JP6973381B2 - 薬剤耐性を有する細胞を作製する方法、抗ガン剤をスクリーニングするための方法、及び抗ガン剤スクリーニング用キット - Google Patents
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Description
本願は、2016年4月19日に日本に出願された特願2016−083952号、および、2016年4月19日に日本に出願された特願2016−083953号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
薬剤耐性を有さない細胞を、薬剤耐性を有する動物から採取された体液試料、薬剤耐性を有する動物から採取された細胞の抽出液、薬剤耐性を有する動物から採取された細胞の培養上清、薬剤耐性を有する培養細胞の抽出液、又は薬剤耐性を有する培養細胞の培養上清のいずれかを含有する培養培地中で培養してもよい。
前記体液試料が、血液、血清、血漿、尿、バフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液又は気管支肺胞洗浄液であってもよい。
前記薬剤耐性を有する培養細胞と、前記薬剤耐性を有さない細胞との細胞の種類が異なっていてもよい。
前記薬剤耐性を有する培養細胞の種類が、ガン細胞、又はガン幹細胞であってもよい。
前記ガン細胞の由来となるガンが、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸ガン、直腸ガン、大腸ガン、肺ガン、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、悪性黒色腫、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、頭頚部ガン、脳腫瘍又は肝臓ガンであってもよい。
前記エクソソームと前記薬剤耐性を有さない細胞を12時間以上培養してもよい。
前記薬剤耐性を有さない細胞2×104個に対する前記エクソソームの数が1×103個以上であってもよい。
本発明の第二態様に係る抗ガン剤をスクリーニングする方法は、薬剤耐性を有さないガン細胞に対して、上記態様に係る方法により薬剤耐性を獲得させる薬剤耐性獲得工程と、前記薬剤耐性獲得工程の後に、薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞に少なくとも1種類の抗ガン剤を接触させ、培養する抗ガン剤投与工程と、前記抗ガン剤投与工程の後に、前記ガン細胞の生存率を算出し、前記抗ガン剤を評価する評価工程と、を備える。
前記薬剤耐性獲得工程において、さらに、前記薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞と少なくとも1種類の他の細胞とを共培養し、三次元的に組織化させてもよい。
前記薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞と共培養する細胞が、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、平滑筋細胞、癌細胞及び癌幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つであってもよい。
本発明の第三態様に係る抗ガン剤スクリーニング用キットは、薬剤耐性を有する生物由来のエクソソームと、薬剤耐性を有さないガン細胞と、を含み、前記薬剤耐性がチロシンキナーゼ阻害剤又はEGFR阻害剤に対する耐性である。
さらに、細胞培養容器を含み、前記ガン細胞が前記細胞培養容器上に備えられていてもよい。
本発明の第一実施形態に係る薬剤耐性を有する細胞を作製する方法は、薬剤耐性を有する生物由来のエクソソームと薬剤耐性を有さない細胞とを接触させ、培養すること(培養工程)によって、薬剤耐性を有する細胞を作製する、方法(作製方法、製造方法)を提供する。
また、本明細書において、「薬剤」とは、細菌、ウイルス等の病原性微生物やガン細胞(悪性新生物)を殺す、或いはその増殖を抑制する化学物質を意味し、特別な限定はない。薬剤としては、例えば、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗原虫薬、抗ガン剤等が含まれ、これらに限定されない。
まず、薬剤耐性を有さない細胞を細胞培養容器に播種し、培養する。
具体的な方法としては、例えば、2段式の培養容器であって、上部の培養容器の底面に薬剤耐性を有する動物から採取された組織、又は薬剤耐性を有する培養細胞を透過しないが、薬剤耐性を有する動物から採取された組織又は薬剤耐性を有する培養細胞から分泌されるエクソソームを透過可能な孔を備える培養容器を用いて、上部の培養器にて薬剤耐性を有する動物から採取された組織、又は薬剤耐性を有する培養細胞を培養し、下部の培養容器にて薬剤耐性を有さない細胞を培養することにより、薬剤耐性を有する動物の組織や培養細胞から分泌されたエクソソームを、薬剤耐性を有さない細胞に接触させてもよい。
Eagle(BME)、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:Nutrient Mixture F−12(DMEM/F−12)、Glasgow Minimum Essential Medium(GlasgowMEM)等が挙げられ、これらに限定されない。
