CN104593417A

CN104593417A - 木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系

Info

Publication number: CN104593417A
Application number: CN201510057829.XA
Authority: CN
Inventors: 陈哲; 王公金; 于建宁; 徐小波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明涉及木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。将XynB基因插入真核表达载体pcDNA3.1(-)，并构建慢病毒重组载体Lanti4-blockit-RELMβ-XynB-myc-GFP，转染原代培养的猪胎儿成纤维细胞，构建肠道定向表达XynB酶蛋白的真核细胞系。为进一步开展体细胞核移植克隆转XynB基因胚胎，培育高饲料利用率、低污染物排放的转基因猪新品种及其相关生物学科研与生产领域提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

Description

木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系

一、技术领域

本发明涉木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。

二、背景技术

环境友好型养殖业是畜牧业可持续健康发展的新方向。改革开放以来，随着我国国民经济的全面、快速发展，人民生活需求水平的不断提高，我国畜牧产业规模化取得了空前的发展。然而，随着畜牧场规模化、集约化和机械化程度的提高，畜禽粪便已成为一个不可忽视的污染源。同时，我国是一个养殖大国，饲料产量居世界第二，由于近年来我国养殖业的快速发展，加剧了人畜争粮矛盾，而且耕地面积日益减少，使粮食问题更加严峻。因此，增加饲料的营养价值，提高饲料的利用率和转化率，节约粮食资源就显得尤为重要。木聚糖酶作为一种环保型饲料酶制剂，应用于饲料中提高了饲料的营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产和抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，在发展环境友好型养殖业中具有重要的意义和价值。

木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维的重要组分，广泛存在于植物细胞壁中，它占植物碳水化合物总量的1/3，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的生物质资源。木聚糖可阻止细胞内养分释放、增加食糜黏度、阻碍饲料营养物质与消化液的接触、增加肠道不动水层厚度，使消化器官代偿性增加，并破坏肠道正常结构和微生态平衡，影响营养物质的消化吸收，因此木聚糖是一种典型的抗营养因子，因猪消化道内缺乏相应的内源性消化酶分解饲料中这类抗营养因子，用作猪饲料的玉米、豆粕中的木聚糖难以被有效利用，被直接排出体外，导致了饲料资源的浪费和严重的环境污染。内切β-木聚糖酶（endo-β-XynB）是水解木聚糖的关键酶，目前，国内外已经获得的木聚糖酶产酶微生物主要来源于自然界中的杆菌、黑曲霉菌、青霉菌属、木霉属以及放线菌属，大部分真菌源木聚糖酶具有嗜酸性，但细菌来源的最适pH_opt均高于5.5，本发明选择研究来源于黑曲霉属的木聚糖酶基因，其酶蛋白pH_opt在5.5左右，酶活性在动物胃的酸性环境中较高。

基于以上研究进展，利用木聚糖酶分解植物中木聚糖的生物学特性，综合现在的分子和细胞生物学手段，采用转基因手段在目的动物体细胞中导入具有特殊生物学功能的外源木聚糖酶（XynB）基因，可望进一步通过转基因体细胞克隆技术途径，获得肠道中稳定表达和稳定遗传的转XynB基因的猪新品种（系）。

抵抗素样分子β（resistin-like molecule β）又称发现于炎症带2（Found in inflammatory zone 2，FIZZ2），目前其相关研究主要集中在人类，生物学功能与肠管上皮细胞分化、细胞增殖、肠道免疫应答紧密相关，是研究肠道疾患及其靶向生物治疗的新靶标。研究发现，RELMβ基因高度表达于肠道组织。而RELMβ基因启动子是其高度表达于肠道的关键，相关研究表明，RELMβ基因启动子区包含多个肠上皮特异性转录调控因子。人和猪同源性非常高，因此猪RELMβ基因的生物学功能和启动子结构具有潜在的相似性。本发明克隆得到猪RELMβ启动子序列，并筛选得到活性最强启动子片段，将其构建成XynB基因的肠道定向表达载体，并进一步转染体细胞，构建转XynB基因的猪胎儿成纤维细胞系，解决了转基因猪体内目的基因在肠道内定向表达及其有效发挥其生物学功能的关键技术问题。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是提供木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，是专用于生命科学和畜牧科研与生产的环保型的生物制品，可作为开展环境友好型转基因猪研究提供必要的生物材料及其相关关键技术方法参考。

技术方案木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：

(1)以原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn I酶切位点和Myc-Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：

P1: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I

P2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’ Kpn I

PCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，PCR扩增片段大小为678bp；

将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T-XynB-Myc；

(2)将上述克隆载体pMD18T-XynB-Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段由T4 DNA连接酶4℃连接过夜，得到XynB真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc；

(3)根据XynB基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 XynB-Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与GFP基因互补，P5有部分序列与XynB-Myc基因片段互补，P6引物5’端引入终止密码子TAA；

P3: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I

P4: 5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’

P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’

P6: 5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn I

以pMD18T-XynB-Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增XynB-Myc片段，大小为682bp；以质粒pEGFP-C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为768bp；

以上述扩增产物XynB-Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，该融合片段的大小为1398bp，扩增程序为98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32个循环；72℃，10min；

将上述PCR终产物XynB-myc-GFP片段与pMD18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T-XynB-myc-GFP；

(4)将中间载体pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-myc-GFP目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段采用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(-)-XynB-myc-GFP；

（5）猪RELMβ基因启动子区目前未见报道，猪和人基因同源性极高，根据Genebank中人RELMβ基因5’侧翼区序列AF352731，猪RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端递减原则，设计PCR正向引物P7-P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位点，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位点，扩增不同长度猪RELMβ启动子片段：

