JP7081483B2 - 被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年4月19日に日本に出願された特願2016-083947号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上を含んでいてもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、さらに、繊維芽細胞、神経細胞、樹状細胞、マクロファージ、及び肥満細胞からなる群より選択される1種以上を含んでいてもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、繊維芽細胞を含み、前記細胞構造体中の血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、繊維芽細胞の細胞数の0.1%以上であってもよい。
本発明の第二態様に係る脈管新生阻害活性評価用キットは、上記第一態様に係る被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法を行うためのキットであって、脈管網構造を備える細胞構造体と、前記細胞構造体を収容する細胞培養容器とを備える。
上記第二態様において、前記細胞構造体が、繊維芽細胞層に挟まれた脈管網構造を備えていていもよい。
また、本発明に係る脈管新生阻害活性評価用キットを用いることにより、前記評価方法をより簡便に実施することができる。
本発明及び本願明細書において、「細胞構造体」とは、複数の細胞層が積層された3次元構造体である。本実施形態において用いられる細胞構造体は、脈管網構造を備えており、脈管を構成する内皮細胞と、脈管を構成していない細胞(内皮細胞以外の細胞)と、により構成される。すなわち、本実施形態において用いられる細胞構造体(以下、「本実施形態に係る細胞構造体」ということがある。)は、脈管を形成していない細胞の積層体の内部に、リンパ管及び/又は血管等の脈管網構造が三次元的に構築され、より生体内に近い組織を構築している。脈管網構造は、細胞構造体の内部にのみ形成されていてもよく、少なくともその一部が細胞構造体の表面又は底面に露出されるように形成されていてもよい。
(a)カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中の細胞混合物から液体成分を除去し、当該細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程。
また、本発明においては、工程(b)において、細胞培養容器内に播種した細胞混合物を当該細胞培養容器内に沈降させることを含み得る。細胞混合物の沈降は、遠心分離等によって積極的に細胞を沈降させてもよいし、自然沈降させてもよい。
の配合比は、1:2~2:1である。本実施形態に係る細胞構造体の構築においては、強電解質高分子と細胞外マトリックス成分との配合比が、1:1.5~1.5:1であることが好ましく、1:1であることがより好ましい。
また、工程(a)の後に、前記工程(b)に代えて、下記工程(b’-1)及び(b’-2)を行ってもよい。本発明及び本願明細書において、「細胞粘稠体」とは、非特許文献2に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
(b’-1)工程(a)で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し細胞粘稠体を得る工程と、
(b’-2)細胞培養容器内に細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程。
上述の工程(a)~(c)を実施することで所望の組織体を得ることができるが、工程(a)の後に(a’-1)および(a’-2)を実施し、工程(b)を実施することで、より均質な組織体を得ることができる。
(c’)播種した混合物から液体成分を除去し、基材上に細胞の層を形成する工程。
例えば、細胞培養容器としてセルカルチャーインサートを用いた場合には、混合物を播種したセルカルチャーインサートを、10℃、400×gで1分間の遠心分離処理に供することによって、液体成分を除去することができる。
本実施形態に係る評価方法において、評価対象となる被検化合物は、脈管新生阻害活性を有することが期待される化合物であればよく、既知の脈管新生阻害剤であってもよく、新規な脈管新生阻害剤の候補化合物であってもよい。既知の脈管新生阻害剤としては、Avastin、EYLEA、Suchibaga、CYRAMZA(登録商標)(Eli Lilly社製、別名ラムシルマブ)、BMS-275291(Bristol-Myers社製)、Celecoxib(Pharmacia/Pfizer社製)、EMD121974(Merck社製)、Endostatin(EntreMed社製)、Erbitaux(ImCloneSystems社製)、Interferon-α(Roche社製)、LY317615(Eli Lilly社製)、Neovastat(Aeterna Laboratories社製)、PTK787(Abbott社製)、SU6688(Sugen社製)、Thalidomide(Celgene社製)、VEGF-Trap(Regeneron社製)、Iressa(登録商標)(Astrazeneca社製、別名ゲフィチニブ)、Caplerusa(登録商標)(Astrazeneca社製、別名パンデタニブ)、Recentin(登録商標)(Astrazeneca社製、別名セディラニブ)VGX―100(Circadian Technologies社製)、VD1andcVE199、VGX-300(Circadian Technologies社製)、sVEGFR2、hF4-3C5、Nexavar(登録商標)(Bayer Yakuhin社製、別名ソラフェニブ)、Vortrient(登録商標)(GlaxoSmithKline社製、別名パゾパニブ)、Sutent(登録商標)(Pfizer社製、別名スニチニブ)、Inlyta(登録商標)(Pfizer社製、別名アキシチニブ)、CEP-11981(Teva Pharmaceutical Industries社製)、AMG-386(Takeda Yakuhin社製、別名トレバナニブ)、anti-NRP2B(Genentech社製)、Ofev(登録商標)(boehringer-ingelheim社製、別名ニンタテニブ)、AMG706(Takeda Yakuhin社製、別名モテサニブ)等が挙げられる。
