DK173905B1 - HIV-beslægtede polypeptider, diagnostiske systemer og analysemetoder - Google Patents
HIV-beslægtede polypeptider, diagnostiske systemer og analysemetoder Download PDFInfo
- Publication number
- DK173905B1 DK173905B1 DK198901931A DK193189A DK173905B1 DK 173905 B1 DK173905 B1 DK 173905B1 DK 198901931 A DK198901931 A DK 198901931A DK 193189 A DK193189 A DK 193189A DK 173905 B1 DK173905 B1 DK 173905B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- polypeptide
- hiv
- polypeptides
- amino acid
- antibodies
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 194
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 184
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 182
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 25
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 25
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 25
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 21
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 20
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 19
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 13
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 claims description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 13
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 10
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 9
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 56
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 50
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 101710112672 Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 18
- 101710204224 Tape measure protein Proteins 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 13
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 8
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- -1 temperature Substances 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 206010025282 Lymphoedema Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241001529934 Simian T-lymphotropic virus 3 Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000789638 Zaira Species 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004543 anhydrous citric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000005250 beta ray Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 108010031071 cholera toxoid Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N l-leucine l-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 208000002502 lymphedema Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000379 polypropylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i DK 173905 B1
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte polypeptide antigener beslægtet med den humane immundefekt-virustype 1 (HIV-1) og deres anvendelse i diagnostiske systemer og analysemetoder.
5 Det erhvervede immundefektsyndrom (AIDS) har nu spredt sig verden over og synes at udgøre et akut samfundssundhedsproblem, især i Afrika. Et retrovirus betegnet humant immun-defektvirus type 1 (HIV-1) , men tidligere kendt som LAV, HTLV-III eller ARV, har vist sig at fremkalde AIDS i forskel-10 lige områder, som er hårdt ramt af epidemier, deriblandt Nordamerika, Vesteuropa og Centralafrika.
Undersøgelser af HIV-1 på molekylært niveau har afsløret nogle forskelle i nucleotidsekvensen af nordamerikanske og afrikanske isolater. Dog synes nordamerikanske, vest-15 europæiske og centralafrikanske isolater at have de samme biologiske egenskaber og antigent kryds-reaktive proteiner med den samme relative molekylmasse.
Individer smittet med HIV-1 udvikler antistoffer over for de gag-genkodede virale kærneproteiner kaldet pl9 20 og p24, og over for deres forstadieprotein kaldet p55. Desuden observeres der antistoffer mod env-aenkodede hylster-glycoproteiner gpl20 (det ekstracellulære glycoprotein eller EGP), gp41 (det transmembrane protein eller TMP) og deres forstadieglycoprotein kaldet gpl60.
25 Et stort antal AIDS-patienter udviser bortfald af antistoffer over for HIV-l-kærneproteinerne på et fremskredent stadium af sygdommen, men bevarer antistoffer, som er immunreaktive med hylster-antigenerne. Hylster-produkterne påvises regelmæssigt ved antistoffer i sera fra patienter 30 på forskellige stadier af HIV-l-infektionen. Selvom der kun er få rapporter tilgængelige om seroomdannelse til HIV-1, synes fremkomsten af antistoffer over for hylster-proteiner i løbet af kort tid at gå forud for fremkomsten af antistoffer over for kerneproteiner. Se Carlson et al., Lancet.
35 i:361-362 (1987). Af disse grunde har anvendelse af antigener, som repræsenterer gny-genprodukterne væsentlig betyd- DK 173905 B1 2 ning ved diagnosen af smitte af AIDS-relaterede retrovira.
Da AIDS kan overføres ved blodprodukter, har der lige fra den oprindelige anerkendelse af sygdommen været et stærkt incitament til at udvikle diagnostiske forsøg for 5 screening af blod for antistoffer eller antigener, som er specifikke for det inficerende virus. Forsøg inden for dette område har båret frugt, og i slutningen af 1985 blev fem firmaer godkendt til at markedsføre tests til påvisning af antistoffer mod HIV-l-virus. Alle disse tests til påvisning 10 af disse antistoffer er afhængige af anvendelse af virale proteiner fremkommet ved dyrkning af HIV-inficerede T-lym-focytter. Vira fra de dyrkede celler sprænges (f.eks. med detergent), og der fås en væske (kaldet "viralt lysat”).
Dette lysat (indeholdende en række fragmenter af viralt og 15 cellulært protein) anvendes derefter typisk som fastfase-komponent ved en immunanalyse.
Medens de eksisterende tests synes at have nedsat overførslen af HIV-1 via blodprodukter væsentligt, har tests baseret på viralt lysat nogle væsentlige ulemper, deriblandt 20 resultater, som viser et højt antal falske positive resultater. De falske positive resultater skyldes formentlig delvis tilstedeværelsen af ikke-virale proteiner i præparaterne indeholdende viralt lysat, som anvendes i fastfase-komponenten i de gængse prøver.
25 I et forsøg på at nedsætte antallet af falske positive resultater, er man inden for teknikken begyndt at udvikle sted-rettede serologiske prøver ved anvendelse af syntetiske polypeptider, som antager lighed med naturligt forekommende antigene determinanter på virale proteiner. F.eks. beskriver 30 USA-patentskrift nr. 4.629.783 i navnet Cosand, Wang et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:6159-6163 (1986), og Kennedy med flere, Science. 231:1556-1559 (1986) adskillige popypep-tider, som angives at være i stand til at antage lighed med antigene determinanter dannet ved forskellige HIV-1-prote-35 iner, deriblandt TMP (gp4l).
Nærmere bestemt beskriver ovennævnte patentskrift et DK 173905 B1 3 polypeptid roed 26 aminosyrerester, kaldet polypeptid 39, hvis sekvens afledes af TMP-sekvensen af HIV-l-isolatet beskrevet af Wain-Hobson et al., Cell. 40:9-15 (1985). Ovennævnte patentskrift indeholder data, som angiver, at polypeptid 39 5 kan påvise antistoffer forårsaget af HIV-l TMP i sera af uidentificeret geografisk oprindelse.
Peptid nr. 8 beskrevet af Wang et al,, supra. indeholder 21 aminosyrerester svarende i sekvens til TMP-rester 586-606 af HIV-l-sekvensen beskrevet af Ratner et al./ 10 Nature. 313:277-284 (1985). Ifelge Wang et al. kan polypeptid 8 påvise anti-HIV-l-TMP-antistoffer i sera fra individer i USA. Endvidere angiver Wang et al, at analoge af polypeptid 8 indeholdende konservativ erstatning af isoleucin med valin ved stilling 587 og lysin med arginin ved stilling 596, som 15 det er tilfældet i visse virusisolater, ikke har stor påvirkning på den humane antistofbinding til de analoge.
For ganske nylig har Gnann et al., J. Infect. Dis.. 156:261-267 (1987) beskrevet, at et polypeptid afledt af TMP-aminosyrerestsekvensen fra Wiley et al., Proc. Natl.
20 Acad. Sci. USA. 83:5038 (1986) kan påvise anti-HIV-1 TMP-antistoffer i sera fra praktisk talt 100% af alle amerikanske AIDS-patienter, men kan påvise de antistoffer i kun ca. 84% af alle zairiske AIDS-patienter.
Udover deres anvendelse som diagnostiske reagenser 25 foreslår Fischinger et al., Cancer Res.. 45:46945-6995 (1985), at syntetiske polypeptider anvendes som vaccinekomponenter for HIV. Dette forsøg på at forebygge og behandle AIDS understøttes af rapporten af Chanh et al., EMBO. 5:3065-71 (1986), hvori et polypeptid med en aroinosyrerestsekvens 30 svarende til TMP-rester 503 til 532 af HIV-l-isolatsekvensen beskrevet af Muesing et al., Naturer 313:450 (1985) har vist sig at være i stand til at forårsage Hl V-neutral i serende antistoffer hos kaniner. Gnann et al., J. Vlrol.. 61:2639-41 (1987) beskriver et lignende resultat, hvor der anvendes 35 et polypeptid svarende til rester 598-609 af HIV-l-isolatet beskrevet af Wain-Hobson et al., supra.
DK 173905 B1 4
Der er nu fundet to specifikke polypeptider med en forbedret evne til at påvise anti-HIV-l-antistoffer i legemsprøver fra centralafrikanere. Den foreliggende opfindelse angår således et polypeptid bestående hovedsagelig af 12 5 aminosyrerester med en sekvens med formlen:
LGZWGCSGKHIC
hvori Z er enten isoleucin eller methionin.
10 Der tilvejebringes også et præparat omfattende en blanding af mindst to polypeptider, hvori et første af poly-peptiderne har en aminosyrerestsekvens med formlen: LGZWGCSGKHIC, 15 hvori Z er enten isoleucin ellermethionin, og et andet af polypeptiderne er i stand til at immunreagere med antistoffer forårsaget af humant immundefektvirus (HIV).
Der tilvejebringes endvidere en fremgangsmåde til 20 analyse for tilstedeværelsen af anti-HIV-l-antistoffer i en legemsvæskeprøve. En immunreaktionsblanding dannes ved at blande en legemsvæskeprøve med et polypeptid med formlen:
LGZWGCSGKHIC
25 hvori Z er enten isoleucin eller methionin.
Immunoreaktionsblandingen holdes under biologiske analysebetingelser i tilstrækkelig lang tid til, at eventuelle anti-HIV-l-antistoffer til stede i prøven kan immun-30 reagere med polypeptidet og danne et polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt.
