JPS6314698A - 原生動物寄生虫に対するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 …１ 本発明は原生動物寄生虫感染に対するワクチンに関する
。ここで、このワクチンは、病因となる寄生虫の自然表
面抗原の反復エピトープを欠く免疫原によって特徴つ心
゛】られるものである。より詳細には、本発明は、種々
の寄生虫の表面抗原の反復エピトープを欠く免疫原、そ
れらの製造法、その使用方法、ざらに咄４、類の原生動
物寄生虫感染に対する免疫および治療のためのそれらを
含む組成物に関する。

従来並置 典型的な原生動物は、ＩＩＩ胞壁を欠き、栄養を食作用
で得る単細胞生物である。原生動物はその運動のメカニ
ズムによってグループ分けされる。アメーバ様運動によ
って動く原生動物は、肉質生類（５ａｒｃｏｄ　ｉ　ｎ
ａ）と呼はれ、鞭毛で特徴づけられるものは鞭毛虫類（
ＦｌａｆＸｃｌ　ｌａｌ、ａまたはＭａｓｔｉｇｏｐｈ
ｏｒａ）、繊毛を用いるものは有毛生類（Ｃｉｌｉｏｐ
ｈｏｒａ）である。四番目のグループの胞子虫類（５ｐ
ｏｒｏｚｏａ）は、非運動性で、単細胞の多分袋によっ
て胞子と呼ばれる多数の小細胞に分裂することで特徴づ
けられる。胞子虫類は多くのグループの原生動物からな
るが、その全てが偏性寄生虫である。これらはスポロゾ
イトと呼ばれる構造をつくるが、これは細菌や酵母の休
眠胞子と似ている。スポロゾイトは新たな宿主への寄生
虫の伝搬に関与する。これに属するものに、種々の高等
動物の赤血球細胞で見出され、ダニによって伝搬される
バベシアがある。

いまのところこれに属するもので最も重要なものは、プ
ラスモジウムに属するもの（マラリア病原虫）である。

マラリアは、世界の多地域で疾病および死亡の主要原因
となっている（３ｒｄ　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　
ｏｎｔｈｅ　５ｐｅｃｉａｌ　Ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄＴｒａｉｎｉｎｇ　ｉｎ　
Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　　ＷＨＯｌＧ
ｅｎｅｖａ（１９７９））。世界人口の３分の１近くが
感染の危険に曝されている。毎年推定で１億５千万件の
マラリア症例があり、年間の死亡者はアフリカだけでも
約１００万人にもなり、おもに子供である（Ｊ。

Ａ、　ＤｅａｎｓおよびＣｏｈｅｎ、　　ｒｌｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　ｏｆＭａｌａｒｉａＪ、　　Ａｎｎ、　Ｒ
ｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、３７．２５−４９（１
９６３）：　　Ａ、Ｎｏｇｕｅｒら、　ＷＨＯＣｈｒｏ
ｎ、、３２．９−１７（１９７８））。したがって、マ
ラリアは世界の熱帯およびｉｌｊ熱帯地域において経済
発展の主要な阻止要因となっている。

広範のを推動物でマラリアを起こす１００種以上のプラ
スモジウムが報告されている。これらは狭義の宿主特異
性を示す。例えば、ヒトにはこのうちの４種しか感染し
ない。それらは、プラスモジウム・フフルシバルム（Ｐ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｊｐａｒｕｍ）、ブラスモ
ジウ２％　”ビバ・ンクス（Ｐ。

ｖｉｖａｘ）、プラスモジウｌトマラリエ（Ｐ。

ｍａｌａｒｉａｅ）およびプラスモジウム・オバーレ（
Ｐ、　ｏｖａｌｅ）である。また、各プラスモジウム種
間でかなりの抗原的な相違がみられる（例えば、Ｒ−Ｌ
、Ｃｏｐｐｅｌ　　ら−　ｒ　１ｓｏｌａ１．ｅ−５ｐ
ｅｃｉｆｉｃＳ−ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　Ｐｌａ−Ｓｍ
ｎｄｊ−ｕＪＩｌ　ｆｉ−１何−ＩＬａｆｉＬＩｌｌ　
Ｃｏｎｔａｉｎｓａ　　Ｒｅｐｅａｔｅｄ　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ　ｏｆ　　Ｅｌｅｖｅｎ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ
ｓＪ　。

Ｎａｔｕｒｅ、３０Ｇ、７５１−７５６　（＋９１１３
）：　　Ｒ，Ｆ、Ａｎｄｅｒｓ　　ら、ｒｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａＬｉｏｎｏｆａｎＳ−ＡｎｔｉｇｅｎＳｙ
ｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　　ｂｙ　　５ｅｖｅｒａｌ　　　
ｌ５ｏｌａｔ、ｃｓ　　０ｔｌｉ３１り屈１１ｕ　　ｆ
ｖ土ｃｊｐａ−ｒｕｍ　　Ｊ　、　　Ｉゝｒｏｃ、　　
Ｎａｔ、１．　　八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８０．　６６５２−５（ｉ　
　（ｌ　τ１８：３））　。