本実施形態に係る評価方法では、まず、培養工程として、脈管網構造を備える細胞構造体を、被検化合物の存在下で培養する。具体的には、被検化合物を混合した培養培地中で、細胞構造体を培養する。培養培地に混合する被検化合物の量は、細胞構造体を構成する細胞の種類や数、培養培地の種類、培養温度、培養時間等の培養条件を考慮して実験的に決定することができる。培養時間は、特に限定されるものではなく、例えば、24~96時間とすることができ、48~96時間であることが好ましく、48~72時間であることがより好ましい。また、培養環境を著しく変化させない限度において、必要に応じて還流等の流体力学的な付加を加えてもよい。
前記培養工程後の細胞構造体中の脈管の状態を指標として、前記被検化合物が、脈管新生阻害活性を有するか否かを評価する。具体的には、被検化合物の非存在下で培養した場合と比較して、被検化合物存在下で培養した場合に、細胞構造体中の脈管を構成する細胞数が少ない場合、又は細胞構造体中の脈管網構造が損傷を受けている場合に、当該被検化合物が脈管新生阻害活性を有すると評価する。一方で、被検化合物存在下で培養した場合に、被検化合物非存在下での培養と同様に脈管新生が生じていた場合、すなわち、脈管を構成する細胞数の減少が確認されない場合や、脈管網構造に損傷が確認されない場合には、当該被検化合物は脈管新生阻害活性を有さないと評価できる。
その他、脈管を構成する細胞を標識した後の細胞構造体の立体構造を破壊した後、FACS(fluorescence activated cell sorting)等により標識された細胞のみを直接計数することもできる。
繊維芽細胞と血管内皮細胞から形成され、血管網構造を備える細胞構造体を作製し、血管網構造を観察した。
血管網構造を含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Lonza社製、CC-2509、Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Lonza社製、CC-2517A、Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)の2種の2種類の細胞から形成された細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(System Biosciences社製、EXO-FBS-50A-1)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる血管新生阻害剤はベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用いた。
まず、2×106個のNHDFとNHDF細胞数の0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、5.0%のHUVECを、ヘパリンとコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC 数の割合:5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて96時間培養した(工程(c))。
培養後の細胞構造体に対して、anti-CD31抗体(DAKO社製、製品番号:JC70A M082329)と二次抗体(Invitrogen社製、製品番号:A-11001)を用いた蛍光免疫染色を行い、当該構造体中の血管を緑色蛍光標識した。この蛍光標識された細胞構造体を直接観察して血管網形成有無を確認した。
繊維芽細胞と血管内皮細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブの血管新生阻害活性を評価した。
血管網構造を含む細胞構造体の構成細胞としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類を用いた。細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用いた。培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる血管新生阻害剤は、ベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用いた。
まず、2×106個のNHDFと3×104個のHUVECとを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理し、液体成分を除去した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。培養終了後、血管網構造を備えた細胞構造体(NHDF(20層分)とHUVEC(1層分)との混合層(21層))が得られた。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0、1、又は2μgである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。
培養後の細胞構造体に対して、anti-CD31抗体(DAKO社製、製品番号:JC70A M082329)と二次抗体(Invitrogen社製、製品番号:A-11001)を用いた蛍光免疫染色を行い、当該構造体中の血管を緑色蛍光標識した。この蛍光標識された細胞構造体を直接観察し、さらに撮像した蛍光画像に対して画像解析を行い、当該蛍光画像における蛍光発光領域の占有面積を計測した。血管を構成する細胞が多いほど、蛍光発光領域の占有面積は大きくなる。各濃度について、繰り返し3回ずつ測定した。測定結果を表2に示す。
繊維芽細胞、血管内皮細胞、及びがん細胞から形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブの血管新生阻害活性を評価した。
血管網構造を含む細胞構造体の構成細胞としては、実施例2で用いたNHDFとHUVECとに加えて、ヒト結腸直腸腺がん細胞株であるHT29(ATCC番号:HTB-38TM)の3種類を用い、細胞培養容器、培養培地、及びベバシズマブは実施例2で使用した物と同じものを用いた。
