JP2000516477A

JP2000516477A - 完全マラリア抗原ｇｐ１９０／ＭＰＳ１の組替え製造方法

Info

Publication number: JP2000516477A
Application number: JP10516249A
Authority: JP
Inventors: ヘルマンブヤード; ラルフトル; ヴェイキングパン
Original assignee: ヘルマンブヤード
Priority date: 1996-10-02
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 2000-12-12
Also published as: EP0929677B1; ID22037A; EP0929677A2; DE19640817A1; ATE299939T1; US6933130B1; AU4864997A; EP1637602A1; DK0929677T3; CN1236391A; DE59712370D1; US20050095256A1; CN1148448C; AU727864B2; ES2244993T3; WO1998014583A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、熱マラリア原虫(Plasmodium)、特に、P.falciparum表面抗原、完全gp190/MPS1の組替え体の製造方法に関する。本発明は、また、これらの方法により始めて寄生動物以外で、全体としての蛋白質が合成されることができたこの蛋白質の完全ＤＮＡ配列、およびこの配列の発現に好適な宿主生物体に関する。本発明は，始めて十分な量でgp190/MSP1を製造する可能性を開拓する。さらに加えて、gp190/MSP1をワクチンとして使用することに関する。最後に、本発明は、ＡＴ−リッチ遺伝子の安定化方法を提供する（図１）。

Description

【発明の詳細な説明】完全マラリア抗原gp190/MPS1の組替え製造方法本発明は、合成ＤＮＡ配列の発現による、別々に天然に生成するドメイン、又はその部分だけでなく、完全マラリア抗原gp190/MPS1、の組替え体の製造方法に関する。発明は、また、この方法により作られたＤＮＡ配列、およびこのＤＮＡ配列の発現に使われたホスト生物体に関する。さらに本発明は、マラリア抗原の部分だけでなく、完全マラリア抗原、マラリアに対する免疫化のワクチンとしての用途に関する。最後に、懸案の本発明は、ＡＴを減らされたことによって特徴づけられた安定化された遺伝子だけでなく、ＡＴ−リッチ遺伝子の安定化方法に関する。マラリアは、世界で最も重大な感染病である。ＷＨＯの報告によれば、１９９０年、９９ケ国で、世界の人口の４０％が、マラリアの危険に曝されていた。同時に、マラリアの分布が、途方もなく増加中であった。このことは、なかんづく、マラリアを起こす寄生動物の抵抗力が、治療目的の医薬を予防薬として推奨したり使用したりすることによって助長されて、強力に発達したことによると思われる。その上、新規で効果的な化学治療剤を望む探索が、今日ワクチンの発達にむけられている、その理由は、マラリアが流行している世界の地域における人々は、ある種の免疫をなんとか発達させているからである。マラリアに対する天然の抵抗力だけでなく、例えば鎌状赤血球遺伝子の異形接合性キャリアーに見られるものや、サラセミア症の患者、グルコース−６−フォスフェートデハイドロゲナーゼ欠乏症、ヒトがマラリア罹患する途中、等において、免疫機構が刺激され、かれら自身がプラスモデア（マラリア原虫）に抵抗する強力な能力を有するようになる。したがって、あまり頻度の高くない、または始めて罹患する人々における病気の進行より、厳しい流行に曝された人々における病気の進行は、一般的にはるかに恐れられていない。ワクチンの発達の大きな問題は、感染防御免疫を誘導できる抗原の同定である。この理由は、ヒトに影響を及ぼす４つの感染動物に適用でき、容易にアクセスでき、十分確立された動物モデルがないからである。マラリアを起こす原虫は、プラスモデア族に属する。４つの寄生動物、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vi vax)、卵型マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)のひとつによる感染は、ハマダラカ族蚊(Anopheles mosquitoes)が噛む結果である。これらの寄生動物の中でも熱帯熱マラリア原虫(Plasiodium falciparum)が最も危険で最も広く分布している。マラリア寄生動物・熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)と他のマラリア寄生動物、例えば、P.vivaxの血中段階の侵襲性の型である分裂小体は、190 -220kDの糖蛋白質（グリコプロテイン）である。寄生動物の発達中の後期において、この前駆体は、より小さな蛋白質になる。それは単一の複合体として分裂小体から単離することが出来る。グリコシルフォスファチジルイノシトール結合によって、この複合体は分裂小体膜に結合している。種々のP．falcipa rum株のgp190蛋白質の配列は２つのグループに分けられ、それらの間で、相互の組替えがしばしば起こる。一般的に、この蛋白質は、多くの保存性のある領域、２つのアレレ体の一方が各場合に属している二形性の領域、Ｎ−末領域にある２つの比較的小さな数種（オリゴ）形性のブロックからなっている(Tanabe,K.,Mackay,M.,Goman,M.,および Scaife,J.G.(1987),マラリア寄生動物熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falcipa rum)の表面抗原遺伝子におけるアレレ二形性J.Mol.Biol.195,273-287,Miller,L. H.,Roberts,T.,Shahabuddin,M.およびMcCutchan,T.F.(1993)，熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)分裂小体表面蛋白質−１(MSP-1)における配列の多様性の分析Mol.Biochem.Parasitol.59,1-14)。すでに、初期においてgp190/MSP1はワクチンのための可能性のある候補であると考えられていた。げっ歯類モデルにおいて、げっ歯類寄生動物での感染に対して、類似する蛋白質を用いた、下記の免疫化で、活性な防御が得られた。この蛋白質に対して誘導された抗体で受動感染防御が獲得されることが出来た(Holder, A.A.およびFreeman,R.R(1981),精製した寄生動物抗原を用いる血中段階げっ歯類マラリアに対する免疫化、Nature 294,361-364 ；Marjarian,W.R.,Daly,T.M., Weidanz,W.P．およびLong,C.A.(1984)、IgG3モノクローナル抗体を用いたマウスのマラリアに対する受動免疫化,J.Lmmunol.132,3131-3137も参照）。この仮定を支持すべき日付は、詳細には満足できるような重要なものではない。また、P.falciparumによる赤血球の侵襲をビトロで阻害するもので、gp190/MS P1に対して誘導されたかなりの数のモノクローナル抗体がある(Pirson,P.J.およびPerkins,M.E.(1985)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)分裂小体の表面抗原のモノクローナル抗体の特徴,J.Lmmunol.134,1946-1951; Blackman,M.J.,Heidrich,H.G.,Donachie,S.,McBride,J.S.Holder,A.A.(1990), マラリア分裂小体表面抗原の単鎖フラグメント（断片）は、赤血球侵襲の間、寄生動物に残存し、侵襲−阻害抗体の標的である。J.Exp.Med.172,379-382）。終わりに、霊長類、特に、AotusおよびSaimiriモンキーのP.falciparumからの gp190/MSP1を用いてかなりの系統のワクチン研究がなされた(Perrin,L.H.,Merkl i,B.,Loche,M.,Chizzolini,C.,Smart,J.およびRichle,R(1984)、サイミリモンキーにおける抗マラリア免疫。