CN87104399A - 抗原生动物寄生虫疫苗 - Google Patents
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Abstract
一种可以用作疫苗和药剂来预防和治疗原生动物寄生虫感染的组合物。此种感染是以寄生虫的表面抗原中含有一系列重复氨基酸，叫作重复抗原决定部位为显著特征的。该组合物的成份包含有在免疫学上有效剂量的肽或多肽，此种肽或多肽的显著特征是大部或全部缺少重复抗原决定部位。这些组合物在免疫预防和治疗原生动物寄生虫感染的方法中是有用的。
Description
本发明与抗原生动物寄生虫感染的疫苗有关，这种疫苗以免疫原（该免疫原缺少致病寄生虫固有表面抗原的重复的抗原决定部位）为显著特征。更准确地说，本发明涉及的有免疫原（缺少各种寄生虫表面抗原的重复的抗原决定位置），生产免疫原的方法，使用免疫原的方法，以及含有免疫原的组合物引起哺乳动物对原生动物寄生虫感染的免疫与治疗。
典型的原生动物是单细胞生物，它无细胞壁，以吞噬获得食物。按照其游动机制，可以把原生动物分类。以变形运动的原生动物叫肉足虫类，以鞭毛运动为特征的叫鞭毛虫类，以纤毛运动的称纤毛虫类，第四类属孢子虫类它无运动器，而是以它们的复分裂，即一个单细胞分裂成许多小细胞-孢子为特征。
孢子虫纲是原生动物的一大类，所有的孢子虫都是专性寄生的。它们产生一种结构称作子孢子，子孢子类似于细菌或真菌的休眠芽孢。子孢子参与寄生虫的转移而到新寄主体内。巴倍虫（Babesia）是孢子虫纲动物，它是在高等动物红血球中被发现的，传播媒介是蜱。到目前为止，孢子虫纲最重要的组成成员是虐原虫（虐疾寄生虫）。
虐疾是世界上很多地区发病率和死亡率的主要原因[第三属热带病研究及训练专题年报告3rd Annual Report on the special program for Research and Training in Tripical Diseases，WHO.Geneva（1979）]。世界上差不多有三分之一的人口受到虐疾感染的危胁。有人估计，每年约有1亿5千万人感染虐疾。在非洲，仅死亡约有1百万（主要是儿童）[J.A.Deans and S.Cohen，“虐疾免疫学”“Immunology of malaria”Ann，Rev，Microbiol.，37，pp.
25-49（1963）;A.Noguer et.al.，WHO Chron.，32，pp.9-17（1978）]。因此，疟疾构成世界热带和亚热带地区经济发展的主要限制因素。
在大范围内，引起脊椎动物疟疾的疟原虫，已经记载的有100种以上。这些疟原虫显示了很狭窄的寄主特异性。例如，感染人的仅有四种：恶性疟原虫（P.falciparum），间日疟原虫（P.vivax），三日疟原虫（P.malariae）和卵形疟原虫（P,ovale），在每一种疟原虫内还有很高的抗原异源性[E.g.，R.L.Coppel et al.，特殊分离的恶性疟原虫的S-抗原含有11个氨基酸的重复序列“Isolate-Specific S-antigen of Plasmodium Falciparum Contains A repeated Sequence of Eleven Amino Acids，”Nature，306，pp751-55（1983）;R.F.Anders et al.，”若干分离的恶性疟原虫合成的S-抗原的鉴定，“Characterization of an S-antigen synthesized by several Isolates of Plasmodium Falciparum”Proc.Natl acad.sci.USA.80pp.6652-56（1983）]