本発明の第二実施形態に係る抗ガン剤をスクリーニングするための方法は、薬剤耐性を有さないガン細胞に対して、上記第一実施形態に係る方法により(第一実施形態に係る作製方法を用いて)薬剤耐性を獲得させる薬剤耐性獲得工程と、前記薬剤耐性獲得工程の後に、薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞に少なくとも1種類の抗ガン剤を接触させ、培養する抗ガン剤投与工程と、前記抗ガン剤投与工程の後に、前記ガン細胞の生存率を算出し、前記抗ガン剤を評価する評価工程と、を備える。
換言すれば、本発明の第二実施形態に係る抗ガン剤をスクリーニングするための方法は、薬剤耐性を有する生物由来のエクソソームと薬剤耐性を有さないガン細胞とを接触させ、培養し、前記ガン細胞に薬剤耐性を獲得させる薬剤耐性獲得工程と、前記薬剤耐性獲得工程の後に、薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞に少なくとも1種類の抗ガン剤を接触させ、培養する抗ガン剤投与工程と、前記抗ガン剤投与工程の後に、前記ガン細胞の生存率を算出し、前記抗ガン剤を評価する評価工程と、を備える。
まず、薬剤耐性を有さないガン細胞を細胞培養容器に播種し、培養する。細胞培養容器としては、上述の第一実施形態に係る<<薬剤耐性を有する細胞を作製する方法>>において例示された容器と同様の容器が挙げられる。
具体的な方法としては、例えば、2段式の培養容器であって、上部の培養容器の底面に薬剤耐性を有する動物から採取された組織、又は薬剤耐性を有する培養細胞を透過しないが、薬剤耐性を有する動物から採取された組織又は薬剤耐性を有する培養細胞から分泌されるエクソソームを透過可能な孔を備える培養容器を用いて、上部の培養器にて薬剤耐性を有する動物から採取された組織、又は薬剤耐性を有する培養細胞を培養し、下部の培養容器にて薬剤耐性を有さないガン細胞を培養することにより、薬剤耐性を有する動物の組織や培養細胞から分泌されたエクソソームを、薬剤耐性を有さないガン細胞に接触させてもよい。
(a)カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中の細胞混合物から液体成分を除去し、当該細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程。
本実施形態においては、工程(a)において、細胞を、カチオン性物質を含む緩衝液(カチオン性緩衝液)および細胞外マトリックス成分と混合し、この細胞混合物から細胞集合体を形成することにより、内部に大きな空隙が少ない立体的細胞組織を得ることができる。また、得られた立体的細胞組織は、比較的安定であるため、少なくとも数日間の培養が可能であり、かつ培地交換時にも組織が崩壊し難い。
また、本実施形態においては、工程(b)において、細胞培養容器内に播種した細胞混合物を当該細胞培養容器内に沈降させることを含み得る。細胞混合物の沈降は、遠心分離等によって積極的に細胞を沈降させてもよいし、自然沈降させてもよい。
工程(a)において、細胞をさらに強電解質高分子と混合することが好ましい。細胞をカチオン性物質、強電解質高分子および細胞外マトリックス成分と混合することにより、工程(b)において遠心分離等の細胞を積極的に集合させる処理を要することなく、自然沈降させた場合であっても、空隙が少なく厚みのある立体的細胞組織が得られる。
前記カチオン性緩衝液に混合する強電解質高分子の量は、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、カチオン性緩衝液中の強電解質高分子の濃度は、0mg/mL超(0mg/mLより高く)1.0mg/mL未満とすることができ、0.025〜0.1mg/mLであることが好ましく、0.05〜0.1mg/mLであることがより好ましい。また、本実施形態においては、前記強電解質を混合せずに前記混合物を調整し、細胞構造体の構築を行うこともできる。
また、工程(a)の後に、前記工程(b)に代えて、下記工程(b’−1)及び(b’−2)を行ってもよい。本実施形態及び本願明細書において、「細胞粘稠体」とは、非特許文献2に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
(b’−1)工程(a)で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し、細胞粘稠体を得る工程と、
(b’−2)細胞培養容器内に細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程。
上述の工程(a)〜(c)を実施することで所望の組織体を得ることができるが、工程(a)の後に(a’−1)および(a’−2)を実施し、工程(b)を実施することで、より均質な組織体を得ることができる。
(c’)播種した混合物から液体成分を除去し、基材上に細胞の層を形成する工程。
続いて、薬剤耐性獲得工程の後に、薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞に少なくとも1種類の抗ガン剤を接触させ、培養する。前記抗ガン剤は、例えば、培地に混合し添加する方法等を用いて、前記薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞に接触させればよい。