Tilstedeværelsen af ethvert polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt, som dannes, bestemmes derefter, og således tilstedeværelsen af eventuelle anti-HIV-l-antistof fer 35 i prøven.
Ved en anden udførelsesform omfatter en fremgangsmåde DK 173905 B1 5 til påvisning af tilstedeværelsen af anti-HIV-antistoffer i en legeinsvæskeprøve dannelse af en immunreaktionsblanding ved at blande en legeinsvæskeprøve med et præparat omfattende en blanding af mindst to polypeptider, hvori et første af 5 polypeptiderne har en aminosyrerestsekvens roed formlen:
LGZWGCSGKHIC
hvori Z er enten isoleucin eller methionin, og et andet af 10 polypeptiderne er enten: LGLWGCSGKLIC, LGIWGCSGKLIC eller NSWGCAFRQVC.
15
Immunreaktionsblandingen, som således dannes, holdes under biologiske prøveforhold i et tidsrum tilstrækkeligt til, at eventuelle anti-HIV-antistoffer til stede i prøven kan immunreagere med et polypeptid i præparatet og danne et 20 polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt*
Tilstedeværelsen af ethvert polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt, som dannes, påvises derefter, og således tilstedeværelsen af eventuelle anti-HIV-antistoffer i prøven.
25 Der tilvejebringes også et diagnostisk system i form af et sæt til analyse for tilstedeværelsen af anti-HIV-1-antistoffer i legemsvæskeprøven omfattende en pakke indeholdende et polypeptid med formlen:
30 LGZWGCSGKHIC
hvori Z er enten isoleucin eller methionin.
Ved en anden udførelsesform omfatter et diagnostisk system i form af et sæt til analyse for tilstedeværelsen af 35 anti-HIV-antistoffer i en legeinsvæskeprøve en pakke indeholdende mindst to polypeptider, hvori et første af polypep- DK 173905 B1 6 tiderne har formlen:
LGZWGCSGKHIC
5 hvori Z er enten isoleucin eller methionin; og et andet af polypeptiderne er enten LGLWGCSGKLIC, LGIWGCSGKLIC eller 10 NSWGCAFRQVC.
A. Definitioner Aminosyre:
Alle aminosyrerester, som er angivet heri, er i den 15 naturlige L-konfiguration. I overensstemmelse med standard polypeptidnoroenklatur, J. Biol. Chem.. 243:3557-59 (1969), er forkortelser for aminosyrerester som angivet nedenfor: DK 173905 B1 7
LISTE OVER FORKORTELSER SYMBOL AMINOSYRE
1-boastav 3-bogstav 5 Y Tyr L-tyrosin G Gly glycin F Phe L-phenylalanin M Met L-methionin A Ala L-alanin 10 S Ser L-serin I Ile L-isoleucin L Leu L-leucin T Thr L-threonin V Val L-valin 15 P Pro L-prolin K Lys L-lysin H His L-histidin Q Gin L-glutamin E Glu L-glutarainsyre 20 W Trp L-tryptophan R Arg L-arginin D Asp L-asparaginsyre N Asn L-asparagin C Cys L-cystein 25 _
Det skal bemærkes, at alle aminosyrerestsekvenser er angivet heri ved formler, hvis orientering fra venstre til højre er i den sædvanlige retning fra amino-terminus til 30 carboxy-terminus. Endvidere skal det bemærkes, at en tanke streg i begyndelsen eller slutningen af en aminosyrerest-sekvens angiver en binding til en yderligere sekvens af én eller flere aminosyrerester op til ca. halvtreds rester i polypeptidkæden.
35 Polvpeotid og peptid: Polypeptid og peptid er udtryk, som anvendes skiftende heri for at angive en lineær serie af ikke mere end ca. 50 aminosyrerester forbundet fra den DK 173905 B1 8 ene til den anden ved peptidbindinger mellem α-amino- og carboxygrupper af tilstødende rester.
Protein: Udtrykket protein anvendes i den foreliggende beskrivelse for at angive en lineær serie af mere end 50 5 aminosyrerester, som er forbundet fra den ene til den anden som i et polypeptid.
B. Polypeptider
Et polypeptid ifølge opfindelsen består i det væsentligste af 12 aminosyrerester med en sekvens med formlen 10
LGZWGCSGKHIC
hvori Z er enten isoleucin (I) eller methionin (M).
De her omhandlede peptider indeholder mindst to cyste-15 inrester. De her omhandlede peptider kan således forekomme i forskellige oxidative former. Udover den monomere form, hvori sulfhydrylgruppen i cysteinresterne er reduceret, kan der også forekomme dimere eller polymere former, hvori sulf-hydrylgrupper på to eller flere peptidmolekyler bliver oxi-20 deret og danner inter- og intrapeptiddisulfidbindinger. Da de her omhandlede polypeptider er i besiddelse af to cystein-rester, kan de danne cycliske monomere elelr lineære eller cycliske dimere og lineære polymere af forskellige længder.
Disse forskellige oxidative former anses for at være en del 25 af den foreliggende opfindelse og er omfattet af udtrykkene "polypeptider" og "peptider".
Et polypeptid ifølge opfindelsen kan syntetiseres ved enhver af de for en fagmand inden for polypeptidteknikken kendte teknikker, deriblandt rekombinant-DNA-teknikker.
Λ Syntetiske kemiteknikker, såsom en fastfasesyntese af Merri-field-typen, foretrækkes af grunde, såsom renhed, antigen specificitet, ingen uønskede biprodukter, lettelse af produktionen og lignende. Et udmærket sammendrag af de mange teknikker, som er til rådighed, er beskrevet i J.M. Steward og 35 J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky et al., "Peptide DK 173905 B1 9
Synthesis", John Wiley & Sons, 2. udg., 1976 og J. Meien-hofer, "Hormonal Proteins and Peptides", bind 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983 for fastfase-peptidsyntese, og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", bind 1, Academic 5 Press (New York), 1965 for klassisk opløsningssyntese, hvortil der henvises i den foreliggende beskrivelse. Passende beskyttelsesgrupper, som kan anvendes i sådanne synteser, er beskrevet i ovennævnte skrifter og i J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic chemistry", Plenum Press, New York, 10 1973, hvortil der henvises i den foreliggende beskrivelse.
Generelt omfatter disse metoder tilsætning i rækkefølge af én eller flere aminosyrerester eller på passende måde beskyttede aminosyrerester til en voksende peptidkæde. Sædvanligvis beskyttes enten amino- eller carboxylgruppen 15 af den første aroinosyrerest af en passende, selektivt flytbar beskyttelsesgruppe. En anden selektivt flytbar beskyttelsesgruppe anvendes til aminosyrer indeholdende en reaktiv sidegruppe, såsom lysin.
Ved anvendelse af en fastfasesyntese som eksempel 20 forbindes den beskyttede eller derivatiserede aminosyre til en indifferent fast støtte gennem dens ubeskyttede carboxyl-eller aminogruppe. Beskyttelsesgruppen på amino- eller carboxylgruppen fjernes derpå selektivt, og den næste aminosyre i sekvensen med den komplementære (amino- eller carbo-25 xyl)gruppe, som er beskyttet på passende måde, blandes og omsættes under betingelser, som er egnede til dannelse af amidbindingen med resten, som allerede er forbundet til den faste støtte. Beskyttelsesgruppen på amino- eller carboxylgruppen fjernes derpå fra denne fornylig tilsatte aminosyre-30 rest, og den næste aminosyre (passende beskyttet) tilsættes derpå, osv. Efter at alle de ønskede aminosyrer er bundet i den passende sekvens, fjernes eventuelle resterende endeeller sidegruppebeskyttende grupper (og faste støtter) i rækkefølge eller samtidigt til dannelse af det endelige 35 polypeptid.
De her omhandlede polypeptider indeholder ca. 12 DK 173905 B1 10 aminosyrerester, undtagen hvor der er tilsat yderligere rester i hver ende med det formål at tilvejebringe et Mbin-demiddel", hvorved de her omhandlede polypeptider på passende måde kan fæstnes til et mærke eller en fast matrix eller 5 et bærestof. Mærker, faste matricer og bærestoffer, som kan anvendes sammen med de her omhandlede polypeptider, er beskrevet i det følgende.
Aminosyrerestbindemidler er sædvanligvis mindst én rest og kan være 40 eller flere rester, oftere 1-10 rester, 10 og omfatter ikke sekvenser, som antager lighed med epitoper af AIDS-fremkaldte vira. Typiske aminosyrerester, som anvendes til binding, er tyrosin, cystein, lysin, glutamin- og asparaginsyre eller lignende. Desuden kan polypeptidsekvensen ifølge opfindelsen adskille sig fra den naturlige sekvens, 15 idet sekvensen kan være modificeret ved ende-NH2~acylering, f.eks. acetylering, eller thioglycolsyreamidering, ved ende-carboxylamidering, f.eks. med ammoniak, methylamin og lignende.