	序列5′-3′	目的片段大小/bp
			P7(-842～+215)	CTAGCTAGCGAACTTATGACCATGAGGAC	1048
P8(-793～+215)	CTAGCTAGCGATGAAGAGCCACTGAAC	1017
			P9(-574～+215)	CTAGCTAGCAAATATGGCCCTAACTCAAC	798
P10(-182～+215)	CTAGCTAGCCTCCCCGATTCTCAAAAC	406
			P11(-147～+215)	CTAGCTAGCGCTCCTCCATTCTGACAC	371
P12(-86～+215)	CTAGCTAGCTCTTTCCTTCCCAGCAAC	310
			P13	CCGCTCGAGATAATCAGACTGCTCAC

（6）上述扩增得到的RELMβs启动子片段连接到pMD18T载体，构建中间载体pMD18T-RELMβs，pGL3-Enhancer载体和上述获得的pMD18T-RELMβs分别经NheⅠ和XhoⅠ双酶切、凝胶回收，使用T4 DNA连接酶4℃过夜连接，将RELMβs定向克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer中，利用双酶切和测序方法，筛选构建正确的重组pGL-RELMβs基因启动子荧光素酶报告质粒；

（7）分别接种人胚肾293T细胞和人结肠腺癌细胞HT29于96孔板，用含有10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和链霉素100 U/ml的DMEM培养基，37℃、5% CO₂条件下培养，当细胞生长至汇合率70-80%时，采用脂质体Lipo LTX转染，将构建的pGL-RELMβs-Enhancer系列缺失片段荧光素酶报告载体转染HT29细胞，同时转染pGL3-basic为阴性对照组，pRL-TK为内参质粒；双荧光素酶活性检测，筛选启动子活性最高片段；

（8）双荧光素酶活性检测结果显示，RELMβ启动子-574～+215区域活性最强，以引物P9和P13扩增RELMβ启动子片段并克隆到pMD18T载体上，获得重组载体pMD18T-RELMβ；采用Nhe I和Xho I进行双酶切，凝胶回收，T4 DNA连接酶4℃过夜连接，将RELMβ片段克隆到pcDNA3.1-XynB-myc-GFP相应的酶切位点，获得木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP。

用所述木聚糖酶肠道定向表达载体制备的慢病毒载体，其方法为：

所述重组载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP采用NheⅠ、KpnⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶分离纯化后获取RELMβ-XynB-myc-GFP，利用相同酶切方法处理pLenti4质粒获取含慢病毒转运载体序列的 DNA 片段，将此片段与RELMβ-XynB-myc-GFP连接，获得新的重组质粒pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP ，与病毒辅助质粒pC-GP和pC-VSVG共转染HEK293细胞制备获得慢病毒载体pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP。

（9）用所述木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP(真核表达载体)通过脂质体介导转染猪胎儿成纤维细胞后获得转XynB细胞系（株）。

（10）用所述慢病毒载体pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP转染猪胎儿成纤维细胞后获得转XynB基因细胞系（株）。

所述木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP转染脂质体转染人结肠癌HT29细胞可以用于检测XynB酶蛋白活性。

有益效果

本发明成功构建了XynB的肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP 和慢病毒载体pLenti4- RELMβ-XynB-myc-GFP，并通过该两种携带目的基因XynB、标记基因GFP以及其肠道特异表达启动子RELMβ的真核基因载体转染体细胞，经反复传代培养、筛选及其相关分子和细胞生物学鉴定技术途径获得能够稳定遗传XynB的猪胎儿成纤维细胞系（株）。

本发明首次将原核表达的XynB基因导入真核表达载体中，使XynB能够在真核细胞中表达，同时将肠道特异启动子连入载体中，使得XynB在动物肠道中定向表达，并通过脂质体转染和慢病毒转染两种方法，分别获得了转XynB基因的猪胎儿成纤维细胞系（株），蛋白活性检测发现，XynB在真核细胞内表达后也具有一定的酶活性，因此可用于体细胞核移植克隆转XynB基因胚胎制备，为培育高饲料利用率、低污染物排放的转基因猪新品种提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

四、附图说明

图1：pcDNA3.1-XynB-myc构建流程图

图2：pcDNA3.1-XynB-myc-GFP构建流程图

图3：pGL-RELMβ(-574～+215)构建流程图

图4：pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP构建流程图

图5：携带XynB目的基因和GFP标记基因的慢病毒构建流程图

图6：重组pGL-RELMβ基因双荧光素酶报告载体双酶切鉴定

M: DL5000; A: 1057 bp; B: 1008 bp; C: 789 bp; D: 397 bp; E: 362 bp; F: 301 bp

图7：RELMβ基因启动子不同片段在HT29和293T细胞系内的相对荧光素酶活性

图8：PCR扩增XynB-myc和GFP电泳图

M：DL1000；A：1-5为XynB-myc扩增产物；B：1-5为GFP扩增产物

图9：pMD18T-XynB-myc酶切鉴定结果

M: DL5000; 1，2: 重组质粒pMD18T- XynB -Myc经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切

图10：PCR扩增XynB-myc-GFP电泳图

M：DL2000；1-2为XynB-myc-GFP扩增产物

图11：pMD18T-XynB-myc-GFP酶切鉴定结果

M: DL5000; 1，2: 重组质粒pMD18T- XynB –Myc-GFP经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切

图12：pcDNA3.1-XynB-myc双酶切鉴定

M: DL5000 Marker; 1: 重组质粒pcDNA3.1-XynB-Myc经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切结果

图13：pcDNA3.1- XynB -myc-GFP酶切鉴定

M: DL5000; 1，2: 重组质粒pcDNA3.1- XynB -myc-GFP经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切