マラリアの世界的規模の根絶には、多くの実際的な困難
が伴う。さらに、殺虫剤に対する蚊の抵抗性の増大およ
び慣用される４−アミノキノリン等の化学療法剤に対し
てのクロロキンの場合のような抵抗性のマラリア病原虫
の出現などの問題が加わった。

さらに、マラリアのワクチン製造にはいくつかの困難が
ある。例えば、培養で増殖した寄生虫からの抗原性混合
物の製造は非常に難しく、とくに有用なワクチンに必要
な大量生産は難しい。さらに、マラリア病原虫の生活環
は、特異的免疫プロセス反応に対して多様な標的が考え
られることを示している。例えば、この寄生虫の二つの
異なる発育期に対して防御的免疫が可能である。それら
は、スポロゾイト期および無性生殖血液期である（Ｇ、
Ｖ、Ｂｒｏｗｎ　　ら、　　ｒＴａｒ３ｅｔ　Ａｎｔｉ
ｇｅｎｓ　ｏｆＰｕｒｉｆｉｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　ｗｈｉｃｈＩｎｈｉｂｉｔ
　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　旧ｌ逓更ｍ」ｈｋ」紅朋ｉｎＶ
　ｉ　ｔｒｏＪ、Ｎａｔｕｒｅ、　２９７．５９１−９
３　（１９Ｂ２））。さらに、マラリア病原虫は、免疫
反応性表面抗原の免疫優性領域に位置する「免疫オトリ
タンパク質」によって、感染宿主の佐疫ｎ横に、１；る
認識や攻撃を逃れることができるかもしれない（以下の
考察を参照されたい）　　（Ｇ、　Ｎ、　Ｇｏｒｄｏｎ
ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３０５．２９−３３　（＋９８３
））。

プラスモジウムのスポロゾイトは蚊が噛むことによって
体内に入る。マラリアの臨床症状にはおもに無性血液期
が閏り、している。これらの時期には、リング（環状体
）、トロフォゾイト（栄養体）、シゾント（分裂前体）
と呼はれる数発育期があり、成熟に関与する。そしてこ
の無性生活環の終わりに、成熟シソントは赤血球を破り
、メロゾイト（分裂小体）が血流に放出される。　放出
されたメロゾイトは次に他の赤血球の細胞膜上の特異的
レセプターに付着して侵入を始める。これらはまた、雄
性と雌性のガメトサイト（生殖母体）に分化し、蚊に摂
取されてそこで有性生殖し、次の感染のためのスポロゾ
イトをつくる。

無性血液期の抗ｌ≦１、とくにシゾントおよびメロゾイ
トの抗原は、マラリアに対する防御的免疫に重要な役割
を果たすことが示されてきた。例えば、免疫供与者から
の免疫グロブリンは、シゾントーメロゾイトの特異的抗
原を認識する（Ｌ、旧ＰｅｒｒｉｎおよびＲ９口ａｙａ
ｌ、　Ｉ＋ａｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、、６１．２４５−
６９　（１９Ｂ２）：　　Ｇ、Ｖ、Ｂｒｏｗｎ　　ら、
　Ｎａｔｕｒｅ、２９７．５９１−９３　（１９８２）
：　Ｊ、　Ｉｆ、　Ｌ、　Ｐｌａｙｆａｉｒ、　Ｂｕｌ
ｌ、　ＷＨＯ１５７，２４５−４６（１９７９））。ま
た、シゾントーメロゾイトに対する免疫血清およびモノ
クローナル抗体は、マラリア病原虫の増殖に対してイン
ビトロで抑制活性を示した（　Ｂｒｏｗｎら、前出：　
Ｐｌａｙｆａｉｒ、前出：Ｌ、Ｈ，Ｐｅｒｒｉｎ　　ら
、　Ｎａｔｕｒｅ、２８９．３０１−０２　（１９８１
）：５ｃｈｏｆｉｅｌｄ　　ら、　Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍ
ｍｕｎ、、３８．８９３−９７（１９８２））。さらに
、Ｐｅｒｒｉｎらのモノクローナル抗体は、世界各地か
らのプラスモジウム分離株と反応し、その増殖を抑制す
る（Ｌ、　Ｈ，Ｐｅｒｒｉｎら、Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、１
ｍｍｕｎｏ１．（１９８４）：　　Ｂ、Ｂｅｒｋｌｉ　
　ら、＾ｂｓｔｒａｃｔ　５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔ、　Ｃｏ
ｎｇ、　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ。

Ｃａｌｇａｒｙ　　（１９８４））。

マラリア病原虫をよりよく知り、それに対する効果的な
ワクチンの生産を試みて、種々のマラリア抗原がクロー
ニングされてＤＮＡ組換え技術によって生産されてきた
。例えは、分子量１４ＳＧ００の抗ｊ５；（が大腸菌（
１ζ、ｃｏｌｉ）でクローニングされたという報告があ
る（Ｋ、　Ｇ、　０ｄｉｎｋら、ｒｃｌｏｎｉｎｇ　ｏ
ｆ　Ｍａｌａｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｏｄｉｎｇｆｏ
ｒ　ｌｌｉｇｈＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｗｅｉ３ｈｔ　
　Ａｎｌ、ｉｇｃｎｓ：　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏ
ｆＦｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆＰｌａｉ、ｍＯ−ｄＬｕ−
ｍ　［ａＪｃＵ朋「■ＧｅｎｅｓＣｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ
　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　１／１５，０００　Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＪ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｅ、　１０．５５−６６（１９８
４））。さらに、ヒトマラリア病原虫プラスモジウム・
ビバ・ンクスの１へ１回スポロゾイトタンパク質の遺伝
子のコード′化が報告されている（Ｄ、　Ｅ。

