CN102586181A

CN102586181A - 无co2条件下诱导间充质干细胞分化成骨细胞的培养方法

Info

Publication number: CN102586181A
Application number: CN2012100254494A
Authority: CN
Inventors: 王金福; 陈键
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-02-07
Also published as: CN102586181B

Abstract

本发明提供了一种无CO₂条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法，所述方法包括：将第3代的人骨髓间充质干细胞，在5％CO₂、37℃条件下培养过夜；待细胞完全贴壁并生长到大约80％融合时，更换诱导培养基，在无CO₂、37℃条件下培养14～21天，获得成骨细胞；所述诱导培养基由基础培养基添加胎牛血清、青霉素、链霉素、地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C制成，所述基础培养基按如下终浓度组成配制：碳酸氢钠0.41g/L；十二水合磷酸氢二钠1.5g/L；磷酸二氢钾0.07g/L；氯化钠8.17g/L；溶剂为不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基。使用本发明提供的新型培养基配方，能正常诱导间充质干细胞成骨分化，且分化效果良好，既节省了设备耗费，又适用于无CO₂条件下的细胞培养和诱导分化研究。

Description

无CO2条件下诱导间充质干细胞分化成骨细胞的培养方法

(一)技术领域

本发明涉及一种无CO₂条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法。

(二)背景技术

细胞的体外培养技术已经历了约一百年的发展历史，并从上世纪五十年代后期开始得到飞速发展。作为生物学研究最基本的技术手段，细胞体外培养技术广泛应用于各个研究领域。目前细胞体外培养系统通常包括：常规培养基(含有细胞生长所需的各类氨基酸、糖类、无机盐、维生素等)、10％血清、20％O₂、5％CO₂和37℃恒温等。CO₂是提供细胞正常生长所需的成分，但它必须与常规培养基中的高浓度碳酸氢钠联用，构成缓冲体系，来维持pH稳定。如果培养环境中无CO₂，则培养基中的碳酸氢钠会迅速分解为碳酸钠，使pH过高导致细胞死亡。随着生物学研究的深入及研究领域的扩展，传统培养基已经难以满足一些特殊条件下研究的需求，因为很多时候往往需要在无CO₂条件下进行细胞培养和诱导分化，这在利用航天器搭载进行太空细胞生物学研究中尤为突出。

我国航天技术已跻身世界领先地位，并正式实施启动了一系列空间生命科学研究。然而，人类在太空失重环境下长期工作和生活会导致失重性的骨质变化，主要表现为骨量减少，骨矿度降低，钙排出增多，血钙升高，出现负钙平衡，导致骨密度下降和骨质疏松，最终使骨力学性能下降，骨折风险增高。大量研究表明，微重力环境导致人骨髓间充质干细胞向骨细胞方向分化的潜能降低是引起骨质变化的重要原因。因此，有必要利用各种航天器的搭载条件，进行真实太空环境下空间微重力影响骨细胞分化的生物学效应及其分子机制的研究，对今后开展人类在深空微重力环境下骨质变化的预防和治疗研究以及药物开发提供理论依据具有至关重要的作用。然而，由于受到航天器搭载的有效载荷、容积、装置设计以及安全等因素的限制，往往无法搭载CO₂储存罐来提供空间细胞培养所需的高浓度CO₂。因此，设计一种在无CO₂环境下能正常培养并诱导细胞定向分化的方法具有重要的科学和技术意义。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种在无CO₂条件下，能体外正常培养和诱导间充质干细胞定向分化成骨细胞的新型培养方法。

本发明是通过对传统培养基进行改造，调整其关键缓冲盐体系的成分及浓度，从而达到在无CO₂的特殊条件下，正常培养并诱导间充质干细胞定向分化成骨细胞的目的。本发明通过以下方案实现：

一种无CO₂条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法，所述方法包括：

(1)收集培养至第3代的人骨髓间充质干细胞，用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α-MEM培养液调节细胞密度至1×10⁵个/ml，制备得到细胞悬液；

(2)将步骤(1)细胞悬液以0.5ml/孔接种至24孔板中，5％CO₂、37℃条件下培养过夜；

(3)待细胞完全贴壁并生长到大约80％融合时，更换本发明新型诱导培养基，在无CO₂、37℃条件下培养14～21天，获得成骨细胞；所述本发明新型诱导培养基由本发明新型基础培养基添加常规胎牛血清、青霉素、链霉素、地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C制成，所述本发明新型基础培养基按如下终浓度组成配制：碳酸氢钠0.41g/L；十二水合磷酸氢二钠1.5g/L；磷酸二氢钾0.07g/L；氯化钠8.17g/L；溶剂为不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基。