图14：pcDNA3.1- RELMβ- XynB -myc-GFP酶切鉴定

M: DL10000；1: 重组质粒pcDNA3.1- RELMβ- XynB -Myc-GFP由NheⅠ、KpnⅠ双酶切

图15：HEK293细胞内慢病毒包装

转染实验24小时后，在荧光显微镜下同一视野的荧光（A）和可见光照片（B）

图16：RELMβ启动XynB基因表达的组织特异性检测

慢病毒转染猪小肠上皮细胞，人结肠癌细胞（HT29），人肝癌细胞（Bel7402），人胃癌细胞（MGC803）猪胎儿成纤维细胞。

荧光显微镜下同一视野观察，A：470nm光波激发（呈绿色荧光细胞为GFP表达细胞），B：可见光下观察

图17：表达XynB猪胎儿成纤维细胞系（株）蛋白检测

M：蛋白Marker；1：空白对照猪胎儿成纤维细胞上清；2：空白对照猪胎儿成纤维细胞总蛋白；3：pcDNA3.1(-)空载体转染猪胎儿成纤维细胞上清；4：pcDNA3.1(-)空载体转染猪胎儿成纤维细胞总蛋白；5：pcDNA3.1- RELMβ- XynB -myc-GFP质粒转染猪胎儿成纤维细胞培养基上清蛋白；6：pcDNA3.1- RELMβ- XynB -myc-GFP转染猪胎儿成纤维细胞总蛋白

图18：转基因猪胎儿成纤维细胞克隆的阳性PCR鉴定结果

1-9：阳性细胞提取的DNA扩增GFP片段；10：阳性对照；M：DL1000

图19:慢病毒方法构建转基因细胞系（株）内XynB蛋白表达检测

1,4分别为携带XynB慢病毒转染组细胞总蛋白和上清蛋白检测；2，5分别为空白对照组细胞总蛋白和上清蛋白检测；3,6分别为携带空载体慢病毒转染组细胞总蛋白和上清蛋白检测

图20:利用RT-PCR检测XynB-GFP酶在转基因猪胎儿成纤维细胞中转录

1-5：转基因细胞克隆扩增；Neg：pcDNA3.1空载体病毒转染阴性对照；Con：空白转染组；P：质粒（pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP）阳性对照

图21 猪和人RELMβ基因启动子序列比较分析

直角箭头表示猪RELMβ基因转录起始位点；黑色箭头指示潜在转录因子结合位点和方向

五、具体实施方式

实施例1 XynB真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc的构建

1．实验材料

质粒：pcDNA3.1(-)质粒购于上海Invitrogen生命技术有限公司；pMD18T质粒购于大连宝生物有限公司；pRSETA-XynB质粒由华南农业大学动物科学学院吴珍芳教授课题组构建并惠赠（张献伟等，中国农业科学，2013，46(22): 4774-4783）。

菌种：大肠杆菌DH5α菌种购于大连宝生物有限公司。

主要酶及试剂药盒：限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ，Prime STAR 高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自大连Takara公司；中量无内毒素质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Promega公司；其余普通化学试剂均为国产、进口分装或进口。

2. 溶液配制

培养基、试剂的配制若无特别要求，均以重蒸水为溶剂，高压灭菌条件为102.9kPa蒸气灭菌30分钟。

LB液体培养基:蛋白胨l0g，酵母粉5g, NaCl l0g，溶于800m1水中，调节pH值至7. 5，定容至1000m1，高压灭菌。

LB固体培养基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl l0g，溶于800m1水中，加琼脂粉15g, 调节pH值至7. 5，定容至1000m1，高压灭菌。

KCM转化法相关试剂配制：

(1) TSM液配制（10ml）

母液	体积	终浓度
			LB	7.3m1
50% PEG MW4000	2 ml	10%
			DMSO	0.5ml	5%
1M MgC12	100μl	l 0mM
			1M MgS04	100μl	l 0mM

(2) 5×KCM: 0.5M KCl, 0.15M CaC1₂, 0.25M MgC1₂过滤除菌后, 分装至1.5m1 EP管中，冻存于一20℃冰箱备用。

质粒提取溶液I: 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl (pH8.0) , l0mmol/L EDTA（pH8. 0) ，高压灭菌15分钟。

质粒提取溶液II: 0. 2mmol/L NaOH, 1% SDS，现用现配。

质粒提取溶液III：5mol/L乙酸钾60m1，冰乙酸11. 5m1，水28. 5m1，4℃保存。

50×TAE: 242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，100m1 0. 5mo1/L EDTA (pH 8.0)，溶解后定容至1000m1。

3.实验步骤

（1）中间载体pMD18T-XynB -Myc的构建及鉴定

引物设计：以原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1，P2，其中5’端引物P1带有Xho I酶切位点（CTCGAG）及其保护碱基，5’端引物P2末端引入Myc-Tag序列，带有Kpn I酶切位点（GGTACC）及其保护碱基，由南京金斯瑞生物公司合成：

P1: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I

P2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’ Kpn I

PCR扩增目的基因XynB-Myc：以质粒pRSET-XynB为模板，用引物P1、P2终浓度约1μmol/mL，50μL体系使用Prime STAR高保真DNA聚合酶扩增，PCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，获得目的基因XynB-myc,片段大小为678bp。

PCR反应体系（50μl）：F primer 0.5μl；R primer 0.5μl；DNA 1μl；Prime STAR 0.5μl；5×buffer 10μl；d NTP 1μl；dd H₂O 37μl。

加A反应：取目的基因XynB-myc5μg加入Taq DNA聚合酶构成25μL PCR体系，72℃30min延伸，为Prime STAR DNA聚合酶产物添加A-碱基尾。将上述PCR终产物与pMD18T4℃连接过夜（按照产品说明书操作），KCM法（C. T. Chung and R. H. Miller.Nucleic Acids Res. 1988;16:3580）转化大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素筛选pMD18T-XynB-myc的阳性转化子，并采用限制性内切酶酶切鉴定。

（2）pcDNA3.1(-)-XynB-myc的构建及鉴定

将pMD18T-XynB-Myc重组质粒用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，纯化回收目的片段（XynB-Myc），同时用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收后的pcDNA3.1(-)载体质粒和XynB-Myc目的片段由T4 DNA连接酶连接过夜。

连接反应体系(10 μL)：

20ng 载体DNA

20ng 外源DNA

1 μL T4 DNA连接酶10 X buffer

1~2U T4 DNA连接酶

补加水至10 μ1，4 ℃温育8~12h。

取5 μ1连接产物使用KCM法转化55 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过含有氨苄青霉素的LB平板固体培养基中选择培养，挑取阳性转化子经过LB液体培养基扩大培养后采用碱裂解法少量提取质粒（参见《分子克隆实验指南》，J·萨姆布鲁克等编，第二版，全冬雁等译的相关章节），酶切鉴定。

