HU221123B1 - Coccidiosis poultry vaccine - Google Patents

Abstract

A találmány új, immunológiai aktivitással rendelkező Eimeria-proteinnel, valamint ilyen proteint kódoló nuk- leinsavszekvenciákkalfoglalkozik. Ez a protein baromfiknak adagolható, ily módon a madarakcoccidiosis ellen megvédhetők. Ezenkívül a proteint kódoló DNScoccidiosis elleni vektorvakcina előállítására használható fel. ŕ

Description

A találmány egy Eimerian fajból, nevezetesen az Eimeria maxima törzsből származó proteinnel foglalkozik, amely immunlimfociták stimulálására képes. A találmány tárgyát képezi továbbá az említett protein egészét vagy egy antigénhatás szempontjából lényeges részét kódoló nukleinsavszekvencia, az ilyen nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns vektor, az ilyen rekombináns vektorral transzformált gazdasejt vagy gazdaszervezet, valamint egy baromfikban coccidiosis elleni védettség létrehozására alkalmazható vakcina.

A coccidiosis a számos coccidia faj egyikével vagy azok közül többel történt fertőzés okozta megbetegedés, melyek az Aplicomplexa altörzshöz és az Eimeria nemzetséghez tartozó intracelluláris egysejtű paraziták. A baromfi elnevezés alatt tojás vagy hús forrásául szolgáló háziasított madarakat értünk, melyek közé olyan gazdasági jelentőségű baromfifélék tartoznak, mint például a csirkék, pulykák, kacsák, libák, gyöngytyúkok, fácánok, galambok és pávák.

A coccidiosis megbetegedést csirkékben ismereteink szerint több Eimeria faj okozza, például Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati, valamint E. hagani. Néhányan az utóbbi két faj létezését kétségbe vonják. A fenti Eimeria fajok bármelyikével történt enyhe fertőzés az újrafertőzéssel szemben védettséget vált ki.

Az egyes fajok különböznek a csirkékben kiváltott kórtani hatás tekintetében, és ebben a csirkefajta is szerepet játszik; például a brojlercsirkékben az E. acervulina vagy az E. maxima parazita súlyos károsodást okoz, mivel ezek a paraziták a vékonybél jelentős részében élősködnek, ahol a táplálék emésztése folyik.

A fent felsorolt fajok közül az E. maxima rendelkezik a legnagyobb immunogén hatással, a fertőzést követően erős természetes védettség alakul ki. A törzsek között vannak azonban olyan variánsok, melyek a törzsek között nem vagy csak kismértékű keresztvédettséget hoznak létre.

Az Eimeria paraziták életciklusok folyamán számos állapoton mennek át. Az életciklus azzal kezdődik, hogy a talajról való táplálékgyűjtés során vagy porral való belélegzés révén a csirkébe bejut a sporulálódó oocosztának nevezett fertőző forma. Az E. maxima esetében az oociszta rendszerint nagyméretű. A sporulálódó oociszta fala a zúzógyomor, valamint a béltraktus által kifejtett mechanikai őrlő és vegyi hatások révén megreped és a négy sporociszta kiszabadul. A sporociszták a patkóbélbe jutnak, ahol az epe és emésztőenzimek hatására egy-egy sporocisztából átlagosan tíz sporozoita szabadul ki.

A sporozoiták mozgásra képesek, és olyan megfelelő gazdasejt-epitéliumsejtet keresnek, amelyen áthatolhatnak és szaporodhatnak benne. Egy epitéliumsejt megfertőzését követően a parazita életciklusának schizonta szakaszába jut, és egy schizonta 8-16-tól több mint 200-ig terjedő merozoitát képez. Miután a merozoiták kiszabadultak a schizontából, azok további epitéliumsejtek megfertőzésére képesek. 2-5 ilyen aszexuális reprodukciós ciklust követően a sejten belüli merozoiták női, azaz makrogamétáknak, illetve hím, azaz mikrogamétáknak nevezett szexuális formákká fejlődnek. Miután a mikrogametocitákból felszabaduló mikrogaméták a makrogametocitát megtermékenyítették, zigóta képződik, amely cisztafalat alakít ki maga körül. Az újonnan képződött oociszta az ürülékkel kikerül a fertőzött csirkéből.

Megfelelő környezeti feltételek mellett, így megfelelő hőmérséklet, nedvességtartalom és a levegőben elegendő oxigén jelenlétében az oociszta a fertőző formává sporulálódik, amely kész új gazdaszervezet fertőzésére és így a betegség terjesztésére. Tehát a parazitának madárról madárra való átviteléhez nem szükséges köztes gazdaszervezet.

Az emésztőrendszer Eimeria parazitával történő fertőzésének következménye lehet a testtömeg-gyarapodás elmaradása, csökkent táplálékhasznosítás, a tojástermelés megszűnése és gyakran elhullás. A baromfifélék intenzív tenyésztésének elterjedésével együtt jártak a fenti parazita okozta súlyos veszteségek: a coccidiosis a legnagyobb gazdasági fontossággal bíró parazita okozta megbetegedés lett. Hollandiában a baromfitenyésztők vesztesége minden évben több millió guldenre rúg; 1986-ban a veszteség körülbelül 13 millió gulden volt. Ugyanabban az évben az Amerikai Egyesült Államokban 300 millió dollár veszteséggel számoltak.

A múltban több módszert alkalmaztak a coccidiosis terjedésének megakadályozására. A kemoterápiás anyagok felfedezését megelőzően fokozott higiéniai rendszabályok betartása volt a fő módszer, fertőtlenítők alkalmazásával és a hulladék mechanikai eltávolításával; általában azonban elegendő oociszta maradt a betegség átviteléhez,

A táplálékba, illetve az ivóvízbe adagolt coccidiosztatikus anyagok bevezetésével, valamint megfelelő tartási körülmények betartásával bizonyos mértékig sikerült a betegség terjedését megakadályozni. Megállapították, hogy ezeknek az anyagoknak a hatékonysága részben a gyógyszerrezisztens Coccidia fajok kialakulása következtében az évek során csökkent. Ezenkívül néhány kemoterápiás hatású anyagról megállapították, hogy a hústermékekben kimutatható, fogyasztásra alkalmatlanná téve azokat.

Megkísérelték a betegség visszaszorítását immunológiai módszerekkel is, a csirkéknek mind a hét Eimeria faj oocisztáit tartalmazó élő vakcina alkalmazásával, a beadott oociszták koraérett vonalakból származtak. Ilyen koraérett vonalakat úgy nyerhetünk, hogy egy vad Eimeria faj populációját csirkékbe oltjuk és a fertőzés következtében képződött legelső ürített parazitákat összegyűjtjük. Az összegyűjtött parazitákat újra csirkékbe juttatjuk, és az eljárást néhányszor megismételjük. Végül olyan koraérett parazitavonalat kapunk, amely a béltraktusban kevesebb aszexuális reprodukciós cikluson megy át. Az ilyen parazitavonalak megtartják immunogenitásukat, azonban kevesebb parazitát eredményeznek a bélben, és így a csirke gazdaszervezetben kisebb mértékű károsodást hoznak létre. A fenti típusú vakcina hátránya, hogy költséges, mivel azt élő

HU 221 123 Β1 csirkékben kell előállítani, ezenkívül alacsony reprodukciós képességgel rendelkezik.

A genetikai módszerek bevezetésével hatékony vakcinák előállítására szolgáló új módszerek jelentek meg. Ezeknek a módszereknek az alkalmazásával az egyes kórokozó mikroorganizmusok antigén hatású proteinjeit kódoló DNS-t mikroorganizmus gazdasejtekbe, például E. coliba klónozták, ennek eredményeképpen a protein elegendő mennyiségben expresszálódott ahhoz, hogy vakcinát készíthessenek belőle. Az így előállított proteinek előnye, hogy nem fertőzőek, és viszonylag olcsó az előállításuk. Számos vírus ellen állítottak elő ilyen módszerrel vakcinát, például a hepatitisvírus, a herpes simplex vírus, valamint száj- és körömfájás vírusa ellen.

Kísérletet tettek genetikai módszerek alkalmazásával a coccidiosis ellen vakcina előállítására. Az EP 337 589 számú bejelentésben egy B-csoportú Eimeria tenella protein izolálását és egy új expressziós vektorba való inszertálását ismertetik, amelyet ezután megfelelő gazdaszervezetek transzformálására használtak. A WO 92/04461 számon közreadott nemzetközi szabadalmi bejelentés egy olyan mikroorganizmus előállítását ismerteti, amely vagy az „mRNS”-út, vagy „nukleáris DNS-út” felhasználásával képes egy antigén hatású proteint előállítani. Ily módon előállították és szekvenálták az E. tenella és az E. maxima bizonyos antigénjeit. A fenti eljárás alkalmazása vakcinába foglalható antigének előállítására azon alapul, hogy olyan antigéneket kell kiválasztani, amelyek egy heterológ fajban ellenanyagok termelődését váltják ki. Ez a megközelítési mód nem szükségszerűen eredményezi a védettséget leginkább létrehozó antigén kiválasztását.

Úgy találtuk, hogy az Eimeria paraziták frakcionálásával, immun T-limfocitákat stimuláló proteinek kiválasztásával, az ilyen proteint kódoló nukleinsavat tartalmazó vektorok előállításával, majd ilyen proteineket tartalmazó vakcina előállításával sokkal hatékonyabb coccidiosis elleni vakcina állítható elő.

A találmány tárgyát egyrészt olyan nukleinsavszekvencia képezi, amely egy tisztított Eimeria maximaeredetű T-limfocita-stimuláló protein egészét vagy annak jelentős részét, előnyösen annak egy immunogén aktivitással rendelkező részét kódolja. A fenti nukleinsavszekvencia expressziós kontrollszekvenciákhoz lehet működőképesen kötve, olyan rekombináns nukleinsavmolekulát képezve, amely megfelelő vektorba inszertálva a nukleinsavszekvencia expresszálására képes rekombináns vektort eredményez.

A fentiek szerinti rekombináns vektorral vagy nukleinsavszekvenciával megfelelő gazdasejt vagy gazdaszervezet transzformálható. Az ilyen transzformált gazdasejt vagy gazdaszervezet ezután felhasználható stimuláló hatású protein előállítására, amely a baromfikban coccidiosis ellen védettség létrehozására alkalmas vakcinába foglalható. Eljárhatunk úgy is, hogy magából a transzformált gazdasejtből vagy gazdaszervezetből készítünk vakcinát.

Általánosságban „protein” alatt aminosavak biológiai aktivitással rendelkező molekuláris láncát értjük.

A proteinek nem rendelkeznek meghatározott hosszúsággal, és kívánt esetben például glikozilezéssel, aminezéssel, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel in vivő vagy in vitro módosíthatók; ideértendők tehát többek között a peptidek, oligopeptidek és polipeptidek.

Pontosabban, a találmány tárgyát olyan T-limfocita-stimuláló proteinek vagy azok immunogén hatással rendelkező részei képezik, amelyek a 2. szekvencia szerinti aminosavszekvenciával rendelkeznek, valamint ezek biológiailag funkcionális megfelelői vagy variánsai.

A találmány szerinti proteinek biológiailag funkcionális megfelelői vagy variánsai olyan proteinek, melyeket a fenti aminosavszekvenciákból például egy vagy több aminosav deletálásával, inszertálásával és/vagy helyettesítésével nyertünk, azonban az Eimeria antigének egy vagy több immunogén determinánsát megtartották, például az említett variáns egy vagy több olyan epitóppal rendelkezik, amely egy gazdaállatban immunválasz kiváltására képes.

Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti proteinek esetében az egyes Eimeria paraziták, illetve törzsek között természetes variációk létezhetnek. Ezek a variációk megjelenhetnek a teljes szekvencián belüli aminosaveltérésben (eltérésekben), deléciókban, szubsztitúciókban, inszerciókban, inverziókban vagy az említett szekvenciához egy vagy több aminosav hozzáadásában. Olyan aminosavhelyettesitéseket, amelyek a protein biológiai, illetve immunológiai aktivitását alapvetően nem változtatják meg, ismertetnek például Neurath és munkatársai [The Proteins, Academic Press New York, (1979)]. Egymással rokonságban álló aminosavak helyettesítése, illetve az evolúció során gyakran előforduló aminosavhelyettesítések többek között az alábbiak: Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val [lásd: Dayhoff M. D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Rés. Found., Washington D. C., 5. kötet, 3. suppl., (1978)]. Egyéb aminosavhelyettesítések lehetnek Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val és Ala/Glu. A fenti ismeretek alapján Lipman és Pearson kifejlesztettek egy proteinösszehasonlításra és homológ proteinek közti funkcionális hasonlóság megállapítására szolgáló gyors és érzékeny eljárást [Science, 227, 1435-1441 (1985)]. A találmány szerinti megoldásban végrehajtott ilyen aminosavhelyettesítések, amennyiben a kapott proteinek immunreaktivitása megmarad, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.

A találmány kiterjed továbbá a fent említett Ez/werw-proteineket kódoló izolált és tisztított nukleinsavszekvenciákra. Ilyen nukleinsavszekvenciát mutat az 1. szekvencia. Amint az a gyakorlatból jól ismert, a genetikai kódok degeneráltsága lehetővé teszi a kodonban bázisok szubsztitúcióját úgy, hogy más, de ugyanazon aminosavat kódoló kodon jöjjön létre. így például mind a GAT, mind a GAA glutaminsavat kódoló kodon. Következtetésképpen nyilvánvaló, hogy a 2. szekvencia által bemutatott aminosavszekvenciával rendelkező proteinek expresszálására az 1. nukleinsav3

HU 221 123 Β1 szekvenciáktól eltérő kodonösszetétellel rendelkező nukleinsavszekvencia is felhasználható.

Az Eimeria maxima parazitákat csirkékben való passzálással állítottuk elő, Long és munkatársai módszere szerint [Folio Vet. Lat., 6, 201-207 (1976)]. A fertőzött csirkék ürülékéből oocisztákat izoláltunk, azokat sporulálódni hagytuk, majd telített nátrium-klorid-oldattal történő flotálással tisztítottunk. A sporulálódott oocisztákkal kórokozótól mentes 4 hetes csirkéket fertőztünk. Immunválaszuk megerősítése céljából a madaraknak további sporulálódott oocisztákat adagoltunk.

A fentiek szerint flotálással tisztított sporulálódott oocisztákat tartalmazó készítményt dezintegrátorban vibrálással kezeltük abból a célból, hogy sporozoiták kiszabaduljanak. A sporozoitákat proteolitikus enzimekkel kezeltük, hogy a sporozoiták kiszabaduljanak, majd azokat mostuk és Schmatz és munkatársai módszere szerint [J. Protozool., 31, 181-183 (1984)] ioncserélő kromatográfiás módszerrel tisztítottuk. A sporozoitákat pufferben szuszpendáltuk, vízfürdőben forraltuk, centrifügáltuk és SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát-poli(akril-amid) gélelektroforézis) céljából poli-(akrilamid)-gélre töltöttük. Ugyanazon a gélen molekulatömeg-jelző proteineket is füttattunk abból a célból, hogy extrapolálni tudjuk az Eimeria antigének molekulatömegét. A gélt Towbin és Gordon módszere szerint [J. Immunoi. Methods., 72, 313 - 340 (1984)] nitro-cellulóz-szűrőre elektroforetizáltuk. A nitro-cellulóz-szűrőt ezután mostuk, és a gyártó utasításai szerint végzett Aurodye-festéssel az eredményt láthatóvá tettük.

A proteincsíkokat a nitro-cellulóz-papírból kivágtuk, kis darabokra vagdaltuk és üvegtartályokba tettük Abou-Zeid és munkatársai módszere szerint [J. Imm. Meth. 98, 5-10 (1987)]. Ezután a nitro-cellulóz-darabokat dimetil-szulfoxidban (DMSO) feloldottuk, egy ideig állni hagytuk, hogy az oldódás biztosan végbemenjen, majd a nitro-cellulóz-részecskéket erőteljes rázás mellett cseppenként adagolt karbonát/bikarbonát pufferrel kicsaptuk. A mintákat ezután centrifugáltuk, a nitro-cellulóz-részecskékből álló üledéket néhányszor mostuk, majd újból szuszpendáltuk és kis térfogatú adagokra osztottuk szét.

Annak megállapítására, hogy az elektroforézisgélből származó csíkok bármelyike stimulálja-e a fertőzött madarak limfocitáit, a fentiek szerint fertőzött csirkéktől limfocita proliferációs vizsgálatra vénapunkcióval vért vettünk. A vért 600 g-n centrifugáltuk, majd 10 perc elteltével a leülepedett vörösvérsejtek felett található sejtszuszpenziót eltávolítottuk és további 10 percig, 400 g-n centrifugáltuk. A második centrifügálás alkalmával leülepedett sejteket néhányszor mostuk, végül újraszuszpendáltuk. Az újraszuszpendált sejteket a hígított szuszpendált nitro-cellulóz-részecskék jelenlétében gömbölyű aljú mikrolemezek rekeszeiben tenyésztettük. A kontrollrekeszek csak nitro-cellulóz-részecskéket tartalmaztak protein nélkül.

A limfocitatenyészeteket 96 órán át inkubáltuk, és az utolsó 16 óra folyamán a tenyészeteket ³H-timidinnel kezeltük, majd a sejteket üveg mikroszálas szűrőkre ülepítettük. Szárítást követően a szűrőket szcintillációs edényekbe helyeztük, ezekhez folyékony szcintillációs koktélt adtunk [Scintillator 299 (regisztrált védjegy) Packard, Caversham, Nagy-Britannia], és a radioaktivitást szcintillációs spektrofotométerben mértük. Az eredményeket az alábbi képlet szerinti stimulációs indexszel (Sí) fejeztük ki:

SI=cmpl/cpm2, ahol:

cpml=triplikátumban készített, proteint hordozó NCrészecskék jelenlétében inkubált tenyészetek percenkénti beütésszámának átlaga, cmp2=triplikátumban készített, proteint nem hordozó NC-részecskék jelenlétében inkubált tenyészetek percenkénti beütésszámának átlaga.

E módszer alkalmazásával főleg a T-limfociták szaporodnak.

Az eredmények azt mutatták, hogy bár a stimulációs index különböző madarak és gélek esetében változott, egy körülbelül 45 000 dalton relatív molekulatömeggel (Mr) rendelkező proteincsík következetesen stimulálta az immunizált madarakból származó limfocitákat, azonban nem stimulálta a kontrollmadarakból származókat.

E megfigyelést követően friss E. maxima sporozoitakészítményt választottunk szét SDS-PAGEmódszerrel és a fent ismertetett módon nitro cellulózra vittünk át. Egy 45 000 dalton molekulatömeggel rendelkező proteincsíkot (p45) kivágtunk, a fentiek szerint szolubilizáltunk, foszfáttal puffereit fiziológiás sóoldattal mostunk (PBS), majd PBS-ben szuszpendáltunk. Ezt a szuszpenziót nyulakba oltottuk a bőr alá, és az injektálást minden két hétben megismételtük. Minden egyes injektálást követően két héttel a nyulaktól vénapunkcióval a szélső fülvénából vért vettünk. Öt megerősítő oltást követően Westem-lenyomat-vizsgálattal ellenőrzött, nyúlban termelt anti-p45-szérumot nyertünk.

E. maxima sporozoitákból teljes ribonukleinsavat (RNS) vontunk ki és tisztítottunk cézium-trifluor-acetát gradiensen keresztül való centrifugálással. A messenger RNS-t (mRNS-t) a nem-mRNS-től oligodT CELLULOSE (poli[A] Quik, Stratagene) oszlopokon választottunk el, a gyártó utasításai szerint. Ezután a poli(A)⁺RNS-t, illetve mRNS-t az oszlopról abszolút etanolban oldott nátrium-acetáttal egy éjszaka alatt eluáltuk.

Az mRNS-ről ΖΑΡ-cDNS (regisztrált védjegy) szintetizálókészlettel (Stratagene) dezoxiribonukleinsav-kópiát (cDNS) állítottunk elő. Az első cDNS-szálat egy oligo-dT-templát (amely egy Xhol restrikciós hasítási helyet tartalmazott), valamint Moloney-Murineféle Leukaemia vírus reverz transzkriptáz enzime alkalmazásával állítottuk elő. Az első cDNS-szálban található citozinmaradékokat metileztük, abból a célból, hogy a cDNS-t a későbbiekben, a klónozási eljárás során alkalmazott restrikciós enzimek általi emésztéstől megvédjük. A második cDNS-szálat ribonukleáz-H és DNS-polimeráz I alkalmazásával állítottuk elő, majd T4 DNS-polimerázzal annak végeit helyreállítottuk.

HU 221 123 Β1

A tompa végűvé alakított cDNS-hez T4 DNS-ligázzal EcoRI adaptereket ligáltunk. Xhoi enzimmel történő emésztéssel olyan cDNS-t kaptunk, amely ATioI-kompatibilis 3’-véggel és EcoRI-kompatibilis 5’-véggel rendelkezett.

A cDNS-t EcoRl/Xhoi enzimekkel emésztett és defoszforilezett Uni-ZAP XR vektorhoz ligáltuk, T4 DNS-ligázzal. Az így kapott elsődleges génkönyvtárakat (Emx8, illetve Emx9) E. coli SURE-sejtekbe oltottuk és amplifikáltuk. Megállapítottuk, hogy az Emx8 génkönyvtár 65% rekombinánst, az Emx9 génkönyvtár pedig 55% rekombinánst eredményezett.

Az Emx8, illetve Emx9 génkönyvtárat a fent ismertetett módon nyúlban termelt anti-p45-szérummal vizsgáltuk át. A pozitív plakkokat összegyűjtöttük és újbóli átvizsgálásnak vetettük alá, amíg tiszta pozitív plakkokból álló tenyészetet nem kaptunk.

Az Emx8, illetve Emx9 génkönyvtár klónjaiból származó cDNS-t pUC19 plazmidba szubklónoztuk és restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel elemeztük. Más eljárás szerint, a cDNS-eket lambdaZapból való in vivő kivágással plazmidmentésnek vetettük alá, majd restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel elemeztük.

Ily módon több különböző kiónt azonosítottunk. Két klón elleni antiszérum a kétdimenziós SDS-PAGE-vel szétválasztott E. maxima sporozoiták lenyomatain az anti-p45 antiszérum által felismert különböző foltokkal keresztreakciót adott, ezeket a kiónokat választottuk DNS-szekvencia-vizsgálat céljára. Ezt random szubklónozással és szekvenálással végeztünk a Bankier és munkatársai által leírt M13/didezoxi-nukleotid láncterminációs eljárással [Techniques in the Life Sciences, (Biochemistry), 85, Techniques in Nucleic Acids Biochemistry, 1-34, (1983)].