常规情况下，间充质干细胞的传统培养基为L-DMEM细胞培养基(Gibco公司，货号11885084)，其主要成分包括：各类氨基酸、维生素、无机盐(含3.7g/L碳酸氢钠)、葡萄糖(1000mg/L)、丙酮酸等。其中，无机盐既是细胞正常生长所必需的成分，又能构成缓冲体系，维持培养液pH稳定。在上述传统培养基的基础上，添加一定浓度的胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素、C青霉素和链霉素，即可制备诱导间充质干细胞定向分化成骨细胞的传统诱导培养基。

本发明针对传统培养基无法在无CO₂条件下培养细胞的缺点，购买不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基(Gibco公司，货号31600034)，对其无机盐缓冲体系进行调整，即在该培养基中加入碳酸氢钠(终浓度为0.41g/L。国药集团化学试剂有限公司)、十二水合磷酸氢二钠(终浓度为1.5g/L。国药集团国药集团化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾(终浓度为0.07g/L。国药集团国药集团化学试剂有限公司)，并用氯化钠调节渗透压(终浓度为8.17g/L。国药集团化学试剂有限公司)，配置本发明新型基础培养基。然后，在本发明新型基础培养基中通过添加常规浓度的胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、青霉素和链霉素，配制得到本发明新型的诱导培养基。

根据本发明配制新型培养基，调节pH至7.2后0.22μm滤器过滤除菌，即可4℃保存备用。

本发明关键在于对基础培养基中碳酸氢钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠等组分的浓度进行了调整，所添加的胎牛血清、青霉素、链霉素、地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C为常规用量。优选的，所述诱导培养基由基础培养基添加10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素/100U/ml链霉素、10nM地塞米松、10nMβ-甘油磷酸钠和50μg/ml维生素C制成。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明提供的新型基础培养基配方能使间充质干细胞在无CO₂条件下，正常生长且不影响细胞活性；

(2)以本发明提供的新型基础培养基配方为基础配制成骨诱导培养基，能正常诱导间充质干细胞成骨分化，且分化效果良好；

(3)使用本发明提供的新型培养基配方，既节省了设备耗费，又适用于无CO₂条件下的细胞培养和诱导分化研究。

(四)附图说明

图1为诱导前、诱导2天、诱导4天和诱导14天的细胞形态；

图2为诱导培养14天后，各处理组细胞数量；

图3为诱导培养14天后，各处理组MTT检测结果；

图4为诱导培养14天后，各处理组碱性磷酸酶钙钴法染色结果；

图5为ALP凝胶电泳及分析结果；

图6为Runx2凝胶电泳及分析结果；

图7为诱导培养14天后，各处理组ALP活性定量测定结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型基础培养基配制

表1：本发明新型基础培养基详细配方

本发明新型基础培养基具体配方参见表1，新型基础培养基配制方法如下：

1)取三蒸水灭菌后，配制培养基所需器皿用灭菌三蒸水清洗并烘干备用。

2)取1包L-DMEM细胞培养基干粉(Gibco公司，货号31600034，净重10.0g，含6.4g氯化钠，不含碳酸氢钠和十二水合磷酸氢二钠)，溶于950ml灭菌三蒸水中，磁力搅拌机充分搅拌溶解。再依次称取0.41g碳酸氢钠(国药集团化学试剂有限公司)，1.5g十二水合磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)，0.07g磷酸二氢钾(国药集团国药集团化学试剂有限公司)1.77g氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)加入培养基中，充分搅拌溶解。

3)用pH计调节培养基pH至7.2后用灭菌三蒸水定容至1L。此时碳酸氢钠终浓度达到0.3g/L，十二水合磷酸氢二钠浓度达到0.5g/L，氯化钠浓度达到6.617g/L。

4)定容后的培养基用0.22μm滤器过滤除菌，然后加入青霉素和氯霉素(使终浓度均为100U/ml)并分装后4℃保存，备用。

实施例2：人骨髓间充质干细胞制备

取离体的成人骨髓进行人骨髓间充质干细胞原代分离、纯化，并用传代扩增到第三代的细胞诱导分化成骨细胞。具体方法如下：

1)收集离体成人骨髓3～4ml，加入35～45ml磷酸缓冲液(PBS)后，于1800rpm下离心5min；

2)吸去上清及脂肪层，至离心管内剩余8ml液体；

3)剩余8ml液体和沉淀反复吹打均匀后，缓慢加入到密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，与2000rpm下离心25min。