4.实验结果

PCR扩增获得目的基因片段XynB-Myc，大小为682bp（图8A）。双酶切鉴定显示，XynB-Myc成功连接到pMD18T载体中(图9)。重组载体pcDNA3.1-XynB-Myc经双酶切，获得的两条带与实际相符，表明连接成功（图12）。

实施例2 猪RELMβ基因启动子扩增及启动子活性检测

1. 主要试剂

Premix Taq（La Taq version 2.0）酶、T4 DNA连接酶，DNA Marker，内切酶、琼脂糖回收纯化试剂盒、小提质粒提取试剂盒、中提质粒提取试剂盒购自宝生物（大连）有限公司；pGL3-basic、pGL3-Enhancer、pRL-Tk载体和双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；人胚肾细胞株293T，人结肠腺癌细胞株HT29购自凯基生物（南京）；Lipo LTX、Opti-MEM、DMEM培养基、胎牛血清购自Invitrogen公司；引物合成及DNA测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。

3. 操作步骤

（1）猪全基因组DNA提取

于江苏省农科院六合基地养猪场购买怀孕40日龄三元杂交母猪，取猪耳组织样，剪碎后采用酚/氯仿提取法提取全基因组DNA，详细操作参照《分子克隆手册》第三版上册6.23。

（2）重组双荧光素酶报告载体pGL3-RELMβs的构建及检测

引物设计：根据Genebank中人RELMβ5’侧翼区序列（AF352731），猪RELMβ基因cDNA序列（NC_010455），按照5’端递减原则，设计PCR正向引物P7-P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位点，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位点，扩增不同长度猪RELMβ启动子片段。由P7和P13扩增得到猪RELMβ基因5’侧翼区842 bp片段，对其进行生物信息学分析，发现人、猪RELMβ基因启动子区存在多个保守的潜在转录因子结合位点（图21）。

扩增RELMβ基因启动子片段引物（酶切位点和保护碱基以下划线表示）

	序列（5′-3′）	目的片段大小/bp
			P7(-842～+215)	CTAGCTAGCGAACTTATGACCATGAGGAC	1048
P8(-793～+215)	CTAGCTAGCGATGAAGAGCCACTGAAC	1017
			P9(-574～+215)	CTAGCTAGCAAATATGGCCCTAACTCAAC	798
P10(-182～+215)	CTAGCTAGCCTCCCCGATTCTCAAAAC	406
			P11(-147～+215)	CTAGCTAGCGCTCCTCCATTCTGACAC	371
P12(-86～+215)	CTAGCTAGCTCTTTCCTTCCCAGCAAC	310
			P13	CCGCTCGAGATAATCAGACTGCTCAC

（3）重组双荧光素酶报告载体构建

上述获得的RELMβs启动子片段连接到pMD18T载体，构建中间载体pMD18T-RELMβs，pGL3-Enhancer载体和上述获得的pMD18T-RELMβs载体分别经NheⅠ和XhoⅠ双酶切、凝胶回收，使用T4 DNA连接酶4℃过夜连接，将RELMβs定向克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer中，利用双酶切和测序方法，筛选构建正确的重组pGL-RELMβs基因启动子荧光素酶报告质粒。

（4）双荧光素酶报告分析

分别接种人胚肾293T细胞和人结肠腺癌细胞HT29于96孔板，用含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 U/ml）的DMEM培养基，37℃、5% CO₂条件下培养，当细胞生长至汇合率70-80%时，采用脂质体Lipo LTX转染，将构建的pGL-RELMβs-Enhancer系列缺失片段荧光素酶报告载体转染HT29细胞，同时转染pGL3-basic为阴性对照组，pRL-TK为内参质粒。

转染24 h后，收集细胞，加入30 μl细胞裂解缓冲液，室温摇晃15 min后，吹打细胞，收集裂解液至96孔白板，加入100 μl荧光素酶分析剂（LARⅡ），放置发光检测仪Glomax（Promega）中，测定firefly荧光素酶活性（M1），然后再加入100 μl Stop & Glo Reagent，测定内参质粒中Renilla荧光素酶活性（M2），计算荧光素酶相对活性（M1/M2）。

（5）实验结果

双酶切鉴定显示，重组双荧光素酶报告载体pGL3-RELMβs构建成功(图6)；双荧光素酶报告分析发现启动子区（-574～+215）活性最高(图7)。

实施例3 肠道特异表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP构建及其慢病毒制备

1.主要试剂

限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ、KpnⅠ，Prime STAR 高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自大连Takara公司；去内毒素中量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、快速连接试剂盒（Liga Fast^TM Rapid DNA Ligation System）购自Promega公司，转染试剂Lipofectamine^TM LTX、质粒pLenti4、pC-GP、pC-VSVG购自invitrogen公司；胰酶、青、链霉素购自SIGMA公司；DMEM（高糖）、胎牛血清（FBS）购自GIBCO公司。

2. 溶液

HEK293细胞完全培养基（1L）：DMEM（高糖）13.4g，FBS（胎牛血清）100ml，青霉素0.06g，链霉素0.1g，超纯水定容到1L，调pH值至7.2，抽滤除菌4℃保存备用。

Ca²⁺/Mg²⁺ free PBS (1L)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，HCl调pH值至7.2，高压灭菌，室温保存。如果配含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS，需再加入CaCl₂.H₂O 0.133g，MgCl₂.6H₂O 0.10g。

3. 操作步骤

（1）中间载体pcDNA3.1(-)-XynB-myc-GFP的构建

扩增XynB-myc片段：根据质粒pcDNA3.1-XynB-myc设计PCR引物 P3、P4，P3引物5’端带有酶切位点Xho I，P4引物5’端序列与GFP序列5’末端互补。PCR条件为：98℃， 5min；98℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min，扩增的XynB-Myc片段大小为682 bp。