A találmány szerinti nukleinsavszekvencia egy Eimeria maxima törzsből izolálható és rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával, például polimerázláncreakciós (PCR) technológiával sokszorozható, vagy in vitro szintetizálható, a gyakorlatban ismert eljárásokkal.

A találmány szerinti nukleinsavszekvencia különböző olyan replikációt befolyásoló DNS-szekvenciákhoz kapcsolható, amelyekkel a természetben nem asszociálódik vagy kapcsolódik, ezáltal olyan úgynevezett rekombináns vektort hozhatunk létre, amely alkalmas megfelelő gazdasejt transzformálására. Az alkalmazható rekombináns vektorok előnyösen plazmidokból, bakteriofágokból, kozmidokból, vagy vírusokból származhatnak.

A találmány szerinti nukleinsavszekvenciák klónozására felhasználható specifikus vektorok ismertek a gyakorlatból, ezek lehetnek többek között plazmidvektorok, például pBR322, különböző pUC, pGEM és Bluescript plazmidok; bakteriofágok, például lambdagt-Wes-, Charon-28- és az M13-eredetű fágok; vagy vírusvektorok, például az SV40, adenovírus vagy a poliomavírus [lásd ugyancsak: Rodriquez, R. L. és D. T. Denhardt, szerk., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, (1988);

Lenstra, J. A. és munkatársai., Arch. Tirol. 110, 1-24 (1990)]. A találmány szerinti rekombináns vektorok előállítására használható módszerek a gyakorlatban járatos személy számára ismeretesek, lásd többek között Maniatis T. és munkatársai kézikönyvében [Molecular Cloning A Laboratory Manual, második kiadás, (1989)].

A találmány szerinti nukleinsavszekvenciának a klónozási vektorba való inszertálása könnyűszerrel elvégezhető például oly módon, hogy mind a gént, mind a kívánt klónozási hordozót ugyanazzal a restrikciós enzimmel (enzimekkel) hasítjuk, és így komplementer DNS-végeket kapunk.

Más eljárásban szükség lehet a kapott restrikciós hasítási helyek tompa végűvé való módosítására az egyszálú DNS emésztésével vagy az egyszálú végeknek megfelelő DNS-polimeráz enzimmel való feltöltésével. Ezt követően például a T4-DNS-ligázzal elvégezhető a tompa végek ligálása.

Kívánt esetben bármely DNS-restrikciós felismerőhely előállítható oly módon, hogy a DNS-végekhez linkereket kapcsolunk. Ilyen linkerek tartalmazhatnak restrikciós hasítási hely szekvenciákat kódoló fajlagos oligonukleotidszekvenciákat. A restrikciós enzimmel hasított vektor és nukleinsavszekvencia módosítható homopolimer végekkel is.

A „transzformálás” kifejezés alatt heterológ nukleinsavszekvenciának a gazdasejtbe való bejuttatását értjük, függetlenül az alkalmazott módszertől, amely lehet például direkt felvétel vagy transzdukció. A heterológ nukleinsavszekvencia önállóan replikálódhat vagy integrálódhat a gazdasejt genomjába. A rekombináns vektorokat kívánt esetben elláthatjuk az adott gazdasejttel kompatibilis, megfelelő kontrollszekvenciákkal. Ezek a szekvenciák szabályozni képesek az inszertált nukleinsavszekvencia expresszióját. Mikroorganizmusokon kívül gazdaszervezetként felhasználhatók többsejtű szervezetekből származó sejttenyészetek is.

A találmány szerinti rekombináns vektorok előnyösen egy vagy több olyan markeraktivitást is tartalmaznak, amelyek felhasználhatók a kívánt transzformánsok szelektálására, mint például a pBR322 plazmidban az ampicillin- és tetraciklinrezisztencia, a pUC8 plazmidban az ampicillinrezisztencia valamint a β-galaktozidáz a-peptidje.

Alkalmas gazdasejtek az olyan mikroorganizmusok vagy sejtek, amelyek polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciával vagy ilyen nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns vektorral transzformálhatok, és kívánt esetben felhasználhatók az említett nukleinsavszekvencia által kódolt említett polipeptid expressziójára. A gazdasejt lehet prokariótaeredetű, például baktérium, mint például az Escherichia coli, a Bacillus subtilis és a Pseudomonas fajták, vagy lehetnek eukariótaeredetűek, mint például az élesztők, így például Saccharomyces cerevisiae, vagy magasabb rendű eukarióta sejtek, mint például a rovar-, növény- vagy emlőssejtek, beleértve a HeLa-sejteket és kínai hörcsög petefészek (CHO)-sejteket. Rovarsejtek közé tartozik a Spodoptera frugiperda Sf9 sejtvonal [Luckow és munkatársai,

HU 221 123 Β1

Biotechnology, 6, 47-55, (1988)]. A találmány szerinti nukleinsavszekvenciának eukarióta klónozási rendszerekbe való klónozására és expressziójára vonatkozó információk találhatók Esser, K. és munkatársai [Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, (1986)] kiadványában.

Általában előnyösen prokarióták használhatók a találmány szempontjából hasznos rekombináns vektorok előállítására. Különösen előnyösek például az E. coli K12 törzsek, még különösebben a DH5a vagy az MCI 061 törzsek.

A találmány szerinti nukleinsavszekvenciákat expresszálás céljából mesterségesen egy expressziós vektorba juttatjuk, azaz az említett szekvenciákat például működőképesen expressziót szabályozó szekvenciákhoz kötjük. Ilyen szabályozószekvenciák promotereket, erősítőszekvenciákat, operátorokat, indukálószekvenciákat, riboszómakötő helyeket stb. tartalmazhatnak. A találmány szerinti megoldással tehát, egy fentiek szerinti fímeria-proteint kódoló, működőképesen expressziót szabályozó szekvenciákhoz kötött nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns vektort hozunk létre, amely egy transzformált gazdasejtben (gazdasejtekben) képes az általa tartalmazott DNS-szekvencia expresszálására.

Értelemszerűen, a klónozási vektor kiválasztott helyére inszertált nukleotidszekvenciák tartalmazhatnak természetesen olyan nukleotidokat is, amelyek nem képezik a kívánt polipeptid adott strukturális génjének részét, vagy tartalmazhatják a kívánt protein teljes strukturális génjének csak egy részét, amennyiben a transzformáit gazdasejt az Tu/werza-protein-antigén legalább egy vagy több immunogén determinánsával rendelkező polipeptidet termel.

Amennyiben a gazdasejtek baktériumok, alkalmazható expressziós kontrollszekvenciák például a Trp-promoter és operátor [Goeddel és munkatársai, Nucl. Acids. Rés. 8, 4057 (1980)]; a lac promoter és operátor [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615 (1978)]; a külső membrán protein promotere [Nakamura, K. és Inouge, Μ., EMBO J„ 1, 771-775 (1982)]; a lambdabakteriofág promoterei és operátorai [Remaut, E. és munkatársai, Nucl. Acids. Rés., 11, 4677-4688 (1983)]; az alfa-amiláz (B. subtilis) promoter és operátor, terminációs szekvenciák és egyéb, a kiválasztott gazdasejttel kompatibilis, expressziót fokozó és szabályozó szekvenciák. Amennyiben a gazdasejt élesztő, az alkalmazható expressziós kontrollszekvencia lehet például az alfa-szaporodási („mating”) faktor. Rovarsejtek esetében a polihedrin vagy a baculovírusok plO-promotere használható [Smith, G. E. és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3, 2156-2165 (1983)]. Abban az esetben, ha a gazdasejt emlőseredetű, az alkalmazható expressziós kontrollszekvenciák lehetnek például SV40 promoter [Berman, P. W. és munkatársai, Science, 222, 524-527 (1983)] vagy például metallothioneinpromoter [Brinster, R. L., Natúré, 296, 9-42 (1982)] vagy egy hősokkpromoter [Voellmy és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53 (1985)]. Alkalmazhatók az Eimeriában jelen levő expressziós kontrollszekvenciák is. A génexpresszió maximalizálására lásd még Roberts és Lauer [Methods in Enzymology, 68, 473 (1979)] szakirodalmi helyet.

A találmány kiterjed tehát a fent ismertetett nukleinsavszekvenciát vagy rekombináns nukleinsavmolekulát vagy rekombináns vektort tartalmazó, a nukleinsavszekvencia expresszálásával az CÚMeriű-proteín előállítására képes gazdasejtre (gazdasejtekre) is.

Baromfik Eimeria-fertőzés elleni immunizálása elérhető például úgy, hogy a madaraknak a találmány szerinti polipeptid immunológiailag releváns készítményét úgynevezett alegységvakcina formájában adagoljuk. A találmány szerinti alegységvakcina tartalmazhat egy polipeptidet tiszta formában, adott esetben egy gyógyszergyártásban elfogadott vivőanyaggal együtt. A polipeptidet adott esetben kovalens kötéssel egy idegen proteinhez köthetjük, ami előnyös lehet például a fúziós termék tisztításánál. Ilyenek idegen proteinek például a β-galaktozidáz, a protein A, prokimozin, az Xa véralvadási faktor stb.

Bizonyos esetekben a fenti proteinek alkalmazásával csak alacsony szintű immunvédettséget tudunk kiváltani. A kisebb fragmenseket immunogenitásuk fokozása érdekében előnyösen hordozómolekulákhoz kapcsoljuk. E célra megfelelő hordozók a makromolekulák, mint például természetes polimerek (fehérjék, mint a kürtőscsiga-hemocianin, -albumin, toxinok), szintetikus polimerek, mint például a poliaminosavak (polilizin, polialanin) vagy amfifílvegyületekből, például szaponinokból képzett micellák. Ezek a ffagmensek önmaguk polimeijeiként is előállíthatok, célszerűen mint lineáris polimerek.

A találmány szerinti vakcinában alkalmazható polipeptidek kívánt esetben in vitro vagy in vivő módosíthatók például glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel.

Az alegységvakcinák alternatívái az élő vektorvakcinák. A találmány szerinti nukleinsavszekvenciát rekombináns DNS-technikák segítségével egy mikroorganizmusba (például baktériumba vagy vírusba) juttatjuk úgy, hogy a rekombináns mikroorganizmus még képes legyen szaporodásra, így az inszertált nukleinsavszekvencia által kódolt polipeptid expresszálására és a fertőzött madár szervezetében immunválasz kiváltására.

A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási formája egy olyan rekombináns vektorvírus, amely a fent említett heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmazza és amely képes a rekombináns vektorvírussal fertőzött gazdasejtben (gazdasejtekben) vagy madár gazdaszervezetben a DNS-szekvencia expresszálására. A „heterológ” kifejezés arra vonatkozik, hogy a találmány szerinti nukleinsavszekvencia a természetben nem fordul elő a vektorvírusban.

A találmány tárgyát képezi továbbá a rekombináns vektorvírussal fertőzött olyan gazdasejt (gazdasejtek) vagy sejttenyészet, amely(ek) a nukleinsavszekvencia expresszálásával képes(ek) az Eimeria-protein előállítására.