Når et polypeptid ifølge opfindelsen kobles til et 20 bærestof via et bindemiddel til dannelse af hvad der inden for teknikken er kendt som et bærer-haptenkonjugat, er det i stand til at fremkalde antistoffer, som immunreagerer med og neutraliserer HIV-1.
c. Polypeptid-blandinger 25 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også et præparat omfattende en blanding af mindst to polypeptider, hvori ét er polypeptiderne her en aminosyrerestsekvens med formlen:
30 LGZWGCSGKHIC
hvori Z er enten isoleucin eller methionin, (dvs. er valgt blandt gruppen af p3 og p4, hvis respektive aminosyrerest-sekvenser er vist i tabel I) . Et andet af polypeptiderne, 35 som er til stede i blandingen, har typisk en aminosyrerestsekvens, som svarer til en del af et protein af en virus, DK 173905 B1 11 som forårsager eller er forbundet med AIDS, såsom HIV-1, HIV-2 og lignende, og er i stand til at immunreagere roed antistoffer forårsaget af dette protein. Fortrinsvis indeholder præparatet desuden, i blanding, mindst ét af polypep-5 tiderne pi, p2 og/eller p5, hvis aminosyrerestsekvens også er vist i tabel I. Typisk er de forskellige polypeptider til stede i ca. ækvimolær mængde.
Tabel I
10
Betegnelse Aminosyrerestsekvens Virus pi LGLWGCSGKLIC HIV-1 p2 LGIWGCSGKLIC HIV-1 p3 LGIWGCSGKHIC HIV-1 15 p4 LGMWGCSGKHIC HIV-1 p5 NSWGCAFRQVC HIV-2 D. Podestoffer og fremgangsmåder til fremkaldelse af HIV-1-20 neutraliserende antistoffer
Ordet "inoculum" i dets forskellige grammatiske former anvendes i den foreliggende beskrivelse til at beskrive et præparat omfattende et farmaceutisk acceptabelt vandigt fortyndingsmiddel indeholdende, som en aktiv bestanddel for 25 fremkaldelsen af HIV-l-neutraliserende antistoffer, et poly-peptid med en aminosyrerestsekvens med formlen:
LGBWGCSGKJIC
30 hvori B er enten isoleucin (I), leucin (L) eller methionin (M), og J er enten histidin (H) eller leucin (L). Foretrukne polypeptider med aminosyrerestsekvenser med den ovennævnte formel er pi, p2, p3 og p4. Et inoculum ifølge opfindelsen forårsager således, når det indgives i en immunologisk effek-35 tiv mængde, antistoffer, som immunreagerer med og neutraliserer HIV-1.
DK 173905 B1 12 Når et polypeptid anvendes til fremkaldelse af antistoffer, skal det forstås, at polypeptidet kan anvendes alene eller bundet til et bærestof som et konjugat, eller som en polypeptidpolymer, men for at forenkle udtrykkene 5 kaldes de forskellige former for polypeptider ifølge opfindelsen samlet "polypeptid" og dets forskellige grammatiske former.
For et polypeptid, som indeholder færre end ca. 35 aminosyrerester foretrækkes det at anvende peptidbinding 10 til et bærestof for at fremkalde dannelse af antistoffer, som beskrevet ovenfor.
Som også allerede beskrevet kan der sættes én eller flere yderligere aminosyrerester til amino- eller carboxy-enderne af polypeptidet for at hjælpe med til at binde poly-15 peptidet til et bærestof. Cysteinrester tilsat amino- eller carboxy-enderne af polypeptidet har vist sig at være særlig anvendelige til dannelse af konjugater via di sulfidbindinger.
Der kan dog også anvendes andre fra teknikken velkendte fremgangsmåder til fremstilling af konjugater. Eksempler 20 på yderligere fremgangsmåder til binding omfatter anvendelse af Michael-ti Isætnings-reaktionsprodukter, dialdehyder, såsom glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis. .
147. 318-326 (1983) og lignende, eller anvendelse af car-bodiimidteknologi ligesom ved anvendelsen af et vandoplø-25 seligt carbodiimid til dannelse af amidbindinger til bærestoffet. For at få et overblik over proteinkonjugation eller koblng gennem aktiverede funktionelle grupper, se Aurameas et al., Scand. J. Immunol., bind 8, Suppl. 7, 7-23 (1978).
Anvendelige bærestoffer er velkendte i teknikken og 30 er generelt selv proteiner. Eksempler på sådanne bærestoffer er nøglehuls-albueskæl-hæmocyanin (KLH), edestin, thyroglo-bulin, albuminer, såsom okseserumalbumin (BSA) eller humant serumalbumin (HSA) , røde blodlegemer, såsom fåreerythrocytter (SRBC), tetanustoxoid, koleratoxoid, hepatitis B viruskerne-35 partikler eller immunogenfragmenter deraf samt polyamino-syrer, såsom poly- (D-lysin: D-glutaminsyre) og lignende.
DK 173905 B1 13
Valget af bærestof er roere afhængigt af den endelige anvendelse af inoculet og er baseret på kriterier, som ikke har særlig forbindelse med den foreliggende opfindelse.
F.eks. bør der vælges et bærestof, som ikke indfører en 5 upassende reaktion i det særlige pattedyr, som skal inoku-leres.
Det foreliggende inoculum indeholder en effektiv, immunogen mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen, typisk et konjugat bundet til et bærestof. Den effektive mængde 10 polypeptid pr. enhedsdosis afhænger blandt andet af arten af pattedyr, som skal inokuleres, pattedyrets legemsvægt og det valgte inokulationssystem, som det er velkendt inden for teknikken. Inocula indeholder typisk polypeptidkoncen-trationer på ca. 10 mikrogram til ca. 500 milligram pr.
15 inokulation (dosis), fortrinsvis ca. 50 mikrogram til ca.
50 milligram pr. dosis.
Udtrykket "enhedsdosis”, når det anvendes i forbindelse med inocula ifølge den foreliggende opfindelse refererer til fysisk adskilte enheder, som er egnede som en-20 hedsdoser til dyr, hvor hver enhed indeholder en forudbestemt mængde aktivt materiale, som er beregnet til at producere den ønskede immunogene virkning sammen med det nødvendige fortyndingsmiddel; dvs. bæremiddel eller hjælpemiddel. Specifikationerne for den hidtil ukendte enhedsdosis af inoculum 25 ifølge opfindelsen er dikteret af og er direkte afhængig af (a) de enestående karakteristika for det aktive materiale og den særlige immunologiske virkning, der skal opnås, og (b) de begrænsninger, der er forbundet med teknikken at sammensætte et sådant aktivt materiale til immunologisk 30 anvendelse i dyr og mennesker, som beskrevet i den foreliggende beskrivelse, idet dette er træk ifølge opfindelsen.
Inocula fremstilles typisk ud fra et tørret fast polypeptid-konjugat ved at dispergere polypeptid-konjugatet i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel, såsom vand, 35 saltopløsning eller fosfat-pufret saltopløsning til dannelse af et vandigt præparat.
DK 173905 B1 14
Inocula Kan også omfatte et hjælpemiddel som del af fortyndingsmidlet. Hjælpemidler, såsom "complete Freund’s adjuvant" (CFA), "incomplete Freund's adjuvant" (IFA) og alun er materialer, som er velkendte inden for teknikken, 5 og som er kommercielt tilgængelige fra adskillige kilder.
For at frembringe HIV-1-virus-neutraliserende antistoffer indgives en immunogen mængde inoculum ifølge opfindelsen, typisk ved subcutan eller intramuskulær injicering, til et pattedyr, såsom en mus, en kanin, en ged, en hest, 10 et menneske og lignende. Det inokulerede pattedyr holdes derpå i tilstrækkelig tid til, at polypeptidet, som er til stede som aktiv bestanddel i inokulet, kan fremkalde neutraliserende anti-HIV-l-antistoffer. Om ønsket kan de således fremkaldte antistoffer derpå høstes og anvendes i præparater 15 til passiv immunisering mod HIV-1 eller i diagnostiske prøver og systemer til påvisning af HIV-l-TMP i legemsprøver.
E. Antistoffer_od antistof-præparater
Udtrykket "antistof" i dets forskellige grammatiske 20 former anvendes i den foreliggende beskrivelse som henvisning til immunoglobulinmolekyler og immunologisk aktive dele af immunoglobulinmolekyler, dvs. molekyler, som indeholder et antistof-kombinerende sted eller paratop. Eksempler på antistofmolekyler er intakte immunoglobulinmolekyler, i alt 25 væsentligt intakte immunoglobulinmolekyler og de portioner af et immunoglobulinmolekyle, som indeholder paratopen, deriblandt de portioner, som er kendte inden for teknikken som Fab, Fab', F(ab')2 og F(v).
Et antistofpræparat ifølge den foreliggende opfindelse 30 er karakteriseret som indeholdende HIV-l-neutraliserende antistofmolekyler, som immunreagerer med et polypeptid med formlen: LGBWGCSGKJIC, hvori B er enten isoleucin, leucin eller methionin, og J er 35 DK 173905 B1 15 enten histidin eller leucin. Fortrinsvis er polypeptidet p3 eller p4. Antistofpraeparatet er yderligere karakteriseret som værende i alt væsentligt fri for antistoffer, som immun-reagerer med HIV-l-TMP-beslægtede polypeptider med formlen: 5 RILAVERYLKDQQLL og CTTAVPWNASWS.
Et antistofpræparat ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles typisk ved at immunisere et pattedyr med et 10 inoculum ifølge opfindelsen og derved i pattedyret fremkalde antistofmolekyler med den passende polypeptid-immunspecifi-citet. Antistofmolekylerne opsamles derpå fra pattedyret og isoleres til det ifølge velkendte teknikker ønskede omfang, såsom ved immunaffinitetschromatografi. Det således fremstil- .