無性生殖血中段階の表面成分を用いた免疫化。J.Exp.Med.160,441-451; Hall,R.,Hyde,J.E.,Goman,M.,Simmons,D．L.，Hope,I.A.,Mackay,M．およびSc aife,J.G.(1984),クローン化され、バクテリア中で発現されたヒトマラリア寄生動物の主な表面抗原遺伝子。Nature 311,379-382; Siddiqui,W.A.,Tam,L.Q.,Kramer,K.J.,Hui,G.S.N.,Case,S.E.,Yamaga,K.M.,Ch ang,S.P.,Chan,E.B.T.およびKan,S.-C.(1987)、分裂小体表面被覆前駆体蛋白質は、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)マラリアに対してAotusモンキーを完全に、免疫防御する。 Proc.Natl.Acad.Sci.USA84,3014-3018; Ettlinger,H.M.,Caspers,P.,Materil e,H.,Schoenfeld H.-J.,Stueber,D．およびTakacs,B(1991)熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum)を用いた異種攻撃誘発免疫に対してモンキーを免疫防御する、組替えまたは天然蛋白質の能力Inf.Imm.59,3498-3503; Holder,A.A.,Freeman,R.R.およびNicholls,S.C.(1988)、大腸菌で製造された組替えポリペプチドを用いた熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に対する免疫化 Parasite Immunol.10,607-617; Herrera,S.,Herrera,M.A.,Perlaza,B.L.,Burki,Y.,Caspers,P.,Doebeli,H.,Ro tmann,D.，およびCerta,U.(1990)，熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum )血中段階組替え蛋白質を用いた、Aotusモンキーの免疫化Proc.Natl.Acad.Sci.U SA87,4017-4021； Herrera,M.A.,Rosero,F.,Herrera,S.，Caspers,P.，Rotmann,D.,Sinigaglia,F .,およびCerta,U.(1992),万能Ｔ−細胞エピトープと融合した組替え血中段階抗原を用いて免疫化したAotusモンキーにおけるマラリアに対する防御免疫；防御免疫と血清ガンマインターフェロンレベルの相関Inf.Imm.60,154-158; Patarroyo,M.E.,Romero,P.,Torres,M.L.,Clavijo,P.,Moreno,A., Martinez,A.,Rodriquez,R.,Guzmann,F．およびCabezas,E.(1987)、合成ペプチドを用いるマラリア実験感染に対する防護免疫の誘導Nature.328,629-632も参照）。これらのワクチン研究において２つの前提が明かになった。 −寄生動物から単離された材料の使用、および −発現の異種の系で獲得された材料の投与後者は、全蛋白質中の、概して、比較的小さな部分からなっている。主としてモンキーに行われた接種の結果であるが、gp190/MSP1は、免疫防御をもたらす事が出来た。霊長類に対して行われた全ての実験は２つの問題がある。それは結果として下記の疑問点を呈した。 (a)実験は非常に数少ない動物群に対して行われた。 (b)実験は繰り返えされなかった。したがって、それらから導かれる結果と結論は、十分に確認されたものではなかった。適切なモンキーにアクセスすることが困難なので、主たる基本的な問題、つまり適切な量で良いワクチン材料を製造することを可能にするにははるかに及ばないという問題が残った。一方、Ｋ１および熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)のMAD20株からのgp190遺伝子の配列決定の後に、重複するフラグメントがE.coli．で発現されることが出来た。この材料を用いた西アフリカでの流行学的研究によって、青年期群においては一方のgp190/MSP1フラグメントに対する抗体力価と、他方の寄生動物感染からの保護免疫との間に相関関係が認められた。また、抗体力価は、低濃度ではあったが、パラサイテミア（寄生虫血症）を制御する能力とも相関すると思われた(Tolle et al.(1993)、マラリア感染の制御と、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)血中段階抗原gp190に対するヒト体液性免疫応答とを結合した保護免疫研究:,Infect.Immun．61，40-47)。これらの結果は、本発明の枠組みの中でAotusモンキーについての新しい研究によって補足される。ここでは、もっぱらプロセッシングを受けていないgp190/ MSP1からなる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)からの蛋白質調整物が、ワクチンとして使われたので、寄生動物での感染に対してより高い保護免疫が達成された。Gp190/MSP1に対して最も高い抗体力価を持つモンキーが最も良く保護免疫を獲得した。結局、この結果は、熱帯マラリアに対するワクチンのための最も可能性のある候補者としてgp190を示唆した。 Gp190(p19およびp42)のＣ−末端ドメインは、研究者のいくつかのグループにおいてgp190によって媒介された免疫において特定の役割が割り当てられている( Chang,S.P.,Case,S.E.,Gosnell,W.L.,Hashimoto,A.,Kramer,K.J.,Tam,L.Q.,Hash iro,C.Q.,Nikaido,C.M.,Gibson,H.L.,Lee-Ng,C.T.,Barr,P.J.,Yokota,B.T.,およびHui,G.S.N.(1996)，熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)分裂小体の表面蛋白質１の組替えバキュロウイルス４２キロダルトンＣ−末フラグメントは、マラリアに対して、Aotusモンキーを免疫防御する。 Inf.Imm.64,253-261; Burghaus,P.A.,Wellde,B.T.,Hall,T.,Richards,R.L.,Egan,A.F.,Riley,E.M.,R ipley-Ballou,W.Holder,A.A(1996)，リポソームおよびアルムアジュバント（免疫活性促進物質）中で熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)分裂小体の表面蛋白質１の組替えＣ−末フラグメントで、Aotus nancymaiを免疫化しても攻撃感染に対して免疫防御を誘導しない。Inf.Imm．印刷中、も参照）。しかし、感染防御免疫応答とは無関係であるとして、理論的な基礎からgp190 の他の部分を除くこともまた、ずっと、不可能であった。したがってワクチン研究には依然として遺伝子全体、又は無傷のgp190を使うことが依然として必要である。しかし多数のグループの多くの研究にもかかわらずgp190/MSP1遺伝子全体を発現したりクローニングしたりすることは成功しなかった。感染防御免疫応答とは無関係なgp190配列のどれかの部分を推論して除くことの可能性も、はるかになかったので、ワクチン研究には全遺伝子または遺伝子産物を使うことは依然として必要である。多数のグループの多くの研究にもかかわらずgp190/MSP1遺伝子全体を発現したりクローニングしたりすることは成功していない。本発明の１つの目的は、したがって、完全gp190/MSP1の形でのワクチン材料を適当量使用できるようにする事である。さらなる目的はこのワクチン材料を回収ことのできる工程を提供する事である。また本発明の１部の他の目的はホスト生物体で発現させることの出来るgp190/ MSP1の完全ＤＮＡ配列を提供する。さらに他の本発明の目的は、完全gp190/MSP1遺伝子を有する宿主（ホスト）生物体を提供する。最後に、本発明はＡＴ量を減らしたことによって特徴付けられる安定化された発現に適した遺伝子のみならず、ＡＴ−リッチ遺伝子の安定化方法を提供する。