NO177536B - HIV-1-relaterte polypeptider, preparat som omfatter en blanding med minst to polypeptider, samt diagnostisk system og anvendelse av et polypeptid for måling av anti-HIV-1-antistoffer - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye polypeptider relatert til humant immunmangelvirus type 1 (HIV-1), preparat omfattende en blanding av minst to polypeptider, anvendelse av et slikt polypeptid til å måle nærværet av anti-HIV-l-antistoffer i kroppsvæskeprøve samt diagnostiske systemer for det samme formål.

Bakgrunn

Det overførbare immunmangelsyndrom (AIDS) har nå spredd seg over hele verden og synes å være et akutt offentlig helseproblem, særlig i Afrika. Et retrovirus betegnet humant immunmangelvirus type 1 (HIV-1), men tidligere kjent som LAV, HTLV-III eller ARV, er blitt vist å forårsake AIDS i de forskjellige områder berørt-av epidemiene, inklusive Nord-Amerika, Vest-Europa og Sentral-Afrika.

Studier over HIV-1 på molekylnivå har avslørt visse forskjeller i nucleotidsekvensen i nordamerikanske og afrikanske isolater. Imidlertid synes de nordamerikanske, vesteuropeiske og sentralafrikanske isolater å ha lignende biologiske egenskaper og antigent kryssreaktive proteiner med samme relative molekylmasse.

Individer som ble infisert med HIV-1, utviklet antistoffer til gag-genet som kodet for virale kjerneproteiner betegnet pl9, p24, og til deres forløperprotein betegnet p55. I tillegg er det observert antistoffer mot env-genet som kodet for kapselglycoproteinene pgl20 (det ekstracellulære glycoprotein eller EGP), gp41 (trans-membranproteinet eller TMP) og deres forløperglycoprotein betegnet gpl60.

Et stort antall av AIDS-pasienter viser en forsvinning av antistoffer til HIV-l-kjerneproteiner ved et fremskredet stadium av sykdommen, men beholder antistoffene som er immunreaktive mot kapselantigenene. Kapselproduktene blir regelmessig oppdaget ved antistoffer i sera fra pasienter på forskjellige stadier i HIV-l-infeksjonen.

Skjønt få rapporter er tilgjengelige når det gjelder serooverføring til HIV-1, synes utviklingen av antistoffer til kapselproteinet i tid å komme frem kort før antistoffene til kjerneproteiner. Se Carlson et al., Lancet, i:361:362,

(1987). Av disse grunner har bruken av antigener som representerer env-genproduktene, betydelig viktighet i diagnosen av eksponering til AIDS-relaterte retrovirus.

Fordi AIDS kan bli overført ved blodprodukter, har det, fra den første anerkjennelse av sykdommen, vært en sterk drivkraft til å utvikle diagnostiske prøver for å teste blod for antistoffer eller antigener spesifikke for det infiserende virus. Anstrengelser på dette område har båret frukter, og ved slutten av 1985 har fem selskaper fått godkjennelse til å markedsføre analyser for å oppdage antistoffer til HIV-l-virus. Disse analyser beror alle når det gjelder oppdagelse av disse antistoffer, på bruk av virale proteiner som er oppnådd fra dyrkede HIV-infiserte T-lymfocytter. Viruset som oppnås fra de dyrkede celler, blir løst opp (f.eks. med detergent), og en væske (kalt "det virale lysat") oppnås. Dette lysat (som inneholder en rekke fragmenter av viralt og cellulært protein) blir så typisk benyttet som den stasjonære fasekomponent i en immunassay.

Mens de eksisterende tester på en signifikant måte synes å ha redusert overføringen av HIV-1 via blodprodukter, har visse viruslysat-baserte tester betydelige ulemper, deriblant resultater som indikerer en høy frekvens av falske positive resultater. De falske positive resultater antas delvis å skyldes nærvær av ikke-virale proteiner i viruslysatpreparatene benyttet i den stasjonære fasekomponenten i de foreliggende analyser.

I et forsøk på å redusere frekvensen av falske positive resultater har faget begynt å utvikle sete-rettede serologiske tester som benytter syntetiske polypeptider som etterligner naturlig forekommende antigene determinanter på virale proteiner. F.eks. beskriver U.S. patentskrift nr. 4.629.783 til Cosand, Wang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:6159-6163 (1986), og Kennedy et al., Science, 231:1556-1559 (1986), beskriver flere polypeptider som er hevdet å være i stand til å etterligne antigene determinanter dannet av forskjellige HIV-l-proteiner, inkludert TMP (gp41).

Mer spesifikt beskriver patentet til Cosand et al 26 aminosyrerestpolypeptid, betegnet polypeptid 39, hvis sekvens ble oppnådd fra TMP-sekvensen til HIV-l-isolatet beskrevet av Wain-Hobson et al., Cell, 40:9-15 (1985). Cosand-patentet inneholder data som antyder at polypeptid 39 kan oppdage antistoffer indusert av HIV-1 TMP i sera av ikke-identifisert geografisk opprinnelse.

Peptid nr. 8 referert til av Wang et al., supra, inneholder 21 aminosyreerester som korresponderer i sekvens til TMP-restene 586-606 til HIV-l-sekvensen rapportert av Råtner et al., Nature, 313:277-284 (1985). Ifølge Wang et al. kan polypeptid 8 oppdage anti-HIV-l-TMP-antistoffer i sera oppsamlet fra individer i De forente stater. Videre rapporterte Wang et al. at analoger til polypeptid 8 som inneholder konservative substitusjoner der valin erstatter isoleucin ved posisjon 587 og arginin erstatter lysin i posisjon 596, som kan finnes i visse virusisolater, ikke affiserte den humane antistoffbinding til disse analoger meget.