15 lede antistofpræparat kan anvendes i, inter alia, de her omhandlede diagnostiske metoder og systemer til påvisning af HIV-1 i en legemsprøve.
Antistofpræparaterne ifølge opfindelsen kan beskrives som oligoklone sammenlignet med naturligt forekommende poly-20 klone antistoffer, da de indeholder paratoper, som er rettet mod relativt få epitoper sammenlignet med epitoperne fra et intakt HIV-l-TMP-molekyle. Således binder de her omhandlede antistoffer sig til relativt få epitoper, som polypeptidet antager lighed roed, hvorimod naturligt forekommende anti-25 stoffer over for hele TMP-molekylet binder til epitoper i hele TMP-molekylet og angives at være polyklone.
Monoklone antistofpræparater omfattes også af den foreliggende opfindelse. Et monoklont antistofpræparat indeholder, inden for påviselige grænser, kun ét slags anti-30 stof-kombinerende sted, som er i stand til effektivt at binde HIV-l-TMP. Således udviser et monoklont antistofpræparat ifølge opfindelsen typisk en enkelt bindingsaffinitet for HIV-l-TMP, selvom det kan indeholde antistoffer, som er i stand til at binde proteiner forskellige fra HIV-l-TMP.
35 Egnede antistoffer i monoklon form, typisk hele anti stoffer, kan fremstilles ved anvendelse af hybridoma-tekno- DK 173905 B1 16 logi beskrevet af Niman et al, Proc. Natl. Sci.. USA. 80:4949-4953 (1983), til hvilken beskrivelse der henvises i den foreliggende beskrivelse. Kort og godt, til dannelse af hybridoma, ud fra hvilket det monoklone antistofpraeparat 5 fremstilles, kondenseres et myeloma eller en anden stadig vedvarende cellelinie med lymfocytter fra milten fra et pattedyr, som er hyperimmuniseret med et polypeptid ifølge opfindelsen.
Det foretrækkes, at myeloma-cellelinien er fra samme 10 art som lymfocytterne. Typisk er en mus af stammen 129 G1X+ et foretrukket pattedyr. Egnede musemyeloma til anvendelse i den foreliggende opfindelse omfatter hypoxanthin-aminop-terin-thymidin-sensitive (HAT) -cellelinier P3X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4, som kan fås fra American Type Culture 15 Collection, Rockwille, MD, henholdsvis under betegnelserne CRL 1580 og CRL 1581.
Splenocytter fusioneres typisk med myelomaceller ved anvendelse af polyethylenglycol (PEG) 1500. Fusionerede hybrider udvælges efter sensitivitet over for HAT. Hybridoma, 20 som sekreterer antistofmolekylerne ifølge opfindelsen, identificeres ved anvendelse af den enzymbundne immunosorbent-prøve (ELISA) beskrevet i eksempel 2.
Et monoklont antistofpræparat ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at initiere en monoklon hybridomakultur 25 omfattende et næringsmiddelmedium indeholdende et hybridoma, som sekreterer antistofmolekyler med den passende polypeptid-specificitet. Kulturen opbevares under betingelser og i et tidsrum, som er tilstrækkelige til at hybridomaet kan afsondre antistofmolekylerne i mediet. Det antistof-indehol-30 dende medium opsamles derpå. Antistofmolekylerne kan derpå yderligere isoleres ved velkendte teknikker.
Medier, som er anvendelige til fremstilling af disse præparater, er både velkendte inden for teknikken og er kommercielt tilgængelige og omfatter syntetiske kulturmedier, 35 indavlede mus og lignende. Et eksempel på et syntetisk medium er "Dulbecco's minimal essential medium" (DMEM; Dulbecco et DK 173905 B1 17 al., Virol. 8:396 (1959)) suppleret med 4,5 gμ/l glucose, 20 mm glutamin og 20% foetalt kalveserum. Et eksempel på en indavlet musestamme er Balb/c.
De monoklone antistofpræparater, som fremstilles 5 ved ovennævnte fremgangsmåde, kan f.eks. anvendes i diagnostiske og terapeutiske modaliteter, hvori dannelsen af et HIV-l-TMP-indeholdende immunreaktionsprodukt ønskes.
F. Diagnostiske systemer
Et diagnostisk system i form af et sæt ifølge opfin-10 delsen indeholder, i en mængde tilstrækkelig til mindst én prøve, et polypeptid, en polypeptidblanding, et antistofpræparat eller et monoklont antistofpræparat ifølge opfindelsen, som et emballeret reagens. Instruktioner til anvendelse af det emballerede reagens er også typisk indeholdt.
15 Som det anvendes i den foreliggende beskrivelse bety der udtrykket "emballage” en fast matrice eller et fast materiale, såsom glas, plastik, papir, folie og lignende, som er i stand til at holde et polypeptid, et antistofpræparat eller et monoklont antistofpræparat ifølge opfindelsen 20 inden for faste grænser. En emballage kan således f.eks. være et hætteglas, som anvendes til at indeholde milligram store mængder af et fremstillet polypeptid, eller det kan være en mikrotiterpladefordybning, hvortil mikrogram store mængder af et fremstillet polypeptid operativt er fæstnet, 25 dvs. bundet for at være i stand til at være immunologisk bundet af et antistof.
"Brugsanvisningen" omfatter typisk et konkret udtryk, som beskriver reagenskoncentrationen eller mindst én prøveparameter, såsom relative mængder reagens og prøve, som 30 blandes, opbevaringstider for reagens-/prøveblandinger, temperatur, pufferbetingelser og lignende.
Ved foretrukne udførelsesformer indeholder et diagnostisk system ifølge opfindelsen polypeptid p3 og/eller p4, fortrinsvis p3 og p4 blandet.
35 Der foretrækkes også et diagnostisk system indehol dende mindst to polypeptider, hvori et første af polypep- DK 173905 B1 18 tiderne har en aminosyrerestsekvens med formlen: LGZWGCSGKHIC, 5 hvori Z er enten isoleucin eller methionin. Et andet af polypeptiderne er i stand til at immunoreagere med antistoffer forårsaget af et HIV, såsom HIV-i, HIV-2 og lignende og udvælges fortrinsvis blandt pi, p2 og p5. Hvert enkelt poly-peptid kan emballeres separat i sættet, f.eks, som del af 10 separate faste understøtninger. Fortrinsvis er det første og andet polypeptid til stede i blanding, fortrinsvis ca. ækvimolær blanding.
Yderligere foretrukket er et diagnostisk system med mindst to faste understøtninger, fortrinsvis separat embal-15 leret i sættet. Den første faste støtte er omfattet af en fast matrice, som operativt dertil har fæstnet en blanding af mindst to polypeptider. Et første af polypeptiderne har en aminosyrerestsekvens med formlen: 20 LGZWGCSGKHIC, hvori Z er enten isoleucin eller methionin, og et andet af polypeptiderne er valgt blandt pi og p2. Den anden faste understøtning er omfattet af en fast matrice, som operativt 25 dertil har fæstnet polypeptid p5.
Ved foretrukne udførelsesformer omfatter et diagnostisk system ifølge opfindelsen et mærke- eller en mærkemåde, som giver besked om dannelsen af et kompleks indeholdende et polypeptid eller antistofmolekyle ifølge opfindelsen.
30 Ordet "kompleks", som det anvendes i den foreliggende beskrivelse, angivet produktet med en specifik bindingsreaktion, såsom et antistof-antigen eller en receptor-ligand-reaktion. Eksempler på komplekser er immunoreaktionsproduk-ter.
35 Som det anvendes her, betyder udtrykkene "mærke" og "mærkemåder" i deres forskellige grammatiske former enkelte DK 173905 B1 19 atomer og molekyler, som enten er direkte eller indirekte involveret i fremstillingen af et påviseligt signal til angivelse af tilstedeværelsen af et kompleks. Ethvert mærke eller enhver mærkemåde kan forbindes roed eller inkorporeres 5 i et angivet protein, polypeptid eller antistofmolekyle, som er del af et antistof eller monoklont antistofpræparat ifølge opfindelsen, eller kan anvendes separat, og de atomer eller molekyler kan anvendes alene eller kombineret med yderligere reagenser. Sådanne mærker er i sig selv velkendte 10 i klinisk diagnostisk kemi og udgør kun en del af den foreliggende opfindelse, såfremt de anvendes sammen med på anden måde hidtil ukendte proteiner, fremgangsmåder og/eller systemer.
En mærkemåde kan være et fluorescerende mærkemiddel, 15 som kemisk binder sig til antistoffer eller antigener uden at denaturere dem til dannelse af en flurochrom (farve), som er et anvendeligt immunofluorescerende sporstof. Egnede fluorescerende mærkemidler er fluorochromer, såsom fluores-ceinisocyanat (FIC), fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5- 20 dimethylamino-1-napthhalensulfonylchlorid (DANSC), tetra-methylrhodamin-isothiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin 8200 sulfonylchlorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse af immunof luorescensanalyseteknikker findes i DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", i Antibody As a Tool.
25 Marchalonis med flere, udg., John Wiley & Sons, Ltd., s. 189-231 (1982), hvortil der henvises i den foreliggende beskrivelse.