Heterológ nukleinsavszekvencia, például a találmány szerinti nukleinsavszekvencia-vektor mikroorga6

HU 221 123 Β1 nizmusba való bejuttatására alkalmazható jól ismert eljárás az in vivő homológ rekombináns technika. A klónozóvektorba szokásos rekombináns DNS-technikákkal először a vektorgenom inszerciós régiójának megfelelő DNS-szakaszt iktatjuk be, vagyis egy olyan szakaszt, amelybe egy heterológ szekvencia anélkül beépíthető, hogy a vektor olyan létfontosságú funkciói megszűnnének, amelyek a fertőzéshez vagy a szaporodáshoz szükségesek. Inszerciós régiókat számos mikroorganizmus esetén leírtak (például az EP 80 806, EP 110 385, EP 83 286, EP 314 569, WO 88/02022 és a WO 88/07088 számon közreadott szabadalmi bejelentésekben, illetve az US 4 769 330 és US 4 722 848 számú szabadalmi leírásokban).

Másrészt kívánt esetben az első lépésben nyert rekombináns vektormolekulában jelen levő inszerciós szekvenciában deletálás hozható létre. Ez elérhető például az első lépésben kapott rekombináns vektormolekula megfelelő exonukleáz-III-emésztésével vagy restrikciós enzimes kezelésével.

Harmadszor, a heterológ nukleinsavszekvenciát az első lépésben kapott rekombináns DNS-vektorban található inszerciós régióba vagy az említett rekombináns vektorból deletált DNS helyére építjük be. Az inszerciós régió DNS-szekvenciájának megfelelő hosszúságúnak kell lennie ahhoz, hogy a vektorgenommal való homológ rekombináció végbemehessen. Ezután a megfelelő vektor-DNS-szekvenciákkal határolt inszertet tartalmazó rekombináns vektor jelenlétében megfelelő sejteket fertőzhetünk a vad típusú vektorvírussal vagy transzformálhatunk a vektorgenom-DNS-sel, miáltal a rekombináns vektorban és a vektorgenomban lévő régiók között rekombináció jöhet létre. Ily módon rekombináns vektorutódok állíthatók elő sejtkultúrában, ezek például genotípusos vagy fenotípusos jegyek alapján szelektálhatok például hibridizációval, a heterológ nukleinsavszekvenciával együtt beépült gén által kódolt enzim aktivitásának meghatározásával, illetve immunológiai módszenei a rekombináns vektor által expresszált antigén szerkezetileg heterológ polipeptid kimutatásával.

A következő lépésben ezek a rekombináns mikroorganizmusok immunizálás céljából beadhatók csirkéknek, ahol valameddig fennmaradnak vagy még szaporodnak is a beoltott állat szervezetében, in vivő expresszálják a találmány szerinti inszertált nukleinsavszekvencia által kódolt polipeptidet és a beoltott állat immunrendszerének stimulációját eredményezik. A találmány szerinti nukleinsavszekvencia beépítésére alkalmas vektorok vírusokból nyerhetők, mint például a himlővírusok, például a vacciniavírus (EP 110 385, EP 83 286, US 4 769 330 és US 4 722 848) vagy csirkehimlővírus (WO 88/02022), herpeszvírusok, mint a HVT (WO 88/07088), a Marek-féle betegség vírusa, adenovírus, vagy influenzavírus, vagy származhatnak baktériumokból, például E. coliból vagy bizonyos Salmonella fajokból. Az ilyen típusú rekombináns mikroorganizmusok esetében a gazdaállatban szintetizált polipeptid megjelenhet felületi antigénként. Ebben az összefüggésben, az említett polipeptidnek OMP-proteinekkel vagy például E. coli pilus proteinekkel, vagy az adott organizmus által felismert jelző- vagy horgony szerepet betöltő proteinek szekvenciáival alkotott fúziói elfogadottak. Lehetséges az is, hogy az Eimeria-polipeptidet - kívánt esetben egy nagy egész részeként az immunizálandó állatban szabadítjuk fel. Az említett esetekben az is lehetséges, hogy egy vagy több immunválaszt kiváltó olyan termék expresszálódjék, amely különböző kórokozók és/vagy az adott kórokozó különböző antigénjei ellen vált ki immunválaszt.

A találmány szerinti vektorvakcina úgy állítható elő, hogy egy rekombináns baktériumot vagy egy, a találmány szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns vektorral fertőzött gazdasejtet tenyésztünk, majd a rekombináns baktériumokat vagy vektort tartalmazó sejteket és/vagy a sejtekben szaporodott rekombináns vektorvírusokat lehetőség szerint tiszta formában összegyűjtjük és - adott esetben liofilizált formában vakcinává alakítjuk.

Vektorvakcinát előállíthatunk úgy is, hogy egyéb protozoaparazitát, például Toxoplasma fajt, Eimeria fajt vagy Leishmaniái. a találmány szerinti DNS-sel transzformálunk.

A csupasz DNS-t is felhasználhatjuk vakcinaként, feltéve, hogy az egy plazmidban található vagy megfelelő eukarióta-promoterszekvenciákhoz, például az SV40vírusból származó szekvenciához van kapcsolva.

A találmány szerinti rekombináns vektorral transzformáit gazdasejtek tenyészthetők olyan körülmények között is, amelyek az említett nukleinsavszekvencia által kódolt polipeptid expressziója szempontjából kedvezőek. Vakcinák előállíthatok nyerstenyészetből, a gazdasejt lizátumából vagy a gazdasejt kivonatából, egy másik megvalósítási mód szerint - a felhasználásnak megfelelően - a találmány szerinti polipeptid tisztább formájából állítunk elő vakcinát. Az előállított polipeptidek tisztítása céljából a találmány szerinti rekombináns vektorral transzformált gazdasejteket megfelelő térfogatban tenyésztjük, és a polipeptideket a sejtekből vagy a tápfolyadékból izoláljuk, ha azok oda kiválasztódnak. A tápfolyadékba kiválasztott polipeptidek ismert módszerek szerint izolálhatok és tisztíthatok, így például kisózással, centrifügálással, ultraszűréssel, kromatográfiával, gélszűréssel, immunaffinitás-kromatográfiával, míg az intracelluláris polipeptidek izolálása esetén először a sejteket összegyűjtjük, roncsoljuk, például ultrahanggal vagy más mechanikai beavatkozással, amilyen a Fench-sajtó, ezt követően elválasztjuk a polipeptideket az egyéb intracelluláris alkotórészektől, és a polipeptidet vakcinává alakítjuk. A sejtek roncsolása megoldható kémiai úton (például EDTA vagy detergens, mint például Triton XI14 segítségével végzett kezeléssel) vagy enzimatikusan, például lizozimmal történő emésztéssel.

A találmány szerinti polipeptid ellen termelt ellenanyagok vagy antiszérum potenciálisan felhasználhatók a passzív immunterápiában, diagnosztikai immunpróbákban és antiidiotípus ellenanyagok előállításában.

A fent említett /u/wer/a-proteinek felhasználhatóak mind monospecifikus poliklonális, mind monoklonális

HU 221 123 Β1 ellenanyagok előállítására. Ha poliklonális ellenanyag előállítása kívánatos, azok előállításának és kezelésének technikái a gyakorlatból ismertek [például Mayer és Walter (szerk.), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987]. Egy immunogén elleni monospecifikus ellenanyagok polispecifikus szérumból tisztíthatok affinitásos tisztítási eljárással Hall és munkatársai [Natúré, 311, 379-387 (1984)] módosított módszere szerint. Monospecifikus ellenanyagon egyetlen ellenanyagféleséget vagy a szóban forgó antigénre nézve homogén, kötősajátságokkal rendelkező több ellenanyag-féleséget értünk. A homogén kötődés az ellenanyag-féleség specifikus antigénhez vagy epitóphoz való kötődési képességére utal.

A találmány szerinti EwwerM-proteinekkel szembeni reaktív monoklonális ellenanyagok szokásos eljárások alkalmazásával, beltenyésztett egerek immunizálásával állíthatók elő [Kohler és Milstein, Natúré, 256, 495-497 (1975)]. Eszerint hibridómasejteket szelektálunk hipoxantint, timidint és aminopterint tartalmazó megfelelő sejttenyésztő folyadékban, mint például a Dulbecco szerinti módosított Eagle-médiumban (DMEM) való növekedés alapján. Az ellenanyagot termelő hibridómákat klónozzuk, előnyösen MacPherson-féle lágyagar-technikával [Soft Agár Techniques, Tissue Culture Methods and Applications, (szerk.: Kruse és Peterson) Academic Press, 276, (1973)]. Különálló kolóniákat megfelelő tenyésztőfolyadékban való szaporítás céljából tenyésztőlemez külön lyukaiba viszünk át. Az ellenanyag-termelő sejteket a megfelelő immunogénnel való szűréssel azonosítjuk. Az immunogén pozitív hibridómasejteket a gyakorlatban ismert módszerek szerint tartjuk fenn. Specifikus antimonoklonális ellenanyagokat a hibridómák in vitro tenyésztésével vagy - ismert módon - a hibridómák egerekbe való beadásával és hasűri folyadék termelésével állítunk elő.

Antiidiotípus ellenanyagok azok az immunglobulinok, amelyek egy kórokozó azon antigénjének „belső tükörképét” hordozzák, amely ellen védettséget kívánunk létrehozni, és vakcinában immunogénként felhasználhatók [Dreesman és munkatársai, J. Infect. Disease, 151, 761 (1985)]. Antiidiotípus ellenanyagok előállítására szolgáló módszerek a gyakorlatból ismertek [MacNamara és munkatársai, Science, 226, 1325 (1984)].

A találmány szerinti vakcina a szokásos aktív immunizálási séma szerint adható be: az adagolási formulával összeegyeztethető módon, egyszeri vagy többszöri beadással és olyan mennyiségben, hogy az profilaktikusan hatásos legyen, például az immunizálásra használt antigén vagy az említett antigént expresszálni képes rekombináns mikroorganizmus olyan mennyiségét adagoljuk, amely virulens Eimeria parazitákkal való fertőzéssel szemben baromfikban védettséget hoz létre. Immunitáson vakcinázást követően egy csirkepopulációban szignifikáns szintű védettség kiváltását értjük összehasonlítva egy nem vakcinázott csoporttal.

Elő vírusvektor-vakcinák esetében az egy csirkére jutó dózis ΙΟ⁵—10⁸ plakképző egység közé eshet. A találmány szerinti tipikus alegység-vakcina 1 mikrogramm-1 milligramm találmány szerinti proteint tartalmaz. A vakcina beadható bőrbe, bőr alá, izomba, hasüregbe, vénába, szájon át vagy orrba.

A vakcina tartalmazhat továbbá egy vizes közeget vagy vizet tartalmazó szuszpenziót, gyakran egyéb összetevőkkel keverve a hatás és/vagy a lejárati idő növelése céljából. Ezek az összetevők lehetnek sók, pHpufferek, stabilizátorok (mint például sovány tej vagy kazeinhidrolizátum), emulgeálóanyagok, az immunválaszt fokozó adjuvánsok (például olajok, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok, amfipátiás anyagok) és konzerválószerek.

Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vakcina multivalens vakcina előállítása céljából tartalmazhat a baromfik egyéb kórokozóira jellemző egyéb immunogéneket vagy az ilyen immunogéneket kódoló nukleinsavszekvenciákat, ilyenek például a Marek-féle betegség vírusából (MDV), a baromfipestis-vírusból (NDV), a fertőzőlégcsőhurut-vírusból (IBV), a csirkeanémia-vírusból (CAA), reovírusból, madárretrovírusból, madáradenovírusból, pulyka orr-légcső hurut vírusából származó antigének, vagy E. co/zból, illetve egyéb Eimeria fajból származó antigének.