普遍的消灭疟疾受到许多实际困难的困扰。由于蚊虫对杀虫药剂抗性的增加和出现许多品系的疟原虫，对普遍使用的化学治疗剂，包括4-氨基喹啉，如氯喹产生抗性，使这些实际问题混杂在一起。
此外，制备疟疾疫苗也受若干困难所困扰。如从生长在培养基中的疟原虫中制备抗原化合物是十分困难的，特别是在需要大规模的有用疫苗时。而且，由于特异的免疫过程作用，疟原虫生活史中存在很多潜在的靶子。例如，保护性免疫可以抵抗两种不同发育阶段的疟原虫-子孢子和无性繁殖的血液阶段疟原虫[G.V.Brown.et al.，“提纯的人免疫球蛋白靶抗原在体外实验中抑制恶性疟原虫的生长”“Target Antigen of purified Human Immunolobulins which inhibit Groth of Plasmodium falciparum in vitro”Nature，297，pp.591-93（1982）]
此外，疟原虫可以借助于位于自己免疫反应表面抗原免疫优势区的免疫德夸蛋白的效力，能够躲避检查和躲避受害寄主免疫系统的攻击。（见下面的讨论）[G.N.Gordon et al.，Nature，305，pp 29-33（1983）]
由于疟蚊的叮咬，疟原虫的子孢子被带入人体。无性繁殖的血液阶段疟原虫主要担负疟疾的临床症状。通过许多发育阶段如环状体，滋养体，裂殖体等达到成熟。最后，在无性世代末;成熟的裂殖体破坏红血球，裂殖子被释放到血液循环中。然后，释放出来的裂殖子进攻其它红血球膜上的特异受体而开始侵入红血球。它们又分化出雌配子母细胞和雄配子母细胞，雌雄配子母细胞可被蚊子摄取，并通过有性繁殖，为以后的感染产生出子孢子。
已经表明，无性繁殖血液阶段的抗原，特别是裂殖体和裂殖子的抗原在保护性免疫，免患疟疾方面起主要作用。例如，来自免疫供体的免疫球蛋白识别裂殖体-裂殖子特异的抗原。[L.H.Perrin and R.Dayal，Immunol，Rev.61，pp 245-69（1982）;G.V.Brown，et al.，Nature，297，pp 591-93（1982）;J.H.L，Playfair，Bull.WHo，57，pp.245-46（1979）]。对裂殖体-裂殖子的免疫血清和单克隆抗体在体外实验中已经显示出对疟原虫生长的抑制性活性。[Brown.et al.见上文;Playfair，见上文;L.H.Perr in et al.，Nature，289，pp 301-02（981）;L.Schofield et al.，Infect.Immun.，38，pp.893-97（1982）]。然而，Perrin等的单克隆抗体与来自世界各地的疟原虫分离物起反应，并且抑制了疟原虫的生长[L.H.Perrin et al.，Clin.exp.Immunol.（1984）;B.Berkli et.al.，第六属国际寄生虫学会文摘“Abstract sixth Int.Cong.of Parasitology，Calgary（1984）”]。
由努力了解更多疟原虫并试图生产出有效的抗疟原虫疫苗，已经利用DNA重组技术，克隆化了各种疟疾抗原并生产出疟疾抗原。例如，已经报导，分子量145，000的抗原已在大肠杆菌E，coli中克隆化[K.G.Odink et al.，给高分子抗原编码的疟原虫基因克隆化：恶性疟原虫基因的分离片段给145，000分子量的蛋白质编码，”“Cloning of malarial Genes Coding for High Molecular Weight Antigens：Isolation of fragments of Plasmodium Falciparum genes codingfor proteins of 145，000 Molecular weight”Mol，Biochem.Parasite，10，pp.55-56（1984）]。