Mer nylig rapporterte Gnann et al., J. Infect. Dis., 156:261-267 (1987), at et polypeptid oppnådd fra TMP-aminosyrerestsekvensen til Wiley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:5038 (1986), kan oppdage anti-HIV-1 TMP-antistoffer i serumprøvene til omtrent 100% av amerikanske AIDS-pasienter, men kan oppdage disse antistoffene i bare omtrent 84% av de zairske AIDS-pasienter.

I tillegg til deres bruk som diagnostiske reagenser har Fischinger et al., Cancer Res., 45:46945-6995

(1985) antydet at syntetiske polypeptider kan bli benyttet som vaksinekomponenter for HIV. Denne fremgangsmåte til AIDS-prevensjon og terapi er antydet i rapporten til Chanh et al., EMB0, 5:3065-71 (1986) hvor et polypeptid som har en aminosyrerestsekvens som korresponderer til TMP-restene 503 til 532 av den HIV-l-isolerte sekvens rapportert av Muesing et al., Nature, 313:450 (1985), ble funnet å være i stand til å indusere HIV-nøytraliserende antistoffer i kanin. Gnann et al., J. Virol., 61:2639-41 (1987), rappor-terer et lignende resultat der de benytter et polypeptid som korresponderer til restene 598-609 av HIV-l-isolatet til Wain-Hobson et al., supra.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

To spesifikke polypeptider som har en forbedret evne til å påvise anti-HIV-l-antistoffer i kroppsprøver fra sentralafrikanere, er blitt oppdaget. Således beskriver den foreliggende oppfinnelse et polypeptid som består av hovedsakelig 12 aminosyrerester som har en sekvens representert ved formelen:

hvor Z er enten isoleucin eller methionin.

Også beskrevet er et preparat som består av en blanding av minst to polypeptider der det første av polypeptidene har en aminosyrerestsekvens med formel: hvor Z er enten isoleucin eller methionin, og der det andre polypeptidet har en formel valgt fra gruppen bestående av:

Videre beskrevet er en anvendelse av et polypeptid til å måle nærværet av anti-HIV-l-antistoffer i en kropps-væskeprøve. En immunreaksjonsblanding dannes ved å blande en kroppsvæskeprøve med et polypeptid med formelen:

hvor Z er enten isoleucin eller methionin,

og eventuelt et annet av nevnte polypeptider vist ved en formel valgt fra gruppen som består av

Immunreaksjonsblandingen som dannes på denne måte, blir holdt ved biologiske testbetingelser i en tidsperiode tilstrekkelig for at ethvert anti-HIV-antistoff til stede i prøven, kan immunreagere med et polypeptid i preparatet og danne et polypeptidholdig immunreaksjonsprodukt.

Nærværet av ethvert polypeptidholdig immunreak-sj onsprodukt som dannes, blir så bestemt og derved nærværet av ethvert anti-HIV—antistoff i prøven.

Også beskrevet er et diagnostisk system i kitform for å måle nærværet av anti-HIV-l-antistoffer i en kroppsvæskeprøve, som består av en pakke som inneholder et polypeptid med formelen:

hvor Z er enten isoleucin eller methionin,

og eventuelt et annet polypeptid vist ved en formel som er valgt fra gruppen som består av:

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisj oner

Aminosyre: Alle aminosyrerester identifisert herved, er i den naturlige L-konfigurasjon. I henhold til standard polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243:3557-59,

(1969), er forkortelser for aminosyrerester vist i den følgende synonymtabell:

SYNONYMTABELL

Det bør bemerkes at alle aminosyrerestsekvensene er representert herved i formlene hvis venstre- til høyre-orientering er i den vanlige retning fra aminoenden til carboxyenden. Videre bør det bemerkes at en bindestrek ved begynnelsen eller slutten av en aminosyrerestsekvens indikerer et bånd til en videre sekvens av én eller flere aminosyrerester opp til en total av omtrent femti rester i polypeptidkj eden.

Polypeptid og peptid: Polypeptid og peptid er betegnelser benyttet herved om hverandre for å vise til en lineær serie av ikke flere enn omtrent 50 aminosyrerester bundet til hverandre med peptidbånd mellom alfa-amino- og carboxygruppene på tilliggende rester.

Protein: Protein er en betegnelse brukt herved for å beskrive en lineær serie av mer enn 50 aminosyrerester bundet til hverandre som i et polypeptid.

B. Polypeptider

Et polypeptid ifølge den foreliggende oppfinnelse består hovedsakelig av 12 aminosyrerester som har en sekvens som er representert ved formelen

LGZWGCSGKHIC,

der Z er enten isoleucin (I) eller methionin (M).

Peptidene ifølge oppfinnelsen inneholder minst to cysteinrester. Følgelig kan de nevnte peptider eksistere i forskjellige oxydasjonsformer. I tillegg til den monomere form i hvilken sulfhydrylgruppen i cysteinrestene er redusert, kan også dimere eller polymere former eksistere i hvilke sulfhydrylgrupper på to eller flere peptidmolekyler blir oxydert og danner inter- og intrapeptiddisulfid-bindinger. Fordi polypeptidene ifølge den foreliggende oppfinnelse har to cysteinrester, kan de danne cykliske monomerer eller lineære eller cykliske dimerer og lineære polymerer av varierende lengder. Disse forskjellige oxydasjonsformer blir betraktet som del av den foreliggende oppfinnelse og er inkludert i betegnelsen "polypeptider" og "peptider".