Ａｒｎｏｔ　　ら、　　ｒＣｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏ
ｉｌ、ｅ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆｍ土ｕＪＩＩ　Ｖ、
１ＪＵＸ’、　Ｇｅｎｅ　（：ｌＩＤｌＩｎ３　ａｎｄ
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｌｌ＋ｃ　
ＩｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔＥｐ　ｉ　ｔｏｐｅＪ、
５ｃｉｅｒ＋ｒｃ、　２３０、旧５−１８　（１９８５
））。この研究の結果、マラリア表面抗原には反復して
いるアミノ酸領域のあることが示された。

未同定のｒ面液朋−１抗１＜＜ｏ）ｒ群もクローニング
されて大腸菌て発ｊ’３１された（Ｉ）、　Ｊ、　Ｋｅ
ｍｐら、ｒＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＬＬｉＬＳＪ
ＩＩＱ（１−！Ｊｌｌｌｌ　ｆ、ｆＬＩｆＪ１旺■Ｂｌ
ｏｏｄ−５ｔａｇｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｉｎ　ｂ柚Ｊ
ユｄ且ｃｕ且：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　ｗｉｔｈ　　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｆｒｏｍ　　Ｉｍｍｕｎｅ　　
ＨｕｍａｎｓＪＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ、８０．３７Ｂ？−９１（１９８３））。これ
らの抗原もまた、反復領域を有するよってある。例えば
、Ｋｅｍｐらの抗原のひとつは、分離特異的で、１１個
のアミノ酸の反復配列を含むと報告されている（Ｒ，Ｌ
、　Ｃｏｐｐｅｌ　ら、ｒ　ｌ５ｏｌａｔｅ−５ｐｅｃ
ｉｆｉｃ　Ｓ−Ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　肚賎般…ルム七
注匠包ｕ　Ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａ　Ｒｅｐｅａｔｅｄ　
５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆＥｌｅｖｅｎ　　Ａｍ１ｎｏ　
　Ａｃ１ｄｓＪ　　、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３０６　
、７５１−５６（１９８３））。

反復アミノ酸配列は、プラスモジウム寄生虫の伯の血液
期抗原にも存在するともいわれている（Ｒ，Ｌ、Ｃｏｐ
ｐｅｌ　　ら、　Ｎａｔｕｒｅ、３０２．７５１　　（
１９８３）：Ｒ，Ｌ、Ｃｏｐｐｅｌ　　ら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、３１０，７８９　（１９８４）：　　Ａ。

Ｆ、　　Ｃｏｗｍａｎ　　ら、Ｃｅ１ｌ、４０、？７５
　（１９８５））。例えば、スポロゾイトの周回スポロ
ゾイト（Ｃ５Ｏ）タンパク質は、各分子内に少なくとも
２回反復する免疫優性のエピトープを含む。プラスモジ
ウム・ノウレジ（ｐ、　ｋｎｏνＩｅｓｉ）抗原からの
マラリア病原虫スポロゾイト表面抗；ｑは、反復アミノ
酸配列で特徴づけられることが報告されている（Ｊ、　
Ｅｌｌｉｓら、ｒｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｃ
ｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅ、　ｃｕｌｉ　ｏｆ　ｔｈｅＭａ
ｌａｒｉａｌ　　５ｐｏｒｏｚｏｉＬｅ　　５ｕｒｒａ
ｔ：ｃ　　Ａｎｔｉ８ｅｎ　　Ｇｅｎｅｆｒｏｍ　　ｕ
ｉｚｍｊｕｍ　　ｋｎｏｗＬｃｓｊＪ　、　　Ｎａｔｕ
ｒｅ、３０２゜５３６−３８　（１９８：１））。さら
に、プラスモジウム・ノウレジのＣ８−タンパク質の免
疫反応領域は、１２個のアミノ酸ユニットを含む１２回
縦に反復しているエピトープ中に含まれているといわれ
、この反復エピトープは「１ノビト−プ」と称された（
Ｇ。