細胞懸濁液として、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECのみを含む懸濁液に代えて、2×106個のNHDFと3×104個のHUVECと2×104個のがん細胞とを含む懸濁液を用いたこと以外は、実施例2と同様にして血管網構造を備えた細胞構造体を得た。HUVEC細胞は、予め、蛍光標識(SIGMA社製、製品番号PKH26GL)しておいたものを用いた。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0、1、又は2μgである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。
次に、当該トランズウェルセルカルチャーインサートにトリス緩衝溶液(50mM,pH7.4)を適量添加し、その後、液体成分を除去した。この一連の工程を繰り返し3回実施した。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を300μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で15分間インキュベートした。その後、溶液全量を回収し、あらかじめ0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)が300μL添加された回収用1.5mLチューブに移した。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を100μL添加し、回収用1.5mLチューブと共にCO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で5分間インキュベートした。その後、溶液全量を回収し、回収用1.5mLチューブに移し、更に0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を300μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で5分間インキュベートし、細胞構造体分散液を得た。
得られた細胞構造体の分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているHUVECとして計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。HUVECの生細胞数の計数結果と、算出した生存率(ベバシズマブ0μgの生細胞数を100%とした場合の生細胞数の割合)(%)を表3に示す。
繊維芽細胞と血管内皮細胞から形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブで評価した。
血管網構造を含む細胞構造体としては、ヒト肺線維芽細胞(Normal Human Pulomonary Fibroblasts:NHPF)(Promocell社製、製品番号:C-12360)、及びヒト肺微小血管内皮細胞(Human Dermal Microvascular Endothelial Cell:HMVEC-L)(Lonza社製、製品番号:CC-2527)の2種類の細胞から形成された細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(System Biosciences社製、EXO-FBS-50A-1)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる血管新生阻害剤はベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用いた。
まず、2×106個のNHPF及び1×105個のHMVEC―Lを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHPF数に対するHMVEC―L数の割合:5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0、1、又は2μgである培養培地中で、37℃、5%CO2にて144時間培養した。
培養後の細胞構造体に対して、anti-CD31抗体(DAKO社製、製品番号:JC70A M082329)及び二次抗体(Invitrogen社製、製品番号:A-11001)を用いた蛍光免疫染色を行い、当該構造体中の血管を緑色蛍光標識した。この蛍光標識された細胞構造体を直接観察し、さらに撮像した蛍光画像に対して画像解析を行い、当該蛍光画像における蛍光発光領域の占有面積を計測した。結果を表4に示す。血管を構成する細胞が多いほど、蛍光発光領域の占有面積は大きくなる。各濃度について、繰り返し3回ずつ測定した。
Claims (4)
- (a)カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中の細胞混合物から液体成分を除去し、当該細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程と、
により、脈管網構造を備える細胞構造体を製造した後、
前記細胞構造体を、被検化合物の存在下で培養する培養工程と、
前記培養工程後の前記細胞構造体中の脈管の状態を指標として、前記被検化合物が、脈管新生阻害活性を有するか否かを評価する評価工程と、
を有し、
前記評価工程において、前記被検化合物の非存在下で培養した場合と比較して、前記細胞構造体中の脈管を構成する細胞数が少ない場合、又は前記細胞構造体中の脈管網構造が損傷を受けている場合に、前記被検化合物が脈管新生阻害活性を有すると評価し、
前記細胞構造体が、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上と繊維芽細胞とを含み、
前記細胞構造体中の血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、繊維芽細胞の細胞数の0.1%以上であり、
前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記混合物中の前記細胞外マトリックス成分の濃度が、0.025mg/mL以上1.0mg/mL未満であり、
前記混合物中の前記高分子電解質の濃度が、0.025mg/mL以上1.0mg/mL未満である、