另外，已有基因编码间日疟原虫（P.vivax）围子孢子蛋白的报导[D.E.Arnot et al.，“间日疟原虫的围子孢子蛋白：基因克隆化和免疫显性抗原决定部位的鉴定”（Circumsporozoite protein of Plasmodium vivax：Gene Cloning and Characterization of lmmunodominant Epitope），Science，230，pp.815-18（1985）]。由于这一研究的结果，已经证明，疟疾表面抗原有重复氨基酸的区域。例如，间日疟原虫围子孢子（CS）蛋白的演绎序列由373个氨基酸组成，并具有一个由9个氨基酸19个串联重复的中心区域。
一组尚未鉴定的“血液阶段”的抗原也已被克隆，并在大肠杆菌E，coli中表达[E.J.Kemp.et al.，“间日疟原虫血液阶段抗原在大肠杆菌中的表达：“利用免疫人的抗体检验“Expression of P.Falciparum Blood-stage Antigens in E.Coli：Detection with Antibodies from immune Humans”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，pp 3787-91（1983）]这些抗原好像也有重复区。例如Kemp等人已经报导了一种抗原是特异性分离物，含有11个氨基酸的重复序列。[R.L.Coppel et al.，恶性疟原虫的特异性分离物S-抗原含有一个11个氨基酸的重复序列。Narture，306，pp，751-56（1983）]。
据说，重复氨基酸序列还存在于疟原虫的其它血液阶段抗原中[R.L.Coppel et al.，Nature，302，751（1983）;R.L.Coppel et al.，Nature，310 789（1984）;A.F.Cowman et al.，Cell 40，775（1985）]。例如，子孢子的围子孢子（CSO）蛋白有一个免疫显性的抗原决定部位，该抗原决定部位在每个分子内至少被重复两次。据报导，来自疟原虫P.Knowlesi子孢子表面抗原是以重复氨基酸的序列为显著特征的[J，Ellis et al.，疟原虫P.Knowlesi子孢子表面抗原基因在大肠杆菌中的克隆与表达”Nature，302，pp 536-38（1983）]。又进一步报导，疟原虫围子孢子蛋白的免疫反应区域被包容在12倍串联的重复抗原决定部位中，该抗原决定部位含有一个重复的12个氨基酸单位，它被称为“重复抗原决定部位”（repitope）。[G.N.Godson et al.，“疟原虫围子孢子蛋白串联重复免疫区域抗原区域的鉴定和化学合成”。Natue，305，pp.29-33（1983）]，其它原生动物寄生虫如巴倍虫（Babesia）的抗原，也是以这样重复的抗原决定部位为特征的。[A.F.Cowman et al.，Cell.37，pp 653-660（1984）]。
据观察，疟原虫抗原绝大部分免疫原是重复序列部分或抗原决定部位。如在恶性疟原虫（P.falciparum）中，从三肽键重复衍生来的30氨基酸肽键比仅从位于重复区上游的单拷贝部位衍生来的肽键含有更多的免疫原。利用其它的原生动物寄生虫物种进一步证实了在疟原虫抗原中重复抗原决定部位有很高的免疫原特征。[Enea et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，81，pp.7520-24（1984）]。鉴于它们的高抗原活性，至今人们还十分关心利用这些抗原的重复抗原决定部位作为潜在的抗疟疫苗来源，然而，到目前为止，其结果令人失望。