P3: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I

P4: 5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’重叠序列

扩增GFP基因片段：以pEGFP-C3（由南京大学模式动物研究中心高翔教授惠赠，Ormo et al., Science, 1996, 273(5280) : 1392～1395）序列为模板，设计PCR反应引物 P5、P6，P5的5’端序列与XynB-myc序列3’末端一致，引物P6的5’端带有酶切位点KpnI。扩增程序为：98℃， 5min；98℃，30s；62℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min，扩增的片段大小为768 bp。

P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’重叠序列

P6: 5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn I

重叠PCR获得XynB-myc-GFP融合片段：以上述扩增产物XynB-Myc片段及GFP片段为模板，用引物为P3和P6，采用重叠PCR方法（Ho et al., Gene 1989; 77:51-59）将两种组件融合，获得XynB-myc-GFP融合片段（1398 bp），扩增的程序：98℃， 4min；98℃，10s；52℃，10s；72℃，130s；30个循环；72℃，10min。扩增的片段大小为1398 bp。

T-A克隆：取20μL上述重叠PCR产物，加入Taq DNA聚合酶构成25μL PCR体系，72℃30min延伸，添加A-碱基尾。将加尾后的XynB-myc-GFP融合片段纯化后与pMD18T 4℃连接，得到中间载体pMD18T-XynB-myc-GFP，双酶切鉴定正确（图11）。

酶切连接：用Xho I和KpnI对pMD18T-XynB-myc-GFP进行双酶切，回收得到的XynB-myc-GFP片段克隆到pcDNA3.1(-)相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1-XynB-myc-GFP，并进行双酶切鉴定（图13）。

（2）真核特异表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP的构建

双荧光素酶活性检测结果显示，RELMβ启动子-574～+215区域活性最强，

采用Nhe I和Xho I对pMD18T-RELMβ（-574～+215）进行双酶切，凝胶回收，T4 DNA连接酶4℃过夜连接，将RELMβ片段克隆到pcDNA3.1-XynB-myc-GFP相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP，并酶切鉴定（图14）。

(3)XynB慢病毒制备

① pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP的构建

目的片段RELMβ-XynB-myc-GFP来自pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP 质粒，由质粒经NheⅠ、KpnⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶分离纯化后获取。相同的酶处理pLenti4质粒获取含慢病毒转运载体序列的 DNA 片段，琼脂糖凝胶分离纯化后以快速连接试剂盒与RELMβ-XynB-myc-GFP连接，获得新的重组质粒pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP ，再与病毒辅助质粒pC-GP、pR-Rev、pC-VSVG共转染HEK293细胞以生产病毒。

② 慢病毒的制备

细胞准备：转染前一天，胰酶消化HEK293细胞，取约 6×10⁶个细胞种植于 75cm²培养瓶中，加入约 10ml完全培养基进行培养。转染当天，待细胞达到 80-85% 融合度时，移除培养液，加入 6ml无双抗培养基。

DNA－脂质体转染复合物制备：将 pC-GP、pC-VSVG 质粒按 6.5:3.5 的质量比进行混合制作包装混合物。取包装混合物11. 5μg与pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP 5 μg，加入到1.9ml无血清无双抗培养基中，混匀称为A液。取另一离心管，于1.9 ml无血清无双抗培养基中加入70μl的脂质体Lipofectamine^TM LTX，轻轻混匀，室温孵育5 min，称为B液，迅速将B液轻轻加入到A液中，混匀，室温孵育 30 min，以形成 DNA－脂质体复合物。

脂质体转染后收集病毒并浓缩：将DNA－脂质体复合物逐滴加入细胞培养瓶中，并轻轻混匀，37℃孵育过夜，转染12 h后移去含有DNA－脂质体复合物的培养基，换上新鲜完全培养基，继续培养48-72 h，观察HEK293细胞转染状态（图15），收集含病毒培养液，4℃ 5000g离心15 min去除细胞沉淀，取上清并采用0.45μm低蛋白结合 PVDF滤膜进行抽滤。病毒原液经 4℃50000g 离心2h，弃上清，以1: 200 DMEM重悬，取部分病毒稀释测量滴度，其余－80℃保存备用。

4.结果

（1）pcDNA3.1-XynB-myc-GFP重组质粒鉴定

以pMD18T-XynB-myc质粒为模板，PCR扩增获得XynB-myc片段（图8A）；以质粒pEGFP-C3为模板，PCR扩增获得GFP片段（图8B）。

以扩增产物XynB-myc片段及GFP片段为模板，采用重叠PCR方法将两种组件融合，获得XynB-myc-GFP片段（1398bp）（图10）。

将 pcDNA3.1-XynB-myc-GFP重组质粒用限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定, 酶切产物电泳分别可见大小为1398 bp和5420 bp的两条条带（图13）。

（2）pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP重组质粒酶切鉴定

将重组质粒pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP用限制性内切酶Nhe I、Kpn I双酶切鉴定, 酶切产物电泳分别可见大小为2196 bp和5329 bp的两条带（图14），证明pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP构建正确。

（3）慢病毒液病毒滴度测定

通过滴度测定结果表明由此生产的慢病毒的物理滴度为3.07E+09，具体计算方法见表1。

表1 Lenti4-blockit-RELMβ-XynB-myc-GFP滴度测定

则Lenti4-blockit-RELMβ-信号肽-XynB-myc-GFP的物理滴度为：

{（3.52E+09）+（2.63E+09）+（1.46E+09）}/3=3.07E+09VP/ml

实施例4. 转XynB基因细胞系（株）特异性表达鉴定

1. 主要细胞系、生物试剂与材料

人结肠癌细胞（HT29），人肝癌细胞（Bel7402），人胃癌细胞（MGC803）购自凯基生物（南京），猪胎儿成纤维细胞（Lai et al., Methods Mol Biol, 2004, 254:149-164.）和原代猪小肠上皮细胞（Schierack et al., Histochem Cell Biol. 2006;125(3):293-305）；细胞培养板、DMEM basic培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Invitrogen公司；胰酶、EGF、胰岛素、青、链霉素、购自SIGMA公司；怀孕40日龄三元杂交母猪（用于采集与制备胎儿成纤维细胞和原代肠上皮细胞）购自江苏省农科院六合基地养猪场。