Ｎ、　　Ｇｏｄｓｏｎ　　ら、　　ｒ　１ｄｃｎ１．１
ｒｉｃａ１．ｉｏｎ　　ａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌ　５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｒ　ａ　Ｔｉｎｄｃｍｌｙ　Ｒｅｐ
ｅａｔｅｄｌｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｒｅ３ｉｏｎ　ｏ
ｒ　ｌごＪ、、ａｓｍｏｄｊｐｌＫｕｗｌｅｍＣｉｒｃ
ｕｍｓｐｏｒｏｉｔｅ　Ｐｒｎ１．ｅｉｎＪ、Ｎａ１．
ｕｒｅ、　３０５．２９−３３（１９８３））。バヘシ
アなどの１１！！の原生動物寄生虫抗原も、このような
反復エビＩ・−ブで特徴づけられる　（Ａ、Ｆ、Ｃｏｗ
ｍａｎ　　ら、　Ｃｅ１ｌ、３７．６５３−６６０（１
９８４））。

プラスモジウＪ１属寄生虫の抗原の最も免疫原的である
部分は、反りｕ配列の部分すなわちエピトーブであるこ
とが観察されている。例えば、プラスモジウム・ファル
シパルムにおいて、トリペプチド反復に由来する３０個
のアミノ酸からなるペプチドは、この反復のすぐ−Ｆ：
、流に位置する独自配列に由来するペプチドよりもずっ
と免疫原性が高い。

プラスモジウム属の抗原にみられるこの反復エピトープ
の著しく高い免疫原的特徴は、他種の原生動物寄生虫で
も確認されている（Ｖ、　Ｅｎｅａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．７
５２０−２４（１９８４））。この高い免疫原性から、
これら抗原の反復エピトープは、今日までマラリアに対
する可能なワクチン源として最も注目されてきた。しか
し今日まで、期待されたほどの有望な結果は得られてい
ない。

この反復は免疫優性であるが、これは寄生虫感染に対す
る防御的抗体の誘導を阻止するオトリともなることが示
唆されている（Ｇ、　Ｎ、　Ｇｏｄｓｏｎら、Ｐｈ１ｌ
ｏｓ、　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ、、ＢＳＧ７．１２
９−３２　（１９８４））。

例えば、プラスモジウム・ファルシパルムの反復エピト
ープは分離株間で異なるが、反復の上流の独自配列は同
じであり、このことは検出を逃れるための寄生虫側のメ
カニズノ、を示唆している（Ａ。

Ｆ、Ｃｏｗｍａｎ　　ら、　Ｃｅ１ｌ、／１０．７７５
−８２　（１９８５））。

１肌四■元 本発明は、上記の問題を解決するもので、一連の反復ア
ミノ酸配列、レピト−ブ、からなる表面抗原決定基で特
徴うけられる原生動物寄生虫による感染に対するワクチ
ンを提供するものである。

より具体的には、発明者らはこの発明によって、原生動
物寄生虫の自然の表面抗原を特徴づけるエピトープの実
質」−全てを欠くワクチンを提供する。

これらのワクチンは、感染したまたはターゲットとなる
宿主の抗体を引き出すことができ、この抗体は、欠失し
た反復のどちらかの側の独自配列を認識してそれに結合
し、標的の寄生虫を非可動化して殺す。

本発明によって、従来は寄生虫の免疫反応表面抗原の免
疫優性部分（免疫第１・リタンバク質）によって宿主免
疫システノ、の標的となっていなかった寄生虫による感
染に対しての免疫あるいは治療−Ｉ／ｌ− が、初めて可能になった。

本発明の一実施例の目的のひとつには、本発明のワクチ
ンに有用な寄生虫抗原様ペプチドまたはポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列の位置を決めて同定し、これらＤ
ＮＡ配列で種々の宿主を形質転換させ、これら形質転換
宿主を用いて天然のエピトープを特徴づける一連の反復
アミノ酸の実質上全てを欠く寄生虫抗原様ペプチドまた
はポリペプチドを製造することが含まれる。本発明によ
って製造される寄生虫抗原様ペプチド、ポリペプチドお
よび免疫原には、プラスモジウム属またはバベシアの修
飾された抗原などの修飾原生動物抗原が含まれる。

このようなりＮＡ配列を適切な宿主内で発現させること
によって、本発明のワクチンに有用な多量のペプチドお
よびポリペプチドの製造が可能になる。これらペプチド
およびポリペプチドの分子構造および性質は容易に解明
され、標的寄生虫への結合および寄生虫活性の抑制効果
も容易に分析される。ペプチドおよびポリペプチドは、
宿主内＝１５− て産生されても有用であるし、これら産生物の検出や製
造の改良のために組成や方法を適切に改変や修飾した後
、ヒ：・を含むターゲット宿主のワクチンに使用するの
に有用である。

本発明の反復を欠失した寄生虫表面抗原ペプチドおよび
ポリペプチドは、公知の合成ペプチド製造法を用いて製
造することも可能である。さらに、他の抗イデイオタイ
プ抗体形成を含む公知の免疫原製造法も用いられる。

末産朋１ゴ４施Ｊニタにめ−の」１浪、夏Ｊ圀態以上記
載した本発明のより完全な理解のために、次のような詳
細な説明を行う。記述中、次の用語を用いる。

反復配潮−一本発明では、　「反復配列」または「エピ
トープ」という用語は、寄生虫表面抗原の縦列に（タン
デノ、状に）反復するエピトープを指す。これには、ポ
リペプチドの各分子中で少なくとも２回縦列に反復する
２　ｆｉ１１以上の一連のアミノ酸が含まれる。例えば
、プラスモジウム・ビバックスの周回スポロゾイトタン
パク質中の９個のアミノ酸の１９回の縦列反復や、 プラスモジウム・ノウレジ中で１２回反復される１２個
のアミノ酸などが、本記載の反復配列すなわちエピトー
プを指す。