Ved foretrukne udførelsesformer er mærkegruppen et enzym, såsom peberrod-peroxidase (HRP), glucoseoxidase eller 30 lignende. I sådanne tilfælde, hvor den væsentligste mærkegruppe er et enzym, såsom HRP eller glucoseoxidase, kræves der yderligere reagenser for at visualisere den kendsgerning, at der er dannet et receptor-ligand-kompleks (immunoreak-tant). sådanne yderligere reagenser for HRP omfatter hydro-35 genperoxid og en oxidations-farvestof-forstadium, såsom diaminobenzidin. Et yderligere reagens, som er anvendeligt DK 173905 B1 20 sammen med glucoseoxidase er 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzo-thiazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).
Radioaktive grundstoffer er også anvendelige mærke-midler og anvendes illustrativt i den foreliggende beskri-5 velse. Et eksempel på et radiomærkemiddel er et radioaktivt element, som fremkalder gammaståling. Elementer, som i sig selv udsender gammastråler, såsom 124I, 125I, 128I, 132l og 51Cr, repræsenterer én klasse gammastrålings-fremkaldende radioaktive grundstof-mærkegrupper. Særlig foretrukket er 10 125I. En anden gruppe af anvendelige mærkemidler er grund stoffer, såsom 11c, 18f, 15o og 13N, som i sig selv udsender positroner. positronerne, som således udsendes, frembringer gammastråler efter mode med elektroner, som er til stede i dyrets legeme. Også anvendelig er en betastråleudsender, 15 såsom ^-^indium eller 3K.
Binding af mærker, dvs. mærkning af polypeptider og proteiner, er velkendte inden for teknikken. F.eks. kan antistofmolekyler fremkaldt af et hybridoma, mærkes ved metabolsk inkorporering af radioisotop-indeholdende amino-20 syrer, der fås som en komponent i kulturmediet. Se f.eks.
Galfre et al, Meth. Enzvmol.. 73:3-46 (1981). Teknikkerne for proteinkonjugation eller kobling gennem aktiverede funktionelle grupper er især anvendelige. Se f.eks. Aurameas et al, Scand. J. Immunol., bind 8 suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell 25 et al, Biotech.. 3:889-894 (1984), og USA-patent nr.
4.493.795.
De diagnostiske systemer kan også omfatte, fortrinsvis i en separat emballage, et specifikt bindemiddel. Et "specifikt bindemiddel" er en molekylær enhed, som er i stand til 30 selektivt at binde en reagens-art ifølge opfindelsen eller et kompleks indeholdende en sådan art, men ikke i sig selv er et polypeptid eller antistof-molekylepræparat ifølge opfindelsen. Eksempler på specifikke bindemidler er sekundære antistofmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter 35 deraf, S. aureus protein A og lignende. Fortrinsvis binder det specifikke bindemiddel reagensarten, når den art er til DK 173905 B1 21 stede som en del af et kompleks.
Ved foretrukne udførelsesformer mærkes det specifikke bindemiddel. Men når det diagnostiske system omfatter et specifikt bindemiddel, som ikke er mærket, anvendes midlet 5 typisk som supplerende middel eller reagens. Ved disse udførelsesformer er det mærkede specifikke bindemiddel i stand til specifikt at binde det supplerende middel, når det supplerende middel er bundet til et reagens-art-indeholdende kompleks.
10 De diagnostiske sæt ifølge opfindelsen kan anvendes i et "ELISA"-format til påvisning af tilstedeværelsen eller mængden af i det mindste anti-HIV-l-antistoffer i en legeros-væskeprøve, såsom serum, plasma eller urin. "ELISA" er en enzym-bundet immunosorbentprøve, som anvender et antistof 15 eller et antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen-eller enzym-antistof-kon jugat til påvisning og måling af mængden af et antigen eller antistof, som er til stede i en prøve. En beskrivelse af ELISA-teknikken findes i kapitel 22 af 4. udg. af Basic and Clinical Immunology af D.P. Sites 20 et al, udgivet af Lange Medical Publications of Los Altos, Californien i 1982 og i USA-patentskrifter nr. 3.654.090, nr. 3.850.752 og nr. 4.016.043, hvortil der henvises i den foreliggende beskrivelse.
Ved foretrukne udførelsesformer kan et polypeptid, 25 et antistofmolekylepræparat eller monoklont antistofmole-kylepræparat ifølge opfindelsen således fæstnes til en fast matrix til dannelse af en fast støtte, som omfatter en emballage i det foreliggende diagnostiske system.
Reagenset fæstnes typisk til den faste matrix ved 30 adsorbering fra et vandigt medium, selvom andre fæstnings måder, som er velkendte for fagfolk, kan anvendes.
Anvendelige faste matricer er også velkendte i teknikken. Sådanne materialer er vanduopløselige og omfatter det tværbundne dextran, som kan fås under varemærket 35 "SEPHADEX" fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose? perler af polystyrenperler ca. 1 mikron til ca. 5 DK 173905 B1 22 millimeter i diameter, som fås fra Abbott Laboratories i Nord-Chicago, IL; polyvinylchlorid, polystyren, tværbundet polyacrylamid, nitrocellulose- eller nylon-baserede væv, såsom ark, strimler eller spatler; eller ror, plader eller 5 eller fordybninger i en mikrotiterplade, såsom de af polystyren eller polyvinylchlorid fremstillede.
Reagensarterne, mærket specifikt bindemiddel eller supplerende reagens af ethvert af de i den foreliggende beskrivelse omtalte diagnostiske systemer kan fås i opløs-10 ning, som en flydende dispersion eller som et i alt væsentligt tørt pulver, f.eks. i lyofiliseret form. Når mærkemidlet er et enzym, kan enzymets substrat også fås i en separat emballage i et system. En fast understøtning, såsom den ovenfor beskrevne mikrotiterplade og én eller flere puffere 15 kan også inkluderes som separat emballerede elemnter i dette diagnostiske prøvesystem.
Emballeringsmaterialerne angivet heri i forbindelse med diagnostiske systemer er de sædvanligvis i diagnostiske systemer anvendte. Sådanne materialer omfatter glas og plas-20 tik (f.eks. polyethylen, polypropylen og polycarbonat) flasker, hætteglas, plastik- og plastik-folie-laminerede hylstre og lignende.
G. Prøvemetoder 25 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en frem gangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen og fortrinsvis mængden af antistoffer mod HIV-1 i en legemsvæskeprøve ved fremstilling af et kompleks indeholdende et polypeptid ifølge opfindelsen og sådanne antistoffer. Fagfolk vil forstå, at 30 der er adskillige velkendte kliniske diagnostiske kemiske fremgangsmåder, som kan anvendes til dannelse af de komplekser. Det vil sige, at selvom der i den foreliggende beskrivelse er angivet eksempler på prøvemetoder, er opfindelsen ikke begrænset dertil.
35 Forskellige heterogene og homogene prøveprotocoler kan anvendes, enten konkurrerende eller ikke-konkurrerende, DK 173905 B1 23 til påvisning af tilstedeværelsen, og fortrinsvis mængde, af antistoffer mod HIV-l-TMP i en legemsvæskeprøve ved anvendelse af et polypeptid ifølge opfindelsen. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer f.eks. en fremgangsmåde til analyse 5 af en legemsprøve for tilstedeværelsen af anti-HIV-l-anti-stoffer, hvilket omfatter: (a) Dannelse af en immunoreaktionsblanding ved at blande en legemsvæskeprøve med et polypeptid med en amino-syrerestsekvens med formlen: 10 LGZWGCSGKHIC, hvori Z er enten isoleucin eller roethionin. Legemsvæskeprøven tilvejebringes fortrinsvis som en kendt mængde blod eller 15 et blodafledt produkt, såsom serum eller plasma, men urin, saliva, semen, vaginal sekretion eller cerebral-spinalvæske (CSF) kan også anvendes. Polypeptidet er fortrinsvis til stede som del af en fast understøtning, f.eks. et polypeptid ifølge opfindelsen, som er fæstnet til væggene af mikrotiter-20 pladefordybningen, således at den fremstillede immunreaktionsblanding har et fast stof og en flydende fase.
(b) Opbevaring af blandingen under biologiske prøvebetingelser i et forudbestemt tidsrum, såsom ca. 10 minutter til ca. 16-20 timer ved en temperatur på ca. 4*C til ca.
25 45*C, som er tilstrækkeligt til, at eventuelle anti-HIV-l- antistoffer, som er til stede i prøven, kan immunreagere med (immunologisk binde) polypeptidet til dannelse af et poly-peptid-indeholdende immunreaktionsprodukt.
Biologiske prøveforhold er sådanne, som bevarer den 30 biologiske aktivitet for polypeptidmolekylerne ifølge opfindelsen og anti-HIV-l-antistofferne, som skal bestemmes, og omfatter et temperaturområde på ca. 4*C til ca. 45*C, et pH-værdi-område på ca. 5 til ca. 9 og en ionstyrke, der varierer fra den for destilleret vand til ca. ét molært natrium-35 chlorid. Metoder til optimering af sådanne betingelser er velkendte inden for teknikken.
DK 173905 B1 24 (c) Analyse for tilstedeværelsen af et eventuelt polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt, som dannes, og således tilstedeværelsen af eventuelle anti-HIV-l-anti-stoffer i immunreaktionsblandingen bestemmes også. Fortrins-5 vis bestemmes mængden af eventuelt dannet polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt og således mængden af anti-HIV-1-antistoffer, som er til stede i proven.