2. 溶液配制

IEC（肠上皮细胞）完全培养基（1L）：DMEM-F12（液体）900ml；FBS（胎牛血清）100ml；EGF（表皮生长因子）10μg；胰岛素1.0g；青霉素0.06g；链霉素0.1g。超纯水定容到1L，抽滤除菌。

成纤维细胞完全培养基（1L）：DMEM（高糖）13.4g；FBS（胎牛血清）100ml；青霉素0.06g；链霉素0.1g；超纯水定容到1L，抽滤除菌。

HT29、Bel7402和MGC803细胞培养基：经滤膜（0.22μm）过滤将FBS（胎牛血清）50ml，青霉素和链霉素各50000U加入到DMEM（basic）500ml内，配制成10% FBS培养基。

Ca²⁺/Mg²⁺ free PBS (1L)：同实施例2

3. 步骤

（1）人结肠癌细胞（HT29），人肝癌细胞（Bel7402），人胃癌细胞（MGC803）培养条件：用含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 U/ml）的DMEM培养基，37℃、5% CO₂条件下培养。

（2）原代猪小肠上皮细胞的分离及培养（Schierack et al., Histochem Cell Biol. 2006;125(3):293-305）

怀孕40日龄母猪，剖腹手术取出子宫，75%酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，采用组织块培养法进行猪肠上皮细胞的培养，操作步骤如下：

①无菌条件下剔除肠系膜，将小肠移至培养皿中，用含有双抗的PBS 液将小肠内腔冲洗干净。用眼科剪刀纵向剖开肠管，先用PBS 液反复清洗，再用无血清的DMEM/F12 清洗数次。

②将肠管剪成碎片，用无血清的DMEM/F12 清洗，静置1-2 min，弃去上清液，继续剪碎，将肠组织剪成小于1mm³的碎片，再转移至50mL的离心管中加入无血清DMEM/F12，用移液管反复吹打，1500g离心7min。如此反复清洗组织块, 直至上清液澄清。

③用含5% FBS的DMEM/F12悬浮组织块并接种于培养瓶中，间隔24h后换液，继续培养获得细胞单层。

④利用上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感度不同，采用胰蛋白酶消化法去除其中的成纤维细胞，以提高上皮细胞的纯度。

（3）原代猪胎儿成纤维细胞的培养（Lai et al., Methods Mol Biol, 2004, 254:149-164.）

将获得的猪胎儿皮肤用剪刀剪碎，放入0.25%的胰蛋白酶中，37℃消化10-20 min。加入含10%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12终止消化，机械吹打使细胞分散。取少量细胞悬液进行细胞计数后，向悬液中加入含10% 小牛血清的DMEM/F12使终浓度为5-8×10⁵个/ml。6孔培养板每孔中加入2 ml悬液，于37.5℃，5%CO2，100%湿度培养箱内培养。待细胞长成单层时换液，以后每隔1天移换一半培养液。待细胞长到100%汇合时进行传代，继续培养。

（4）慢病毒转染

分别接种猪胎儿肠上皮细胞、猪胎儿成纤维细胞、HT29、Bel7402和MGC803细胞于6孔板，当细胞汇集成片约70%时，解冻病毒贮液，用新鲜的完全培养基稀释到病毒滴度为4.76×10⁶，移除细胞原有培养基，将含有病毒的培养基逐滴加至细胞上，6 h后除去含有病毒的培养基，换上新鲜完全培养液，48 h后荧光显微镜下观察。

4. 结果

慢病毒介导转染猪胎儿肠上皮细胞、人结肠癌细胞（HT29）、人肝癌细胞（Bel7402），人胃癌细胞（MGC803）和猪胎儿成纤维细胞48h后，表达荧光检测发现，猪胎儿肠上皮细胞和HT29细胞发现绿色荧光阳性细胞，而Be17402、MGC803和猪胎儿成纤维细胞未发现荧光阳性细胞（图16），表明XynB基因在猪肠上皮细胞和HT29细胞可以表达，而在Bel7402、MGC803和猪胎儿成纤维细胞内不能表达，尽管上述五种不同细胞系经转染后其基因组中均存在XynB基因。本实验结果证明了RELMβ启动子仅启动了XynB基因（目的基因）在肠道细胞中的特异性表达，而未在在其它细胞组织（肝、胃、成纤维细胞等）内非特异性表达，验证了所构建的基因载体具有启动目的基因在肠道组织细胞内表达的特异功能。

实施例5 脂质体转染构建转XynB基因的猪胎儿成纤维细胞系（株）

1. 试剂

脂质体Lipofectamine^TM LTX（GEⅡ）、DMEM（高糖）、DMEM-F12、胎牛血清（FBS）、小牛血清（FCS）购自Invitrogen公司。抗Myc的小鼠一抗、辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠二抗、Pro-light HRP化学发光检测试剂均购于天根生化公司。Western Blot相关试剂购自上海生工，显影液、定影液购自南京正然科技公司。

2. 溶液配制

Ca²⁺/Mg²⁺ free PBS (1L)：同实施例2

改良 RIPA buffer：Tris-HCl 50 mM pH 7.4；NP-40 1%；Na-deoxycholate 0.25%；NaCl 150mM；EDTA 1 mM；PMSF 1 mM；Aprotinin, leupeptin, pepstatin 各1mg /ml；Na₃VO4 1 mM；NaF: 1 mM。

1×SDS 样品缓冲液：62.5 mM Tris-HCl（pH 6.8 于25°C）；2% w/v SDS；10%甘油；50 mM DTT；0.01% w/v溴酚蓝。

封闭缓冲液：1×TBS，0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA。

100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA)：500g TCA 加入 350 ml H2O中，室温保存。