本発明は、反復アミノ酸エピトープすなわちエピトープ
の存在によって免疫システムによる検出を逃れると信じ
られている原生動物寄生虫に対するワクチンに関する。

本発明では、エピトープの全部または一部を除いた標的
寄生虫の表面抗原由来のペプチドまたはポリペプチドを
、マラリアやバベシアなどの原生動物寄生虫による感染
の免疫または治療に用いる。

本発明の一実施例において、原生動物寄生虫抗原をコー
ドするＤＮＡ配列を同定し、抗原の反復、　　アミノ酸
をコードするＤＮＡ配列部分を実質的にまたは完全に欠
失させる。本発明の一実施例で、これらＤＮＡ配列は、
種々の原核細胞および真核細胞の形質転換およびその宿
主内での発現に用いられ、「反復欠失Ｊ　　（ｒｅｐｅ
ａｔ−ｄｅｌｅｔｅｄ）寄生虫抗原を製造し、本発明の
ワクチンに用いられる。また、これらＤＮＡ配列を、エ
ピトープの片側または両側のペプチド：［たはポリペプ
チドを製造するように修飾することもできる。

これらペプチドまたはポリペプチドの他の製造方法は半
業者に公知のものである。例えば、エピトープの片側ま
たは両側のペプチド′またはポリペプチドの合成ベブナ
トの製造がこれに含まれる。

さらに、ワクチン製造の種々の免疫学的方法が本発明の
ペプチドまたはポリペプチドの製造に用いられる。

これら組成物、または薬剤として容認されかつ免疫学的
に効果のあるこれらの派生物の投与は、プラスモジウム
寄生虫に対して免疫原性を示す薬剤に、慣用の投与形態
で行うことができる。これには、経口投与−や腸管外段
り、が含まれる。

これらワクチンに用いる組成物もまた、種々の形態で用
いられる。例えは、粉体、溶液または懸濁液、座薬、注
射お、Ｌひ注入ｉｔになとの固形、半固形および液体投
薬形状が含まれる。好ましい形状は、投与および治療的
刊用の、０図する形態によっＩ１１− て異なる。

組成物はまた、薬剤的に容認されているキャリアを含む
のが好ましいし、ヒト血清アルブミンや血漿製剤など、
他の薬剤材料、キャリア、アジュバント、賦形剤を含ん
でもよい。本発明の組成物の好ましい形態は単位投与で
ある。ワクチンまたは薬物として１回にあるいはある期
間中に投与する活性組成物の量は、治療対象者、投与の
方法と形態、および治療医師の判断によって異なる。し
かしながら、効果的な投与量は、本発明の組成物の約１
ｎｇから約１　ｍ　ｇの範囲、好ましくは約１００μｇ
からＳＧ０μｇ１　　であるが、これよりも多いまたは
少ない投与量でも有用であることが認められている。

このように、本発明は、ヒトを含む哺乳動物での原生動
物寄生虫感染に対するワクチン免疫の方法およびその治
療方法を提供するものであって、その方法は免疫学的な
有効量の本発明のペプチドまたはポリペプチドに特徴づ
けられるワクチンまたは薬物を投与することからなるも
のである。

次の例は、以」一記載した本発明がより完全に理解しろ
るようにするためのものである。ただし、本例はもっば
ら説明のためのものであって、本発明をここに提示した
特定の実施態様に決して限定するものではない。

例 本例は、プラスモジウム・ファルシパルムの表面抗原の
独自配列を含むけれども寄生虫が免疫システムから逃れ
てこれを第１・りにかけるようになる免疫優性の反復配
列を欠くポリペプチドの、−製造法を示すものである。

まず、ＰＣＴ出願り号−Ｗ　Ｏ１１５／　０３７２５に
記載のようにｐ　コ（ｌ　−１σ月）Ｎへ挿入を用いて
プラスモジウム・ファルシパル１１の発育期特異性の後
期シゾントーメロゾイトｂ’Ｆハ；（３１−１をつくり
、次いでそのＤＮＡ配列をレピト−ブをコードする全配
列を欠くように修飾した。］二記したように、レピトー
プは部分的に欠失させても□よく、またレピトープのど
ちらかの側のポリペプチドをつくって、その結果として
有効免疫原としてまだ有用な組成を得てもよい。

ｐ３１−１のＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列およびそれ
に由来するアミノ酸配列は第１図に示した通りである。