Et polypeptid ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli syntetisert ved enhver av de teknikker som er kjent for dem som er erfarne i polypeptidfaget, inkludert rekombinante DNA-teknikker. Syntetiske, kjemiske teknikker, slik som stasjonær fase Merrifield-type syntese, blir foretrukket av renhetsårsaker, antigenspesifisitet, fravær av ikke ønskede biprodukter, letthet med hensyn til produksjon og lignende. En utmerket oppsummering av de mange tilgjengelige teknikker kan bli funnet i J.M. Steward og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 2. utg., 1976 og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983, for stasjonær fase peptidsyntese, og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", vol. 1, Academic Press (New York), 1965, for klassisk syntese i løsning, hver av disse er inkorporert herved ved referanse. Passende protektive grupper som er brukbare til slik syntese, er beskrevet i de ovenfor nevnte tekster og i J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, som er innbefattet herved ved referanse.

I tillegg omfatter disse metodene den sekvensielle (trinn for trinn) tilførsel av én eller flere aminosyrerester eller passende beskyttede aminosyrerester til en voksende peptidkjede. Normalt er enten amino- eller carboxylgruppen av den første aminosyrerest beskyttet ved en passende, selektiv beskyttelsesgruppe som kan fjernes. En forskjellig, selektiv beskyttelsesgruppe som kan fjernes, blir benyttet for aminosyrer som inneholder en reaktiv sidegruppe slik som lysin.

Når det brukes en stasjonær fasesyntese som eksempel, bindes den beskyttede eller derivatiserte aminosyre til et inert, stasjonært underlag gjennom dens ikke-beskyttede carboxyl- eller aminogruppe. Beskyttelsesgruppen til amino- eller carboxylgruppen blir så selektivt fjernet, og den neste aminosyre i sekvensen som har den komplementære (amino- eller carboxyl-) gruppe som er passende beskyttet, blandes til og reageres under betingelser som egner seg for å danne amidbindingen med resten som allerede er bundet til det stasjonære underlag. Beskyttelsesgruppen til amino- eller carboxylgruppen blir så fjernet fra den nylig tilførte aminosyrerest, og den neste aminosyre (passende beskyttet) blir så tilført, og så videre. Etter at alle de ønskede aminosyrer er blitt bundet i den rette sekvens, fjernes enhver gjenværende ende- og sidegruppe-beskyttelsesgruppe (og fast underlag) sekvensielt eller samtidig, for å tillate dannelsen av det endelige polypeptid.

Polypeptidene ifølge denne oppfinnelse inneholder omtrent 12 aminosyrerester bortsett fra hvor tilleggsrester er blitt addert ved begge ender for det formål å gi en "linker" ved hvilken polypeptidene ifølge denne oppfinnelse med letthet kan bli bundet til en markør eller stasjonær matriks, eller bærer. Markører, stasjonære matrikser og bærere som kan bli benyttet med polypeptidene ifølge denne oppfinnelse, er beskrevet nedenfor.

Aminosyrerestlinkere er vanligvis minst én rest og kan bli 40 eller flere rester, oftest 1 til 10 rester, og omfatter ikke sekvenser som etterligner epitoper til AIDS-induserende virus. Typiske aminosyrerester benyttet for binding, er tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyre og asparaginsyre,.eller lignende. I tillegg kan en polypeptid-sekvens ifølge denne oppfinnelse være forskjellig fra den naturlige sekvens ved at sekvensen er modifisert ved terminal-NH2-acylering, f.eks. acetylering, eller thio-glycolsyreamidering, ved terminal-carboxylamidering, f.eks. med ammoniakk, methylamin og lignende.

Når det er koplet til en bærer via en linker for å danne hva som er kjent i faget som et bærer-haptenkonjugat, er et polypeptid ifølge denne oppfinnelse i stand til å indusere antistoffer som immunreagerer med og nøytraliserer HIV-1.

C. Polypeptidblandinger

Den foreliggende oppfinnelse beskriver også et preparat som omfatter en blanding av minst to polypeptider der et av polypeptidene har en aminosyrerestsekvens som er representert ved formelen:

LGZWGCSGKHIC

hvor Z er enten isoleucin eller methionin, (dvs. er valgt fra gruppen p3 og p4 hvis respektive aminosyrerestsekvenser er vist i tabell 1). Et annet av polypeptidene til stede i blandingen, har typisk en aminosyrerestsekvens som korresponderer til en del av proteinet til et virus som forårsaker eller er assosiert med AIDS, slik som HIV-1, HIV-2 og lignende, og er i stand til å immunreagere med antistoffer indusert av nevnte protein. Det er mest å foretrekke at preparatet videre inneholder i blanding minst ett av polypeptidene pl, p2 og/eller p5, hvis aminosyrerestsekvens også er vist i tabell 1. Typisk foreligger de forskjellige polypeptidene som er til stede, i omkring ekvimolare mengder.

D. Inokula og metoder for å indusere HIV- 1-nøytraliserende antistoffer

Ordet "inokulum" i dets forskjellige grammatikalske former er brukt her for å beskrive et preparat som består av et farmasøytisk akseptabelt, vandig fortynningsmiddel som inneholder som en aktiv ingrediens for induksjon av HIV-l-nøytraliserende antistoffer, et polypeptid som har en aminosyrerestsekvens representert ved formelen:

LGBWGCSGKJIC,

der B er enten isoleucin (I), leucin (L) eller methionin (M), og J er enten histidin (H) eller leucin (L).

Foretrukne polypeptider som har aminosyrerestsekvenser representert ved den ovenstående formel, er pl, p2, p3 og p4. Således, når det er gitt i en immunologisk effektiv mengde, induserer et inokulum av foreliggende oppfinnelse antistoffer som immunreagerer med og nøytraliserer HIV-1.

Når et polypeptid blir brukt for å indusere antistoffer, er det å forstå at polypeptidet kan bli brukt alene, eller bundet til en bærer som et konjugat, eller som en polypeptidpolymer, men for å underlette uttrykket av de forskjellige utførelsesformer av polypeptidene i den foreliggende oppfinnelse blir de kollektivt referert til herved ved betegnelsen "polypeptid" og dens forskjellige grammatikalske former.