これらの目的はクレームに記載された主題によって解決される。以下に、この文脈において、これらの目的がどのように理解されるべきかを明かにするために、より詳細にそれぞれの概念を説明する。「組替え製造工程」とは、クローニングによって得られ、そして個々のＤＮＡ断片の融合から得られたＤＮＡ配列をそのなかに有する適切な宿主生物体によって、ＤＮＡ配列の蛋白質を発現することを意味する。「完全gp190/MSP1蛋白質」とは、ここで、プラスモデアと名づけられた、特に熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)から単離されうるすべてのgp190/M SP1表面蛋白質を意味する。そしてP.vivaxのような他のプラスモデウム種由来の蛋白質だけでなく、上記された寄生動物の主たる表面蛋白を示す。したがってこの語は、人に危険であるとして上記のように名づけられた４つのマラリア寄生動物の分裂小体の主たる表面蛋白質のそれぞれの場合を含む。「完全gp190/MSP1遺伝子」とは、この蛋白質をコードする遺伝子を意味する。したがって、この文脈において、「完全」とは、天然の蛋白質の全部のアミノ酸配列が存在すること、またはその遺伝配列が天然の蛋白質の全アミノ酸配列をコードすることを意味する。しかし、成熟した及び／又短縮系のgp190/MSP1もそれが完全gp190/M SP1と同様の免疫化力（ワクチン免疫防護力）を示す限り本発明のgp190/MSP1に含まれる。最後にこの語は、種々のアレレ突然変異型群の１分子蛋白質フフラグメント中に含まれることによって特徴付けられるgp190/MSP1の変異体をも含む。「FCB-１」は、例えばHeidrich,H.-G．，Miettinen-Baumann,A.,Eckerkson,C. およびLottspeich,F.(1989)に、記載されたP.falciparumの系統の株である。両方とも185-195キロダルトンの前駆体から由来した４２と３６キロダルトンの熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)(FCB1)分裂小体表面抗原のＮ末アミノ酸配列Mol.Biochem.Parasitol.34,147-154。「付着シグナル」は、本発明蛋白質の３’又は５’末端のＤＮＡ配列によってコードされた蛋白質構造を意味する。付着シグナルは、例を挙げれば、膜のような、他の構造のポリペプチドに付着しうる構造である。「シグナルペプチド」は、本発明の遺伝子のＮ末端のＤＮＡ配列がコードする蛋白質構造を意味する。シグナルペプチドは、なかでも、そのポリペプチドを膜に貫通させる構造である。本発明では、「ＡＴ−含量」とは、グアニン−シトシン塩基対に比したアデーニン−チミン塩基対のパーセント量を意味する。「クローニング」とは、本発明に適用しうる、当技術ですべて公知のクロ−ニング方法を意味する。これらの方法は、すべてを詳細に記載してはいないが、当業者にとって通常のツール（道具）に属するからである。「適切な発現系で発現する」とは、本発明に適用しうる、公知の発現系での、当技術ですべて公知の方法を含む。これらの方法は、すべてを詳細に記載してはいないが、当業者にとって通常のツール（道具）に属するからである。本発明の主たる目的は、蛋白質gp190/MSP1とその遺伝子が過剰な経費をかけずに十分な量製造されることの出来る製造方法を提供することである。この目的は、請求項１の組替え製造方法によって解決される。そこでは完全gp19 0/MSP1の遺伝子とそれのコードする蛋白質を十分な量で得ることが出来る。始めて、本発明の工程によって、本発明の蛋白質の合成が寄生動物の外で可能となった。立体的にエピトープを認識するモノクローナル抗体の分析が示すようにこのように合成された蛋白質は、少なくとも天然の立体型における広範な範囲に渡って再現的に合成可能である。組替え製造工程によれば多量ミリグラムの完全なgp190/MSP1が宿主生物体からすべての場合において回収されることが出来るのであり、その量は技術的、経済的理由から寄生動物からは決して得ることができないものである。望ましい要求量での蛋白質の製造が可能となったので、マラリアに対する試験ワクチンとしての用途のための新しい展望が開けた。さらに核酸を基礎としたワタチンのためだけでなく今や弱毒性ワクチンの発展のための道が開かれた。蛋白質gp190/MSP1をコードする遺伝子配列の合成はP.falciparumのFCB-１株の配列に選択的に基づいている。P.falciparumは熱帯マラリアの媒体であり、したがって、マラリアの型のなかでは最も危険である。基本的な遺伝子は「Ｋ１アレラ（対立遺伝子）」の典型的なものであり、ここでＫ１は特定のP.falciparum株から確立される。それのコードする配列は4917塩基対に渡って伸び、Ｃ−末端の付着配列のみならずＮ−末端のシグナル配列をふくんでいる。さらに、本発明によれば、この組替え製造方法では、この蛋白質が基礎としているＤＮA配列のＡT含量が、天然型と比べて、原料遺伝子での７４％から好ましくは約５５％まで、減らされているという選択的特徴があり、例えば、FCB-１蛋白質のアミノ酸配列が保持されるかぎりヒトゲノムにおいて通常であるコドン頻度を有するＤＮＡ配列が作られる。例示された以外のＡＴ含量を減らした他のコドン頻度を持つ配列もまた可能である。選択的に（好ましくは）、この組替え製造方法によって製造された蛋白質の基礎である、シグナルペプチドおよびＧＰＩ付着シグナルペプチドを含む全アミノ酸配列をコードする遺伝子は、さらにgp190^Sとして記載される。他の好ましい態様として、この組替え製造方法によって製造された蛋白質が基礎としている遺伝子は、ＧＰＩ付着シグナルを除いた完全アミノ酸配列をコードする。この態様はgp190^S1として記載される。さらに他の好ましい態様として、この組替え製造方法によって製造された蛋白質が基礎としている遺伝子は、ＧＰＩ付着シグナルとシグナルペプチドを除いた完全アミノ酸配列をコードする。この態様はgp190^S2として記載した。さらに好ましい態様として、この組替え製造方法によって製造された蛋白質が基礎としている遺伝子は、完全アミノ酸配列および膜貫通付着配列をコードする。特に好ましい態様として、本発明の組替え製造方法は以下の工程を含む：最初に、P.falciparum FCB-１からの遺伝子に基づいて合成すべきＤＮＡ配列が設計される。このＤＮＡ配列は、例えばFCB-１蛋白質のアミノ酸配列を保持していて、ヒトゲノムで通常のコドン頻度である配列が製造される。この遺伝子のＡＴ含量は、好ましくは５５％まで減らされるべきである。さらに本発明工程では計画された配列は例えば５つの重複する領域に分けられる。これらは同時にFCB-１からgp190/MSP1の天然でプロセッシングされるドメインｐ８３，ｐ３１，ｐ３６，ｐ３０及びｐ１９に相当する。デオキシオリゴヌクレオチド(desoxyoigonucleotide)が合成され、各場合においてある領域の全長まで延ばして合成される。このように合成されたデオキシオリゴヌクレオチド（desoxyoigonucleotide）は、特に、その配列が、上側の（５’−３’）または、下側の（３’−５’）ＤＮＡ鎖に対して交互に対応するものであるのが好ましい。これらのオリゴヌクレオチド配列の長さは好ましくは平均１２０ヌクレオチドであり、隣の配列との重なりは各場合で約２０である。好ましいひとつの態様では、存在する最終製品の約２倍の長さのＤＮＡを、非対称ＰＣＲ法によって製造する。その結果延びすぎたＤＮＡ配列は、各場合で、ほとんど反対鎖を示すようになる。これが第２のＰＣＲ増幅サイクルにおいて、重複部分を除いた４つの最初に挿入したオリゴヌクレオチドの長さに相当する第２の製品になる。これらの製品を、終端オリゴヌクレオチドと共に、非対称ＰＣＲ法によってもっぱら単鎖ＤＮＡからなる調整物に移行すると、たったの２５ＰＣＲサイクルで、８００ｂｐ長さの２重鎖ＤＮＡフラグメントのさらなる増幅工程で製造ができる。この方法では、ｐ１９，ｐ３０，ｐ３６及びｐ３１をコードする領域が直接合成でき、E.coll（大腸菌）中で分子的に複製される。欠陥のない配列のクローンが、直接又は欠陥のない配列セグメントと一緒になった状態で保存される。ｐ８３をコードする領域は、約１２００ｂｐからなる２つの配列の融合によって構築される。さらなる製造工程において単鎖がクローン化（複製）される。好ましいとして候補となる発現ベクターは、プラスミドpDS56,RBS11(“Hochuli,E．