4)收集单个核细胞层，加入35-45ml PBS，于1800rpm下离心5min。

5)弃上清后，用4ml含10％胎牛血清的α-MEM培养液(α-Modified Eagle Medium，杭州荧光泰生物技术有限公司，杭州)重悬细胞，然后接种于底面积为25cm²的培养瓶中，放置于37℃和5％CO₂的培养箱内培养。培养4天后半量换液，以后每隔3天全量换液一次。

6)当原代培养的细胞生长到大约90％铺层时，用0.25％胰酶/1mMEDTA于37℃下消化1分钟，然后以1∶1的比例加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基以中和胰蛋白酶的活性，并用吸管轻轻吹打细胞，直到贴壁细胞悬浮。

7)离心洗涤细胞一次，再用10％胎牛血清的α-MEM培养液重新悬浮细胞，按1∶2进行传代培养。传至第三代的骨髓间充质干细胞备用于成骨细胞诱导分化。

实施例3：细胞接种及实验组设计

1)收集培养至第3代的人骨髓间充质干细胞，用含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α-MEM培养液调节细胞密度至1×10⁵个/ml，制备细胞悬液。

2)将上述细胞悬液以0.5ml/孔接种至24孔板中，即每孔接种5×10⁴个细胞。将24孔板放入5％CO₂，37℃恒温培养箱中，培养过夜。

3)待细胞完全贴壁并生长到大约80％融合时，按照表2分组条件换上基础培养基或诱导培养基进行培养或诱导分化实验，每隔2天全量换液1次。

实验组设计如下：

表2：处理分组及培养条件设置

处理组	CO₂条件	培养基类型
			1	无	本发明新型基础培养基

2	无	本发明新型诱导培养基
			3	5％	传统基础培养基
4	5％	传统诱导培养基
			5	无	传统基础培养基
6	无	传统诱导培养基

传统诱导培养基配置：在传统基础培养基(L-DMEM细胞培养基，Gibco公司，货号11885084)中添加10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素、10nM地塞米松、10nMβ-甘油磷酸钠和50μg/ml维生素C。

本发明新型诱导培养基配置：在本发明新型基础培养基(组成详见实施例1)中添加10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素、10nM地塞米松、10nMβ-甘油磷酸钠和50μg/ml维生素C。

实施例4：细胞生存状态及活性比较分析

一、细胞形态比较分析

诱导2天后，第5和第6处理组中细胞大量漂浮、死亡，到第4天细胞已全部死亡。两两比较第1和第3处理组及第2和第4处理组，发现诱导过程中细胞形态均未见明显差异，参见图1。表明使用本发明进行细胞培养、诱导分化，不会对细胞形态造成影响。其中图1a所示为诱导前各处理组的细胞形态；图1b所示为诱导2天后各处理组的细胞形态；图1c所示为诱导4天后各处理组的细胞形态；图1d所示为诱导14天后各处理组的细胞形态。

二、通过DNA总量测定比较分析细胞存活状况

1、DNA含量检测

1)待细胞诱导培养14天后，消化细胞，吸取细胞悬液至离心管中，1500rpm，25℃，离心5min后吸去上清，再用PBS清洗1次。

2)向离心管中加入500μl蛋白酶K，振荡溶解沉淀，反复冻融3次后，45℃孵育6h。

3)孵育完毕后，加入500μl浓度为2μg/ml的Hoechst 33258(使终浓度为1μg/ml)，室温避光放置5-10min。

4)吸取200μl上述混合液于96孔板中，多功能酶标仪检测350/450nm处吸光值。

5)根据标准曲线，算出样品裂解液的DNA浓度，并换算出DNA含量。

6)按照9.3pg/cell(hMSC)计算细胞数量。

结果参见图2。从图中可以看出，第1和第3处理组之间细胞数量无显著差异，第2和第4处理组之间细胞数量无显著差异。表明使用本发明进行细胞培养、诱导分化，不会对细胞生存造成影响。

三、MTT法比较分析细胞活性

1)配制5mg/ml的MTT溶液：称取MTT0.05g，溶于10ml的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤器过滤以除去溶液中的细菌，放在4℃避光保存。