For et polypeptid som inneholder færre enn omtrent 35 aminosyrerester, er det å foretrekke å benytte peptidet bundet til en bærer for det formål å indusere produksjonen av antistoffer som allerede nevnt.

Som allerede nevnt, kan én eller flere ekstra aminosyrerester bli addert til amino- eller carboxyendene til polypeptidet for å underlette bindingen av polypeptidet til en bærer. Cysteinrester bundet til amino- eller carboxyendene til polypeptidene, er blitt funnet å være spesielt nyttige for å danne konjugater via disulfid-bindinger. Imidlertid kan andre metoder velkjente i faget for å utvikle 30 konjugater, også bli benyttet. Eksempler på andre bindingsprosedyrer inkluderer bruken av Michael addisjonsreaksjonsprodukter, dialdehyder slik som glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318-326 (1983) og lignende, eller bruken av 35 carbodiimid-teknologi som ved benyttelsen av et vannløselig carbodiimid for å danne amidbroer til bæreren. For en oversikt av proteinkonjugering eller kopling gjennom aktiverte, funksjonelle grupper, se Aurameas et al., Scand. J. Immunol., vol. 8, Supp-1. 7, 7-23 (1978).

Brukbare bærere er velkjente i faget og er generelt proteiner. Eksempler på slike bærer er "keyhole limpet" hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albuminer slik som bovint serumalbumin (BSA) eller humant serumalbumin (HSA), røde blodlegemer slik som saueerythrocytter (SRBC), tetanus toxoid, koleratoxoid, hepatitt B-virus-kjerne-partikler eller immunogene fragmenter av dette, såvel som polyaminosyrer slik som poly (D-lysin: D-glutaminsyre), og lignende.

Valget av bærer er mer avhengig av den endelige bruk av inokulatet og er basert på kriterier som ikke er spesielt innblandet i den foreliggende oppfinnelse. F.eks. bør en bærer som ikke utløser en uønsket reaksjon i det spesielle pattedyr som skal inokuleres, bli valgt.

Det foreliggende inokulum inneholder en effektiv, immunogen mengde av et polypeptid beskrevet i foreliggende oppfinnelse, og typisk som et konjugat bundet til en bærer. Den effektive mengde av polypeptider pr. enhetsdose avhenger bl.a. av arten av pattedyr inokulert, dyrets kroppsvekt og det valgte inokulasjonsregime slik det er velkjent i faget. Inokula inneholder typisk polypeptid-konsentrasjoner på omtrent 10 mikrogram til omtrent 500 milligram pr. inokulering (dose), fortrinnsvis omkring 50 mikrogram til omkring 50 milligram pr. dose.

Betegnelsen "enhetsdose" slik det refererer seg til inokulatet ifølge foreliggende oppfinnelse, refererer seg til fysisk små enheter som er passende som enhetsdoser for dyr, hver enhet inneholder en på forhånd bestemt mengde av aktivt materiale beregnet å gi den ønskede immunogene effekt i forbindelse med det foretrukne fortynningsmiddel, f.eks. bærer eller bæremiddel. Spesifikasjonene til den nye enhetsdose av et inokulum ifølge denne oppfinnelse er diktert av og er direkte avhengige av (a) de enestående karakteristika til det aktive materiale og den spesielle immunologiske effekt som skal oppnås, og (b) begrensningene som er iboende i faget for å utvikle slikt aktivt materiale for immunologisk bruk i dyr og i mennesker, slik som det er beskrevet i detalj her, idet dette er karakteristika for

den foreliggende oppfinnelse.

Inokula er typisk utviklet fra tørret, fast polypeptidkonjugat ved å løse opp polypeptidkonjugatet i et fysiologisk tålbart (aksepterbart) fortynningsmiddel slik som vann, saltvann eller fosfatbufret saltvann, for å gi en vandig løsning.

Inokula kan også inkludere en adjuvans som del av fortynningsmidlet. Adjuvans slik som fullstendig Freunds adjuvans (CFA), ufullstendig Freunds adjuvans (IFA) og alun, er materialer velkjente i faget og er tilgjengelige kommersielt fra flere kilder.

For å indusere HIV-l-virus-nøytraliserende antistoffer, blir en immunogen mengde av et inokulum av denne oppfinnelse gitt, typisk ved subkutan eller intramuskulær injeksjon, til et pattedyr slik som mus, kanin, geit, hest, menneske og lignende. Det tilførte (inokulerte) pattedyr blir så holdt i en tid som er tilstrekkelig for polypeptidet til stede som en aktiv ingrediens i inokulatet til å indusere nøytraliserende anti-HIV-l-antistoffer. Hvis ønskelig, kan antistoffene som blir således indusert, høstes og benyttes i preparater for diagnostiske tester og systemer for å oppdage HIV-1-TMP i kroppsprøver.

E. Antistoffer og antistoffblandinger

Betegnelsen "antistoff" i dens forskjellige grammatikalske former blir benyttet herved for å referere til immunglobulinmolekyler og immunologisk aktive deler av immunglobulinmolekyler, f.eks. molekyler som inneholder et antistoff-bindingssete eller "paratop". Eksempelvis er antistoffmolekyler intakte immunglobulinmolekyler, hovedsakelig intakte immunglobulinmolekyler, og de deler av et immunglobulinmolekyl som inneholder "paratopen", inkludert de deler kjent i faget som Fab, Fab<1>, F(ab')2 og F(v).