，Bannwarth ，W.,Doebeli,H.,Gentz,R.およびStueber,D.(1988)新規金属キレート吸着剤を使った組替え蛋白質の有効な精製についての遺伝子的アプローチ，Biotechn.6,132 1-1325”)， pBi-5(“Baron,U.,Freundlib,S.,Gossen,M.およびBujard,H.(1995) ２方向プロモーターを介するテトラサイクリンによる２つの遺伝子の活性の共同調節、Nu.cl.AcidsRes.23,3605-3606)およびppTMCSである。上記にもかかわらず、他の発現ベクターを候補として想起することも可能である。宿主に好適な生物体はE.coll，特に好ましくは、DH5alphaZ1株、HeLa細胞，ＣＨＯ細胞、トキソプラズマゴンデイ(Toxoplasma gondii)(Pfefferkorn,E.R. およびPfefferkorn,C.C.1976，トキソプラズマゴンデイ：温度感受性突然変異体の単離と基礎的な特徴付け Exp.Parasitol.39,365-376)，またはリーシュマニアLeishmaniaである。さらに付け加えられる宿主系は、例えば酵母（yeasts）、バクロウイルス(baculoviruses)、アデノウイルス(adenoviruses)であるが、本発明の主題は、記載した宿主系に限られるべきではない。本発明の他の目的は、P.falciparumの表面蛋白質gp190/MSP1の発現に適した、完全ＤＮＡ配列を提供することにある．この目的は請求項１７の発明によって解決された。これによって，本発明の配列が、上述の組替え製造方法によって得られることができる。本発明の好ましい態様では、発現に好適な配列は完全アミノ酸配列をコードする。本発明の他の好ましい態様では、発現に好適な配列は付着シグナル以外の完全アミノ酸配列をコードする。本発明のさらに好ましい態様では、発現に好適なＤＮＡ配列は、付着シグナルおよびペプチドシグナル以外の完全アミノ酸配列をコードする。したがってこの gp190/MSP1の態様は、そのうちの６個がヒスチジンであるＮ−末の付加的な１１アミノ酸、を含むことで特徴づけられる。特に好ましい発現に好適なＤＮＡ配列は、認識できるスプライス−ドナーとスプライス−アクセプターサイトを含まない。特に好ましくは、ＲＮＡレベルで安定なヘアピン構造になる可能性のある比較的大きなＧＣ−リッチ配列を含まない。好ましくは、６以上の塩基対の配列を認識する制限酵素のための認識シグナルはさけるべきである。好ましい態様では、これは遺伝子中で１回だけおこるのだが、制限エンドヌクレアーゼのための開裂サイトが以下で示す、蛋白質のプロセッシングで存在するドメインを分離するために領域中に導入される。特に好ましくは、遺伝子中では起こらない制限エンドヌクレアーゼのための配列の遺伝子を両末端に存在させることである。さらに、本発明では、gp190/MSP1表面蛋白質の完全配列を含む宿主生物体が提供される。そのような宿主生物体はE.coli，特に好ましくは、DH5alphaZ1株、HeLa細胞、ＣＨＯ細胞，トキソプラズマゴンデイ(Toxoplasma gondii)，またはリーシュマニア(Leishmania)である。HeLaとＣＨＯ細胞は、好ましくはｔＴＡを本質的に合成すべきである．最後に本発明は、組替え製造方法により創作し製造されたgp190/MSP1表面蛋白質又はその一部を、マラリアに対する活性免疫化のために用いる可能性を提供する。本発明で提供された合成の概要は、また、gp190/MSP1の第２のアレレを製造することが出来る。その際、蛋白質の２形性(dimorphism)もまた考慮される。しかし、主たる蛋白質の変異性は、２つの比較的短いブロック、ブロックIIとブロックIV(引例1)、これらは、オリゴ形性(oligomorphic)である、の配列に依存する。本発明の配列データは、これらのブロックの６−８配列の結合と共にすべての公知のgp190/MSP1配列の９５％以上を開示することを可能にした。これらの配列変異体の合成は、ここで提案された策略の方法により問題なく達成することができるので、変異体はＫ１およびＭＡＤ２０アレレ内に両方とも構築されうる。このように製造された配列群からのワクチンは、gp190/MSP1変異体と寄生動物の広い範囲に対して、必要な場所に免疫保護を提供する。さまざまの型のワクチンの製造が可能である。 −蛋白質製造の段階では、各場面で２つのファミリー（Ｋ１型、ブロック（Bloc s）IIとIVの異なる変異型を持つＭＡＤ２０）の混合物が使用できる。 −弱毒化ワクチンの段階では(a)ウイルスキャリアー、特にワクチニアとアデノウイルス；(b)キャリアーとしての寄生動物、特にリーシュマニア(Leishmania )およびトキソプラズマの無毒性型;(c)細菌キャリアー、例えば、サルモネラ。 −核酸の段階では、ここでは例えば、遺伝子治療に適したベクターが遺伝子を宿主中に導入するのに用いられるであろう。さらに所望の蛋白質をコードする核酸の導入がもくろまれうる。ワクチン化のためのさらなる可能性は、本発明によって設計された組替え製造工程により製造されたgp190/MSP1蛋白質を、モノクローナル抗体の製造に使用することであり、このモノクローナル抗体は、次に今度は自分がマラリアに対する受動免疫化に用いられることができる。同様に、組替え製造方法の途中で起こる中間段階で、核酸に基づくワクチンを構築するために、この蛋白質が基礎としているＤＮＡ配列を、用いることが可能になる。最後に本発明はまた、遺伝子配列の安定化、特に発現系で適切な安定性を示さない配列に対する安定化のための方法に関する。本発明によれば、この安定化は、配列のＡＴ含量を減らすことによって達成される。さらに、本発明によれば、ＡＴを減らすことによって特徴付けられる安定化された遺伝子を提供する。そのような安定化された遺伝子の例は、本発明によるgp 190/MSP1表面蛋白質のための遺伝子である。以下、本発明を、図や表、ならびに各実施態様の実施例のいくつかに言及しつつ説明する。図１：熱帯熱マラリア原虫（P．falciparum）(FCB-1)由来のgp190/MSP1前駆物質タンパク質の模式図。図２： P．falciparum(FCB-1)由来の天然のgp190/MSP1を用いてヨザル（Ao tus monkeys）で実施した２種のワクチン接種試験。図２Ａ：３×６０μｇのgp190/MSP1を投与。図２Ｂ：３×４０μｇのgp190/MSP1を投与。図３Ａ：gp190/MSP1遺伝子の合成戦略。図３Ｂ：ＰＣＲによる全合成の原理。図３Ｃ：gp190^Sの全配列。図３Ｄ：gp190^S1変異体のＮならびにＣ末端。図４Ａ：gp190^S2配列を有する発現ベクターpDS56。図４Ｂ：gp190^S2のゲル電気泳動。図５Ａ：gp190^S1配列を有する発現ベクターpBi-5。図５Ｂ：HeLa細胞の免疫蛍光分析。図５Ｃ：HeLa細胞から精製したgp190^S1の電気泳動による特性分析。図６Ａ：gp190配列を有する発現ベクターppT190。図６Ｂ：gp190^SのT．gondiiでの発現の免疫蛍光分析。図６Ｃ：T．gondii由来のgp190のポリアクリルアミドゲル電気泳動。図１に模式的に示す熱帯熱マラリア原虫(P．falciparum)由来のgp190/MSP1 前駆物質タンパク質では、黒色のブロックは、全系統で強固に保存されている領域を示す。斜線のブロックは、FCB-１の場合には、単離物がＫ１対立遺伝子に由来するようなダイモルフィック(dimorphic)な領域を示す。Ｏ１ならびにＯ２は、オリゴモルフィック(oligomorphic)な領域を示す。Ｓは、１９のアミノ酸からなるペプチドシグナル配列を示しており、ＧＡは、タンパク質の膜へのＧＰＩによる付着に関してのシグナルを含むＣ末端領域を示す。矢印は、処理部位を示しており、この処理によってタンパク質ｐ５３、ｐ３１、ｐ３６、ｐ３０、ｐ１９が生じる。gp190遺伝子は、１６３９個のアミノ酸全体をコードする。他の数字は、以下の実施例の文脈で、より適切なかたちで説明する。実施例実施例１： gp190/MSP1をコードするＤＮＡ配列の一つの全合成（図３参照）Ａ： gp190/MSP1遺伝子(gp190^S)の合成戦略（図３Ａ参照）配列を、主要な処理生成物であるｐ８３、ｐ３１、ｐ３６、ｐ３０、ｐ１９に対応する断片に分割した。それらの移行領域には、制限エンドヌクレアーゼ用の開裂部位（図３の矢印）を、アミノ酸配列に変更が生じないように挿入した。