有人已经建议，虽然重复抗原决定部位是免疫显性，但它们是作为德夸（decoy）避免诱导保护性抗体来防止寄生虫感染的。[G.N.Godson et al.，Philos.Trans，R.Soc.B307，pp.129-32（1984）]。例如，当恶性疟原虫（P.falciparum）的重复抗原决定部位在分离中改变时，重复区上游的单拷贝序列仍保持不变，它暗示关于部分寄生虫避免检出的机制[A.F.Cowman et al.，Cell.40，pp.775-82（1985）]。
由于本发明提供了抗原生动物寄生虫（该寄生虫以表面抗原决定部位为特征，或由一系列重复的氨基酸序列组成的抗原决定部位为特征）感染的疫苗，因而该发明解决了上述的有关问题。更准确地说，根据本发明，我们所提供的疫苗实际上缺乏原生动物寄生虫表面抗原所特有的全部重复抗原决定部位。这些疫苗能使受害寄主或靶寄主产生抗体，而抗体能够识别并联结到缺乏重复任一端上的单拷贝序列上，起到免疫和杀死靶寄生虫的目的。
本发明的优点是第一次对被寄生虫感染的受害寄主进行免疫预防或治疗成为可能。尽管这些寄生虫依靠它们自己的免疫反应表面抗原的免疫显性部位：“免疫德夸蛋白”，以前可能逃避了寄主免疫系统的进攻。
实施本发明的目的之一包括DNA序列（在本发明的疫苗中DNA序列是有用的，它编码寄生虫似抗原肽或多肽）的定位和鉴定，带有这些DNA序列的各种各样寄主的转化作用以及寄生虫似抗原肽或多肽（实际上缺乏以天然产生的抗原决定部位为特征的全部重复氨基酸序列）在这些已转化寄主内的生产。在根据本发明所生产的寄主虫的似抗原肽，多肽和免疫原中，原生动物的抗原已被修饰，如修饰疟原虫抗原，或修饰巴倍虫抗原。
在合适的寄主内，这种DNA序列的表达，允许大量地生产本发明疫苗中有用的肽和多肽。这样可以很快地测定这些肽和多肽的分子结构与性质，并且也可以很快地测定它们在结合和抑制靶寄生虫活性方面的效率。或在寄主体内或者是适当衍生或修饰之后产生时，了解肽和多肽的成份和方法是有用的，可以监测和改进这些产物的生产，以便把疫苗用于靶寄主，包括人。
还可以利用合成肽的方法（已知的技术）制备本发明中缺失重复的寄生虫表面抗原肽和多肽。此外，其它已知的制造免疫原的方法，包括抗特异基因型抗体的形成，也可以采用。
附图的扼要说明
图1.描写疟性插入片P31-1的核苷酸序列和衍生的氨基酸序列。
图2 是重组DNA分子31-1较长缺失结构的图解式描述。
图3 是重组DNA分子31-1重复缺失结构的图解式描述。
图4 描写31-1重复缺失的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列。
图5 描述表达载体31a，31b，31c和34C的核苷酸序列。
为了更充分地理解本文所描述的发明，详细描述如下。
在下面的描述中，采用一个概念：重复序列-在本申请中所述使用的“重复序列”或“重复抗原决定部位”（repitope）指的是寄生虫表面抗原串联的重复抗原决定部位。在多肽中，这包括一系列两个或多个氨基酸，即每个分子中至少有两倍的串联重复。例如，在间日疟原虫（P.vivax）的围子孢子蛋白中有9个氨基酸的19次串联重复，在疟原虫（P.Knowlesi）中有12个氨基酸重复12次，这就举例说明了本说明书中所指的“重复序列”或“重复抗原决定部位”含意。
本发明与抗原生动物寄生虫（据认为这些原生动物寄生虫存在有重复氨基酸的抗原决定部位而避开寄主系统的检验）的疫苗有关。
按照本发明，从靶寄生虫表面抗原（已被切除全部的或部分的重复抗原决定部位）衍生的肽或多肽，被用于免疫或治疗由原生动物寄生虫引起的感染，如疟疾和巴倍虫。
在本发明的一个实施例中，编码原生动物寄生虫抗原的DNA序列已被鉴定，并且编码抗原重复氨基酸的DNA序列或大体上，或完全被删去。本发明的一个实施例就是采用这些DNA序列，按照在各种原核和真核寄主内被转化的表达方式，生产“缺重复”的寄生虫抗原，用作本发明的疫苗。为了在重复抗原决定部位的一端或两端产生肽或多肽，也可以修饰这些DNA序列。