En antistoffblanding i forbindelse med den foreliggende . oppfinnelse er karakterisert ved at den inneholder HIV-l-nøytraliserende antistoffmolekyler som immunreagerer med et polypeptid av formelen: hvor Z er enten isoleucin eller methionin og J er histidin. Fortrinnsvis er polypeptidet p3 eller p4. Antistoffblandingen er videre karakterisert ved å være i hovedsak fri for antistoffer som immunreagerer med HIV-1 TMP-relaterte polypeptider med formelen:

En antistoffblanding i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse er typisk produsert ved å immunisere et pattedyr med et inokulum av denne oppfinnelse og derved indusere i pattedyret antistoffmolekyler som har den rette poly-peptidimmunspesifisitet. Antistoffmolekylene blir så samlet fra pattedyret og isolert i den grad det er ønskelig ved velkjente teknikker slik som f.eks. ved immunoaffinitetskromato-grafi. Antistoffblandingen som lages på denne måte, kan bli brukt i bl.a. de diagnostiske systemer og anvendelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse for å oppdage HIV-1 i en kropps-væskeprøve.

Antistoffblandingene kan bli beskrevet som å være oligoklonale sammenlignet med naturlig forekommende polyklonale antistoffer da de inneholder "paratoper" rettet mot relativt få epitoper sammenlignet med epitopene som presen-teres ved et intakt HIV-1 TMP-molekyl. Følgelig binder antistoffene til relativt få epitoper som etterligner polypeptidet, mens naturlig forekommende antistoffer utviklet mot hele TMP-molekylet binder til epitoper overalt på TMP-molekylet og blir referert til som å være polyklonale.

Monoklonale antistoffblandinger blir også beskrevet i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse. En monoklonal antistoffblanding inneholder innenfor målbare grenser, bare én sort antistoffbindingssete som er i stand til å binde effek-tivt HIV-1 TMP. Således viser en monoklonal antistoffblanding typisk en enkel bindingsaffinitet for HIV-1 TMP, skjønt den kan inneholde antistoffer som er i stand til å binde andre proteiner enn HIV-1 TMP.

Passende antistoffer i monoklonal form, typisk hele antistoffer, kan bli laget ved å bruke hybridomteknologi beskrevet av Niman et al., Proe. Nati. Sei., U.S.A., 80:4949-4953 (1983). Kort omtalt, for å lage hybridomet fra hvilket den monoklonale antistoffblanding er produsert, blir et myelom eller en annen selv-voksende cellelinje fusjonert med lymfocytter som oppnås fra milten til et pattedyr som er hyper-immunisert med et polypeptid ifølge denne oppfinnelse.

Det er foretrukket at myelomcellelinjen er fra den samme art som lymfocyttene. Typisk er en mus av arten 129 G1X<+ >det foretrukne pattedyr. Passende musemyelomer for bruk i den foreliggende oppfinnelse inkluderer hypoxanthin -aminopterin-thymidin-sensitive (HAT) cellelinjer P3X63-Ag8.653, og Sp2/0-Agl4 som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, under betegnelsene hhv. CRL 1580 og CRL 1581.

Splenocyttene blir typisk fusjonert med myelomcellene ved å bruke polyethylenglycol (PEG) 1500. Fusjonerte hybrider blir selektert ved deres følsomhet til HAT. Hybridomer som utskiller antistoffmolekyler ifølge denne oppfinnelse, blir identifisert ved å bruke enzymbundet immunosorbent målemetode (ELISA) beskrevet i eksempel 2.

En monoklonal antistoffblanding kan bli produsert ved å starte opp en monoklonal hybridomkultur som omfatter et næringsmedium som inneholder et hybridom som utskiller antistoffmolekyler av den rette polypeptidspesifisitet. Kulturen blir holdt under betingelser og i en tid som er tilstrekkelig for hybridomet til å utskille antistoffmolekylene til mediet. Det antistoffholdige medium blir så oppsamlet. Antistoffmolekylene kan så bli videre isolert ved velkjente metoder.

Medier som er brukbare for fremstillingen av disse blandinger, er velkjente i faget og kommersielt tilgjengelige og inkluderer syntetiske kulturmedier, innavlede mus og lignende. Et eksempel på syntetisk medium er Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)) supplert med 4,5 g/l glucose, 20 mM glutamin og 20% føtalt kalveserum. Et eksempel på innavlet muse-stamme er Balb/c.

Monoklonale antistoffblandinger fremstilt ved den ovenfor nevnte metode, kan bli benyttet f.eks. i diagnostiske henseender hvori dannelse av et HIV-1 TMP-holdig immunreaksjonsprodukt er ønskelig.

F. Diagnostiske systemer

Et diagnostisk system i kitform ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer i en mengde tilstrekkelig for i det minste én analyse, et polypeptid, en poly-peptidblanding, et antistoffpreparat eller monoklonalt antistoffpreparat ifølge den foreliggende oppfinnelse, som et ferdiglaget reagens. Instruksjoner for bruk av det ferdiglagede reagens er også typisk inkludert.

Som benyttet herved, refererer betegnelsen "ferdiglaget" seg til en stasjonær matriks eller materiale slik som glass, plast, papir, folie og lignende som er i stand til innen bestemte grenser å holde et polypeptid, en antistoffblanding eller monoklonal antistoffblanding ifølge den foreliggende oppfinnelse. Således, kan f.eks. et ferdiglaget reagens (pakke) være et glass som blir benyttet for å inneholde milligramsmengder av et beskrevet polypeptid, eller det kan være en mikrotiterplatebrønn til hvilken mikrogramsmengder av et beskrevet polypeptid er blitt operativt bundet, f.eks. bundet slik at det er i stand til å bli immunologisk bundet av et antistoff.

"Bruksanvisning" inkluderer typisk en vedlagt opp-skrift som beskriver reagensets konsentrasjon eller minst én analysemetodeparameter slik som de relative mengder av reagenset og prøven som skal blandes til, inkubasjonstider for reagens/prøveblandinger, temperatur, bufferbetingelser og lignende.

I foretrukne utførelsesformer inneholder et diagnostisk system ifølge foreliggende oppfinnelse polypeptid p3 og/eller p4, fortrinnsvis p3 og p4 i blanding.