A találmány kiterjed egy „immunkémiai reagensre”, amely reagens tartalmaz egy találmány szerinti proteint. Az „immunkémiai reagens” fogalma azt jelöli, hogy a találmány szerinti polipeptidek megfelelő hordozóhoz vannak kötve vagy egy jelölőanyaggal vannak ellátva.

A felhasznált hordozók lehetnek például mikrokémcső vagy küvetta belső fala, cső vagy kapilláris, membrán, szűrő, tesztcsík vagy egy részecske felszíne, mint például latexrészecske, vörösvérsejt, festékszemcse, fémszemcse vagy fémvegyületek mint részecskék.

A felhasználható jelölőanyag lehet többek között radioaktív izotóp, fluoreszkáló anyag, enzim, festékszemcse, fémszemcse vagy fémvegyület mint részecske.

A találmány szerinti nukleinsavszekvencia felhasználható hibridizációs kísérletekben alkalmazható olyan specifikus próbák tervezésére is, melyekkel bármilyen szövetből Ez/nerz'ű-eredetű nukleinsavakat tudunk kimutatni.

A találmány tárgykörébe tartozik egy az említett nukleinsavszekvenciát tartalmazó, £7/wer/a-fertőzés diagnosztizálására felhasználható tesztkészlet is.

A találmány egy immunvizsgálatban felhasználható tesztkészletre is vonatkozik, amely legalább egy a találmány szerinti immunkémiai reagenst tartalmaz. A tesztkészlet felhasználásakor lezajló immunkémiai reakció célszerűen szendvicsreakció, agglutinációs reakció, kompetíciós reakció vagy inhibíciós reakció.

Szendvicsreakció kivitelezése esetén a tesztkészlet tartalmazhat például szilárd hordozóhoz, például mikrokémcső belső falához kötött találmány szerinti polipeptidet, valamint vagy a találmány szerinti jelölt polipeptidet, vagy jelölt második ellenanyagot.

A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal szemléltetjük.

HU 221 123 Β1

1. példa

E. maxima sporozoitákböl származó antigének előállítása

l.a.i. Paraziták előállítása

Az Eimeria maxima Houghton törzsből (E. maxima H) származó parazitákat Light Sussex csirkékben passzáltunk Long és munkatársai eljárása szerint [Folio Vet. Lat., 6, 201-207 (1976)]. A székletből 29 °C-on, 72 órán át, 2%-os kálium-dikromátban oocisztákat izoláltunk, azokat 10%-os nátrium-hipokloritban mosva felületüket sterilizáltuk, majd telített nátrium-kloridban való lebegtetéssel tisztítottuk. A sporulálódott oocisztákat foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS) (pH 7,6) szuszpendáltuk és vibrációs kezeléssel roncsoltuk. A sporocisztákat 0,5% tömeg/térfogat sertésepét (Difco), valamint 0,25% tömeg/térfogat tripszint (Difco, 1:250) tartalmazó PBSben (pH 7,6) szuszpendáltuk és 30 percig, 41 °C-on inkubáltuk. A kiszabadult sporozoitákat PBS-ben mostuk (pH 8,0), DE-52 oszlopokon (Whatman) tisztítottuk Schmatz és munkatársai szerint [J. Protozool., 31, 181-183 (1984)], és az üledéket Eppendorf-csövekben -70 °C-on tároltuk.

1. a.ii. Antigének előállítása

A sporozoitákböl álló üledéket (5χ10⁷) 10 percig, 100 ml minta pufferben (50 mmol/1 Tris-Cl pH=6,8; 2% SDS; 10% glicerin, 100 mmol/1 DTT; és 10 mg/ml brómfenolkék) való forralással szolubilizáltuk, majd kétrétegű SDS-poli(akril-amid)-gélre vittük. A géleket elektroforetizáltuk, és a polipeptideket nitro-cellulóz-papírra (NC) vittük át, Towbin és Gordon módszere szerint [.7 Immunoi. Methods, 72, 313-340 (1984)]. Az átvitelt követően az NC-papírt 0,3% Tween-20-at tartalmazó PBS-ben (pH 7,6) mostuk, és a polipeptideket a gyártó utasításai szerint végzett kolloidális arannyal való festéssel (Aurodye, Cambio, Anglia) láthatóvá tettük.

Az NC-papírt csíkokra vágtuk, amelyek mindegyike egy korlátozott molekulatömeg-tartományba eső Eimeria polipeptideket tartalmazott. Mindegyik csíkot apró darabokra vágtuk, és a darabkákat jelölt üvegtartályokba tettük. Mindegyik tartályba 400 ml DMSO-t mértünk, és az elegyet szolubilizálás és sterilezés céljából 60 percig állni hagytuk. Az NC-papírrészecskéket erőteljes rázás mellett, cseppenként adagolt azonos térfogatú karbonát/bikarbonát puffer (50 mmol/1, pH=9,6) hozzáadásával kicsaptuk. A mintákat 1,5 ml térfogatú mikrocsövekbe vittük át és 10 000 g-n 5 percig centrifugáltuk. Az NC-részecskéket RPMI 1640 tápfolyadékban (Gibco Biocult, Paisley, Skócia) háromszor mostuk, végül a fenti tápfolyadék 1 ml-ében szuszpendáltuk, 200 μΐ térfogatú mintákra osztottuk, és -70 °C-on fagyasztva tároltuk.

2. példa

Limfocitastimuláló antigének azonosítása

2.a. Módszerek

2.a.i. Az állatok immunizálása

Az elsődleges fertőzés alkalmával Reaseheath-C csirkék (4 hetes korú, csoportonként 10 csirkéből álló) csoportjait szájon át 4000 sporulálódott E. maxima H.

oocisztával fertőztünk. Másodlagos fertőzés alkalmával ugyanezeknek a madaraknak szájon át 50 000 sporulálódott E. maxima H. oocisztát adtunk. Mindegyik kísérletnél egy azonos korú Reaseheath-C csirkékből álló kontrollcsoportot tartottunk elkülönítve.

2.a.ii. Perifériás vérből származó limfociták előállítása

Heparint (10 egység/ml) tartalmazó műanyag fecskendőkkel a felszíni számyvénákból vérmintákat vettünk (5 ml). A vért csövekbe (Falcon 2027, Becton-Dickinson) vittük át, és 400 fordulat/perc sebességgel 15 percig egy Sorvall RC3B centrifugában centrifugáltuk. A leülepedett vörösvérsejtek felett képződött sejtréteget pipettával óvatosan új csövekbe (Falcon 2027, Becton-Dickinson) vittük át és 2000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk. A leülepedett sejteket 10% borjúszérumot (FCS, vírus és micoplazmamentességre vizsgált, Gibco Biocult), valamint 200 egység/ml penicillint és 200 mg/ml streptomycint (G. R. Squibb and Sons, Moreion, Anglia) tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban háromszor mostuk és a fenti tápfolyadékban 4χ 10⁶ sejt/ml sűrűségben szuszpendáltuk. 100 mikroliter térfogatú sejtszuszpenziókat (4 χ 10⁵ sejt) 96 rekeszű gömbölyű fenekű mikrolemezek (Nunc-Gibco, Paisley, Skócia) rekeszeibe pipettáztunk. Mindegyik rekeszhez 100 mikroliter előkészített mintát adtunk. A vizsgálati minták 10% borjúszérumot, valamint 200 egység/ml penicillint és 200 mg/ml streptomycint tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban hígított előkészített NC-részecske-szuszpenziót (lásd az l.a.i példát) tartalmaztak. A hígítások elkészítéséhez a szuszpenziókat -70 °C-ról felolvasztottuk, a tápfolyadékkal tízszeresére hígítottuk, majd kétszeres határhígítási sort készítettünk. A kontrollminták azonos módon hígított, proteinmentes NCrészecske-szuszpenziót tartalmaztak. Egy másik kontrollmintákból álló sorozat sporozoitákböl fagyasztás-olvasztásos eljárással és ultrahangos kezeléssel előállított egész sporozoiták lizátumát tartalmazta (0,5 mg/ml protein). Az egyes mintákat triplikátumban készítettük mindegyik sejtkészítmény esetében, a replikátumokat random helyeztük el a lemezeken. A lemezeket 96 órán át, 41 °C-on inkubáltuk 5% CO₂koncentráció mellett, az utolsó 16 órában lökésszerűen 1 mCi ^{2 3}H-timidinnel (Amersham U. K.) kezeltük 48 Ci/mmol/1 koncentráció mellett, majd üveg mikroszálas szűrőkre (MA781, Dynatron Laboratories Ltd.) gyűjtöttük (Dynatron Macromash Harvester, Dynatron Laboratories Ltd., Sussex, Anglia). Miután 1 órán át, 50 °C-on szárítottuk, a korongokat szcintillációs edényekbe helyeztük, 3,5 ml folyékony szcintillációs koktélt (Scintillator 299^Tm Packard, Caversham, U. K.) adtunk hozzájuk, és a beépült radioaktivitást egy szcintillációs spektrofotométerben (Beckman Instruments Inc. LS9000) meghatároztuk.

2b. Eredmények

Az eredményeket az egyes madarakból származó sejteket tartalmazó mindegyik minta esetében stimulációs indexként (Sí) fejeztük ki az alábbi módon: SI=cpml/cpm2,

HU 221 123 Β1 ahol:

cpml =proteint hordozó NC-részecskék jelenlétében inkubált triplikátumban készített tenyészetek percenkénti átlagos beütésszáma.

cpm2=proteint nem hordozó NC-részecskék jelenlétében inkubált triplikátumban készített tenyészetek percenkénti átlagos beütésszáma.

Úgy találtuk, hogy a körülbelül 49 kDa/45 kDa relatív molekulatömeggel (együttesen 45 kDa) rendelkező polipeptideket tartalmazó szolubilizált NC-csíkok stimulálták a fertőzött madarakból származó limfocitákat (lásd 1. táblázat). A kontrollmadarakból származó limfociták proliferiációját az NC-csíkok nem stimulálták. Az Sl-értékek 4-9 között változtak, és az időgörbevizsgálatok szerint a madarakból előállított limfociták a második fertőzést követő 4. napon proliferálódtak a legjobban.

3. példa

Limfocitastimuláló antigének elleni ellenanyagok előállítása és vizsgálata

3.1. Módszerek

3.a.i. Az állatok immunizálása

Kórokozómentes nyulakat (Harlan-Olac, Bicester,

Anglia) coccidiamentes környezetben tartottunk. E. maxima H sporozoiták üledékéből származó polipeptideket szolubilizáltunk, SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel szétválasztottunk és az 1. példában ismertetett módon NC-szűrőre vittünk át. A 45 000 dalion molekulatömeggel rendelkező polipeptideket tartalmazó NC-csíkokat kivágtuk, az 1. példában ismertetettek szerint DMSO-ban szolubilizáltuk, PBS-ben (pH=7,0) mostuk, végül 1 ml PBS-ben (pH 7,0) szuszpendáltuk. A szuszpenziókat bőr alá injektáltuk négy helyre (egy helyre 0,25 ml-t), és az injektálást minden két hétben megismételtük oly módon, hogy nyulanként egy-egy alkalommal egy NC-csíkot használtunk. A negyedik injektálást követően két héttel vért vettünk.