0.01% w/v溴酚蓝：0.01g溴酚蓝溶于100ml无水乙醇，密闭保存。

10X Tris缓冲盐(TBS)：准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1M HCl调pH为7.6。

转移缓冲液：25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)。

一抗稀释液：1X TBS, 0.1% Tween-20 加5%脱脂奶粉。

3. 步骤

（1）稳定表达XynB基因的猪胎儿成纤维细胞株的建立

原代猪胎儿成纤维细胞接种于细胞培养孔中，分为空白对照组、转染pcDNA3.1(-)空载体组和转pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP质粒组，生长汇合至80%左右。采用脂质体法分别将pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1- RELMβ- XynB -myc-GFP转染到猪胎儿成纤维细胞，12h后更换培养基并加入300 mg/ml G418筛选，一周后G418浓度减半维持筛选三周左右，获得阳性克隆。

（2）Western-blot检测XynB酶蛋白表达

将转染48h后的猪胎儿成纤维细胞总蛋白和细胞上清进行Western-blot检测，应用RIPA裂解液裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，上清收集后-20℃保存。细胞上清采用TCA法收集蛋白，加入上样缓冲液溶解后-20℃保存。取适量细胞总蛋白及培养液上清蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，100V转膜1h，4℃封闭过夜，室温下一抗（1:500）孵育1h，洗膜3次后室温二抗（1:10000）孵育1h，ECL显色5min，曝光1min，显影，定影。

（3）PCR验证

G418筛选4周后的猪胎儿成纤维细胞提取全基因组DNA，采用GFP特异引物进行PCR阳性鉴定（GFP引物序列：F 5'TGGTGAGCAAGGGCGAGG AG3'，R 5'CAGGGCGGACTGGGTGCTCA3'），PCR产物长度674 bp。

4. 结果

（1）Western blot结果显示，转XynB基因的猪胎儿成纤维细胞的上清和总蛋白中均含有目的蛋白XynB，大小为约50kDa，空白对照组细胞和转染pcDNA3.1(-)空载质粒的猪胎儿成纤维细胞未检测到目的蛋白（图17）。表明外源基因XynB在猪胎儿成纤维细胞被翻译成蛋白，并被分泌到细胞外。

（2）采用脂质体法转染pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP到猪胎儿成纤维细胞中，经过G418筛选获得了多个细胞克隆，并且PCR能够成功扩增出674 bp的GFP条带（图18），表明获得的细胞克隆为转基因阳性细胞。

实施例6 慢病毒转染构建转XynB基因猪胎儿成纤维细胞系（株）

1. 主要试剂

DMEM（高糖）、DMEM-F12、胎牛血清（FBS）购自Invitrogen公司。抗Myc的小鼠一抗、辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠二抗、Pro-light HRP化学发光检测试剂、抗GAPDH的小鼠一抗、辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠二抗均购自碧云天生物技术研究所。Western Blot相关试剂购自上海生工，显影液、定影液购自南京正然科技公司。

2. 步骤

（1）慢病毒转染

将猪胎儿成纤维细胞接种于6孔细胞培养板，调整细胞密度为5×10⁴/孔，进行慢病毒介导RELMβ- XynB -myc-GFP基因片段转染实验。试验设3组（转基因组、同代正常培养组和空载体转染组），每组4个重复。当细胞汇集成片约70%时，解冻病毒贮液，用新鲜的完全培养基稀释到病毒滴度为4.76×10⁶，移除细胞原有培养基，将含有病毒的培养基逐滴加至细胞上，6 h后除去含有病毒的培养基，换上新鲜完全培养液，24h后更换培养基并加入300 mg/ml G418筛选，一周后G418浓度减半维持筛选三周左右，获得阳性克隆。

（2）Western blot检测 XynB酶蛋白表达

收集转基因第4天的胎儿成纤维细胞、同代正常培养和空载体转染的胎儿成纤维细胞及培养液提取总蛋白，Western blot检测 XynB酶蛋白表达。

（3）RT-PCR检测XynB基因转录

收集转基因第4天的胎儿成纤维细胞、同代正常培养和空载体转染的胎儿成纤维细胞抽提RNA，经过DNase处理后进行RT-PCR检测其转录情况，设计引物扩增XynB-GFP基因片段部分序列，引物序列XynB-F：GCTACCCGTACCAATGCT，GFP-R：TGGTGCCAAAACAAACTC，扩增片段长度725 bp。跨内含子β-action内参引物：(F) GGACTTCGAGCAGGAGATGG，(R)GCACCGTGTGGCGTAGAGG。扩增片段含有内含子长331 bp，无内含子长141 bp，用于排除基因组DNA污染。

3. 结果

（1）Western结果见图19，转XynB基因的猪胎儿成纤维细胞的上清和细胞总蛋白中均有目的蛋白XynB的表达，大小为约50kDa，空白对照组细胞和转染pcDNA3.1(-)空载病毒的猪胎儿成纤维细胞未检测到目的蛋白，细胞上清内没有内参GAPDH蛋白的表达。表明外源基因XynB在猪胎儿成纤维细胞被翻译成蛋白，并被分泌到细胞外。

（2）RT-PCR结果见图20，慢病毒介导RELMβ- XynB -myc-GFP片段转染猪胎儿成纤维细胞后，都能正常转录合成XynB酶mRNA序列。跨内含子引物扩增β-action基因显示无内含子片段扩增，排除了DNA污染可能。结果显示构建成功转基因阳性细胞株（系）。

实施例7 特异性表达产物XynB酶蛋白活性的鉴定

1.试剂

脂质体Lipofectamine^TM LTX（GEⅡ）、DMEM（basic）胎牛血清（FBS）、购自Invitrogen公司。D-木糖，木聚糖购自SIGMA公司（美国）。磷酸氢二钠、柠檬酸、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、亚硫酸钠购自南京鼎国生物。

2.溶液配制

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠71.62 g，蒸馏水溶解，定容至1000 ml；称取柠檬酸21.01 g，蒸馏水溶解，定容至1000 ml。取磷酸氢二钠溶液515 ml，柠檬酸钠溶液485 ml，混合均匀，用pH计矫正为5.0缓冲液。