Også foretrukket er et diagnostisk system som inneholder minst to polypeptider hvori det første av polypeptidene har en aminosyrerestsekvens representert ved formelen:

hvor Z er enten isoleucin eller methionin. Et annet polypeptid er i stand til å immunreagere med antistoffer indusert av et HIV, slik som HIV-1, HIV-2 og lignende, og er fortrinnsvis valgt fra gruppen pl, p2 og p5. Hvert polypeptid kan bli separat tillaget innenfor kitformen, f.eks. til stede som deler av separate, stasjonære underlag. Fortrinnsvis er det første og andre polypeptid til stede i en blanding, fortrinnsvis i omtrent ekvimolare tilsetninger.

Videre foretrukket er et diagnostisk system som har minst to stasjonære underlag, fortrinnsvis separat ferdiglaget i vedkommende "kit". Et første stasjonært underlag omfattes av en stasjonær rnatriks som har en operativt bundet tilsetning av minst to polypeptider. Det første av polypeptidene har en aminosyrerestsekvens representert ved formelen:

hvor Z er enten isoleucin eller methionin, og et annet av polypeptidene er valgt fra gruppen av pl og p2. Et annet stasjonært underlag omfattes av en stasjonær matriks som har operativt bundet polypeptid p5.

I foretrukne utførelsesformer inkluderer et diagnostisk system ifølge den foreliggende oppfinnelse videre en markør eller en indikator som er i stand til å signalisere dannelsen av et kompleks som inneholder et polypeptid eller antistoffmolekyl ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Ordet "kompleks" brukt herved, refererer seg til produktet av en spesifikk bindingsreaksjon slik som en antistoff-antigen- eller reseptor-ligand-reaksjon. Eksempler på komplekser er immunreaksjonsprodukter.

Som brukt herved, refererer betegnelsene "markør" og "indikatorsystemer" i deres forskjellige grammatikalske former til enkeltatomer og molekyler som enten er direkte eller indirekte involvert i produksjonen av et oppdag.bart signal for å indikere nærværet av et signal. Enhver markør eller ethvert indikatorsystem kan bindes til eller inkor-poreres i et uttrykt protein, polypeptid eller antistoffmolekyl som er del av et antistoff eller en monoklonal antistoffblanding ifølge den foreliggende oppfinnelse, eller brukes separat, og disse atomer eller molekyler kan bli brukt alene eller i samband med tilleggsreagenser. Slike markører er selv velkjente i klinisk diagnostisk kjemi og utgjør en del av denne oppfinnelse bare i den grad de er benyttet og på annen måte er nye proteinmetoder og/eller systemer.

Markørsystemene kan være en fluorescerende merket substans som kjemisk binder til antistoffene eller antigenene uten å denaturere dem for å danne fluorokrom (farge) som er brukbart som immunofluorescerende signal. Passende fluorescerende merkingssubstanser er fluorokromer slik som fluoresceinisocyanat (FIC), fluoresceinisothio-cyanat (FITC), 5-dimethylamin-l-nafthalensulfonylklorid (DANSC), tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin 8200 sulfonylklorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse av immunfluorescensanalyseteknikkene finnes i DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", i Antibody As a Tool, Marchalonis et al., red., John Wiley & Sons, Ltd.,

s. 189-231 (19,82).

I foretrukne utførelsesformer er indikatorgruppen et enzym, slik som pepperrotperoxydase (HRP), glucoseoxydase eller lignende. I slike tilfeller hvor den prinsipale indikatorgruppe er et enzym slik som HRP eller glucoseoxydase, er tilleggsreagenser krevet for å synliggjøre det faktum at et reseptor-ligandkompleks (immunreaktant) er blitt dannet. Slike tilleggsreagenser for HRP inkluderer hydrogenperoxyd og en oxydasjonsfargeforløper slik som diaminobenzidin. Et tilleggsreagens som er brukbart sammen med glucoseoxydase, er

2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).

Radioaktive elementer er også brukbare merkingssubstanser og er benyttet som illustrasjon nedenfor. Et eksempel på radiomerkingssubstans er et radioaktivt element som produserer og sender ut gammastråler. Elementer som selv utsender gammastråler, slik som -'■^4I, ^^ 1, <1>^1, 132j og ^<l>cr, representerer en klasse indikatorgrupper som består av radioaktive elementer som utsender gammastråler. <125>j er spesielt foretrukket. En annen gruppe med brukbare indikatorsubstanser er elementer slik som ^C, ^F, -^O og ^■^N som selv utsender positroner. Positronene som blir utskilt, produserer gammastråler når de treffer elektroner til stede i dyrets kropp. Også brukbar er en beta-emittor slik som <11>J<->indium eller <3>H.

Bindingen av markører, f.eks. merking av polypeptider og proteiner, er velkjent i faget. F.eks. kan antistoffmolekyler som er produsert av et hybridom, bli merket ved metabolsk inkorporering av radioisotopholdige aminosyrer tilsatt som en komponent til kulturmediet. Se f.eks. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Metodene for proteinkonjugering eller kopling via aktiverte, funksjonelle grupper er spesielt anvendbare. Se f.eks. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) og U.S. patentskrift nr. 4.493.795.

De diagnostiske systemer kan også inkludere fortrinnsvis som en separat pakke, en spesifikk bindingssubstans. En "spesifikk bindingssubstans" er en molekylær enhet som er i stand til selektivt å binde en type reagens i den foreliggende oppfinnelse eller et kompleks som inneholder et slikt reagens, men er ikke selv et polypeptid eller antistoffmolekylblanding i den foreliggende oppfinnelse. Som eksempel på spesifikke bindingssubstanser er sekundære antistoffmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter av dette, S. aureus protein A og lignende. Fortrinnsvis binder det spesifikke bindingsmiddel reagensene når disse er til stede som del av et kompleks.

