml，较佳地为0.2-1ml，更佳地为0.3-0.7ml。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞为表达选自下组的表面标记的脂肪间充质祖细胞：CD29、CD73、CD90、CD49d。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞为不表达选自下组的表面标记的脂肪间充质祖细胞：CD34、CD45、CD14、HLA-DR、Actin。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(i)90％以上的细胞具有表面抗原CD29；
(ii)90％以上的细胞具有表面抗原CD73；
(iii)90％以上的细胞具有表面抗原CD49d；
(iv)90％以上的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD29。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD73。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD49d。
在另一优选例中，95％以上的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(v)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD34；
(vi)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD45；
(vii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原Actin；
(viii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；
(ix)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD34。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD34。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原Actin。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。
在另一优选例中，2％以下的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原Actin。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。
在另一优选例中，1％以下的细胞具有表面抗原CD14。在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞具有分化为骨，软骨和脂肪的能力。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是通过SVF培养P3-P10代纯化扩增获得的细胞。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞是用含血清培养基培养纯化扩增的细胞，或所述的脂肪间充质祖细胞是用无血清培养基培养纯化扩增的细胞。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞还表达细胞因子，且所述的细胞因子选自下组：TGF-β1，HGF，VEGF，或其组合。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子TGF-β1的量为1000-1300pg/ml/106细胞。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子HGF的量为9000-10000pg/ml/106细胞。
在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子VEGF的量为700–800pg/ml/106细胞。
在另一优选例中，所述的间充质祖细胞具有成软骨、成骨及成脂分化能力。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射制剂，优选为椎间盘内注射试剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括透明质酸。
在另一优选例中，在所述制剂中，所述的透明质酸的含量为1-99wt％。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括：0.001-10ml的透明质酸(HA)，以及悬浮于所述的透明质酸中的脂肪间充质祖细胞。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述的脂肪间充质祖细胞的浓度为1×106/ml-1×108/ml。
本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗椎间盘退行性变的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用脂肪间充质祖细胞，或如本发明第二方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为鼠、兔、牛、羊、猪等。
在另一优选例中，所述的施用方法为椎间盘内注射，较佳地为X线引导下椎间盘内注射。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1脂肪间充质祖细胞分化的油红O染色、阿辛蓝染色和茜素红染色实验图；
图2油红O染色对照组(阴性)；
图3haMPC流式检测试验图谱；
图4为兔椎间盘退行性变治疗后低剂量组和高剂量组椎间盘恢复情况，其中，图A为低剂量组的对比情况，图B为高剂量组的对比情况。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，脂肪间充质祖细胞具有极其优异的预防或治疗椎间盘退行性变的作用。具体地，给需要的对象施用本发明的含有脂肪间充质祖细胞的药物组合物，对于椎间盘退行性变有显著的预防或治疗作用。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95％以上”指≥95％，“0.2％以下”指≤0.2％。
如本文所用，术语“脂肪基质血管成分”和“脂肪来源的基质血管成分”可互换使用。
如本文所用，术语“脂肪间充质祖细胞”、“脂肪间充质干细胞”和“脂肪来源的间充质祖细胞”，“脂肪来源的间充质干细胞”可互换使用。
特别地，在本发明中，术语“95％以上”包括96％以上，97％以上，98％以上，99％以上，或99.5％以上。
脂肪
自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织，包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。
在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。