Light Sussex csirkéket (3 hetes korúakat) coccidiamentes környezetben tartottunk. E. maxima H sporozoiták üledékéből származó polipeptideket szolubilizáltunk, SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel szétválasztottunk, és a géleket rövid ideig Coomassie Brilliant Blue vizes oldatában festettük. Egy körülbelül 45 kDa molekulatömeggel rendelkező polipeptideket tartalmazó gélcsíkot kivágtunk és kis darabokra vagdaltunk. A géldarabkákat egy „Schlechter and Schuell Biotrap” tartályba öntöttük, és a polipeptideket 150 volt feszültség mellett 16 órán át eluáltuk a gyártó utasításai szerint. Az eluált proteineket PBS-sel szemben (pH=7,6) alaposan dializáltuk, majd AG11A8gyantával kezeltük, hogy minden maradék SDSnyomot eltávolítsunk. Az antigént szaponinnal (Sigma) elegyítettük, a csirkék nyakába, a bőr alá injektáltuk (egy csirkébe 0,5 ml-t, amely 1-5 pg proteint és 5 pg szaponint tartalmazott), az injektálást kéthetes időközönként két alkalommal megismételtük. A harmadik injektálást követően két héttel a csirkéktől szérumot nyertünk.

3.a.ii. Antiszérumok vizsgálata egy- és kétdimenziós lenyomattechnikával

E. maxima H sporozoiták üledékéből származó polipeptideket szolubilizáltunk és az 1. példában ismertetett módon SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel szétválasztottuk. Más eljárás szerint, a sporozoitákat (7xl0⁷) 500 ml lízispufferben (0,2% Nonidet-P40, 20 mmol/1 CHAPS, 9 mol/1 urea, 0,2% Biolytes 3-10 (Biorad), 1 mmol/1 DTT) szuszpendáltuk, ultrahanggal kezeltük (három, egyenként tíz másodpercig tartó 10 mikronos kezeléssel; MSE soniprep 50 készülékkel) és háromszor fagyasztottuk, illetve olvasztottuk. A mintákat 12 000 g-n 1 percig egy mikrocentrifugában centrifugáltuk, majd a polipeptideket lényegében O’Farrell módszerével [/. Bioi. Chem., 250, 4007-4021 (1975)] kétdimenziós gélelektroforézissel szétválasztottuk.

A szétválasztott polipeptideket az 1. példában ismertetett módon NC-papírra vittük át. Az NC-papírokat 3% szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) tartalmazó TTN-pufferbe (10 mmol/1 Tris-HCl pH 7,4; 500 mmol/1 NaCl, 0,05% Tween-20) merítettük és 2 órán át óvatos keverés mellett szobahőmérsékleten inkubáltuk. A papírokat vízben mostuk, csíkokra vágtuk, és mindegyik csíkot 3 órán keresztül 1% BSA-t tartalmazó TTN-pufferben 1:250 arányban hígított nyúlszérumot tartalmazó mintában inkubáltuk. A csíkokat 0,5% Tween-20-at tartalmazó TTN-pufferben háromszor mostuk, majd 1 órán át, 1% BSA-t tartalmazó TTN-pufferben 1:7500 arányban hígított, kecskében nyúl ellen termelt, alkalikus-foszfatázzal konjugált IgG-vel (Promega) inkubáltuk. A csíkokat további három alkalommal 0,5% Tween-20-at tartalmazó TTN-pufferben, majd egy alkalommal AP-pufferben (100 mmol/1 Tris pH 9,5; 100 mmol/1 NaCl; 10 mmol/1 MgCl₂) mostuk. A kötődött foszfatázkonjugátumot úgy mutattuk ki, hogy a csíkokat 50 mg/ml nitroblue-tetrazoliumot és 50 mg/ml brómklór-indolil-foszfátot tartalmazó AP-pufferben inkubáltuk.

3. b. Eredmények

Az 1. ábra nyúlban termelt anti-p45-szérum E. maxima polipeptidekkel szembeni fajlagos reagálóképességét mutatja egydimenziós Western-lenyomatvizsgálatokban. Kétdimenziós Western-lenyomatokon a szérum által felismert foltokat mutatja a

2. ábra.

4. példa

E. maxima sporozoita cDNS-génkönyvtár előállítása

4.a. Módszerek

4.a.i. mRNS izolálása

E. maxima sporozoitákat (5xl0⁸) izoláltunk az 1. példában leírtak szerint. Teljes sejt RNS-t állítottunk elő egy RNS extrakciós készlet (Pharmacia) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. Röviden, a sporozoitákat guadinium-tio-cianátot, N-lauril-szarkozinátot, valamint EDTA-t tartalmazó pufferolt elegyben való inkubálással lizáltuk, és az RNS-t az egyéb sejtal10

HU 221 123 Β1 kotórészektől pufferolt cézium-trifluoro-acetáton keresztül való ultracentrifugálással elválasztottuk. Az RNS-ből álló üledéket óvatosan TE-pufferben (10 mmol/1 Tris-HCl, pH=7,5; 1 mmol/1 EDTA) oldottuk, és etanollal kicsapva -70 °C-on tároltuk. Ebből a teljes RNS-t tartalmazó készítményből mRNS-t állítottunk elő oligo-(dT) cellulóz [poli(A) Quik, Stratagene] oszlopok felhasználásával a gyártó utasításai szerint.

Röviden, a kicsapott RNS-t centrifugálással ülepítettük (12 000 g, 30 perc), levegőn szárítottuk és 400 pl 500 mmol/1 NaCl-t tartalmazó TE-pufferben szuszpendáltuk. Az RNS-t egy olyan oszlopra vittük fel, melyet előzőleg a fentivel megegyező összetételű pufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopról a mRNS-t előzőleg 65 °C-ra melegített TE-pufferrel eluáltuk, az mRNS mennyiségét spektrofotometriás eljárással, 260 nm-en mért abszorbció alapján határoztuk meg, és az 2,6 pg-nak bizonyult. Az mRNS-t 0,1 térfogat 3 mol/1 nátrium-acetát (pH=5,0) és 2,5 térfogat abszolút etanol hozzáadásával egy éjszakán át -70 °C-on precipitáltuk.

4.a.ii. cDNS előállítása és klónozása

Az mRNS-ről cDNS-t állítottunk elő egy ZAP-cDNA™ szintetizálókészlet (Stratagene) felhasználásával, a gyártó utasításai szerint. Az előállított cDNS egy kis részének agarózgél-elektroforézises és autoradiográfiás vizsgálata alapján a cDNS-ek 200 bázispámál kisebb méretűtől a körülbelül 6 kilobázispár nagyságúig terjedtek. A maradék cDNS végeit a négy dNTP jelenlétében 37 °C-on 30 percig T4 DNS-polimerázzal helyreállítottuk. A tompa végekké alakított cDNS-végekhez EcoRI adaptereket ligáltunk T4 DNSligázzal, 8 °C-on, 24 órán át inkubálva. Xhol enzimmel végzett hasítással olyan cDNS-t kaptunk, amely az összes 3’-végen Xhol hasítási helyet, az összes 5’végen AcoRI hasítási helyet tartalmazott. Az oligonukleotidokat (a feleslegben lévő adaptereket és a restrikciós enzimmel hasított primer templátot) oly módon távolítottuk el, hogy a mintát 1 ml térfogatú Sephacryl S-400 oszlopon át centrifugáltuk. 100 nanogramm cDNS-adagokat 1 mg EcoRI és Xhol enzimekkel emésztett és defoszforilezett Uni-ZAP XR vektorral (Stratagene) ligáltunk egy éjszakán át, 12 °C-on T4 DNS-ligázzal. A ligáit DNS-t fágfejekbe csomagoltuk Gigapack II Gold becsomagolókivonat (Stratagene) felhasználásával, a gyártó utasításai szerint. Az így kapott elsődleges génkönyvtárakat lemezekre oltottuk, E. coli SURE sejtekben (Stratagene) amplifikáltuk, és az így nyert amplifikált génkönyvtárakat (Emx8 és Emx9) E. coli XLl-Blue sejteken (Stratagene) titráltuk, mindegyik lépést a gyártók utasításai szerint végeztük. Röviden, a gazdasejteket mindegyik kioltás alkalmával egy éjszakán át, rázás mellett, 30 °C-on, 0,2% (tömeg/térfogat) maltózzal és 10 mmol/1 magnézium-szulfáttal kiegészített L-Broth tápfolyadékban tenyésztettük. A sejteket felhasználás előtt 10 mmol/1 magnézium-szulfáttal 600 nanométeren mért 0,5 optikai denzitás (OD)-értékre hígítottuk. Az egyes génkönyvtárakban a rekombinánsok számát oly módon határoztuk meg, hogy a fágokat 0,4% (tömeg/térfogat) 5-bróm-4-klór-3-indolil-béta-Dgalaktozid (Xgal) és 2,5 mmol/1 izopropil-tio-béta-Dgalaktozid (IPTG) (Northumbria Biolohicals Ltd.) jelenlétében kioltottuk.

4. b. Eredmények

Az Emx8 jelzésű génkönyvtár milliliterenként 3xl0⁸ plakképző egységet (65% rekombinánst), az Emx9 génkönyvtár milliliterenként 6xl0⁸ plakképző egységet (55% rekombinánst) tartalmazott.

5. példa

E. maxima p45 antigéneket kódoló cDNS-klónok azonosítása

5.a. Módszerek

A cDNS génkönyvtárak immunvizsgálatát a Stratagene által megadott szokásos utasítások szerint végeztük. A papírokat nyálban termelt, 1% BSA-t tartalmazó TTN-pufferben 1:100 arányban hígított anti-p45szérumba merítettük. A további eljárások azonosak voltak a 3.a. példában, a Westem-lenyomatok előhívásánál ismertetett eljárásokkal. Pozitív plakkokat azonosítottunk, és miután azokat egy éjszakán át a bakteriofág részecskék eluálása céljából 4 °C-on tároltuk, a plakkokat újravizsgáltuk. A vizsgálatot addig ismételtük, amíg mindegyik pozitív klón tisztán ellenanyaggal reagáló plakkokat nem tartalmazott.

5. b. Eredmények

Az Emx8 és Emx9 génkönyvtárakból huszonkét, nyálban termelt anti-p45-szérummal reagáló egymástól független plakkot (pEm45/l-pEm45/22) azonosítottunk és tisztítottunk.

6. példa

E. maxima p45 antigéneket kódoló cDNS-klónok vizsgálata

6.a. Módszerek

ó.a.i. cDNS-inszertek vizsgálata

A nyúlban termelt anti-p45-szérummal reagáló tisztított plakkokból lambda-fág részecskéket eluáltunk. A cDNS-inszerteket rekombináns lambda-ZAPII-ből való in vivő kihasítással pBluescript plazmidba mentettük a gyártó (Stratagene) utasításai szerint. A cDNS-t tartalmazó pBluescript plazmidokat alkalikus lízises eljárással [Bimbóim és Doly, Nucleic Acids Rés., 7, 1513 (1979)} izoláltuk és a cDNS-eket restrikciós endonukleázos emésztéssel vizsgáltuk.

6. a. iii. DNS-szekvencia-meghatározás

A pEm45/9-et CsCl/etidium-bromid gradiensekben végzett egyensúlyi centrifugálással tisztítottuk, és a cDNS-inszert nukleotidszekvenciáját közvetlenül a dupla szálú DNS-templát alapján, T3 és T7 oligonukleotid primerek (Stratagene), valamint a 2,0 változatú Sequenase felhasználásával (United States Biochemical) határoztuk meg, a gyártó utasításai szerint.