I foretrukne utførelsesformer er den spesifikke bindingssubstans merket. Når imidlertid det diagnostiske system inkluderer en spesifikk substans som ikke er merket, er substansen typisk brukt som et amplifiserings-

middel eller reagens. I disse utførelsesformer er den spesifikke bindingssubstans i stand til spesifikt å binde amplifiseringsmidlene når amplifiseringsmidlene er bundet til et reagensholdig kompleks.

De diagnostiske "kits" ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli brukt i "ELISA"-format for å oppdage nærværet eller mengden av minst anti-HIV-l-antistoffer i en kroppsvæskeprøve slik som serum, plasma eller urin. "ELISA" refererer seg til en enzymbundet immunosorbentanalyse som benytter et antistoff eller antigen bundet til en stasjonær fase og et enzymantigen eller enzymantistoffkonjugat for å oppdage og kvantifisere mengden av et antigen eller antistoff til stede i prøven. En beskrivelse av ELISA-teknikken er funnet i kapittel 22 av den 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., publisert av Lange Medical Publications, Los Altos, CA, i 1982, og i U.S. patenterskrifter nr. 3.654.090, nr. 3.850.752 og nr. 4.016.043 som alle er inkorporert herved ved referanse.

Således kan i foretrukne utførelsesformer et polypeptid, en antistoffmolekylblanding eller en monoklonal antistoffmolekylblanding ifølge den foreliggende oppfinnelse bli bundet til en stasjonær matriks for å danne et stasjonært underlag som omfatter en tillaget pakke innenfor de foreliggende diagnostiske systemer.

Reagenset er typisk bundet til den faste matriks ved adsorpsjon fra et vandig medium, skjønt andre måter for binding velkjente for fagmannen, kan bli benyttet.

Brukbare faste matrikser er også velkjente i faget.

Slike materialer er vannuløselige og inkluderer kryssbundet dextran tilgjengelig under kjøpenavnet Sephadex<®> fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; kuler av polystyren der kulene er omtrent 1 mikrometer til omtrent 5 millimeter i diameter og tilgjengelige fra Abbott Laboratories, North Chicago, IL; polyvinylklorid, polystyren, kryssbundet polyacrylamid, nitrocellulose-eller nylon-baserte nettingmaterialer, slik som ark, "strips" eller blader; eller rør, plater eller brønner i en mikrotiterplate slik som de som er laget av polystyren eller polyvinylklorid.

Reagenstypene, merkede, spesifikke bindingssubstanser eller amplifiseringsreagenser av ethvert diagnostisk system beskrevet herved, kan foreligge i løsning, som en vandig dispersjon eller som et i det vesentlige tørt pulver, f.eks. i lyofilisert form. Hvor indikatorsystemet er et enzym, kan enzymets substrat også bli tilført i en separat pakke i et system. Et fast underlag slik som den tidligere beskrevne mikrotiterplate og én eller flere buffere, kan også bli inkludert som separate, ferdigpakkede elementer i dette diagnostiske testsystem.

Materialene i pakken som er beskrevet herved i relasjon til diagnostiske systemer, er de som vanligvis blir benyttet i diagnostiske systemer. Slike materialer inkluderer glass og plast- (f.eks. polyethylen, polypropylen og polycarbonat) flasker, prøveglass, plast og plastfolie-laminerte innpakninger og lignende.

G. Målemetoder

Den foreliggende oppfinnelse beskriver en metode for å oppdage nærværet og fortrinnsvis mengde av antistoffer mot HIV-1 i en kroppsvæskeprøve ved å produsere et kompleks som inneholder et polypeptid i den foreliggende oppfinnelse og slike antistoffer. De som er dyktige i faget, vil forstå at det er tallrike, velkjente klinisk-diagnostiske, kjemiske prosedyrer som kan bli benyttet for å lage disse komplekser.

Forskjellige heterogene og homogene testprotokoller kan bli benyttet, enten av kompetitiv eller ikke-kompetitiv natur for å oppdage nærværet, og fortrinnsvis mengde, av antistoffene mot HIV-1 TMP i en kroppsvæskeprøve ved å bruke et polypeptid av denne oppfinnelse. Den foreliggende oppfinnelse beskriver f.eks. en metode for å måle en kroppsprøve for nærværet av anti-HIV-l-antistoffer som omfatter trinnene: (a) Dannelse av en immunreaksjonsblanding ved å tilblande en kroppsvæskeprøve et polypeptid som har en aminosyrerestsekvens representert ved formel: hvor Z er enten isoleucin eller methionin. Kroppsvæske-prøven er fortrinnsvis til stede som en kjent mengde blod eller et blodrelatert produkt slik som serum eller plasma, skjønt urin, spytt, sæd, vaginalsekresjon eller ryggmargsvæske (CSF), kan også bli benyttet. Fortrinnsvis er polypeptidet til stede som en del av et fast underlag, f.eks. et polypeptid av den foreliggende oppfinnelse bundet til innerveggene til en mikrotiterplatebrønn, slik at immunreaksjonsblandingen som dannes, har en stasjonær og en flytende fase. (b) Inkubasjon av blandingen under biologiske testbetingelser i en forhåndsbestemt tidsperiode slik som omkring 10 minutter til omkring 16-20 timer ved en temperatur på omkring 4°C til omkring 45°C som er tilstrekkelig for ethvert anti-HIV-l-antistoff til stede i prøven til å immunreagere med (immunologisk binde) polypeptidet for å danne et polypeptidholdig immunreaksjonsprodukt.