本领域的技术人员还知道，有可替代的方法制备这些肽或多肽。例如，它们包括位于重复抗原决定部位的一端或两端的肽或多肽的合成性肽生产。此外，制备疫苗的各种免疫学方法也可被用于生产本发明中的肽或多肽。
服用这些组合物，或其可药用的以及免疫学上有效的衍生物，可以通过常规地任何一种可采用的服药方式，而显示出抗原生动物寄生虫的免疫原性。这些服用方式包括口服或非肠胃给药。
这些疫苗所使用的组合物也可以有多种形态，例如，包括固体的，半固体的和液体剂型，如粉剂，液体溶剂或悬剂、栓剂，注射剂和浸剂，究竟哪种剂型好取决于给药方式和治疗应用。
疫苗的组合物最好包括常规的可药用载体，还可以有其它的药剂，载体，佐剂，赋形剂等，例如人血清白蛋白或血浆制剂。本发明的优选组合物是以单位剂量的形式出现。作为免疫作用或治疗作用的活性物质，每次给药量，或每段时间的服药量决定于治疗对象、给药方式和治疗大夫的判断。然而，有效剂量范围约为本发明组合物的lng-lmg，最好约为100μg-500μg。据认为，较低或较高剂量也都可以使用。
因此，本发明提供了一种抗原生动物寄生虫感染哺乳动物包括人体的疫苗接种方法，也提供了一种治疗原生动物寄生虫感染哺乳动物包括人的方法，包括疫苗或药剂（以本发明中的肽或多肽为特征的）在免疫学上有效剂量的服药方法。
为了更充分地理解本文所描述的发明，举例如下。应当明白，下面的例子仅仅是为了阐明的目的，而不应该理解成以某种形式把本发明限制在这里引用的特殊的具体实施例上。
实施例
在这一例子中，我们阐明制造一种多肽的方法，该多肽有恶性疟原虫（P.falciparum）表面抗原的单拷贝序列，但缺失免疫显性重复序列（该序列可允许寄生虫逃避和德夸免疫系统）。
我们首先利用DNA插入片P31-1生产恶性疟原虫（P.falciparum）特异阶段后期裂殖体-裂殖子抗原31-1（如同PCT申请W085/03725中描述的一样）。然后修饰DNA序列。正如上面指出的那样，可有选择地删去部分重复抗原决定部位，或者可制备在重复抗原决定部位的任一端上的多肽，并产生用作有效免疫原的组合物。
DNA插入片P31-1的核苷酸序列及其产生的氨基酸序列描写在图1。正如图1描述的一样，从DNA插入片P31-1产生的氨基酸序列可以分成3部分：43个氨基酸的单拷贝序列，30个氨基酸的三肽重复（ser-gly-gly or ser-val-ala）和20个氨基酸下游的单拷贝序列。含有疟性插入片P31-1的重组DNA分子，已贮存在Doutsche Sammlung Von Microorganismen，Gottingen West Germany，并在那里鉴定为PF-13：E.Coli 537（pPL31A-Pst（Pst）/X11-011）[DSM2890]和PF-14：E.Coli，K12λ（pPL，31A-Pst（Pst）/1）[D SM-2891]。
以前，我们观察到P31-1的重复“Ser-Gly-Gly”（见PCT申请WO85/03725）比单拷贝区域有更多的免疫原。然而我们又观察到，在邻近序列保持不变时，相同的重复序列不是都存在于每一个P31-1的分离物中。正如上面讨论的那样，已经假设，当寄生虫逃避寄主免疫系统进攻时，所使用的含有多肽（包括可变的重复序列）的疫苗能够引起抗寄生物的免疫应答。因此，我们决定制备含有多肽（缺少那些重复）的疫苗。
为此，我们首先制备了一系列结构，它们十分准确地缺少我们原有“31-1”序列中的重复序列（图1）。对于这些结构，我们先用P31-1作为杂交探针筛选基因组疟性库，以克隆载体pUC9和E.Coli JM103制备，筛选出下列有关的DNA序列：