酶活测定底物：精确称取木聚糖1.000 g，加入80 ml pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，水浴加热至完全溶解，冷却后定容至100 ml。

DNS试剂：称取酒石酸钾钠182 g，溶于500 ml蒸馏水中，加热后依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3 g，2 mol/L氢氧化钠262 ml，苯酚5 g，亚硫酸钠5 g，搅拌至容，冷却后用蒸馏水定容至1000 ml。混匀，过滤，储存于棕色瓶。

1%木糖标准液：称取干燥至恒重的D-木糖1.000 g，蒸馏水溶解后定容至100 ml。

3.步骤

（1）脂质体转染人结肠癌HT29细胞

实施例4发现，XynB酶可以在猪胎儿肠上皮细胞和HT29细胞系表达分泌，故本实验选择HT29细胞系作为检测XynB基因表达产物XynB酶蛋白活性检测的生物材料之一。转染前1天，接种人结肠癌细胞HT29细胞于细胞培养皿，当细胞汇集成片约70%时，转染pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP真核表达载体到HT29细胞，按照转染试剂盒Lipofectamine^TM LTX说明书转染。4 d后收集细胞培养液，即粗酶液。

（2）酶蛋白活性测定

采用DNS法测定酶活性，方法参考费笛波等（费笛波等，浙江农业学报，2004, 16(2): 53-58.）测定方法和国家标准《GB/T23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》。

反应温度根据猪胃肠道温度，设计为39℃水浴，1%木糖标准液梯度稀释成标准液，分别取梯度浓度标准液0.5 ml加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5 ml，加入DNS液3.0 ml，然后沸水浴中沸腾5 min，加入蒸馏水10 ml摇匀。以蒸馏水替代木糖标准液稀释液作为对照。冷却后，测定吸光度（波长550 nm），并制作标准曲线。

吸取粗酶液500 ul加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5 ml，39℃水浴反应10 min后，迅速加入DNS液终止反应，然后沸水浴中沸腾5 min，取出加入蒸馏水10ml，摇匀。同时进行空白对照组实验，在0.5 ml粗酶液中加入3.0 ml终止液DNS，然后加入1%木聚糖溶液1.5ml，置于39℃水浴反应10 min，然后沸水浴中沸腾5 min，加入蒸馏水10 ml摇匀。以后步骤同于标准曲线制作。

4. 结果

实验结果显示，XynB基因表达载体pcDNA3.1- RELMβ- XynB -myc-GFP转染真核细胞后，检测到培养及其传代后结肠癌HT29细胞分泌出基因最终表达产物（即木聚糖酶），其酶活性（XynB酶蛋白活性）达到180.96 ± 20.57 U/ml水平。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系

<130> 0

<160> 13

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 1

<220>

<221> P1

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 1

ccgctcgagg ccaccatgtt tcaact 26

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P2

<222> (1)..(53)

<223>

<400> 2

ggggtaccca gatcctcttc tgagatgagt ttttgttcct gaacagtgat gga 53

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P3

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 3

ccgctcgagg ccaccatgtt tcaact 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P4

<222> (1)..(25)

<223>

<400> 4

ccttgctcac catagatcct cttct 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P5

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 5

gaagaggatc tgatggtgag caaggg 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P6

<222> (1)..(28)

<223>

<400> 6

ggggtacctt acttgtacag ctcgtcca 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P7

<222> (1)..(29)

<223>

<400> 7

ctagctagcg aacttatgac catgaggac 29

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P8

<222> (1)..(27)

<223>

<400> 8

ctagctagcg atgaagagcc actgaac 27

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P9

<222> (1)..(29)

<223>

<400> 9

ctagctagca aatatggccc taactcaac 29

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P10

<222> (1)..(27)

<223>

<400> 10

ctagctagcc tccccgattc tcaaaac 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P11

<222> (1)..(11)

<223>

<400> 11

ctagctagcg ctcctccatt ctgacac 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P12

<222> (1)..(27)

<223>

<400> 12

ctagctagct ctttccttcc cagcaac 27

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P13

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 13

ccgctcgaga taatcagact gctcac 26

Claims

1.木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：

P1: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I

P2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’ Kpn I

将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T-XynB-Myc；

P3: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I

P4: 5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’

P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’

P6: 5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn I

（7）分别接种人胚肾293T细胞和人结肠腺癌细胞HT29于96孔板，用含有10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和链霉素100 U/ml的DMEM培养基，37℃、5% CO₂条件下培养，当细胞生长至汇合率70-80%时，采用脂质体Lipo LTX转染，将构建的pGL-RELMβs-Enhancer系列缺失片段荧光素酶报告载体转染HT29细胞，同时转染pGL3-basic为阴性对照组，pRL-TK为内参质粒；

双荧光素酶活性检测，筛选启动子活性最高片段；

2.用权利要求1所述木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP制备的慢病毒载体。

3.用权利要求1所述木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP制备慢病毒载体的方法，其特征在于：

权利要求1所述重组载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP采用NheⅠ、KpnⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶分离纯化后获取RELMβ-XynB-myc-GFP，利用相同酶切方法处理pLenti4质粒获取含慢病毒转运载体序列的 DNA 片段，将此片段与RELMβ-XynB-myc-GFP连接，获得新的重组质粒pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP ，与病毒辅助质粒pC-GP和pC-VSVG共转染HEK293细胞制备获得慢病毒载体pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP。

4.用权利要求1所述木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP转染猪胎儿成纤维细胞后获得的转基因细胞系或细胞株。

5.用权利要求2或3所述慢病毒载体pLenti4-RELMβ-XynB-myc-GFP转染猪胎儿成纤维细胞后获得转基因细胞系或细胞株。

6.用权利要求1所述木聚糖酶肠道定向表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-myc-GFP转染

脂质体转染人结肠癌HT29细胞检测XynB酶蛋白活性的方法。