続いて、抗ガン剤投与工程の後に、前記ガン細胞の生存率を算出し、前記抗ガン剤を評価する。
ガン細胞の生細胞数のカウントについて詳述すると、ガン細胞の生細胞数は、ガン細胞の生細胞又はその存在量に相関のあるシグナルを用いて評価することができる。評価時点のがん細胞の生細胞数を測定できればよく、必ずしも生きている状態で測定する必要はない。例えば、ガン細胞をその他の細胞と区別するように標識し、当該標識からのシグナルを指標として調べることができる。例えば、ガン細胞を蛍光標識した後、細胞の生死判定を行うことにより、細胞構造体中の生きているガン細胞を直接計数することができる。この際、画像解析技術を利用することもできる。細胞の生死判定はトリパンブルー染色やPI(Propidium Iodide)染色等の公知の細胞の生死判定方法により行うことができる。なお、ガン細胞の蛍光標識は、例えば、ガン細胞の細胞表面に特異的に発現している物質に対する抗体を一次抗体とし、当該一次抗体と特異的に結合する蛍光標識二次抗体を用いる免疫染色法等の公知の手法で行うことができる。細胞の生死判定及び生細胞数の測定は、細胞構造体の状態で行ってもよく、細胞構造体を単細胞レベルに破壊した状態で行ってもよい。例えば、ガン細胞と死細胞を標識した後の細胞構造体の立体構造を破壊した後、標識を指標としたFACS(fluorescence activated cell sorting)等により、評価時点において生きていたガン細胞のみを直接計数することもできる。
一方、非抗ガン剤を投与した群でのガン細胞の生存率が、抗ガン剤非投与群でのガン細胞の生存率と比較して、生存率が変わらない、又は高くなっている場合は、前記ガン細胞において、抗ガン剤に対する薬剤耐性が獲得されており、抗ガン剤が前記ガン細胞に効果がないと判断することができる。
本発明の第三実施形態に係る抗ガン剤スクリーニング用キットは、薬剤耐性を有する生物由来の液性物質と、薬剤耐性を有さないガン細胞と、を含む。
培養培地等としては、上述の第二実施形態に係る<<抗ガン剤をスクリーニングするための方法>>において例示されたものと同様のものが挙げられる。また検出装置としては、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、2光子励起スキャナー、蛍光顕微鏡等が挙げられる。
薬剤耐性を有する生体試料としては、Cetuximab(メルクセローノ社製、アービタックス)に対して耐性を有するヒト結腸直腸腺ガン細胞株HCT116(ATCC(登録商標) CCL−247)を用い、薬剤耐性のない細胞としては、ヒト結腸直腸腺ガン細胞株HT29(ATCC(登録商標) HTB−38TM)を用いた。
また、培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、#3470)を用い、培地としては、10vol/vol%ウシ血清(System Biosciences社製、EXO−FBS−50A−1)、1vol/vol%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、168−23191)含有D−MEM(和光純薬社製、043−30085)を用いた。
薬剤については、終濃度1mg/mL Cetuximab(メルクセローノ社製、アービタックス)を用いて、繰り返し3回ずつ評価を実施した。
薬剤耐性細胞株由来のエクソソームについては、ヒト結腸直腸腺ガン細胞株HCT116(ATCC(登録商標) CCL−247)の培養上清から超遠心処理にて回収したエクソソームを用い、0個(条件A)(薬剤耐性細胞株由来のエクソソーム無添加)、1×109個(条件B)の2条件について評価を実施した。
なお、生細胞数解析について、詳述すると、以下の通りである。
まず、当該トランズウェルセルカルチャーインサートにトリス緩衝溶液(50mM,pH7.4)を適量添加し、その後、液体成分を除去する。この一連の工程を繰り返し3回実施する。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を300μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で15分間インキュベートする。その後、溶液全量を回収し、あらかじめ0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)が300μL添加された回収用1.5mLチューブに移す。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を100μL添加し、回収用1.5mLチューブと共にCO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で5分間インキュベートする。その後、溶液全量を回収し、回収用1.5mLチューブに移し、更に0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を300μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で5分間インキュベートし、細胞構造体分散液を得た。