6.b. Eredmények

A pEm45/9 nukleotid szekvenciáját és annak következtetett aminosavszekvenciáját az 1., illetve a 2. szekvencia mutatja.

HU 221 123 Β1

A pEm45/9 klón egy 392 bázispárból álló cDNS, amely 3’-végi poli(A) szekvenciát tartalmaz. A cDNS az első nukleotidtriplettől kezdődően a 329. bázispárnál található, a poli(A)-szekvenciát megelőző „opal” terminációs kodonig (TGA) nyitottnak tűnik. A kikövetkeztetett aminosavszekvencia egy 109 aminosavból álló proteint, vagyis egy körülbelül 12 kilodalton molekulatömegű proteint kódol. A cDNS egyedi Bsml (a 213. bázispámál), Hindin (a 260. bázispámál), valamint Sphl (a 323. bázispámál) restrikciós hasítási helyeket tartalmaz.

7. példa pEm45/9 klón által kódolt rekombináns protein expresszálása

7. a. Módszerek

7.a.i. A pGEX3XEM45/9plazmid konstrukciója mikrogramm pEm45/9 plazmidot 10 egység őű/mHI enzimmel és 10 egység Xhol enzimmel emésztettünk 2 óráig, 37 °C-on, és a kiszabadított cDNSinszertet BamHl-Xhol enzimekkel emésztett és defoszforilezett pRSETB (InVitrogen) plazmidba ligáltuk. A ligáit DNS-t JM109 E. coli törzsbe transzferáltuk, pRSETBEm45/9 rekombináns plazmidot tartalmazó kiónokat gyűjtöttünk és alkalikus lízises eljárással [Bimbóim és Doly, Nucl. Acid. Rés., 7, 1513 (1979)] plazmid DNS-t izoláltunk.

pg pRSETBEm45/9-et 10 egység £coRI enzimmel emésztettünk, és a kiszabadított cDNS-inszertet £coRI enzimmel emésztett és defoszforilezett pGEX3X (Pharmacia) plazmidba ligáltuk. A ligáit DNS-t JM101 £. coli törzsbe transzferáltuk, rekombináns plazmidokat hordozó baktériumokat válogattunk, és a fent ismertetettek szerint azokból plazmid DNS-t izoláltunk. A DNS-t restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel és agarózgél-elektroforézissel vizsgáltuk pGEX3XEM45/9 plazmid azonosítása céljából, mely plazmid a pEM45/9 cDNS-inszertet a protein expressziója szempontjából helyes orientációban, glutation-S-transzferázzal fuzionálva tartalmazta.

7.a.ii. A glutation-S-transzferáz (GST)-Em45/9fúziós protein expresszálása

Baktériumtelepeket 100 pg/ml Ampicillint tartalmazó L-broth táptalajba oltottunk és egy éjszakán át, erőteljes rázás mellett, 37 °C-on tenyésztettünk. 50 pl egyéjszakás tenyészettel 5 ml friss táptalajt oltottunk be, és a tenyészeteket addig inkubáltuk, amíg az abszorbció körülbelül 0,3 értéket nem ért el (600 nm-en mérve). A tenyészethez 1 mmol/1 végkoncentrációban IPTG-t adtunk, és a tenyésztést további 4-5 órán át folytattuk. Az inkubálás során, különböző időpontokban, a baktériumtenyészetből mintát vettünk, és azt a

3.a.ii. pontban leírtak szerint, a natív p45-antigén ellen termelt ellenanyagokkal PAGE, valamint Westernlenyomat-vizsgálatnak vetettük alá.

ml egy éjszakán át tenyésztett tenyészettel 200 ml friss táptalajt oltottunk be, és azt a fentiek szerint tenyésztettük. Öt órával az IPTG 1 mmol/1 koncentrációban való hozzáadását követően a baktériumsejteket centrifugálással összegyűjtöttük és 5 ml 1% (térfogat/térfogat) Triton-X-100-at tartalmazó PBS-ben szuszpendáltuk. A sejteket négy, egyenként 30 másodpercig tartó kezeléssel, a legmagasabb fokozaton (MSE, Soniprep készülékkel) ultrahanggal kezeltük, és az ultrahanggal kezelt elegyet centrifugálással felülúszóra és üledékre választottuk szét. Az üledéket 8 mol/l-es karbamidban vagy 2%-os SDS-ben szolubilizáltuk, majd PAGE, valamint Western-lenyomatvizsgálatnak vetettük alá.

7. b. Eredmények

A rekombináns GST-EM45/9 proteint sikeresen expresszáltuk £. co/zban, amint azt a baktériumlizátumok Westem-lenyomatának nyálban termelt vagy csirkében termelt anti-p45-szérummal való vizsgálata alapján megállapítottuk. A szérummal fajlagosan reagáló fúziós protein egy körülbelül 37 kilodalton molekulatömegű protein volt, melyben 26 kDa a GST-nek, 11 kDa az EM45/9-nek felelt meg (lásd 2. ábra, 1. sor). A protein termelődött az egy éjszakán át inkubált tenyészetben is, de IPTG hozzáadását követően az expresszió lényegesen nagyobb volt (2. ábra, 3. sor). Az ülepített tenyészet ultrahangos kezelését követően nagyon kis mennyiségű rekombináns proteint tudtunk kimutatni a felülúszóban (2. ábra, 4. sor), míg az nagy koncentrációban volt megtalálható az üledékben és a 2%-os SDS szolubilizálta (2. ábra, 6. sor). 8 mol/l-es karbamidban az üledék csak részben volt feloldható (2. ábra, 5. sor).

8. példa

A pGEX3XEM45/9 fúziós protein preparatív elektroforézise

8.a. Módszerek

Két, egyenként 1 ml térfogatú, a 7.a.ii. pontban leírtak szerint előállított SDS-sel szolubilizált fúziós proteint tartalmazó mintát az l.a.ii. pontban ismertetettek szerint elektroforetizáltunk. Az elektroforézist követően a gél mindkét széléről egy 1 cm vertikális csíkot levágtunk és 10 percig, 45% (térfogat/térfogat) metanolban és 10% (térfogat/térfogat) ecetsavban oldott 0,125%-os Coomassie Brilliant Blue festékkel festettük. Mindkét gél megmaradt részét 45% (térfogat/térfogat) metanolban és 10% (térfogat/térfogat) ecetsavban inkubáltuk. A festett csíkokat rövid ideig színtelenítettük, majd az egész gélt egy fényforrással ellátott doboz felett egy üvegtálcán összeraktuk. A gélek középső, meg nem festett részéből kivágtuk a pGEX3XEM45/9 rekombináns proteint tartalmazó részt és apró darabokra vágtuk. A géldarabkákat kis térfogatú pufferben (25 mmol/1 Tris pH 8,3; 192 mmol/1 glicin, 0,1% SDS) egy dialíziszsákba tettük. A leforrasztott zsákokat az előbbivel megegyező összetételű pufferrel feltöltött agarózelektroforézis-tartályba helyeztük, és a fúziós proteint 50 volt feszültség mellett, 16 órán át elektroeluáltuk. A fúziós proteint tartalmazó puffért eltávolítottuk a zsákból, PBS-sel (pH 7,6) szemben alaposan dializáltuk, majd az esetleg visszamaradt SDS-nyomok eltávolítása céljából AGllA8-gyantával (Biorad) kezeltük a gyártó utasításai szerint. A fenti antigén mintáit SDS-PAGE- és Westem-lenyomat-vizsgálattal analizáltuk.

HU 221 123 Β1

8. b. Eredmények

Két akrilamid-gélcsíkból körülbelül 200 pg proteint elektroeluáltunk. Ennek az antigénnek az összetételét SDS-PAGE-eljárással (3. ábra) és anti-p45-szérummal vizsgált Western-lenyomattal (4. ábra) analizáltuk. Mindkét ábra esetében az első csík a baktériumtenyészetből 4-5 órás IPTG-indukciót követően vett mintát tartalmaz, a 2. csík azt az elektroeluált antigénből vett mintát tartalmazza, amelyet az immunizációs kísérleteknél (9. példa), és egy in vitro limfoproliferációs vizsgálatban (10. példa) használtunk.

9. példa

Csirkék immunizálása a pGEX3XEM45/9 fúziós proteinnel az Eimeria maxima-fertőzéssel szemben védettséget hoz létre

9. a. Módszerek

9.a.i. Az állatok immunizálása

Harminchat Light Sussex csirkét háromhetes korig coccidiamentes környezetben tartottunk. A madarakat random módszerrel két csoportra osztottuk és elkülönítve egy-egy madarat tartalmazó ketrecekben tartottuk őket. Vérmintákat vettünk, és tizennyolc madarat bőr alá injektálva, PBS-ben szuszpendált (0,1 ml) 10 mikrogramm (a 8. példában ismertetett módon előállított) antigénnel és 5 mikrogramm szaponinnal immunizáltunk. A fennmaradó tizennyolc madarat PBS-ben szuszpendált 5 mikrogramm szaponinnal immunizáltuk (0,1 ml) bőr alá injektálva. Az immunizálást kéthetes időközökben még kétszer megismételtük, és mindegyik immunizálást követően vérmintákat vettünk.

9.a.ii. A madarak fertőzése

Az utolsó immunizálást követően két héttel mindegyik madárnak szájon át, intubálással 100 sporulálódott E. maxima oocisztát adtunk be. Mindegyik madár ürülékét naponta, a fertőzést követő 5-10. napokon papírral bélelt tálcákba gyűjtöttük, és az egyes madarak által ürített oociszták számát elkevert és hígított székletmintákban Macmaster számlálókamrákban megszámoltuk.

9. b. Eredmények

A 3. táblázat az egyes madarak által ürített oociszták számát és az antigénnel, illetve álantigénnel immunizált két madárcsoport csoportátlagát mutatja. Azok a madarak, amelyek antigént kaptak, 44%-kal kevesebb oocisztát ürítettek, mint az álimmunizált csoportba tartozók, ami azt mutatja, hogy a 8. példa szerinti antigén alkalmas csirkékben Eimeria maxima elleni védettség létrehozására.

10. példa

10. a. Módszerek

A 9. példa szerint végzett harmadik immunizációt követően vett vérmintákból perifériás limfocitákat állítottunk elő. Az előállítás menete megegyezett a 2.a.ii. példában ismertetettel. Mindegyik rekeszhez 100 μΐ, a

8. példában leírt módon előállított antigént adtunk, melyet PBS-ben 0,2 pg/ml koncentrációra hígítottunk, majd a limfostimulációs vizsgálatot a 2.a.ii. példában leírt módon folytattuk.

lO.b. Eredmények

Az 5. ábra mutatja az antigénnel immunizált madarakból nyert sejtek átlagos stimulációs indexét összehasonlítva az álimmunizált madarakból nyert sejtek átlagos stimulációs indexével. Az immunizált madarak esetében a stimuláció négyszer nagyobb volt, mint az álimmunizált madaraknál, ami arra utal, hogy a rekombináns pGEX3XEM45/9-antigén fajlagos limfostimulációs hatást fejtett ki a sejtekre.

Az ábrák leírása

1. ábra: E. maxima sporozoitákból származó polipeptidek Westem-lenyomat-vizsgálat mutatja nyálban termelt anti-p45-ellenanyaggal.