第１図に示すように、ｐ３１−１のＤＮＡ挿入に由来す
るアミノ酸配列は３領域に分けられる。すなわち、独自
配列の４３個のアミノ酸、トリペプチド反復（Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ）の３０
個のアミノ酸および下流の独自配列の２０個のアミノ酸
である。ｐ３１−１のマラリア挿入を含む組換えＤＮＡ
分子は、ドイツチェ・ザンムルング・フォノ・ミクロオ
ルガニスメン（西ドイツ、ゲッチンゲン）に寄託されて
おり、　ＰＦ−１３：　　Ｅ、　　ｃｏＦｉ　　５３７
　　（ｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔ　（Ｐｓｔ）／Ｘ１ｌ−０
１１）（Ｄ　５Ｍ２８９０）およびＰＦ−１４：Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　　Ｋ１２λ（ｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔ（Ｐｓ　ｔ
）／１）（ＤＳＭ２８９１）として特定されている。

本発明者らは、ｐ３１−１の反復ｒＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ＩｙＪ　　（ＰＣＴＣ願出号ＷＯ３５１０３７２５を参
照されたい）が独自配列、ｌ；りもっと免疫原性が高い
ことを以前に見出していた。しかしながら、本発明者ら
はまた、同じ反復配列が必ずしも全てのｐ３１−１分離
物に存在しないこと、一方、隣接する配列は不変である
ことを見出した。上記したように、寄生虫に対しての免
疫応答を引き出すのに用いるワクチンが可変反復配列を
含むポリペプチドからなる場合には、寄生虫は宿主の免
疫システムによる攻撃を逃れることができるということ
が考えられている。したがって、発明者らは、これら反
復を欠くポリペプチドからなるワクチンを製造すること
とした。

このために、発明者らはまず、本発明者オリジナルのｒ
３１−ＩＪ配列の反復配列（第１図）を正に正確に欠失
させた一連の構築物を作った。これらの構築のため、ｐ
３１−１をゲノムマラリア遺伝子ライブラリーのスクリ
ーニングのハイブリダイゼーションプローブとして用い
（クローニングベクターｐＵＣ９および大腸菌ＪＭ１０
３で調製した）、次のような関連１）　Ｎ　Ａ配列を選
択した。

＝２２− （ａ）３１−１および３１−１／３に対してｃＤＮＡが
逆に合成されて遺伝子がアンチセンス方向に並んでいる
、プラスミド３１−１／２Ｂ。

このプラスミドは、最初のＰｓｔＩ部位の後に１８個の
Ｇからなる尾部を有し、二番目のＰｓｔ１部位の前に１
７個のＣからなる尾部を有している（第２図）。

（ｂ）最初のＰｓｔ１部位の下流に２３個のＧからなる
尾部を有し、二番目のＰｓｔＩ部位の上流に１７個のＣ
からなる尾部を有するプラスミド３１−１／３（第２図
）。

第２図に示すように、次ぎにｐ３１−１／３をＢｇｌｌ
ｌおよびＰｖｕｌＩで消化し、長い方の断片（３４００
ｂｐ）を分離した。さらに、３１−１／２ＢをＰｖｕＩ
ＩおよびＢａｍＨＩで消化して短い方の断片（６７０ｂ
ｐ）を分離した。

第２図を参照していえば、３１−１／２Ｂプラスミドの
短い方のＰｖｕｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（６７０ｂｐ）を
３１−１／３プラスミドの長い方のＢｇｌＩＩ−Ｐｖｕ
ｌＩ断片（３４００ｂｐ）に２３一 連結して、　ｒ３１−１長Ｄ」を構築した。３１−１／
２Ｂから得た断片は連結に先だって反転させた。結果と
して得られた構築物には、全３１−１遺伝子が含まれる
。しかしながら、ベクターのＭＳ２配列および３１−１
遺伝子の開始コードン（ＨｉｎｄｌｌＩ部位の前９６ｂ
ｐ）の間にある停止コードンのために、この構築物によ
る発現は不可能であった。第２図から判るように、Ｂａ
ｍＨ１部位およびＢ　ｇ　ｌ　１１部位の双方は連結後
に欠失した。

さらに第２図で示すように、このｒ３１−１長ＤＪ　　
（３１−１１ｏｎ８ｅｒ　ｌ））プラスミドを５ａｕ３
Ａで消化し、短い方（＄１００１）　ｐ　）の断片を単
離した。

この消化で、三番１１（７）Ｓ　ａ　ｕ　３Ａ部位に始
まる右部分とともに、停止１−＝１−トンを含む３１−
１長りの左全部を最初のＳ　ａ　ｕ　３　Ａ部位まで除
いた。

３４ＣブラスミＩ・をＩ］　ａ　ｍ　ｔｌ　ｌで消化し
た後、ベクターとして用いた。発現ベクター３４Ｃは、
ｐＰＬｃ２４の派生物（Ｅ、　Ｒｅｍａｕｔら、Ｇｅｎ
ｅ、　１５．８１−９３　（１９８１））で、前記特許
出願番号ＷＯ３５／０３７５でｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔと
して記載されている発現ベクターｐ３１ａと関連する。

ｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔのように、プラスミド３４ＣはＡ
Ｄ３５リンカ−を導入したｐＰＬｃ２４に由来する。し
かし、３４Ｃは、ベクターのＭＳ２部分をコードする配
列の下流のＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
持たない。発現ベクター３４Ｃは、ＭＳ２コード領域末
端の４個の塩基対を欠失している点およびＡＤ３５リン
カ−の末端からの２７個の塩基対を欠失している点で、
ｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔと異なる（第５図を参照されたい
）。