それぞれの特定開裂部位は、いずれも、配列中に一度のみ出てくるものとする。断片は、互いに重複するように合成し、各末端の開裂部位がライゲーションによって隣接する断片と付着するようにした。また、各断片は、いずれも、５’末端にBamHI分裂部位を有しており、発現ベクターへの挿入が可能となっている。この配列全体は、MluIならびにClaIを介してクローニングが可能であった。また、ここに示すスキームでは、Ｃ末端の１８アミノ酸が欠落しているためにＧＰＩ付着を生じ得ない配列も得られる。対応するオリゴヌクレオチド、ならびにSphI 開裂部位を越えて延在する「プライマー」を合成すると、ＰＣＲの後に、Sp hIならびにClaIを用いることにより使用が可能なGAフラグメントが得られ、得られた全配列がgp190^Sとなる。ペプチドシグナルをコードしている配列を除いて「ＰＣＲプライマー」を作成し、それを用いて断片△Ｓを合成した。BamHIならびにHindIII開裂部位を利用して、Ｎ末端を、タンパク質がアミノ酸番号２０からはじまるように変更することもできる。gp190/MSPlをコードし、シグナル配列もＧＰＩ付着シグナルも含まない核配列を、gp190^S2と称するものとした。ＧＰＩ付着シグナルのみが欠失したものが、gp190^S1となる。Ｂ．ＰＣＲを利用した全合成の原理（図３Ｂ参照）コード鎖あるいは非コード鎖から、約１２０ヌクレオチドのオリゴデオキシヌクレオチドを交互に合成し、それぞれの場合について、約２０塩基が隣接断片と重複するようにした。このスキームで示すのは、たとえば、複数のオリゴヌクレオチドから長さ約８００bpの断片を合成する過程である。まず、４つの反応容器のそれぞれで、ステージ２のオリゴヌクレオチドを「非対称」増幅させた。その結果、長さ約２２０bpの４群のＤＮＡが得られ、これらは、主に、一本鎖から構成されていた（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。ＡとＢ、ＣとＤをユニットとして、５サイクル増幅したところ、２本の長さ約４００bpの二本鎖生成物が得られた。これらのＤＮＡ断片の非対称増幅を行ったところ（ステージIII、一本鎖の群が得られ、さらにユニット化して増幅したところ（ステージIV）、１０サイクル後に、長さ約８００bpの最終生成物Ｇが得られた。この合成は、中間生成物を単離したり、バッファーや酵素を取り替えたりしなくても実施することができ、３時間以内で完了した。最終生成物を電気泳動によって精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで分割し、ポリリンカーにMluIならびにClaI開裂部位が挿入されているpB luescript(ストラタジーン(Stratagene))に入れて大腸菌にクローニングした。Ｃ． gp190^Sの全配列（図３Ｃ参照）すべての部分配列（図３Ａ）を、pBluescriptで融合した後、遺伝子の配列を、ジデオキシ法で確認した。gp190^Sの読み枠は、４９１７bp（＋停止コドン２つ）の長さを有しており、FCB-1由来のgp190/MSP1のアミノ酸配列（１６３９アミノ酸）に対応するアミノ酸配列をコードしていた。Ｄ． gp190^S1の変異体のＮならびにＣ末端（図３Ｄ参照） BamHI開裂部位から始まるＮ末端の配列は、アミノ酸２０での移行を示唆しており、このことから、シグナルペプチドの切り離した後は、この部位がＮ末端となると考えることができる。Ｃ末端では、コード配列は、アミノ酸１６２１で終わっていた。停止コドンが、ClaI開裂部位に続いていた。実施例２：大腸菌でのgp190^S2の発現Ａ．発現ベクター（図４Ａ参照） pDS56RBSIIに、BamHI開裂部位ならびにClaI開裂部位を介して、gp190^S2配列を挿入したところ、ベクターに由来する６つのヒスチジンといくつかのアミノ酸が、Ｎ末端に融合した。その結果、以下のＮ末端配列、すなわち、Met Arg Gly Se r(His)₆ Gly Serが読み枠に生成した。プロモーターPN_251ac0-1が存在しているので、転写は、lacR/O/IPTGの制御下で生じることとなる。Ｂ． gp190^S2の発現と生成（図４Ｄ参照）ベクターpDS56RBSII gp190^S2を大腸菌DH5alphaZ1に入れ、IPTGによって合成を誘導したところ、培養物からの全タンパク質抽出物を電気泳動によって分離した後に、予測通りのサイズのはっきり目に見えるバンドが得られた（矢印）。この物質をIMACならびにアフィニティクロマトグラフィー（mAb５．２の抗体カラム）で精製したところ、約１９０kDの均質な生成物が得られた。図中、Ｍは、分予量スタンダードであり、１は、IPTGによる誘導を行う前の大腸菌、２は、IPTGで２時間誘導を行った大腸菌、３、４、５は、モノクローナル抗体カラムからの溶出分画である。実施例３： gp190^S1のHeLa細胞ならびにCHO細胞中でのテトラサイクリン制御下での発現、ならびに生成物の単離（図５および６Ｃ参照）Ａ． gp190の配列を、発現ベクターpBi-5に、BamHI/ClaI開裂部位を介して挿入した。その結果、遺伝子の転写が、双方向「tTA-レポンシブ(reponsive)」プロモーターの制御下に置かれ、Ｔｃによって調節可能となった。この双方向プロモーターが、インジケーター遺伝子であるルシフェラーゼの転写も同時に開始した。そのため、発現の調節を容易に追跡することができた（図５Ａ参照）。Ｂ．Ｔｃ制御下でルシフェラーゼとgp190^S1を発現するHeLa細胞の免疫蛍光分析（Ａ）の双方向転写ユニットを含むHtTA93-9細胞で、Ｔｃの不在下ではルシフェラーゼ（左）ならびにgp190^S1（中央）が産生されていることが、示された。Ｔｃを加えた後は、gp190^S1の顕著な合成は見られなかった（図５Ｂ（右）参照）。Ｃ． HeLa細胞から精製したgp190^S1の電気泳動分析 HeLa細胞のクローンであるHtTA93-9、ならびにCHO細胞のクローンであるCHO27 -29を、Ｔｃの存在下ならびに不在下で培養した。電気泳動で分離した細胞抽出物を、mAb5.2を用いて、「ウェスタン・ブロッティング」によって分析した（図５Ｃ）。ＣＨＯ株化細胞の分析結果を左に、HeLa細胞の分析結果を右に示す。（１）Ｔｃの不在下での培養、（２）Ｔｃの存在下での培養、（３）トランスフェクションしていないHtTA-1株化細胞。分子量スタンダードは、それぞれのケースについて、左側に示してある。Ｄ． HeLa細胞のクローンHtTA93-9によって合成されたgp190^S1の精製 HtTA株化細胞の調製用培養を行い、Ｔｃを抑制することによってgp190^S1の発現を誘導したところ、アフィニティクロマトグラフィー（mAb5.2カラム）によって遺伝子産物を単離することができた。電気泳動の後に、ポリアクリルアミドゲルをクーマシー染色したところ（図６Ｃ）、生成物が、gp190^S1と約５０kDの別のタンパク質から構成されていることが示された。後者は、gp190^S1に由来するものではなく、したがって、HeLa細胞に由来するものであった。このタンパク質の除去を行うことは、原理的にさしたる困難を伴わないはずである。実施例４：トキソプラズマ・ゴンディー(Toxoplasma gondii)でのgp190^S1の発現、ならびに生成物の精製（図６参照）Ａ． gp190^Sの配列を、ベクターppTにMluI／PstIを介して挿入した。その結果として、遺伝子が、T．gondiiのチューブリンプロモーター(P_tub-1)の制御下に置かれることとなった。３’の非翻訳領域(VTR)は、T．gondiiの主要な表面タンパク質(SAG-1)に由来するものであった。Ｂ． T．gondiiでのgp190^Sの発現 T．gondiiをpTT１９０でトランスフェクションしたところ、gp190^Sを構成的に発現する寄生虫系統が単離された。mAb5.2を用いた免疫蛍光分析では（中央図）、遺伝子が発現されていることのみならず、SAB-1同様、同じ免疫蛍光パターンを示すことから、発現産物が寄生虫の表面に近接して結合して存在していることが示された（図６Ｂの右側）。図６Ｂの左側に、中央の図の位相差顕微鏡写真を示す。Ｃ． T．gondiiからのgp190^Sの単離調製量のT．gondii（５ｘ１０⁹の寄生虫）から、アフィニティクロマトグラフィー（mAb5.2カラム）によって、gp190^Sを精製した。