この細胞構造体分散液をトリパンブルーに浸漬してライフテクノロジーズ社製セルカウンター(CountessII)の蛍光モードでカウントして、生細胞数を評価した。
薬剤感受性評価については、CNT(残存生細胞率)%=(薬剤を添加した場合の生細胞数)/(薬剤添加しない場合の生細胞数)×100(%)を評価値として用いた。
また、比較として健常者ヒト血清由来のエクソソーム(条件C)を添加した場合及び薬剤耐性を有する生体試料(HCT116)の薬剤感受性(条件D)についても評価を実施した。
詳細な手順は以下に示すとおりである。
(1)2×104個のHT29細胞を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した。
(2)適量の培地を当該トランズウェルセルカルチャーインサートに追加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した。
(1)適量の培地とエクソソームとを混合し、前記条件A〜Dとなるように調製した。
(2)トランズウェルセルカルチャーインサートに添加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24〜96時間培養した。
(1)適量の培地と薬剤とを混合し、終濃度1mg/mLとなるように調製した。
(2)トランズウェルセルカルチャーインサートに添加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて72時間培養した。
(1)上述の方法を用いて、前記条件A〜Dにおける生細胞数を解析し、薬剤感受性を評価した。結果を図1に示す。
また、エクソソーム1×109個(条件B)添加した細胞は、薬剤耐性を有する生体試料(条件D)を添加した細胞とほぼ同様の結果であった。なお、健常人血清由来のエクソソームを用いた場合(条件C)では、逆により奏功する結果が得られた。
薬剤耐性を有する生体試料としては、Cetuximab(メルクセローノ社製、アービタックス)に対して耐性を有するヒト肺胞基底上皮腺ガン細胞株A549(ATCC(登録商標) CCL−185)を用い、薬剤耐性のない細胞としては、ヒト結腸直腸腺ガン細胞株HT29(ATCC(登録商標) HTB−38TM)を用いた。
培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、#3470)を用い、培地としては、10vol/vol%無細胞外分泌小胞体ウシ血清(System Biosciences社製、EXO−FBS−50A−1)、1vol/vol%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、168−23191)含有D−MEM(和光純薬社製、043−30085)を用いた。
薬剤については、終濃度1mg/mLCetuximab(メルクセローノ社製、アービタックス)を用いて、繰り返し3回ずつ評価を実施した。
薬剤耐性細胞株由来のエクソソームについては、ヒト肺胞基底上皮腺ガン細胞株A549(ATCC(登録商標) CCL−185)の培養上清から超遠心処理にて回収した試料(エクソソーム)を用い、0個(条件A)(薬剤耐性細胞株由来のエクソソーム無添加)、1×108(条件F)、1×109個(条件G)の3条件について評価を実施した。
薬剤感受性評価については、CNT%=(前記条件で薬剤を添加した場合の生細胞数)/(薬剤添加しない場合の生細胞数)×100(%)を評価値として用いた。
また、比較として健常者ヒト血清由来のエクソソーム(条件C)を添加した場合及び薬剤耐性を有する生体試料の薬剤感受性(条件H)についても評価を実施した。
詳細な手順については、実施例1の[1]〜[4]と同様の方法を用いて行った。結果を図2に示す。
薬剤耐性を有する生体試料としては、Gefitinib(アストラゼネカ社製、イレッサ錠250)に対して耐性を有するヒト肺がん細胞株A549(ATCC番号:CCL−185)を用い、薬剤耐性のない細胞としては、ヒト肺がん細胞株NCI−H1975(ATCC番号:CRL−5908)を用いた。
また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、#3470)を用い、培地としては、10vol/vol%ウシ血清(System Biosciences社製、EXO−FBS−50A−1)、1vol/vol%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、168−23191)含有D−MEM(和光純薬社製、043−30085)を用いた。
評価に関しては、あらかじめ薬剤耐性のない細胞を蛍光標識(SIGMA社製、PKH67GL)して生細胞数解析にて薬剤感受性を評価した。
薬剤については、終濃度10μM Gefitinibを用いて、繰り返し3回ずつ評価を実施した。
薬剤耐性細胞株由来のエクソソームについてはヒト肺がん細胞株A549(ATCC番号:CCL−185))の培養上清から超遠心処理にて回収したものを用い、0個(薬剤耐性細胞株由来のエクソソーム無添加)、1×109個の2条件について評価を実施した。
生細胞数解析については、実施例1と同様にトリパンブルー溶液を用いてライフテクノロジーズ社製セルカウンター(CountessII)の蛍光モードでカウントして評価した。