次に、クローン３１−１長りのこの短い方の断片（約８
００ｂｐ）を、ＢａｍＨＩで消化して分離しておいたプ
ラスミド３４Ｃの長い方の断片（約３４００ｂｐ）と連
結させて、　［３１−１長欠失Ｊ　　（３１−１ｌｏｎ
ｇｅｒ　Ｄｅｌｅｔｅ）を構築した。第２図で示される
ように、この挿入の結果、両ＢａｍＨ１部位が除かれた
。

次いで第３図に示すように、次の３個の断片を２５一 連結して、プラスミドｒ３１−１反復欠失」（３１−Ｉ
　Ｒｅｐｅａｔ　Ｄｅｌｅｌ、ｅｄ）をつくッた：　（
１）３１−１ｉｎｔ反復欠失の１ＳＧｂｐ　　Ｅｃ。

Ｒ１−Ｈ１ｎｆＩ断片、　（２）３１−１長欠失の４８
８ｂｐ　　Ｈｉｎｒｌ−ＢｇｌＩＩ断片および（３）３
１−１欠失Ｇ＋Ｃの３０００ｂｐ　ＢｇｌＩＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片。この構築物（３１−１反復欠失）は、プラス
ミド３１−１長欠失に似ているが、これは反復配列を欠
いている。

３１−１反復欠失を構築するために、まず３１−１長欠
失プラスミドをＩＩ　ｉ　ｎ　ｆ　ＴおよびＢｇｌｎで
消化して小さい方（４８８ｂｐ）の断片を切り出した。

次に、プラスミドｐ　３１−１から８０塩基対を除いて
、　ｒ３１−１ｉｎｔ反復欠失Ｊ　　（３１−１１ｎｔ
Ｒｅｐｅａｔ　Ｄｅｌｅｔｅｄ）をつくり、これによっ
て５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列の反１ｕ部分を除いた。

８０塩基対は、ｐ３１−１をＥ　ｃ　ｏ　ＲＩおよび１
１　ｇＩ　ｎで消化して短い方のＥ　ｃ　ｏ　ｌ＜　ｌ
　−ｌ（１７ｌ　ＩＩ断片を分離することによって、除
いた。生した断片を　Ｒｓａ　１で消化して長さの異な
る３個の断片を切り出した。

一番目の断片と三番目の断片をアニールして、レピトー
プが欠失しているＥｃｏＲＩ−ＢｇｌｌＩ断片を作出し
た。抗原の１０個の反復アミノ酸配列をコードする配列
を含むこのまん中のヌクレオチド断片を除くことによっ
て、反復を含まないより短いタンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を作出したく第４図を参照されたい）。

このＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐ３１ａに挿入した
。上記したように、発現ベクターｐ３１ａはｐ３４ｃと
関連しており、ともにｐＰＬｃ２４に由来する。ｐ３１
ａは、ベクターのＰＬプロモーターの支配下での発現の
ためのｃＤＮＡを挿入すべき、ベクターのＭＳ２部分の
コード配列の下流のＰｓｔＩ制限部位で特徴づけられる
（第５図）。このプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｆｌで消化して、末端のヌクレオチドを除いた。

次いで、３１−１反復欠失を作出するために必要な最後
の断片をクローン３１−１由来のｒ３１−１欠失Ｇ＋Ｃ
，Ｊ　　（３１−Ｉ　Ｄｅｌｅｔｅ　Ｇ＋Ｃ）から得た
が、それにはまず第１図（ｐ３１−１）に示したＤＮＡ
配列の（：及びＣＪ’６部を除いた。部位特異性の突然
変異法を用いて、ＩΣｃｏＲ１部位をヌクレオチド１２
−１５すなわち反復の前に、またＢｇ１１１部位を反復
の後のヌクレオナト２８２−２８７に、つくった。用い
たオリゴヌクレオチド・リンカ−は、 ＭＡ　Ｌ　　　ｎ　　ｇ　　ｌ　　ｎ　　　　　　　　
ＧＡＴ１’Ｃ八にへＴＣＴＴＡＡＡＴＣＴＴＭＡＬＥｃ
ｏＲＩＧＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴ最後に
、これら；（個の断片（３１−１長欠失、３ｌ−１ｉｎ
ｔ反１ｕ欠失および３１−１欠失Ｇ十Ｃ）を結合させて
、ブラスミｌ’　３１−１反復欠失を構築した。　１反
１’に、欠失Ｊｌ’：ｒ：ｏＲＩ　−Ｈ４ｎｆｌ断片＜
　ｌ　ＳＧ　ｂ　ｐ　）を３１−１長欠失の４８８ｂｐ
断片のＩｆ　ｉ　ｎ　ｆ　Ｉ末端片と連結した。