被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法。 - 前記工程(a)において、前記混合物は、前記細胞構造体を構成する全ての細胞を含む、請求項1に記載の被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法。
- 前記細胞構造体が、さらに、神経細胞、樹状細胞、マクロファージ、及び肥満細胞からなる群より選択される1種以上を含む、請求項1又は2に記載の被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法を行うためのキットであって、
脈管網構造を備える細胞構造体と、前記細胞構造体を収容する細胞培養容器とを備え、
前記細胞構造体は、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上と繊維芽細胞と細胞外マトリックス成分と高分子電解質とを含み、かつ構造体全体に脈管網構造が形成されており、
前記細胞構造体中の血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、繊維芽細胞の細胞数の0.1%以上であり、
前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、
脈管新生阻害活性評価用キット。
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---|---|---|---|---|
CN111051495A (zh) * | 2017-08-21 | 2020-04-21 | 凸版印刷株式会社 | 原代培养方法 |
JP2019170469A (ja) * | 2018-03-27 | 2019-10-10 | テルモ株式会社 | リンパ管機能測定装置およびリンパ管機能測定方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015079759A1 (ja) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 国立大学法人大阪大学 | 三次元組織体及びその製造方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2235509A1 (en) * | 1995-10-25 | 1997-05-01 | Ammon B. Peck | In vitro growth of functional islets of langerhans and in vivo uses thereof |
WO2006083782A2 (en) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
US9051550B2 (en) * | 2009-04-09 | 2015-06-09 | Arizona Board Of Regents, On Behalf Of The University Of Arizona | Cellular seeding and co-culture of a three dimensional fibroblast construct |
WO2017183676A1 (ja) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | 凸版印刷株式会社 | 被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法 |
-
2017
- 2017-04-19 WO PCT/JP2017/015807 patent/WO2017183676A1/ja active Application Filing
- 2017-04-19 JP JP2018513206A patent/JP7081483B2/ja active Active
-
2022
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015079759A1 (ja) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 国立大学法人大阪大学 | 三次元組織体及びその製造方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Amano, Y. et al.,Development of vascularized iPSC derived 3D-cardiomyocyte tissues by filtration Layer-by-Layer technique and their application for pharmaceutical assays,Acta Biomater.,2016年,Vol. 33,pp. 110-121 |
Asano, Y. et al.,Ultrastructure of blood and lymphatic vascular networks in three-dimensional cultured tissues fabricated by extracellular matrix nanofilm-based cell accumulation technique,Microscopy,2014年,Vol. 63(3),pp. 1-8 |
Folkman, J. ,Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery?,Nat. Rev. Drug Discov.,2007年,Vol. 6(4),pp. 273-286 |
Nishiguchi, A. et al.,Effects of angiogenic factors and 3D-microenvironments on vascularization within sandwich cultures,Biomaterials,2014年,Vol. 35(17),pp. 4739-4748 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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