（a）质粒31-1/2B中的cDNA，与31-1和31-1/3相比，已被反向合成，结果基因定向在反义方向上。这一质粒在第一个PstⅠ位点之后有一个18G尾巴，在第二个PstⅠ位点之前有一个17C尾巴（图2）。
（b）质粒31-1/3，在第一个PstⅠ位点下游有一个23G尾巴，在第二个PstⅠ位点上游有一个17C尾巴（图2）
然后如图2所示，我们使P31-1/3受到BglⅡ和PvuⅡ消化，分离出较长的片段（3400bp）。我们使31-1/2B受到PvuⅡ和BamHⅠ消化，分离出较短的片段（670bp）。
现在参照图2，我们可以把31-1/2B质粒的较短的PvuⅡ-BamHⅠ片段（670bp）连接到31-1/3质粒的较长的BglⅡ-PvuⅡ片段（3400bp）上，从而构建质粒“31-1较长D”。在连接之前使取自31-1/2B的片段逆转。生成的结构包括全部的31-1基因;然而，带有这种结构根本不可能表达，因为在载体的MS2序列和31-1基因的起始密码子之间出现了终止密码子（95bp，在HindⅢ位点之前）。从图2可以看出，连接之后，删去了BamHⅠ位点和BglⅡ位点
如图2所示，我们用Sau 3A消化这个“31-1较长D”质粒，分离出较短的片段（800bp）。通过这一消化，我们切除了所有含有终止密码子的“31-1较长D”的左部分，直到第一Sau3 A位点，也切除了在第三Sau 3A位点开始的右部分。在利用BamHⅠ消化之后，我们用34C质粒作为载体表达载体34C是pPLC24的衍生物[E.Remauf et al.，gene，15，pp.81-93（1981）]，并与表达载体P31a有关（在WO85/03725中被描述为pPL31A-Pst）。像pPL31A-Pst一样，质粒34C是从pPLC24衍生出来的（AD35连锁子被引入到pPLC24上）。然而在给载体MS2部分编码序列下游，34C没有一个PstⅠ限制性核酸内切酶识别位点。由于在MS2编码区的末端删去四个碱基对，在AD35连锁子的末端又删去了27个碱基对，因此表达载体34C不同于pPL31A-Pst，（见图5）。
然后，我们把克隆31-1较长D的这一较短片段（-800bp）连接到质粒34C（BamHⅠ消化后分离物）的较长片段（-3400bp）上，可以构建“质粒31-1较长缺失”。从图2可以看出，这一插入片引起两个BamHⅠ位点的消失。
然后如图3所示，我们把下列三种片段（1）31.1整合重复缺失的150bp EcoRⅠ-HinfⅠ片段;（2）31.1较长缺失的488bp HinfⅠ-BglⅡ片段和（3）31.1缺失G+C的3000bp BglⅡ-EcoRⅠ片段连接在一起，可以构建质粒“31-1重复缺失”。这一结构（31-1重复缺失）类似于质粒31.1较长缺失，但它缺失重复序列。
为了构建31-1重复缺失，我们先把质粒31-1较长缺失用Hinf Ⅰ和BglⅡ消化，切除较小的片段（488bp）。
然后，我们从质粒P31.1删去80碱基，构建“31.1整合重复缺失”，由此删去了重复部分的序列Ser-Gly-Gly。我们把P31-1让EcoRⅠ和BgeⅡ消化，并分离出较短的EcoRⅠ-BglⅡ片段删去了80个碱基。我们用RsaⅠ消化那个片段，切去改变长度的三个片段。第一和第三片段被退火，建造一种缺少重复抗原决定部位的片段EcoRⅠ-BglⅡ。通过删去这个中心核苷酸片段（它含有为抗原的10个重复氨基酸序列的编码序列），我们建造了一个DNA序列来编码无重复的较短蛋白（见图4）。
我们把EcoRⅠ-BglⅡ片段插入到P31a，如上所述，表达载体P31a与P34C有关，它们都是pPLC24的衍生物。P31a的特征是在给载体的MS2部分编码序列的下游，有一PstⅠ限制性位点，为了在载体启动子PL的控制下表达，在载体上又插入一个cDNA序列（图5）。为了删去终端核苷酸，我们用EcoRⅠ和HinfⅠ消化质粒。