脂肪间充质祖细胞(Humanadiposederivedmesenchymalprogenitorcells)
间充质祖细胞可以分泌广谱的具有免疫调节和/或再生活性的生物因子。在本发明中，优选地采用脂肪来源的间充质祖细胞(Humanadiposederivedmsenchymalprogenitorcells,haMPCs)：其中，一种最为优选的脂肪来源的间充质祖细胞为不含CD34+细胞，通常通过SVF培养P3-P10代纯化扩增获得。
在本发明中，脂肪间充质祖细胞的制备方法可以包括步骤：洗涤脂肪组织，然后用胶原酶消化，离心分离基质血管成分，除去油脂和胶原酶，培养原代细胞，得到传代后的脂肪间充质祖细胞。
脂肪间充质祖细胞的抗原检测
用本发明使用的脂肪间充质祖细胞具有很高的纯度，基本上不含有其他类型的细胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。
脂肪间充质祖细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等。
CD34抗原是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.2％，更佳地，≤0.1％。
CD45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有CD45的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.1％。
CD29、CD73、CD49d、CD90等主要存在于脂肪间充质祖细胞表面。
带有CD29的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥80％，更佳地≥90％。
带有CD73的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥70％，更佳地≥80％。
带有CD49d的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥60％，更佳地≥70％。
带有CD90的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为≥70％，更佳地≥80％。
本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪间充质祖细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的脂肪间充质祖细胞，以及药学上可接受的载体。
通常，可将脂肪间充质祖细胞和脂肪基质血管成分配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为7-8。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。在本发明的优选实施例中，所述的有效量为：10±5×106个细胞。优选地，所述的有效量细胞一次性注射完毕。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的脂肪间充质祖细胞，脂肪基质血管成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述脂肪间充质祖细胞和脂肪来源基质血管成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明的药物组合物优选为椎间盘内注射试剂。在另一优选例中，所述的椎间盘内注射试剂中，脂肪间充质祖细胞的浓度为0.1-10×107个/ml，较佳地为0.2-5×107个/ml，更佳地为0.5-3×107个/ml。
椎间盘退行性变及其治疗
椎间盘退行性变(DegenerativeDiscDisease,DDD)是一种自然的衰老过程。随着年龄的增长，椎间盘逐渐失去柔韧性、弹性和减震的功能。椎间盘退行性变的确切机制还有待研究，但主要是由于机械、营养、生物等各种因素造成损伤，导致椎间盘细胞因子减少，炎症介质增多、基质金属蛋白酶和其它蛋白水解酶含量及活性增加，引起细胞外基质降解，髓核细胞数目减少，进而使蛋白多糖、胶原的合成减少，椎间盘类软骨细胞赖以生存的内环境被破坏，不能维持椎间盘内应有的张力，从而导致椎间盘的退行性变。
本发明中，对于椎间盘退行性变，采用注射脂肪间充质祖细胞，或含有脂肪间充质祖细胞的药物组合物的方式进行治疗，所述的注射方式优选为椎间盘内注射，如X线引导下椎间盘内注射。
本发明的主要优点：
(1)提供了一种用于治疗椎间盘退行性变的脂肪间充质祖细胞复合物，所述的脂肪间充质祖细胞组合物施用后可以对椎间盘退行性变起到一定的治疗或逆转效果。
(2)脂肪间充质祖细胞来源丰富、取材方便、免疫原性低，在临床应用具有广阔前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1haMPC的制备
一、试剂和耗材
1.无菌手术器械及耗材
(1)无菌长柄手术镊子5把
(2)无菌100目滤网
(3)灭菌40目滤网
(4)50ml离心管
2.无菌试剂：
(1)DMEM(基础培养基)、StemProMSCSFMCTS培养基(life)；
(2)I型胶原酶(现配现用)：0.1％胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培养基中，用之前37℃进行预热；
(3)氯化钠注射液；
二.实施方案
1.洗涤脂肪组织，除去血细胞。向离心管中加入20ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液变为清澈。
2.分离基质血管组分(SVF)：加入等量新配制的预热的胶原酶Ⅱ溶液，37℃，200rpm，消化40-60分钟，将消化后的组织用无菌100目滤网过滤，室温1500rpm离心5分钟，得到的沉淀即为脂肪来源基质血管成分。
3.细胞培养：净化沉淀：离心后，脂肪来源基质血管成分沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。用适量DMEM重悬细胞，细胞培养于无血清，无抗生素的培养基中培养细胞，细胞融合达80％时传代细胞。培养至3-10代收获脂肪间充质祖细胞。
4.细胞回输：将收获的细胞注入生理盐水，制备成细胞悬液,以备回输使用。
三.结论:
1.细胞分离培养实验结果
经上述方法分离的细胞得率：5×105～1×106cells/ml脂肪
培养第7天，P1代细胞扩增的倍数可以达到1-2倍；
培养第14天，P2代细胞扩增的倍数可以达到4-6倍；
培养第21天，P3代细胞扩增的倍数可以达到10倍。
2.脂肪干细胞分化的免疫染色分析
脂肪间充质祖细胞成软骨、成骨、成脂分化能力测试
以实施例1所培养的细胞作为本发明组，进行成软骨、成骨、成脂分化能力测试。体外向软骨方向分化培养3-4周后阿辛蓝染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向软骨分化的能力(图1B)；体外向骨方向分化培养3-4周后茜素红染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向骨分化的能力(图1C)；体外向脂肪方向分化培养3-4周后油红O染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向脂肪分化的能力(图1A)。