この極めて高純度のタンパク質が予測通りの分子量を有しいることが、電気泳動後のクーマシー染色ポリアクリルアミドゲルによって示された（図６Ｃ、２−３）。図６Ｃの（１）は、ＣＨＯ細胞由来の精製gp190^Sについてのものである。分子量は、左側に示してある。実施例５：モノクローナル抗体を用いたgp190^Sの特性分析１６種のモノクローナル抗体と、各種の異種発現系由来のgp190^Sとの相互作用を、P．falciparumならびにT．gondiiでの免疫蛍光分析、あるいは精製タンパク質での「ウェスタンブロット」によって調べた。２種の寄生虫を比較したところ、完全な一致が認められた（＋の数は、相対的な蛍光強度を示す）。ウェスタンブロッティングでは、１２種のモノクローナル抗体が、大腸菌ならびにＣＨＯ細胞由来のgp190^Sと反応した。一方、３種の抗体は、ＣＨＯ細胞からの単離物質と結合しなかった。オリゴモルフ(oligomorph)あるいは交互対立電子対(MAD20)由来の抗原決定基を認識する抗体１５および１６は、反応しなかった。結果を、表１にまとめて示す。表中、NDは、実施しなかったことを示すものである。実施例６：異種系でのgp190^Sの発現１．大腸菌での発現発現ベクターpDS56,RBSIIにgp190^S2を挿入したところ、gp190^S2は、lacオペレーター／レプレッサー／IPTG系を介して制御が可能なプロモーターPN_251acO-1の制御下に置かれることとなった（図４Ａ）。レプレッサー産生性大腸菌、たとえば、大腸菌DH5alphaZ1にプラスミドを入れたところ、gp190^S2がIPTGの制御下で発現された。ベクターによって導入されたＮ末端の(His)₆配列を利用することにより、ニッケルキレートカラムで粗生成物を単離することができた。抗体カラムでアフィニティクロマトグラフィーを行ったところ、極めて高純度の調製物が得られた。使用したモノクローナル抗体（mAb5.2）がＣ末端領域のコンホメーショナルなエピトープを認識するので、この２工程精製によって、少なくともＣ末端が正しく折り畳まれている全長の無傷のタンパク質が選択された（図４Ｂ）。天然物質とは異なり、最終生成物は、Ｎ末端に１１個のアミノ酸をさらに有しており、そのうち６つがヒスチジンである。この生成物は、Ｎ末端シグナルを有しておらず、また、Ｃ末端の付着配列も有していない。P．falclparumに特異的な配列は、アミノ酸２０から始まり、アミノ酸１６２１で終わっている。２． HeLa細胞ならびにＣＨＯ細胞の培養中でのgp190^Sの発現 gp190^S1をベクターpBi-5に挿入することにより、テトラサイクリン（Tc）によって調節可能なプロモーターの制御下に置いた。Ｔｃ制御系を選んだのは、以下の２つの理由による。・ Tc制御系が属するのは、哺乳動物細胞でも最高の収率が得られるような発現系である。・高濃度外来タンパク質が分泌されないままに存在すると、細胞の代謝に負の影響を及ぼすおそれがあるが、目的生成物の合成が始まるのは、培養が成熟して後のことである。 pBi5-gp190^S1構築物中では、Ｔｃによって制御される転写アクチベーターによって双方向プロモータが活性化され、gp190^S1とルシフェラーゼインジケーター遺伝子の双方の転写が開始された。Ｔｃの存在下では、プロモーターは不活性である。転写ユニットは、いずれもｔＴＡを構成的に合成するHeLa細胞ならびにＣＨＯ細胞に導入した（HtTA系統:Gossen，MおよびBujard，H．(1992)，T ight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-respo nsive promoters．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，5547-5551；CHO-tTA系統、未発表）。ハイグロマイシン耐性導入性のマーカー遺伝子を用いたコトランスフェクション（Ｃａ²⁺リン酸塩法）によって、染色体への組込みが成功裡に行われた細胞を選択した。ハイグロマイシン耐性のクローンを、Ｔｃによる発現調節性について調べ、その際には、ルシフェラーゼ活性を指標として使用した。高度の調節が可能なクローン（調節因子、Tc1000）で、gp190の合成について調べた。免疫蛍光分析（図５Ｂ）ならびに「ウェスタンブロット」（図５Ｃ）で調べたところ、高度の調節が可能な条件下で、gp190を合成するクローンを、両種の細胞で特定することができた。２０のクローンのうち、調節性の最もよかったクローンを、各ケースについて、サブクローニングした。サブクローンHtTA93-9ならびにCHO27-29は、１０：１の割合で培養に使用した。これらの培養の細胞抽出物から、アフィニティクロマトグラフィー(mAb5.2)によって、無傷のgp190^S1を単離することができた。この材料は、調製物の２５％を構成しているgp190^S1起源ではないある細胞成分１種以外については均質であった（図６Ｃ）。この成分は、別の精製工程で除去する必要があった。３．トキソプラズマ・ゴンディーでのgp190^Sの発現熱帯熱マラリア原虫(P．falciparum)同様、トキソプラズマ・ゴンディー (Toxoplasma gondii)もアピコンプレックス門(Apicomplexa)に属しており、したがって、明らかに、P．falciparumに似たタンパク質修飾系を有している。T.gon diiは、外来のＤＮＡによるトランスフェクションが可能で、この外来ＤＮＡはゲノムに効率的に組み込まれ、細胞培養中でのT．gondiiの増殖に支障をきたさない。天然のgp190に最も近い生成物を得るために、タンパク質が寄生虫の表面に分泌され、P．falciparumの場合のように、タンパク質がＧＰＩの同族体によって膜に結合するよう、gp190^S2を発現させた。このようにして、gp190^S2を（図３Ａ）をプラスミドppTMCS（D．Soldati、未発表）に挿入し、T．gondiiのチューブリンプロモーターの制御下に置いた。この発現構築物をT．gondiiにトランスフェクションした。クロラムフェニコールで選択したところ、gp190を合成する耐性クローンが得られ、このクローンを免疫蛍光分析によって検出した（図６Ｂ）。抗gp190抗体を用いた免疫蛍光分析の結果は、対応する、T．gondiiの主要な表面タンパク質であるSAGlに対する抗体を用いた寄生虫の染色による結果と区別がつかなかった。このことから、T. gondiiの表面にgp190が結合していることが推測される。いくつかのT．gondiiのクローン(No.3.1から、3.4)の特性を分析し、gp190生成用に保管した。T.gondii の培養から、アフィニティ・クロマトグラフィー(mAb5.2)によってgp190を単離し（クローン３、４）、調製目的の規模で培養を行った。電気泳動分析では、無傷のタンパク質と移動速度がほぼ同等であるような均質な生成物が検出された（図６Ｃ）。実施例７：各種の発現系で得られたgp190^Sの、モノクローナル抗体を用いた特性分析 gp190に対して特異的なモノクローナル抗体であって、コンホメーショナルなエピトープを認識する抗体も含む一群のモノクローナル抗体を使用して、これらの抗体と、P．falciparumならびにT．gondiiとの反応性の比較を、免疫蛍光分析によって行った。表１にも示されているように、１６種の抗体は、各寄生虫に対して同一の反応性を有していた。このことには、T．gondiiでは、主に、「ネーティブ」なgp190が産生されていることがはっきり示されている。各種抗体と、大腸菌、HeLa細胞、ＣＨＯ細胞ならびにT．gondii由来のタンパク質との反応性を比較したところ、抗体のうちの大半のものが、この４種の調製物と反応性を有していることも示され、特に、大腸菌由来のタンパク質の方が、哺乳動物で産生されるタンパク質より、抗体を認識する程度が高いことが示された。これは、明らかに、哺乳動物細胞でグリコシル化が生じているためである。実施例８： P．falciparum (FCB-1)由来のgp190/MSP1による、ヨザル（Aortusl emurinus griseimembra)の免疫感作２つの免疫感作実験（Ａ、Ｂ）を独立に実施した。これらの実験では、約２× １０¹¹個の寄生虫から、極めて高純度gp190/MSP1を、実験（Ａ）では１．０mg、実験（Ｂ）では０．６mg抽出した。タンパク質は、フロイントのアジュバント(FCA)とともに投与した。対照群には、FCAのみを投与した。