薬剤感受性評価については、CNT(残存生細胞率)%=(薬剤を添加した場合の生細胞数)/(薬剤添加しない場合の生細胞数)×100(%)を評価値として用いた。
また、参考として健常人血清由来エクソソーム1×109個を添加した場合についても実施した。
詳細な手順は以下に示すとおりである。
(1)2×104個のNCI−H1975細胞を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した。
(2)適量の培地を当該トランズウェルセルカルチャーインサートに追加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した。
(1)適量の培地とエクソソームとを混合し、エクソソーム0個(薬剤耐性細胞株由来のエクソソーム無添加)、1×109個を含むエクソソーム培地溶液を調製した。
(2)トランズウェルセルカルチャーインサートに添加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した。
(1)適量の培地と薬剤とを混合し、終濃度10μg/mLとなるように調製した。
(2)トランズウェルセルカルチャーインサートに添加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて72時間培養した。
生細胞数解析については、実施例1と同様にトリパンブルー溶液を用いてライフテクノロジーズ社製セルカウンター(CountessII)の蛍光モードでカウントして評価した。
薬剤感受性評価については、CNT(残存生細胞率)%=(薬剤を添加した場合の生細胞数)/(薬剤添加しない場合の生細胞数)×100(%)を評価値として用いた。
なお、健常人血清由来のエクソソームを用いた場合では、エクソソーム0個の試料のCNTとほぼ同等の結果が得られた。
薬剤耐性を有する生体試料としてはCetuximab(メルクセローノ社製、アービタックス)に対して耐性を有する患者血清由来エクソソームを用い、薬剤耐性のない細胞としては、ヒト大腸がん細胞株NCI−H508(ATCC番号:CCL−253)を用いた。
また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、#3470)を用い、培地としては、10vol/vol%ウシ血清(System Biosciences社製、EXO−FBS−50A−1)、1vol/vol%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、168−23191)含有D−MEM(和光純薬社製、043−30085)を用いた。
評価に関しては、あらかじめ薬剤耐性のない細胞を蛍光標識(SIGMA社製、PKH67GL)して生細胞数解析にて薬剤感受性を評価した。
薬剤については、終濃度0.01μg/mL、0.1μg/mLCetuximabを用いて、繰り返し3回ずつ評価を実施した。
エクソソームについては患者血清R11(Cetuximabに対して耐性を有する患者血清由来エクソソーム)から超遠心処理にて回収したものを用い、血清0μL相当(血清由来のエクソソーム無添加)、血清9μL相当(血清9μL相当量のエクソソーム添加量)、血清45μL相当(血清45μL相当量のエクソソーム添加量)の3条件について評価を実施した。
生細胞数解析については、実施例1と同様にトリパンブルー溶液を用いてライフテクノロジーズ社製セルカウンター(CountessII)の蛍光モードでカウントして評価した。
薬剤感受性評価については、CNT(残存生細胞率)%=(薬剤を添加した場合の生細胞数)/(薬剤添加しない場合の生細胞数)×100(%)を評価値として用いた。
また、参考として耐性のない患者血清由来のエクソソームを添加した場合についても実施した。
詳細な手順は以下に示すとおりである。
(1)2×104個のNCI−H508細胞を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した。
(2)適量の培地を当該トランズウェルセルカルチャーインサートに追加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した。
(1)適量の培地とエクソソームとを混合し、血清0μL相当(血清由来のエクソソーム無添加)、血清9μL相当、血清45μL相当のエクソソームを含むエクソソーム培地溶液を調製した。
(2)トランズウェルセルカルチャーインサートに添加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて6時間培養した。
(1)適量の培地と薬剤とを混合し、終濃度0.01μg/mL、0.1μg/mLとなるように調製した。
(2)トランズウェルセルカルチャーインサートに添加後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて72時間培養した。
生細胞数解析については、実施例1と同様にトリパンブルー溶液を用いてライフテクノロジーズ社製セルカウンター(CountessII)の蛍光モードでカウントして評価した。
薬剤感受性評価については、CNT(残存生細胞率)%=(薬剤を添加した場合の生細胞数)/(薬剤添加しない場合の生細胞数)×100(%)を評価値として用いた。