2. ábra: A pGEX3XEM45/9 expressziójának vizsgálata Westem-lenyomat-technikával. A csíkok az alábbi mintákat mutatják:

std=molekulatömeg-markerek (kDa-ban);

l=pGEX3XEM45/9 egyéjszakás tenyészete;

2=(600 nm-en mérve) 0,3 abszorbciós érték eléréséig szaporított tenyészet (ebben az időpontban mmol/1 koncentrációban IPTG-t adtunk a tenyészethez);

= a tenyészetből az IPTG hozzáadását követően

3,5 órával vett minta;

4=az IPTG-vel indukált tenyészetből ultrahangkezeléssel és centrifugálással nyert szolubilis lizátum;

5=az ultrahangkezelést és centrifugálást követően nyert üledékből 8 mol/l-es karbamiddal szolubilizált minta;

6=az ultrahangkezelést és centrifugálást követően nyert üledékből a csak 2%-os SDS-ben szolubilizálódó minta.

3. ábra: Az elektroeluált pGEX3XEM45/9 fúziós protein SDS-PAGE-vizsgálatát mutatja. A csíkok az alábbi mintákat mutatják:

std=molekulatömeg-markerek (kDa-ban);

l=a pGEX3XEM45/9 tenyészetéből az IPTG hozzáadását követően 4,5 órával vett minta;

2=elektroeluált fúziós protein;

= 1 pl koncentrált (Centrion contracter, Amicon) elektroeluált fúziós protein;

4=5 pl a 3. csíkon található mintából;

5=20 μΐ a 3. csíkon található mintából.

A vízszintes irányú nyíl a 4. ábrán a csirkében termelt anti-p45-szérum által felismert proteint mutatja.

4. ábra: Az elektroeluált pGEX3XEM45/9 fúziós protein Westem-lenyomat-vizsgálatát mutatja csirkében termelt anti-p45-szérummal. A csíkok az alábbi mintákat mutatják:

std=molekulatömeg-markerek (kDa-ban);

l=a pGEX3XEM45/9 tenyészetéből az IPTG hozzáadását követően 4,5 órával vett minta;

2=elektroeluált fúziós protein;

= 1 μΐ koncentrált elektroeluált fúziós protein;

4=5 μΐ a 3. csíkon található mintából;

5=20 μΐ a 3. csíkon található mintából.

Az 5. ábra az antigénnel immunizált madarakból nyert sejtek átlagos stimulációs indexét mutatja összehasonlítva az álimmunizált madarakból nyert sejtek átlagos stimulációs indexével.

HU 221 123 Β1

3. táblázat

In vivő védettség létrehozása E. maxima-fertőzéssel szemben: pGEX3XEM45/9 fúziós proteinnel immunizált madarak oocisztaürítésének összehasonlítása álimmunizált kontrollmadarakéval

1. táblázat

Nitro-cellulózhoz kötött E. maxima sporozoita antigénekkel immunizált madarak, valamint kontrollmadarak stimulációs indexei (Mindegyik S.I. érték tíz madár átlagát jelenti) 5

Csoport- szám (Mr)	1. kísérlet immunizált madarak	2. kísérlet immunizált madarak	1. kísérlet kontroli- madarak	2. kísérlet kontroli- madarak
1149 kDa	5,04	4,51	1,12	1,41
12 45 kDa	2,48	5,12	1,32	1,63

2. táblázat

E. maxima H sporozoiták vizsgálata kétdimenziós gélen - anti-45-szérum által felismert és limfocitastimuláló hatású foltok azonosítása

Helyzetszám	Anti-p45-szérum által felismert	Limfostimuláció
11	+
12	+	-
17	+	+
18	+	-
25	+	+
26	+	+
27	+	-
28	+	-
29		-
34	+	-
43	+	-
54		-

Csoport	Madarak száma	Ooociszta ürítés (xlO6)	Átlag	Szórás
lm-	1	34,2	18,7	11,5
munizált	2	46,8
	3	13,6
	4	37,6
	5	11,7
	6	26,6
	7	15,4
	8	7,3
	9	8,7
	11	10,3
	12	9,5
	13	10,6
	14	16,0
	15	12,9
	16	24,8
	17	11,8
	18	20,5
Álim-	19	41,9	33,5	15,1
munizált	20	49,1
	21	27,1
	23	31,2
	24	38,1
	25	11,4
	26	22,1
	27	48,5
	28	39,3
	29	23,3
	30	44,4
	31	40,5
	32	23,0
	33	8,5
	34	21,0
	35	31,3
	36	68,2

SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BEJELENTŐ: Akzo Nobel N.V.

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: COCCIDIOSIS ELLENI BAROMFIOLTÓ ANYAG (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 2 (2) INFORMÁCIÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 392 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS-ről mRNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) ORGANIZMUS: Eimeria maxima

HU 221 123 Β1 (B) TÖRZS: Houghton (D) FEJLŐDÉSI FOK: Sporozoita (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:

(A) KÖNYVTÁR: Lambda-ZapII-be klónozott sporozoita-cDNS (B) KLÓN: Em45-9 (ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 3...329 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. szekvencia

CA ACA GCA GAT GCT TAT TTA ACA AAC GCC TGC TGC TGT CTT AGA TAC 47

Thr Alá Asp Alá Tyr Leu Thr Asn Alá Cys Cys Cys Leu Arg Tyr

1

5

10

15

ACG

AAC

TCT

TGC

TGC

AGC

AAG

TAT

TGC

TGC

AGC

AAG

TGT

TGC

TGC

AGC

95

Thr

Asn

Ser

Cy s

Cy s

Ser

Lys

Tyr

Cy s

Cys

Ser

Ly s

Cy s

Cy s

Cy s

Ser

20

25

30

AAG

TGT

TGC

TGC

AGC

AAA

TGC

TGC

TGC

AGC

ACG

TAT

TGC

TGC

AGT

ACG

143

Ly s

Cy s

Cy s

Cy s

Ser

Ly s

Cy s

Cy s

Cy s

Ser

Thr

Tyr

Cy s

Cys

Ser

Thr

35

40

45

TTC

TGC

TGC

AGC

AAG

TGC

TGC

TGC

AGC

AAG

TTT

TGC

TGC

AAT

AGA

TTT

191

Phe

Cy s

Cy s

Ser

Ly s

Cy s

Cy s

Cy s

Ser

Ly s

Phe

Cy s

Cy s

As n

Arg

Phe

50

55

60

AGT

AAT

AGA

TTT

TGC

TGC

AGC

AGA

ATG

CTG

CTG

CAG

CAA

CTT

TTG

CTG

239

Ser

As n

Arg

Phe

Cy s

Cy s

Ser

Arg

Me t

Leu

Leu

Gin

Gin

Le u

Leu

Leu

65

70

75

CAG

CAA

GGT

TTG

CTG

CAA

CAA

GCT

TTT

GCT

GCA

GCA

TTT

GCT

GCT

GCA

287

Gin

Gin

Gly

Leu

Leu

Gin

Gin

Al a

Phe

Al a

Alá

Alá

Phe

Al a

Al a

Al a

80

85

90

95

GCA

GGT

GCT

GCT

GCA

GCA

AGT

GCT

GCT

GCA

GCA

TGC

ACA

GAC

329

Al a

Gly

Al a

Al a

Al a

Al a

Ser

Al a

Al a

Al a

Al a

Cy s

Thr

As p

100 105

TAGCCTGTAT TACACAGGGA GCCTTAACCT TTCCGCCTGT TGTTAAAAAA AAAAAAAAAA 389 AAA 392 (2) INFORMÁCIÓK AZ 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 109 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. szekvencia

Thr 1

Al a

As p

Al a

Tyr 5

Leu

Thr

As n

Al a

Cy s 10

Cy s

Cy s

Le u

Arg

Tyr 15

Thr

Asn

Ser

Cy s

Cys

Ser

Ly s

Tyr

Cy s

Cys

Ser

Ly s

Cy s

Cy s

Cy s

Ser

Ly s

20

25

30

Cy s

Cys

Cy s

Ser

Ly s

Cy s

Cy s

Cy s

Ser

Thr

Thr

Cy s

Cys

Ser

Thr

Phe

35

40

45

Cys

Cy s

Ser

Ly s

Cy s

Cy s

Cy s

Ser

Ly s

Phe

Cy s

Cy s

As n

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Asn

Arg

Phe

Cys

Cy s

Ser

Arg

Me t

Leu

Le u

Gin

Gin

Leu

Le u

Leu

Gin

65

70

75

80

Gin

Gly

Leu

Leu

Gin

Gin

Al a

Phe

Al a

Al a

Al a

Phe

Al a

Al a

Al a

Alá

85

90

95

Gly

Al a

Al a

Al a

Al a

Ser

Al a

Al a

Al a

Alá

Cy s

Thr

As p

100

105

Claims (14)

1. Eimeria-eredetű, T-limfocita-stimuláló protein, amely a 2. szekvencia szerinti aminosavszekvencia legalább egy T-limfocita-stimuláló epitópot tartalmazó részét tartalmazza, vagy annak biológiailag funkcionális származéka.

2. Az 1. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy Eimeria maxima-eredetű.

3. Nukleinsavszekvencia, amely valamely, az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti proteint kódol.

4. A 3. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavszekvencia az 1. szekvencia szerinti DNS-szekvencia legalább egy részét tartalmazza.

5. Rekombináns nukleinsavmolekula, amely egy, a 3. vagy 4. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz, expresszálását lehetővé tevő expressziós kontrollszekvenciákhoz működőképesen van kapcsolva.

6. Rekombináns vektor, amely egy, a 3. vagy 4. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.

7. A 6. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavszekvencia expressziós kontrollszekvenciákhoz van működőképesen kapcsolva.

8. Gazdasejt vagy gazdaszervezet, amely egy, a 3. vagy 4. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciával, vagy egy, az 5. igénypont szerinti rekombináns nukleinsavmolekulával, vagy egy, a 6. vagy a 7. igénypont szerinti rekombináns vektormolekulával van transzformálva.

9. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti protein expresszálására, azzal jellemezve, hogy egy, a 8. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztünk.

10. Baromfik coccidiosis-fertőzése ellen védő vakcina, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti proteint, egy, az 5. igénypont szerinti rekombináns nukleinsavmolekulát, egy, a 6. vagy 7. igénypont szerinti rekombináns vektormolekulát, vagy egy, a 8. igénypont szerinti gazdasejtet vagy gazdaszervezetet tartalmaz állatgyógyászatban szokásos hordozóanyagokkal együtt.

11. Eljárás coccidiosis elleni vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy, a 8. igénypont szerinti transzformált sejtet tenyésztünk, a rekombináns vektort összegyűjtjük, és az említett rekombináns vektort immunizáló aktivitással rendelkező állatgyógyászati készítménnyé alakítjuk, vagy

b) egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti proteint, vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással előállított proteint immunizáló aktivitással rendelkező állatgyógyászati készítménnyé alakítunk.

12. Antitest vagy antiszérum, amely egy, az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti proteinnel immunológíailag reagál.

13. Immunkémiai reagens, amely egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti proteint tartalmaz, egy hordozóhoz kötve vagy egy jelölőanyaggal ellátva.

14. Vizsgálókészlet E/wierm-fertőzés diagnosztizálására, amely egy, a 3. vagy 4. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát, vagy egy, a 13. igénypont szerinti ellenanyagot vagy antiszérumot, vagy egy, a 14. igénypont szerinti immunkémiai reagenst tartalmaz.