免疫感作は、タンパク質混合物の場合も、アジュバントの場合も、同等に、途中４週間の感覚をおいて、３回実施した。最後の免疫感作の２週間後に、各動物に、１０⁵個の寄生虫（FVO系統）を感染させた。寄生虫血症を毎日測定した。図２に結果をまとめて示す。図中の各記号の意味内容は以下のとおりである。Ｔ：動物をレゾシンで治療。Ｄ：死亡動物図２Ａ：３ｘ６０μｇのgp190/MSP1をワクチン接種群の各動物に投与図２Ｂ：３ｘ４０μｇのgp190/MSP1をワクチン接種群の各動物に投与対照群では、寄生虫血症を発症しなかったのが１／１１匹のみであったのに対し、ワクチン接種群では、６／１０匹が寄生虫血症を発症しなかった。ワクチン接種群のうちの顕著な寄生虫血症を発症した４匹は、寄生虫血症は発症したものの、発症したのが対照群と比べて平均で４日間遅かった（寄生虫血症の２％限界を超過）。これらの実験は、gp190/MSP1が、P．falciparumによる感染に対して極めて有意な予防効果を有することを、サルのモデルで初めて示したものである。したがって、本発明の方法は、マラリアに対して実際に使用することができるワクチンを、はじめて提供するものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月１０日（１９９８．１２．１０）【補正内容】（新）請求の範囲１．Plasmodiumの完全gp190/MSP1蛋白質の製造方法、特に、gp190/MSP1のための完全遺伝子で特徴付けられる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum）が、適切な系、好ましくは宿主生物体中で発現され、蛋白質が基礎としている発現されたＤＮＡ配列のＡＴ含量が天然に存在する配列に比べて減らされている方法。２．その蛋白質が基礎としているＤＮＡ配列の合成が、P.falciparum株、FCB- １のＤＮＡ配列に由来する、請求項１の組替え製造方法。３．発現されたＤＮＡ配列のＡＴ含量が７４％〜５５％に減少されることを特徴とする請求項２の組替え製造方法。４．製造された蛋白質が基礎とする遺伝子が、シグナルペプチドと付着ペプチドを含む完全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいづれかの組替え製造方法。５．製造された蛋白質が基礎とする遺伝子が、付着ペプチドを除いた完全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいづれかの組替え製造方法。６．製造された蛋白質が基礎とする遺伝子が、シグナルペプチドと付着ペプチドとを除いた完全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいづれかの組替え製造方法。７．以下の工程を含むことを特徴とする請求項１〜６のいづれかの組替え製造方法、（a）コドン頻度はヒトゲノムにおいて通常のものであり、そして製造されるべきFCB-1蛋白質のアミノ酸配列は保持されるように、合成されるべきP.falciparu m FCB-1から、ＤＮＡ配列を設計する、（b）設計した配列を、重複する各領域、好ましくはｐ８３，ｐ３ｑ１，ｐ３６，ｇｐ３０およびｇｐ１９に分割する、（c）各領域の全長に延在するおのおののデオキシオリゴヌクレオチドの合成、（d）ＰＣＲ法によるｇｐ１９，ｇｐ３０，ｐ３６およびｐ３１をコードする領域、および、約1200bpの２つの配列の融合によるｐ８３をコードする領域の合成、（e）コードされた配列のおのおのをクローン化（複製）する、（f）完全な遺伝子に融合する、（g）適切な発現系で発現する。８．前記工程（ｃ）で合成されたデオキシオリゴヌクレオチドが、平均１２０ヌクレオチド長であり、各々で約２０塩基隣接する配列と重複することを特徴とする請求項７の組替え製造方法。９．発現ベタターとしてdPS56,RBS IIを用いることを特徴とする請求項１〜８のいづれかの組替え製造方法。１０．発現ベクターとしてpBi-５を用いることを特徴とする請求項１〜８のいづれかの組替え製造方法。１１．発現ベタターとしてppTMCSを用いることを特徴とする請求項１〜８のいづれかの組替え製造方法。１２．前記蛋白質が基礎としているＤＮＡ配列が、大腸菌中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法。１３．用いられる大腸菌株が、抑制因子製造(repressor-producing)株E.coli DH5alphaZ1であることを特徴とする請求項１２の組替え製造方法。１４．前記蛋白質が基礎とするＤＮＡ配列が、HeLa細胞中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法。１５．前記蛋白質が基礎とするＤＮＡ配列が、ＣＨＯ細胞中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法。１６．前記蛋白質が基礎とするＤＮＡ配列が、トキソプラズマ・ゴンデイまたはリーシュマニア中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法。１７．請求項１〜１６のいづれかの組替え製造方法によって、得られうる、発現に適した、Plasmodium、特にP.falciparumのgp190/MSP1表面蛋白質の完全ＤＮＡ配列。１８．付着シグナルをコードしないことを特徴とする請求項１７の、発現に適したＤＮＡ配列。１９．付着シグナルもシグナルペプチドもコードしないことを特徴とする請求項１８の、発現に適したＤＮＡ配列。２０．１１の付加的なアミノ酸、そのうち６はヒスチジンであるアミノ酸に対する配列を含み、Ｎ−末に存在することを特徴とする請求項１９の、発現に適したＤＮＡ配列。２１．配列が、認識しうるスプライス・ドナーとスプライス・アクセプターとを含まないことを特徴とする請求項１７〜２０のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２２．配列が、大きなＧＣ−リッチ配列を含まないことを特徴とする請求項１７〜２１のいずれかの、発現に適したDNA配列。２３．配列が、６以上の塩基対の配列を認識する制限酵素に対する認識シグナルを含まないことを特徴とする請求項１７〜２２のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２４．蛋白質のプロセッシングの後に、存在するドメインを分離し、制限エンドヌクレアーゼのためのただ１つしかない開裂サイトを含む、ある領域中の特定の制限ヌクレアーゼのシグナルを認識するための配列であることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２５．残りの配列中に、および、使用できるベクター中には現れないエンドヌクレアーゼのための開裂サイトを両末端に持つ配列であることを特徴とする請求項１７〜２４のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２６．gp190/MSP1表面蛋白質および・または完全蛋白質のための請求項１７〜２６のいずれかの完全な核酸配列を含む宿主生物体．２７．生物体がE.coliであることを特徴とする請求項２６の宿主生物体。２８．E.coli株が、抑制因子製造(repressor-producing)E.coli株DH5alphaZ1 であることを特徴とする請求項２７の宿主生物体。２９．宿主生物体がHeLa細胞であることを特徴とする請求項２６の宿主生物体。３０．宿主生物体がＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項２６の宿主生物体。３１．宿主細胞が、本質的にｔＴＡを合成することを特徴とする請求項２９または３０の宿主生物体。３２．宿主生物体が、トキソプラズマ・ゴンデイ、リーシュマニア、バクロウイルス、アデノウイルス、または酵母を供給することを特徴とする請求項２６の宿主生物体。３３．マラリアに対する活性免疫化のための請求項１〜１６のいずれかの方法で製造されたgp190/MSP1蛋白質の使用。３４．受動免疫化のために適したモノクローナル抗体の製造のための請求項１〜１６のいずれかの方法で製造されたgp190/MSP1蛋白質の使用。３５．核酸を基礎とするワクチンの製造のための請求項１〜１６のいずれかの方法で製造されたＤＮＡ配列の使用。３６．配列のＡＴ含量を減少させることを特徴とする遺伝子配列の安定化方法。３７．安定化されていない遺伝子より減少したAT含量を示すことを特徴とする安定化された遺伝子。３８．請求項１７〜２５および・または３７のいずれかのＤＮＡ配列を含むベクター。３９．請求項３８のベクターを含む宿主細胞。４０．請求項１−１６のいずれかの方法で、および・または請求項１７−２５のいずれかのＤＮＡ配列、および・または請求項２６−３１のいずれかの宿主、請求項３８のベクターを用いて、製造された蛋白質を含むワクチン。４１．Plasmodium、特にP.falciparumからのさらなる免疫促進生成物を含むことを特徴とする請求項４０に記載のワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パンヴェイキングドイツ国Ｄ―69123 ハイデルベルクイムブッシュゲヴァン 71