Analyse for tilstedeværelsen af eventuelt polypeptid-indeholdende (anti-HIV-l-antistof-indeholdende) immunreak-10 tionsprodukt, enten direkte eller indirekte, kan gennemfores ved prøveteknikker, som er velkendte inden for teknikken.
F.eks. fremstilles det polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt fra trin (b) til analyse ved foretrukne udførelsesformer ifølge trin (c) ved følgende trin: 15 (i) Et biologisk aktivt mærket specifikt bindemiddel blandes med det polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt til dannelse af en mærke-reaktionsblanding. Det mærkede specifikke bindemiddel er i stand til at binde til eventuelt immunglobulin til stede i det polypeptid-indeholdende immun-20 reaktionsprodukt til dannelse af et mærket kompleks. Fortrinsvis er det mærkede specifikke bindemiddel omfattet af andre antistofmolekyler, såsom xenogene anti-humane Fc-anti-stoffer. Mere foretrukket er det mærkede specifikke bindereagens immunoglobulin-klassespecifikt.
25 (ii) Den således dannede mærke-reaktionsblanding holdes under biologiske prøvebetingelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til at det mærkede specifikke bindemiddel kan binde til eventuelle anti-HIV-l-antistoffer til stede som polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt 30 til dannelse af et mærket kompleks.
Analyse for tilstedeværelsen af det mærkede kompleks giver en analyse for tilstedeværelsen af anti-HIV-l-antistof fer i prøven. Ved foretrukne udførelsesformer bestemmes mængden af det mærkede specifikke bindemiddel, som er bundet 3 5 som del af komplekset, og således kan tilstedeværelsen og mængden af anti-HIV-l-antistoffer i prøven bestemmes. Den DK 173905 B1 25 mængden kan være nul, hvilket angiver, at der ikke er nogen anti-HIV-l-antistoffer til stede i prøven inden for de grænser, der kan påvises. Metoder til analyse for tilstedeværelsen og mængden af et mærket specifikt bindemiddel afhænger 5 af det anvendte mærke, idet sådanne mærker og analysemetoder er velkendte inden for teknikken.
Alternativt kan der anvendes homogene analysemetoder, såsom de i USA-patentskrifterne nr. 4.536.479, nr. 4.233.401, nr. 4.233.402 og nr. 3.996.345 beskrevne, hvor-10 til der henvises i den foreliggende beskrivelse, til påvisning af det polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt fra trin (c).
EKSEMPLER
15 1. Polvpeptidsvntese
Polypeptider pi, p2, p3, p4 og p5 syntetiseres ved anvendelse af den af Merrifield, Adv. Enzvmol.. 32:221-96 (1969) beskrevne klassiske fastfaseteknik, tilpasset til anvendelse med en "model 43OA automatisk peptidsynthesizer" 20 fra Applied Biosystems, Foster city, Californien. Polypeptid-harpikser spaltes med hydrogenfluorid, ekstraheres og analyseres for renhed ved væskechromatografi med høj ydeevne ved anvendelse af en "omvendt fase-C18-søjle" fra Waters Associates, Milford, MA.
25 Aminosyrerestsekvensen af polypeptid p5, som er afledt af sekevensen af et HIV-2-isolat, er vist i tabel I i del C. For at lette sammenligningen er aminosyrerestsekvensen af polypeptider pi, p2, p3 og p4, som er afledt af 4 forskellige HIV-l-isolater, vist i Tabel II.
30
TABEk.JI
Peptid- Aminosyrerestsekvensa
betegnelse 122A££Z££10HI2 p2 LGIWGCSGKL I C
35 pi -b-L--------- p3 _H »- P4 --M------H - - DK 173905 B1 26 a Aminosyrerestsekvensen af hvert polypeptid svarer til en del af en kendt HIV-l-gp41-aminosyrerestsekvens.
5 ^ En streg angiver, at aminosyreresten er dem samme, som findes i den samme stilling som i polypeptid-p2-sekvensen, hvorimod tilstedeværelsen af en aminosyre, som er forskellig fra den i p2-sekvensen fundne, er angivet ved det bogstav, som svarer til den forskellige eller "substituerede" rest.
10 Således har pi en aminosyrerestsekvens, som er identisk med p2’s, bortset fra en erstatning af isoleucin med leucin ved reststilling nr. 3.
2. ELISA-svstem og -fremgangsmåde 15 Ét hundrede mikroliter (μΐ) fosfat-pufret saltopløs ning (PBS) indeholdende 1 mikrogram (ug) polypeptid pi, p2, p3, p4 eller p5 blandes i fordybningerne af polyvinyl-mikro-titerplader med 96 fordybninger (Microtest III, Falcon). Pladerne opbevares derpå i ca. 16 timer ved 37”c for at 20 tillade at PBS inddamper, og polypeptiderne absorberes på (overtrækkes ved operativt at binde dertil) fordybningernes vægge. Ét hundrede og halvtreds μΐ ELISA-fortyndingsmiddel [PBS indeholdende 0,2% polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat (Tween 20), 10% varme-inaktiveret føtalt kalveserum (FCS) og 25 0,5 millimol (mM) thimerosal] blandes derpå i hver fordybning for at blokere overskydende proteinbindingssteder.
Efter at have opbevaret de fortyndingsmiddel-indeholdende fordybninger i 1 time ved ca. 23 °C fjernes fortyndingsmidlet ved omrystning eller sugning, hvilket giver et 30 diagnostisk system ifølge opfindelsen, dvs. en mikrotiter-pladefordybning med et polypeptid ifølge opfindelsen operativt fæstnet til dets indre vægge (en polypeptid-overtrukket fordybning).
Ét hundrede μΐ af hvert serum fortyndet 1:64 i ELISA-35 fortyndingsmiddel blandes i en polypeptid-overtrukket fordybning. Den fremkomne fast-væskefaseimmunreaktionsblanding opbevares ved ca. 23'C i 90 minutter for at tillade dannelse af polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukter. De fortyndede sera fjernes derpå fra fordybningerne ved sugning 40 ved anvendelse af en ELISA-vasker (Immuno Wash 12, Nunc).
DK 173905 B1 27
Hver fordybning vaskes derpå 4 gange med ELISA-vask (PBS indeholdende 0,2% Tween 20) og suges ter.
Ét hundrede μΐ peberrods-peroxidase-mærket gede-anti-humant IgG, affinitets-renset, fra Boehringer Mannheim 5 Biochemicals fortyndet 1:30.000 i PBS indeholdende 10% varme-inaktiveret FCS og 0,5 mM thimersol, blandes derpå i hver fordybning. Den fremkomne mærke-reaktionsblanding holdes i 90 minutter ved ca. 23'C for at tillade dannelse af poly-peptid-indeholdende mærkede komplekser. Det uomsatte mærkede 10 antistof fjernes ved omrystning, og hver fordybning vaskes og suges tør, som allerede beskrevet.
Ét hundrede μΐ chromogen substratopløsning [citratpuffer (500 ml af ioniseret vand indeholdende 5,0 g vandfri citronsyre og 7,0 g Na2HP04, pH 5) indeholdende 0,4 mg/rol 15 o-phenylendiamin (OPD) og 0,01% H202] blandes i hver fordybning til dannelse af en fremkaldelses-reaktionsblanding.
Efter at have opbevaret fremkaldelses-reaktionsblandingen i 30 minutter ved ca. 23 *C, blandes 100 μΐ 1M HC1 i hver fordybning for at standse fremkaldelsesreaktionen. De fremkomne 20 opløsninger prøves for absorberbarhed ved 492 nanometer (OD492) ved anvendelse af en ELISA-læser fra Titertek Multiscan, Flow Laboratories, Inglewood, Californien. Sero-positivitet (HIV-infektion) defineres som enhver OD492-værdi, der er større end OD492-gennemsnitsværdien plus 3 standard-25 afvigelser af 24 normale kontrolsera (ikke-inficeret). Alle sera analyseres mindst 3 gange.
Sera fra HIV-l-inficerede patienter fra USA opsamledes i San Diego, Californien (n=84) og ved Centers for Disease Control (CDC) overalt i USA (n«79). Panelet af 40 HIV-1-30 positive sera omfatter prøver fra 12 asymptomatiske seropositive patienter (CDC gruppe II), 13 patienter med generel lymfoedemopati (CDC gruppe III) eller AI DS-relateret kompleks ARC; CDC gruppe IV-A) og 15 patienter med åbenbar AIDS (CDC gruppe IV-C eller IV-D). Se Centers for Disease 35 Control, Morbid. Mortal Weekly Rep.. 35:334 (1976).
Sera fra zairiske HIV-l-inf icerede patienter og sunde, DK 173905 B1 28 normale zairiske kontrolprøver opsamledes i Kinshasa i 1983 og karakteriseres ved Brun-Vezinet med flere, Science.
226:453 (1984).
De HIV-2-positive sera opsamledes i Guinea Bissau i 5 1980 og karakteriseres ved immunoblott ing og immunofluorescens mod HIV-1-, HIV-2- og STLV-antigener.
Fultz et al, Third International conference on AIDS, abstract MP.72 (1987).
Alle serumprøver kodes, inddeles i aliquoter og op-10 bevares ved -20*C.
Resultaterne af analyse af de ovenfor beskrevne sera for tilstedeverelsen af anti-HIV-antistoffer ved anvendelse af polypeptider pi, p2, p3, p4 og p5 er vist i tabel III.