2)待间充质干细胞诱导分化14天后，每孔加入MTT(终浓度为0.5mg/ml)，培养箱内继续培养4小时。

3)终止培养，小心吸去孔内培养液。

4)每孔加入适量DMSO(24孔板每孔为400μl)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

5)吸取150μl上述结晶溶解液于96孔板中，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

MTT结果参见图3。从图中可以看出，第1和第3处理组之间细胞活性无显著差异，第2和第4处理组之间细胞活性无显著差异。表明使用本发明进行细胞培养、诱导分化，不会对细胞活性造成影响。

实施例5：定向诱导间充质干细胞成骨分化的比较分析

碱性磷酸酶(ALP)的基因表达和活性水平以及Runx2基因的表达水平是检验是否有效分化成骨细胞的重要指标。本实施例通过碱性磷酸酶钙钴法染色、RT-PCR以及碱性磷酸酶活性定量分析方法进行了不同实验处理诱导分化结果分析。

一、碱性磷酸酶钙钴法染色

1)待24孔板中的细胞诱导14天后，吸去培养液，PBS清洗3次，每孔各加入95％乙醇400μl，室温固定10min。

2)小心吸去乙醇，蒸馏水清洗3次。

3)每孔各加入孵育液300μl，37℃孵育4小时。其中孵育液需现配现用，配方如下：3％β-甘油磷酸钠2.5ml，2％巴比妥钠2.5ml，蒸馏水5ml，2％氯化钙5ml，2％硫酸镁0.5ml依次混合。根据需要的量配，1ml分3-4个孔。

4)孵育完毕，小心吸去孵育液，蒸馏水清洗3次。

5)每孔各加入2％硝酸钴水溶液300μl，反应3min。

6)反应完毕，小心吸去硝酸钴水溶液，蒸馏水清洗3次。

7)每孔各加入1％硫化铵水溶液300μl，反应2min。

8)反应完毕，小心吸去硫化铵水溶液，蒸馏水清洗3次。

9)显微镜下观察染色结果，并拍照保存。

染色结果参见图4a(第1处理组，本发明新型基础培养基)、4b(第2处理组，本发明新型诱导培养基)、4c(第3处理组，传统基础培养基)、4d(第4处理组，传统诱导培养基)。比较图4a和4c可以看出，两者间染色效果均不明显且差异不大；比较图4b和4d可以看出，两者间染色效果均十分明显且差异不大；比较图4a和4b可以看出，两者间染色效果差异显著；比较图4c和4d可以看出，两者间染色效果差异显著。

碱性磷酸酶钙钴法染色结果说明，使用本发明在体外无CO₂条件下培养人骨髓间充质干细胞，不会使其分化；使用以本发明配制的诱导培养基，在体外无CO₂条件下能正常诱导人骨髓间充质干细胞定向成骨分化。

二、成骨分化相关基因检测

采用半定量RT-PCR检测成骨分化相关基因的表达情况，先用TRIzlL提取总RNA，再用Fermentas公司生产的cDNA第一链合成试剂盒反转录得到第一链cDNA，并以此做模板PCR扩增Runx2、ALP等成骨分化特异基因。

1、样品总RNA提取

1)待细胞诱导培养到14天后，吸去培养液，用PBS清洗1次。

2)24孔板中每孔加入40μl RNAiso Plus，水平放置片刻使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落

3)将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹打至裂解液中无明显沉淀，然后室温静置5min。

4)加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管，用手剧烈振荡15s。待溶液充分乳化无分相后，再室温静置5min。

5)12000g，4℃离心15min。

6)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆分为3层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中。

7)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，在15～30℃下静置10min。

8)12000g，4℃离心10min。

9)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g，4℃离心5min后小心弃去乙醇。

10)室温干燥沉淀2～5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

2、cDNA第一链合成

1)总RNA样品用DNA酶消化处理清除残余的基因组DNA污染，用紫外分光光度计测定(波长260nm)RNA浓度。

2)取2μg总RNA，1μl oligo(dT)18引物，1μl随机引物，ddH₂O补至总体积12μl，置70℃反应5min。

3)加入5×buffer 4μl、dNTP 2μl、ribolock^TMRNase inhibitor 1μl和RevertAid^TMM-MuLV反转录酶1μl，反应总体积为20μl，25℃反应5min→42℃反应60min→70℃反应10min。

4)合成的cDNA第一链用于下一步PCR反应。

3、PCR扩增

1)将上面制备的cDNA进行PCR扩增，所用引物序列如下：

2)PCR反应体系如下：cDNA2μl、2mM dNTP1μl、20μM的上下游引物各1μl、10×buffer(含Mg²⁺)5μl和TaqDNA聚合酶1μl，加ddH₂O补至总体积50μl。