Claims

【特許請求の範囲】１．Plasmodiumの完全gp190/MSP1蛋白質の製造方法、特に、gp190/MSP1のための完全遺伝子で特徴付けられる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)が、適切な系、好ましくは宿主生物体中で発現される方法。２．その蛋白質が基礎としているＤＮＡ配列の合成が、P.falciparum株、FCB- １のＤＮＡ配列に由来する、請求項１の組替え製造方法。３．発現されたＤＮＡ配列のＡＴ含量が天然に存在する配列に比して減少されることを特徴とする請求項２の組替え製造方法。４．製造された蛋白質が基礎とする遺伝子が、シグナルペプチドと付着ペプチドを含む完全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいづれかの組替え製造方法。５．製造された蛋白質が基礎とする遺伝子が、付着ペプチドを除いた完全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいづれかの組替え製造方法。６．製造された蛋白質が基礎とする遺伝子が、シグナルペプチドと付着ペプチドとを除いた完全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいづれかの組替え製造方法。７．以下の工程を含むことを特徴とする請求項１〜６のいづれかの組替え製造方法、 (a)コドン頻度はヒトゲノムにおいて通常のものであり、そして製造されるべきF CB-１蛋白質のアミノ酸配列は保持されるように、合成されるべきP.falciparum FCB-１から、ＤＮＡ配列を設計する、 (b)設計した配列を，重複する各領域，好ましくはｐ８３，ｐ３１，ｐ３６，ｇｐ３０およびｇｐ１９に分割する、 (c)各領域の全長に延在するおのおののデオキシオリゴヌクレオチドの合成、 (d)ＰＣＲ法によるｇｐ１９，ｇｐ３０，ｐ３６およびｐ３１をコードする領域、および、約1200bpの２つの配列の融合によるｐ８３をコードする領域の合成、 (e)コードされた配列のおのおのをクローン化（複製）する、 (f)完全な遺伝子に融合する、 (g)適切な発現系で発現する。８．前記工程（ｃ）で合成されたデオキシオリゴヌクレオチドが、平均１２０ヌクレオチド長であり、各々で約２０塩基隣接する配列と重複することを特徴とする請求項７の組替え製造方法。９．発現ベクターとしてdPS56,RBS IIを用いることを特徴とする請求項１〜８のいづれかの組替え製造方法。１０．発現ベクターとしてpBi-５を用いることを特徴とする請求項１〜８のいづれかの組替え製造方法。１１．発現ベクターとしてppTMCSを用いることを特徴とする請求項１〜８のいづれかの組替え製造方法。１２．前記蛋白質が基礎としているＤＮＡ配列が、大腸菌中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法。１３．用いられる大腸菌株が、抑制因子製造(repressor-producing)株E.coli DH5alphaZ1であることを特徴とする請求項１２の組替え製造方法。１４．前記蛋白質が基礎とするＤＮＡ配列が、HeLa細胞中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法。１５．前記蛋白質が基礎とするＤＮＡ配列が、ＣＨＯ細胞中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法．１６．前記蛋白質が基礎とするＤＮＡ配列が、トキソプラズマ・ゴンデイまたはリーシュマニア中で発現されることを特徴とする請求項１〜１１のいづれかの組替え製造方法。１７．請求項１〜１６のいづれかの組替え製造方法によって、好ましくは得られる、発現に適した、Plasmodium、特にP.falciparumのgp190/MSP1表面蛋白質の完全ＤＮＡ配列。１８．付着シグナルをコードしないことを特徴とする請求項１７の、発現に適したＤＮＡ配列。１９．付着シグナルもシグナルペプチドもコードしないことを特徴とする請求項１８の、発現に適したＤＮＡ配列。２０．１１の付加的なアミノ酸、そのうち６はヒスチジンであるアミノ酸に対する配列を含み、Ｎ−末に存在することを特徴とする請求項１９の、発現に適したＤＮＡ配列。２１．配列が、認識しうるスプライス・ドナーとスプライス・アクセプターとを含まないことを特徴とする請求項１７〜２０のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２２．配列が、大きなＧＣ−リッチ配列を含まないことを特徴とする請求項１７〜２１のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２３．配列が、６以上の塩基対の配列を認識する制限酵素に対する認識シグナルを含まないことを特徴とする請求項１７〜２２のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２４．蛋白質のプロセッシングの後に、存在するドメインを分離し、制限エンドヌクレアーゼのためのただ１つしかない開裂サイトを含む、ある領域中の特定の制限ヌクレアーゼのシグナルを認識するための配列であることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２５．残りの配列中に、および使用されるベクター中には現れないエンドヌクレアーゼのための開裂サイトを両末端に持つ配列であることを特徴とする請求項１７〜２４のいずれかの、発現に適したＤＮＡ配列。２６．gp190/MSP1表面蛋白質および・または完全蛋白質のための完全な核酸配列を含む宿主生物体。２７．生物体がE.coliであることを特徴とする請求項２６の宿主生物体。２８．E.coli株が、抑制因子製造(repressor-producing)E.coli株 DH5alphaZ 1であることを特徴とする請求項２７の宿主生物体。２９．宿主生物体がHeLa細胞であることを特徴とする請求項２６の宿主生物体。３０．宿主生物体がＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項２６の宿主生物体。３１．宿主細胞が、本質的にｔＴＡを合成することを特徴とする請求項２９または３０の宿主生物体。３２．宿主が、トキソプラズマ・ゴンデイ、リーシュマニア、バクロウイルス、アデノウイルス、または酵母を供給することを特徴とする請求項２６の宿主生物体。３３．マラリアに対する活性免疫化のための請求項１〜１６のいずれかの方法で製造されたgp190/MSP1蛋白質の使用。３４．受動免疫化のために適したモノクローナル抗体の製造のための請求項１〜１６のいずれかの方法で製造されたgp190/MSP1蛋白質の使用。３５．核酸を基礎とするワクチンの製造のための請求項１〜１６のいずれかの方法で製造されたDNA配列の使用。３６．配列のＡＴ含量を減少させることを特徴とする遺伝子配列の安定化方法。３６．安定化されていない遺伝子より減少したＡＴ含量を示すことを特徴とする安定化された遺伝子。３７．請求項１７〜２５および・または３６のいずれかのＤＮＡ配列を含むベクター。３８．請求項３７のベクターを含む宿主細胞。３９．請求項１−１６のいずれかの方法で、および・または請求項１７−２５のいずれかのＤＮＡ配列、および・または請求項２６−３２のいずれかの宿主、請求項３７のベクターを用いて、製造された蛋白質を含むワクチン。４０．Plasmodium、特にP.falciparumからのさらなる免疫促進生成物を含むことを特徴とする請求項３９に記載のワクチン。