Af tabel III fremgår det, at polypeptid p2, hvis 15 aminosyrerestsekvens er homolog med de 12 rester i peptid 39's carboxy-ende, beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.629.783, immunreageres med 100% af de HIV-l-inficerede sera fra patienter fra USA, men kun 88,2% af de zairiske Ηΐν-1-inficerede sera påvises.
20 DK 173905 B1 29
TABEL III
Karakterisering af sera fra zairiske AIDS-patienter ELISA-antigener 5 HIV Western Helt
Serum Kultur blot virus pi p2 p3 p4 p5 Z-9 + p24+,p41+/- + -a + + + Z-23 + p24+,p41+/- + + + Z-24 + p25+ + + + + + 10 Z-29 + NDb + + + Z-31 + p24+,p41+ + + + + + - Z-34 + p24+,p41- + + + Z-47 + p24+,p41- + + +
Z-50 - p24+ , p41+ + + + ND
15 Z-51 - p41+ + + + + + Z-52 + p25+,p41+ + + + + + p60+ Z-68 +ND ++ + - + - Z—72 + p25+ + + + + + 20 Z-75 + pl8+,p25+ + + + + + p41+,p60+ Z-81 + pl8+,p25+ + + + + + p41+,p60+ 25 a + = positiv; - = negativ (afslutning af positivitet for peptidet ELISA angives som den gennemsnitlige OD492 plus 3 standardafvigelser for et panel på 24 negative kontrolsera.
Pr over mærkes som positive eller negative 30 ved en serumfortynding på 1:64).
b ND = ikke udfort, utilstrækkelig mængde prøver.
På lignende måde immunomsættes polypeptid pi, hvis aminosyrerestsekvens indeholder en erstatning af isoleucin 35 med leucin, i forhold til polypeptid p2, med 99,4% af de HIV-l-inficerede USA-sera, men kun 86,8% af de HIV-l-in- DK 173905 B1 30 ficerede zairiske sera.
I modsætning til polypeptider pi og p2 viser de i tabel III angivne resultater, at de her omhandlede polypeptider, dvs. polypeptider p3 og p4, påviser anti-HIV-l-TMP-5 antistoffer i henholdsvis 94,1% og 97,1% af de analyserede zairiske AIDS-sera. Forskellen i grad af sensitivitet mellem de her omhandlede polypeptider og polypeptider pi og p2 er uventet, fordi l) polypeptider pi og p2 synes at have ækvivalent sensitivitet over for HIV-l-TMP-antistoffer i både 10 USA-sera og zairiske sera, og 2) aminosyrerestsekvenserne for polypeptider pi, p3 og p4 og er alle afledt af zairiske HIV-l-isolater, men de har uventede forskellige i sensitivitet over for anti-HIV-l-TMP-antistoffer.
Grunden eller grundene til de ovenfor beskrevne for-15 skelle i sensitivitet er ukendte. Disse forskelle viser dog, at polypeptider p3 og/eller p4 kan anvendes sammen med polypeptider, såsom pi og p2, for at opnå en større grad af sensitivitet over for kontakt roed HIV-l. Desuden viser de i tabel III angivne forskelle i sensitivitet, at et polypeptid 20 ifølge opfindelsen kan anvendes kombineret med et HIV-2-specifikt polypeptid, såsom p5, for at opnå en højere grad af sensitivitet over for kontakt med HIV-l eller HIV-2, end der opnås ved anvendelse af et HIV-2 afledt af polypeptid alene.
25 Fem af de zairiske AIDS-sera, som ikke reagerer med polypeptid pi, 1, som ikke reagerer med hverken polypeptid p3 eller p4, og 8, som reagerer med pi og p4, analyseres for tilstedeværelsen af infektiøst HIV-l ved dyrkningsmetoden beskrevet af McCormick et al, Am. J. Trop. Med. Hvq.. 36:102 30 (1987). Desuden analyseres disse sera for tilstedeværelsen af anti-HIV-l-antistoffer ved anvendelse af et kommercielt ELISA-diagnostisk system, som anvender hele virus (viralt lysat) antigener (Litton Bionetics, Kensington, MD) og for antistoffer over for specifikke HIV-l-proteiner ved Western 35 immunblotting ved anvendelse af HIV-l-stammen 451 som antigenkilde. Resultaterne af disse analyser, vist i tabel IV, DK 173905 B1 31 viser, at polypeptider p3 og p4 reagerer med alle 5 zairiske sera, som er ikke-reaktive med polypeptid pi. Da alle 5 polypeptid pl-negative sera viser sig at indeholde infektiøst HIV-1, men er negative eller tvivlsomme ved Western blotting-5 analyse, repræsenterer de her omhandlede diagnostiske systemer desuden immunanalysesystemer med forbedret sensitivitet over for anti-HIV-l-TMP-antistoffer.
3. Antistofdannelse oa 10 neutraliserinasanalvse
Polypeptid pi kobles til nøglehuls-albueskæl-hæmo-cyanin (KLH) bærestofprotein gennem carboxy-endecysteinresten ved anvendelse af den tværbindende m-meleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester ved metoden beskrevet af Lin med 15 flere, Biochem. 18:690-697 (1979). Efter preimmunisering fås seraprøver, to kaniner injiceres hver især dag 0 på seks subcutane steder med 250 Mg koblet polypeptid emulgeret i 1 ml komplet Freund's hjælpestof. Den 14. dag injiceres kaninerne subcutant med 250 Mg koblet polypeptid i ukomplet 20 Freund's hjælpestof. Den 21. dag injiceres de intraperito-nealt med 250 μg koblet polypeptid i 1 ml alunsuspension. Kaninsera opsamles 7. og 14 dag efter den tredje injektion og opbevares ved -20*C. Antistofniveauer bestemmes ved ELISA-metoden fra eksempel 2.
25 Kanin-anti-polypeptid-pl-antiseras evne til at neu tralisere HIV-l-infektivitet bestemmes ved revers transcriptase- (RT) -aktivitetsanalyse i lighed med den af Chanh et al beskrevne, EMBO. 5:3065-71 (1986). Resultaterne af denne i tabel IV viste undersøgelse angiver, at immunisering med 30 et inoculum ifølge opfindelsen forårsager HIV-l-neutralise-rende antistoffer.
DK 173905 B1 32
TABEL IV
Kanin-anti-polypeptid %-inhibering*3 gerumnummer CPMaXl03 af RT-virknino 5 V3343 12.246 95 V3344 55.202 77
Kontrol0 218.210
Kontrol 264.122 10 a CPM = tællinger pr. minut af [3H]TPP.
k %-inhibering af RT-virkning (Ineutralisering) = CPM-RT-analyse af anti-polypeptidantiserum 1- [_] X 100%
Gennemsnitlig CPM RT-analyse af kontrolsera 15 c Kontrol = præimmunt kaninserum.
Den foregående beskrivelse, inklusive de specifikke udførelsesformer oa eksempler, tjener til belysning af den foreliggende opfindelse uden at begrænse denne dertil. Ad-20 skillige andre varianter og modifikationer kan gennemføres uden af afvige fra omfanget af den foreliggende opfindelse.
Claims (13)
1. Polypeptid, kendetegnet ved, at det hovedsagelig består af 12 aminosyrerester »ed en aminosyrerest-sekvens »ed formlen 5 LGZWGCSGKHIC, hvori Z er enten isoleucin eller methionin.
2. Præparat, kendetegnet ved, at det omfatter 10 mindst to polypeptider, hvori et første af polypeptiderne hovedsagelig består af 12 aminosyrerester med en sekvens med formlen: LGZWGCSGKHIC, 15 hvori Z er enten isoleucin eller methionin, og et andet af polypeptiderne er i stand til at immunreagere med antistoffer forårsaget af et humant immundefektvirus.
3. Præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, 20 at et andet af polypeptiderne har en aminosyrerestsekvens med en formel valgt blandt LGLWGCSGKLIC, LGIWGCSGKLIC og
25 NGWGCAFRQVC.
4. Fremgangsmåde til analyse for tilstedeværelsen af anti-HIV-l-antistoffer i en legemsvæskeprøve, kendetegnet ved, at a) der dannes en immunreaktionsblanding ved at blande 30 en legemsvæskeprøve med et polypeptid bestående hovedsagelig af 12 aminosyrerester med en sekvens med formlen: LGZWGCSGKHIC, 35 hvori z er enten isoleucin eller methionin; b) immunreaktionsblandingen opbevares under biologiske DK 173905 B1 analysebetingelser i et tidsrum tilstrækkelig langt til, at eventuelle anti-HIV-l-antistoffer til stede i prøven kan immunreagere med polypeptidet og danne et polypeptid-inde-holdende immunreaktionsprodukt; og 5 c) der analyseres for tilstedeværelsen af eventuelt dannet polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt og således tilstedeværelsen af eventuelle anti-HIV-l-antistoffer i prøven.