3.细胞的流式检测
通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为1×105cells/mL，1,800r/min(120g)离心5min，弃掉上清，用4℃的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800r/min，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至1mL，加入抗体5～10μL，避光，冰上放置30min。用D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2～3次，确保将未结合抗体除净。最后，加入约200至300μL的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测。
haMPC流式检测结果
I型胶原酶消化方法分离、培养的P3代细胞MSCs表面抗原流式鉴定结果如图3所示，流式检测试验图谱如下表2中所示。
表2流式检测试验图谱
4.脂肪间充质祖细胞表达细胞因子的检测
实施例1中所培养的脂肪间充质祖细胞离心后重悬，调整细胞密度接种，48h后收集上清，检测细胞因子TGF-β1，HGF和VEGF，检测结果见下表。
| 细胞因子 | TGF-β1 | HGF | VEGF |
| 结果(pg/ml/106细胞) | 1256 | 9663 | 747 |
结论：该脂肪间充质祖细胞能够表达TGF-β1，HGF和VEGF。
结论：
该结果表明：通过流式细胞仪对脂肪间充质祖细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析该细胞纯度高，大部分为脂肪间充质祖细胞，其中CD29、CD73、CD90、CD49d为间充质祖细胞的阳性标记，CD34、CD45、CD14、HLA-DR、Actin为间充质祖细胞的阴性标记。
实施例2兔椎间盘退行性变治疗
本实验采用4-6月龄，2.5-3.0kg新西兰大白兔，共60只。
共分5组：正常对照组、模型对照组、HA组、低剂量haMPCs+HA组、高剂量haMPCs+HA组，每组12只。兔腰椎间盘退行性变模型成功后4周，使用26G皮下注射针头注射：
正常对照组：L2-L3、L3-L4、L4-L5椎间盘内注射40ulPBS；
模型对照组：L2-L3、L3-L4、L4-L5造模但不进行治疗；
HA组：L2-L3、L3-L4、L4-L5造模+椎间盘内注射40ulHA(Diluted)；
低剂量haMPCs+HA治疗组：L2-L3、L3-L4、L4-L5造模+椎间盘内注射20ulhaMPCs+20ulHA(Diluted)(haMPCs：2×104cells)；
高剂量haMPCs+HA治疗组：L2-L3、L3-L4、L4-L5造模+椎间盘内注射20ulhaMPCs+20ulHA(Diluted)(haMPCs：1×105cells)。
其中，低剂量和高剂量组中，注射制剂用如实施例1中制备的haMPCs悬浮于透明质酸中制备。
治疗后4周，每组实验动物分别进行MRI检测椎间盘高度，结果如附图4中所示。结果显示，低剂量组和高剂量组治疗后椎间盘高度都有所增加，且高剂量组的椎间盘高度增加更为明显，说明haMPCs对椎间盘高度的恢复呈剂量依赖。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种脂肪间充质祖细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗椎间盘退行性变的药物组合物；优选地，所述的脂肪间充质祖细胞是具有分化为软骨的能力的细胞。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(i)90％以上的细胞具有表面抗原CD29；
(ii)90％以上的细胞具有表面抗原CD73；
(iii)90％以上的细胞具有表面抗原CD49d；
(iv)90％以上的细胞具有表面抗原CD90。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(v)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD34；
(vi)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD45；
(vii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原Actin；
(viii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；
(ix)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD14。
4.一种用于预防或治疗椎间盘退行性变的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：有效量的脂肪间充质祖细胞，以及药学上可接受的载体；优选地，所述的脂肪间充质祖细胞具有分化为软骨的能力。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(i)90％以上的细胞具有表面抗原CD29；
(ii)90％以上的细胞具有表面抗原CD73；
(iii)90％以上的细胞具有表面抗原CD49d；
(iv)90％以上的细胞具有表面抗原CD90。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
(v)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD34；
(vi)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD45；
(vii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原Actin；
(viii)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；
(ix)在细胞群中，5％以下的细胞具有表面抗原CD14。
7.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞还表达细胞因子，且所述的细胞因子选自下组：TGF-β1，HGF，VEGF，或其组合。
8.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括透明质酸。
9.如权利要求4-8任一所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：0.001-10ml的透明质酸(HA)，以及悬浮于所述的透明质酸中的脂肪间充质祖细胞。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中，所述的脂肪间充质祖细胞的浓度为1×106/ml-1×108/ml。
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|---|---|---|---|---|
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