通过首先删去图1（P31-1）描述的DNA序列中G和C尾巴，从31-1克隆的31.1缺失G+C的衍生物中建造31-1重复缺失，然后得到我们需要的最后片段。利用特异位点的致突变，我们在核苷酸12-15，即在重复之前建造一个EcoRⅠ位点，并在重复之后，在282-287核苷酸处，建造一个BglⅡ位点。使用的寡核苷酸连锁子是
MAL BglⅡ GATTCAGATCTTAAATCTT
MAL EcoRⅠ GGGGGGAATTCAAGAACTT
最后，我们退火了这三种片段（31.1较长缺失，31.1整合重复缺失，31.1缺失G+C），构建质粒31-1重复缺失。“重复缺失”EcoRⅠ-Hinfl片段（150bp）与31.1较长缺失片段（488bp）的HinfⅠ末端连接。然后，把这些片段插入到31.1缺失G+C的3000bp中。
我们将表达质粒31-1重复缺失引入到E.coli K12中，测定修饰的疟性抗原多肽的产量。我们利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对原生动物寄生虫蛋白产量分析了每种发酵混合物总细胞等分试样。并对染色凝胶（代表收集后所取等分试样的疟性蛋白产量，）部分进行光密度扫描。扫描结果表明总蛋白量的10-15%是抗原。
在许多可药用的组合物中都可采用本发明的免疫原来预防和治疗原生动物的寄生性感染。这些组合物可以包括各种可药用的载体或佐剂，还包括一些增加免疫应答的化合物。例如各种淋巴激活素和干扰素。这些混合物在预防和治疗疟原虫及其它原生动物寄生感染方面是最有效的。
这些组合物可以被用在许多种可药用的剂型中，也可以应用在免疫技术方面著名的治疗方法中。
按照本发明的一个实施例，已举例说明了微生物和DNA序列在多肽生产中的应用，所用的培养物已于1985年12月27日贮存在西德Gottingen的Deufsche Sammlung Von Microorganismen并在那里被鉴定为大肠杆菌K12（SG936 CI）（P31-1重复缺失）。已经被指定登记号码为D SM3618。
在此以前，我们曾举出许多本发明的实施例，很显然，为了提供其它的采用本发明方法和组合物的实施例，我们的基本结构是可以改变的。因此，应该懂得本发明的范围将受到权利要求书的限定，而不受我们在此以前通过举例的方式提供的具体实施例所限制。
Claims (4)
1、一种生产由具有足够的免疫原性引起对靶原生动物寄生虫的免疫应答的氨基酸序列组成的肽或多肽的方法，所述的寄生虫是以具有重复抗原决定部位的表面抗原为特征，所述的氨基酸序列是从由上述寄生虫表面抗原序列组成的序列中筛选出来的，它靠近那种抗原的重复抗原决定部位的一端，上述寄生虫的表面抗原序列靠近于那种抗原的重复抗原决定部位的另一端，抗原决定部位是这些序列中的任一片段并联合某一邻近的序列与片断，所述的方法包括培养用重组DNA分子转化的微生物寄主，重组DNA分子中含有编码原生动物寄生虫的类抗原肽或多肽的DNA序列，上述的DNA序列是以大部或全部缺少编码重复抗原决定部位序列为特征。重复决定部位表示靶寄生虫抗原的特征。
2、按照权利要求1所述的方法，其中的序列包含有靠近重复抗原决定部位两端的序列，重复抗原决定部位表示靶原生动物寄生虫表面抗原的特征。
3、按照权利要求1所述的方法，其中寄生虫表面抗原是疟疾抗原。
4、按照权利要求1所述的方法，其中的寄主是从一组寄主中挑选出来的，这组寄主包括E.coli.K12，E.coli SG936;E.coli SG935，E.coli.SG928，E.coli SG927和其它的大肠杆菌菌株。这些其它的菌株是lon的突变种，并以生产低水平的lon蛋白酶为特征。
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