次いで、これら断片を３１−１欠失Ｇ＋Ｃの３０００ｂ
ｐ断片に挿入した。

ｇ　　　　、 発現ブラスミＦ’　３１−１反復欠失を大腸菌に１２に
導入して修飾マラリア抗原ポリペプチド−邦− の産生を分析した。

各培養混合物の全細胞の原生動物寄生虫のタンパク質産
生を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し
た。回収した各細胞のマラリアタンパク質の産生を示す
染色されたゲル部分をデンシトメーターで走査した。こ
の走査で、全タンパク質の１０−１５％が抗原であるこ
とが示された。

本発明の免疫原は、原生動物寄生虫感染の防御および治
療のための薬剤として容認される種々の組゛成物で利用
できよう。そのような組成物は種々の薬剤的に容認され
るキャリアやアジュバントなどを含むことができる。免
疫応答を促進するようなものも含まれる。例えば、種々
のリンフ才力インやインターフェロンなどがある。これ
らの混合物は、ヒトのマラリアや他の原生動物寄生虫感
染症の予防および治療に最も有効であろう。

これらの組成物は、ワクチン分野でよく知られた種々の
□薬剤的に容認された投薬形状および治療２９一 方法で利用され得る。

本発明の一実施例によるポリペプチドの製造に用いる微
生物およびＤＮＡ配列は、ドイツチェ・ザンム゛ルング
・フォノ・ミグ１：１オルガニスメン（西ドイツ、ゲッ
チンゲン）に１９８５年１２月２７日に寄託された培養
物で例示され、Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ　　Ｋ１２　（ＳＧ９３６ｃ　Ｉ）（ｐ３１
−１反復欠失）と明示されている。これには寄託番号Ｄ
ＳＭ３６１８がｆ４”７．されている。

発明者らは、以１−のように本発明の実施態様を多数提
示してきたが、本発明の工程や組成物を利用して他の実
施態様を提供するためには、発明者らの基本的な構成を
変え１ｊトることは自明である。

したがって、本発明の範ＩＪｉｌは、例として以上提示
した特定の実施態様によってではなく特許請求の範囲に
よって画定されることが了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐ３１−１のマラリア挿入のヌクレオチド配
列および対応アミノ酸配列を示す。 第２図は、組換えＤＮＡ分子３１−１長欠失の構築を図
解して示したものである。 第３図は、紺換えＤＮＡ分子３１−１反復欠失の構築を
図解して示したものである。 第４図は、３１−１反復欠失のヌクレオチド配列および
対応アミノ酸配列を示す。 第５図は、発現ベクター３１ａ、３１ｂ、３１Ｃおよび
３４ｃのヌクレオチド配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、レピトープを含む表面抗原によって特徴づけられる
   寄生虫の原生動物寄生虫感染に対するワクチンおよびそ
   の治療のための薬物に用いる組成物であって、該抗原を
   特徴づけるレピトープの実質的または完全な欠失によっ
   て特徴づけられる免疫学的に有効量のペプチドまたはポ
   リペプチドを含むものであることを特徴とする、組成物
   。 ２、原生動物寄生虫感染がマラリア感染である、特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 ３、標的原生動物寄生虫への免疫応答を引き出すに充分
   な免疫原性を有するアミノ酸配列からなるペプチドまた
   はポリペプチドであって、該寄生虫がレピトープを有す
   る表面抗原で特徴づけられるものであり、該配列が、そ
   の抗原のレピトープの片側に隣接した該寄生虫の表面抗
   原の配列、その抗原のレピトープのもう一方の側に隣接
   した該寄生虫の表面抗原の配列、これら配列のどちらか
   の断片およびこれら隣接配列および断片のいずれかの組
   合せからなる群より選択されたものである、ペプチドま
   たはポリペプチド。 ４、アミノ酸配列が、標的原生動物寄生虫の表面抗原を
   特徴づけるレピトープの両側に隣接する配列を含む、特
   許請求の範囲第３項記載のペプチドまたはポリペプチド
   。 ５、原生動物寄生虫抗原様ペプチドまたはポリペプチド
   をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質
   転換された微生物宿主を培養する工程からなり、該ＤＮ
   Ａ配列が、標的となる寄生虫抗原を特徴づけるレピトー
   プのコーディング配列の実質的または完全な欠失で特徴
   づけられるものであることを特徴とする、特許請求の範
   囲第３項または第４項記載のペプチドまたはポリペプチ
   ドの製造法。 ６、寄生虫抗原がマラリア抗原である、特許請求の範囲
   第５項に記載の方法。 ７、宿主が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、大腸菌Ｓ
   Ｇ９３６、大腸菌ＳＧ９３５、大腸菌ＳＧ９２８、大腸
   菌ＳＧ９２７、およびｌｏｎ変異株であってｌｏｎプロ
   テアーゼの低レベルの産生で特徴づけられる他の大腸菌
   株からなる群から選択される、特許請求の範囲第６項記
   載の方法。 ８、原生動物寄生虫で特徴づけられる感染に対する免疫
   または治療の方法であって、該寄生虫がレピトープを含
   む表面抗原で特徴づけられるものであり、該方法が免疫
   学的に有効量の特許請求の範囲第１項記載の組成物を投
   与することからなるものであることを特徴とする、免疫
   または治療法。