なお、耐性のない患者由来血清45μL相当のエクソソームを添加した細胞も、耐性のある患者由来のエクソソームを無添加の細胞(耐性のある患者由来血清0μL相当のエクソソームを添加した細胞)のCNT%とほぼ同等の結果が得られた。
Claims (17)
- 薬剤耐性を有する生物由来のエクソソームと薬剤耐性を有さない細胞とを接触させ、培養することによって、薬剤耐性を有する細胞を作製する、方法であって、
前記薬剤耐性を有さない細胞が、ガン細胞であり、
前記薬剤耐性がチロシンキナーゼ阻害剤又はEGFR阻害剤に対する耐性であり、
前記薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞における前記チロシンキナーゼ阻害剤又はEGFR阻害剤に対する抵抗性遺伝子の変異が0.1%以下である、方法。 - 薬剤耐性を有さない細胞を、薬剤耐性を有する動物から採取された体液試料、薬剤耐性を有する動物から採取された細胞の抽出液、薬剤耐性を有する動物から採取された細胞の培養上清、薬剤耐性を有する培養細胞の抽出液、又は薬剤耐性を有する培養細胞の培養上清のいずれかを含有する培養培地中で培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記体液試料が、血液、血清、血漿、尿、バフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液又は気管支肺胞洗浄液である、請求項2に記載の方法。
- 前記薬剤耐性を有する培養細胞と、前記薬剤耐性を有さない細胞との細胞の種類が異なる、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記薬剤耐性を有する培養細胞の種類が、ガン細胞、又はガン幹細胞である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記エクソソームが薬剤耐性を有するガン患者から採取されたエクソソームである、請求項1に記載の方法。
- 前記ガン細胞の由来となるガンが、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸ガン、直腸ガン、大腸ガン、肺ガン、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、悪性黒色腫、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、頭頚部ガン、脳腫瘍又は肝臓ガンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エクソソームと前記薬剤耐性を有さない細胞を12時間以上培養する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤耐性を有さない細胞2×104個に対する前記エクソソームの数が1×103個以上である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤又は前記EGFR阻害剤がCetuximab、又はGefitinibである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 抗ガン剤をスクリーニングする方法であって、
薬剤耐性を有さないガン細胞に対して、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により薬剤耐性を獲得させる薬剤耐性獲得工程と、
前記薬剤耐性獲得工程の後に、薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞に少なくとも1種類の抗ガン剤を接触させ、培養する抗ガン剤投与工程と、
前記抗ガン剤投与工程の後に、前記ガン細胞の生存率を算出し、前記抗ガン剤を評価する評価工程と、
を備える、方法。 - 前記薬剤耐性獲得工程において、さらに、前記薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞と少なくとも1種類の他の細胞とを共培養し、三次元的に組織化させる、請求項12に記載の方法。
- 前記薬剤耐性を獲得させた前記ガン細胞と共培養する細胞が、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、平滑筋細胞、癌細胞及び癌幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項13に記載の方法。
- 薬剤耐性を有する生物由来のエクソソームと、
薬剤耐性を有さないガン細胞と、
を含み、
前記薬剤耐性がチロシンキナーゼ阻害剤又はEGFR阻害剤に対する耐性である、抗ガン剤スクリーニング用キット。 - さらに、細胞培養容器を含み、
前記ガン細胞が前記細胞培養容器上に備えられた、
請求項15に記載の抗ガン剤スクリーニング用キット。 - 前記チロシンキナーゼ阻害剤又は前記EGFR阻害剤がCetuximab、又はGefitinibである、請求項15又は16に記載の抗ガン剤スクリーニング用キット。
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