5. Fremgangsmåde til analyse for tilstedeværelsen af 10 anti-HIV-antistoffer i en legemsvæskeprøve, kendeteg net ved, at (a) der dannes en immunreaktionsblanding ved at blande en legemsvæskeprøve med et præparat omfattende en blanding af mindst to polypeptider, hvori det første af polypeptideme 15 hovedsagelig består af 12 aminosyrerester og har en sekvens med formlen: LGZWGCSGKHIC 20 hvori Z er enten isoleucin eller methionin, og et andet af polypeptideme har formlen valgt blandt: LGLWGCSGKLIC, LGIWGCSGKLIC og
25 NGWGCAFRQVC; b) immunreaktionsblandingen holdes under biologiske analysebetingelser i tilstrækkelig lang tid til, at eventuelle anti-HIV-antistoffer til stede i prøven kan immun- 30 reagere med polypeptidet og danne et polypeptid-indeholdende immunreakt ionsprodukt; og c) der analyseres for tilstedeværelsen af et eventuelt dannet polypeptid-indeholdende immunreaktionsprodukt og således tilstedeværelsen af eventuelle anti-HIV-antistoffer 35. prøven. DK 173905 B1
6. Diagnostisk system i form af et sæt til analyse for tilstedeværelsen af anti-HIV-i-antistoffer i en legems-væskeprøve, kendetegnet ved, at det omfatter en pakke indeholdende et polypeptid med en aminosyrerestsekvens 5 med formlen: LGZWGCSGKHIC, hvori Z er enten isoleucin eller methionin.
7. Diagnostisk system i form af et sæt til analyse for tilstedeværelsen af anti-HIV-antistoffer i en legems-væskeprøve, kendetegnet ved, at det omfatter en pakke indeholdende mindst to polypeptider, hvori et første af polypeptiderne har en aminosyrerestsekvens med formlen: 15 LGZWGCSGKHIC, hvori Z er enten isoleucin eller methionin, og et andet af polypeptiderne er i stand til at immunreagere 20 med antistoffer forårsaget af et humant immundefektvirus.
8. Diagnostisk system ifølge krav 11, kendetegnet ved, .at det andet af polypeptiderne har en aminosyrerestsekvens med formlen valgt blandt:
25 LGLWGCSGKLIC, LGIWGCSGKLIC og NSWGCAFRQVC. 1
35 LGZWGCSGKHIC Diagnostisk system i form af et sæt, kende-30 tegnet ved, at det omfatter: (a) en første fast understøtning omfattet af en fast matrix, hvortil der operativt er fæstnet et polypeptid med en aminosyrerestsekvens med formlen: DK 173905 B1 hvori Z er enten isoleucin eller methionin; og (b) en anden fast understøtning omfattet af en fast matrix, hvortil der operativt er fæstnet et polypeptid med en aminosyrerestsekvens med en formel valgt blandt: 5 LGLWGCSGKLIC, LGIWGCSGKLIC og NSWGCAFRQVC.
10. Diagnostisk system i form af et sæt, kende tegnet ved, at det indeholder: (a) en ferste fast understetning omfattet af en fast matrix, hvortil der operativt er fæstnet en blanding af mindst to polypeptider, hvori et ferste af polypeptiderne 15 har en aminosyrerestsekvens med formlen LGZWGCSGKHIC hvori Z er enten isoleucin eller roethionin, 20 og et andet af polypeptiderne har en aminosyrerestsekvens med en formel valgt blandt: LGLWGCSGKLIC og LGIWGCSGKLIC 25 og (b) en anden fast understøtning omfattet af en fast matrix, hvortil der operativt er fæstnet et polypeptid med en aminosyrerestsekvens med formlen: 30 NSWGCAFRQVC.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8806787A | 1987-08-21 | 1987-08-21 | |
US8806787 | 1987-08-21 | ||
PCT/US1988/002870 WO1989001494A1 (en) | 1987-08-21 | 1988-08-19 | Hiv-1-related polypeptides, diagnostic systems and assay methods |
US8802870 | 1988-08-19 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK193189A DK193189A (da) | 1989-04-20 |
DK193189D0 DK193189D0 (da) | 1989-04-20 |
DK173905B1 true DK173905B1 (da) | 2002-02-11 |
Family
ID=22209204
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198901931A DK173905B1 (da) | 1987-08-21 | 1989-04-20 | HIV-beslægtede polypeptider, diagnostiske systemer og analysemetoder |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0329761B1 (da) |
JP (1) | JP2902658B2 (da) |
AU (1) | AU614543B2 (da) |
DE (1) | DE3886032T2 (da) |
DK (1) | DK173905B1 (da) |
FI (1) | FI95274C (da) |
NO (1) | NO177536C (da) |
WO (1) | WO1989001494A1 (da) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8828098D0 (en) * | 1988-12-01 | 1989-01-05 | Wellcome Found | Peptides |
US6248574B1 (en) | 1989-12-13 | 2001-06-19 | Avigdor Shaffermann | Polypeptides selectively reactive with antibodies against human immunodeficiency virus and vaccines comprising the polypeptides |
FR2732346B1 (fr) * | 1995-03-27 | 1997-05-30 | Centre Nat Rech Scient | Proteines mutees, codees par un gene env mute de lentivirus, fragments peptidiques inclus dans lesdites proteines, vecteurs d'expression exprimant lesdites proteines mutees et leurs applications |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4629783A (en) * | 1985-04-29 | 1986-12-16 | Genetic Systems Corporation | Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease |
AU614521B2 (en) * | 1987-04-16 | 1991-09-05 | Johnson & Johnson | Stlv-iii-related polypeptides, diagnostic systems and assay methods |
-
1988
- 1988-08-19 WO PCT/US1988/002870 patent/WO1989001494A1/en active IP Right Grant
- 1988-08-19 JP JP63507309A patent/JP2902658B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-19 DE DE3886032T patent/DE3886032T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-19 AU AU23021/88A patent/AU614543B2/en not_active Expired
- 1988-08-19 EP EP19880907953 patent/EP0329761B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-20 DK DK198901931A patent/DK173905B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-04-20 FI FI891898A patent/FI95274C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-04-20 NO NO891635A patent/NO177536C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1989001494A1 (en) | 1989-02-23 |
JP2902658B2 (ja) | 1999-06-07 |
FI891898A0 (fi) | 1989-04-20 |
AU2302188A (en) | 1989-03-09 |
NO891635L (no) | 1989-06-20 |
FI95274B (fi) | 1995-09-29 |
FI95274C (fi) | 1996-01-10 |
NO177536B (no) | 1995-06-26 |
DK193189A (da) | 1989-04-20 |
DE3886032T2 (de) | 1994-06-16 |
NO177536C (no) | 1995-10-04 |
EP0329761A1 (en) | 1989-08-30 |
EP0329761A4 (en) | 1990-09-26 |
DK193189D0 (da) | 1989-04-20 |
EP0329761B1 (en) | 1993-12-01 |
DE3886032D1 (de) | 1994-01-13 |
AU614543B2 (en) | 1991-09-05 |
JPH02500597A (ja) | 1990-03-01 |
NO891635D0 (no) | 1989-04-20 |
FI891898A (fi) | 1989-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rusche et al. | Antibodies that inhibit fusion of human immunodeficiency virus-infected cells bind a 24-amino acid sequence of the viral envelope, gp120. | |
FI91073C (fi) | Parannettu menetelmä ja peptidi AIDS-sukuisten tautien osoittamiseksi | |
EP0261224B1 (en) | Synthetic htlv-iii peptides, compositions and uses thereof | |
EP0339504A2 (en) | Human immunodeficiency virus (HIV) env-coded peptide capable of eliciting HIV-inhibiting antibodies in mammals | |
Laman et al. | Variant-specific monoclonal and group-specific polyclonal human immunodeficiency virus type 1 neutralizing antibodies raised with synthetic peptides from the gp120 third variable domain | |
JP3356280B2 (ja) | 哺乳動物免疫不全ウイルスの検出 | |
US5777074A (en) | Human monoclonal antibodies directed against the transmembrane glycoprotein (GP41) of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) | |
US5670309A (en) | Methods and diagnostic kits for the detections of HIV-2-specific antibodies employing polypeptides obtained from the simian immunodeficiency virus | |
FI101797B (fi) | STLV-III-virukseen liittyvät polypeptidit, diagnostiset järjestelmät j a määritysmenetelmät | |
DE3850593T2 (de) | Synthetische Antigene zur Bestimmung der AIDS-bezogenen, von LAV-2 verursachten Krankheiten. | |
DK173905B1 (da) | HIV-beslægtede polypeptider, diagnostiske systemer og analysemetoder | |
Boucher et al. | Immune response and epitope mapping of a candidate HIV‐1 p17 vaccine HGP30 | |
CA2105664C (en) | Polypeptides derived from the human immunodeficiency virus endonuclease protein | |
Bugge et al. | Analysis of a highly immunodominant epitope in the human immunodeficiency virus type 1 transmembrane glycoprotein, gp41, defined by a human monoclonal antibody | |
AU753780B2 (en) | Synthetic antigen for the detection of antibodies immunoreactive with HIV virus | |
US6083504A (en) | Human monoclonal antibodies directed against the transmembrane glycoprotein (GP41) of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) | |
ES2302236T3 (es) | Peptidos del vhi-1 modificados y su uso en la deteccion de anticuerpos anti-vih. | |
US5562905A (en) | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals | |
NO176022B (no) | Analogifremgangsmåte til fremstilling av små peptider som hindrer binding til T4-reseptorer og virker som immunorganer | |
AU6655300A (en) | Compositions and methods for treating infections | |
JPS63500353A (ja) | ヒトtリンパ球指向性ウイルス3からのsor遺伝子生産物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B1 | Patent granted (law 1993) | ||
PUP | Patent expired |