3)PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30循环，72℃延伸5min，退火温度和循环次数根据引物的具体情况进行选择。

4)扩增完毕后，取5μl扩增产物加1μl溴酚蓝指示剂，用1.0％的琼脂糖进行凝胶电泳。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统观测结果，拍照。

5)各凝胶电泳条带用Image J软件分析，用对应的GAPDH标准化进行半定量分析。结果采用two-way ANOVA和Dunnett t检验法进行统计分析，^*表示差异显著(P＜0.05)；^**表示差异非常显著(P＜0.01)；^***表示差异极为显著(P＜0.001)。

图5a为ALP基因检测凝胶电泳结果，图5b为凝胶电泳分析数据结果。从图中可看出，培养14天后，第1处理组(本发明新型基础培养基)、第3处理组(传统基础培养基)的ALP表达水平均极低，且它们之间无显著差异；诱导14天后，第2处理组(本发明新型诱导培养基)和第4处理组(传统诱导培养基)均高水平表达ALP，且表达水平差异不显著。

检测Runx2基因的表达也有相似结果，参见凝胶电泳结果(图6a)和凝胶电泳分析数据结果(图6b)。

三、碱性磷酸酶活性定量检测

待细胞诱导培养14天后，加入RIPA细胞裂解液裂解细胞，收集总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测蛋白浓度。然后用ALP活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)定量检测ALP活性。

1、总蛋白提取

1)待细胞诱导培养14天后，吸去培养液，用预冷的PBS洗涤1次。

2)24孔板中每孔加入RIPA细胞裂解液(含1mM PMSF)，冰上裂解3-5min。

3)充分裂解后，收集混合液于1.5mL EP管中，4℃下12000rpm离心5min，收集上清。

2、BCA法检测蛋白浓度

1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

2)完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

3)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板中，加PBS补足到20μl。

4)加适当体积样品到96孔板中，加PBS补足到20μl。

5)每孔加入200μl BCA工作液，37℃孵育30min。

6)测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

3、ALP活性检测试剂盒定量检测ALP活性

1)取30μl待测样品与0.5ml缓冲液以及0.5ml基质液充分混匀，37℃水浴15min。

2)加入1.5ml显色剂，立即混匀，520nm处测各管吸光度。

3)ALP活性以每克蛋白每分钟在37℃条件下能催化产生多少mg酚为单位来定量表示。

ALP活性定量检测结果参见图7，从图中可看出，培养14天后，第1处理组(本发明新型基础培养基)、第3处理组(传统基础培养基)的ALP活性均极低，且它们之间无显著差异；诱导14天后，第2处理组(本发明新型诱导培养基)和第4处理组(传统诱导培养基)均有高水平ALP活性，且活性差异不显著。

结论：

(1)本发明提供的新型基础培养基可使间充质干细胞在无CO₂条件下正常存活：

通过DNA总量测定、MTT法检测细胞活性等实验表明，与传统培养基和传统成骨诱导培养基相比，本发明提供的新型基础培养基和新型成骨诱导培养基在无CO₂条件下培养、诱导间充质干细胞，不影响细胞的生存和活性。

(2)本发明提供的新型诱导培养基可在无CO₂条件下，正常诱导间充质干细胞定向成骨分化：

使用本发明提供的新型成骨诱导培养基，对人骨髓间充质干细胞诱导培养14天后，通过碱性磷酸酶钙钴法染色、成骨相关基因检测、碱性磷酸酶活性定量测定等检测手段，表明诱导效果与传统成骨诱导培养基的诱导效果无显著差异。

(3)使用本发明提供的新型培养基，既节省了设备耗费，又适用于无CO₂条件下的细胞培养和诱导分化研究。

Claims

1.一种无CO₂条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法，所述方法包括：

(3)待细胞完全贴壁并生长到80％融合时，更换诱导培养基，在无CO₂、37℃条件下培养14～21天，获得成骨细胞；所述诱导培养基由基础培养基添加胎牛血清、青霉素、链霉素、地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C制成，所述基础培养基按如下终浓度组成配制：碳酸氢钠0.41g/L；十二水合磷酸氢二钠1.5g/L；磷酸二氢钾0.07g/L；氯化钠8.17g/L；溶剂为不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述诱导培养基由基础培养基添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素/100U/ml链霉素、10nM地塞米松、10nMβ-甘油磷酸钠和50μg/ml维生素C制成。