Biologiske målebetingelser er de som opprettholder den biologiske aktivitet til polypeptidmolekylene i denne oppfinnelse og anti-HIV-l-antistoffene som søkes å bli målt, og inkluderer et temperaturområde på omkring 4°C til omkring 45°C, et pH-verdiområde på omkring 5 til omkring 9 og en ionestyrke som varierer fra det som destillert vann har, til det som omkring 1 molar natriumklorid har. Metoder for å optimalisere slike betingelser er velkjente i faget. (c) Analyse for nærvær av ethvert polypeptidholdig immunreaksjonsprodukt som er dannet, og derved nærværet av ethvert anti-HIV-l-antistoff i immunreaksjonsblandingen, er også bestemt. Fortrinnsvis er mengden av ethvert polypeptidholdig immunreaksjonsprodukt som dannes, bestemt, og derved mengden av anti-HIV-l-antistoffer til stede i prøven.

Måling for nærvær av ethvert polypeptidholdig (anti-HIV-l-antistoffbindende) immunreaksjonsprodukt, enten direkte eller indirekte, kan bli utført ved målemetoder velkjente i faget. I foretrukne utførelsesformer er f.eks. det polypeptidholdige immunreaksjonsprodukt av trinn (b) videre behandlet for måling ifølge trinn (c) ved de følgende trinn: (i) Tilblanding av en biologisk aktiv, merket, spesifikk bindingssubstans til det polypeptidholdige immunreaksjonsprodukt for å danne en merket reaksjonsblanding. Den merkede, spesifikke bindingssubstans er i stand til å binde til ethvert immunglobulin til stede i det polypeptidholdige immunreaksjonsprodukt slik at det dannes et merket kompleks. Fortrinnsvis består den merkede, spesifikke bindingssubstans av sekundære antistoffmolekyler slik som xenogeniske, anti-humane Fc-antistoffer. Fortrinnsvis er det merkede, spesifikke bindingsreagens immunglobulin-klassespesifikt. (ii) Den merkede reaksjonsblanding som således dannes, blir vedlikeholdt under biologiske assaybetingelser for en forhåndsbestemt tid tilstrekkelig for den merkede, spesifikke bindingssubstans til å bindes til ethvert anti-HIV-l-antistof f til stede som polypeptidholdig immunreak-sj onsprodukt for å danne et merket kompleks.

Måling for nærværet av det merkede kompleks muliggjør en målemetode for nærværet av anti-HIV-l-antistoffer i prøven. I foretrukne utførelsesformer er mengden av den merkede, spesifikke bindingssubstans bundet som del av komplekset, bestemt, og derved kan nærværet og mengden av anti-HIV-l-antistoffer i prøven bli bestemt. Den mengden kan være null, og derved indikere at ingen anti-HIV-1-antistoffer er til stede i prøven, innenfor de grenser som kan bli oppdaget. Målemetoder for nærværet og mengden av en merket, spesifikk bindingssubstans avhenger av merkingen som blir brukt, slike merkinger og målemetoder som er velkjente i faget.

Alternativt kan homogene målemetoder slik som de beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 4.536.479, nr. 4.233.401, nr. 4.233.402 og nr. 3.996.345, hvis innhold er inkorporert herved ved referanse, bli benyttet for å oppdage det polypeptidholdige immunreaksjonsprodukt i trinn (c).

Eksempler

1. Polypeptidsyntese

Polypeptidene pl, p2, p3, p4 og p5 ble syntetisert ved å bruke den klassiske stasjonære faseteknikk beskrevet av Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96 (1969) slik den er tilpasset bruken med en modell 430A automatisert peptid-syntesemaskin (Applied Biosystems, Foster City, CA). Polypeptidresiner ble kløyvet ved hjelp av hydrogenfluorid, ekstrahert og analysert for renhet ved høytrykksvæske-kromatografi ved bruk av en revers-fase C18-søyle (Waters Associates, Milford, MA).

Aminosyrerestsekvensen til polypeptid p5 som er fremkommet fra sekvensen til et HIV-2-isolat, er vist i tabell 1 i seksjon C. For å lette sammenligningen er aminosyrerestsekvensene til polypeptid pl, p2, p3 og p4,

som er fremkommet fra 4 forskjellige HIV-l-isolater, vist i tabell 2.

a Aminosyrerestsekvensen til hvert polypeptid korresponderer til en del av en kjent HIV-1

gp41 aminosyrerestsekvens.

k En bindestrek indikerer at aminosyreresten er

den samme som den funnet i den samme del som i polypeptid p2-sekvensen, mens nærværet av en aminosyre som er forskjellig fra den funnet i p2-sekvensen, er betegnet med bokstaven som korresponderer til den forskjellige eller "substituerte"

rest. Således har pl en aminosyrerestsekvens som er identisk med den som p2 har, unntatt for et leucin substituert for isoleucin ved restposisjon nr. 3.

2. ELISA- system og fremgangsmåte

100 mikroliter (/ul) av fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 1 mikrogram (/ug) av polypeptid pl, p2, p3, p4 eller p5, ble blandet i brønnene til polyvinyl, 96-brønns mikrotiterplater (Mikrotest III, Falcon). Platene ble så inkubert i omtrent 16 timer ved 36°C for å tillate PBS å fordampe og polypeptidene å adsorbere til (dekke ved opera-tiv binding hertil) veggene i brønnene. 150 /ul av ELISA fortynningsmiddel (PBS som inneholder 0,2% polyoxyethylen (20)-sorbitanmonolaurat (Tween20), 10% varme-inaktivert, føtalt kalveserum (FCS) og 0,5 millimolar (mM) thimerosal) ble så blandet til hver brønn for å blokkere overskudd

protein-bindingsseter.

Etter inkubasjon av de fortynningsmiddelholdige brønner i 1 time ved 23°C, ble fortynningsmidlet fjernet ved risting eller aspirasjon og danner således et diagnostisk system av den foreliggende oppfinnelse, dvs. en mikrotiter-platebrønn som har et polypeptid av foreliggende oppfinnelse som er operativt bundet til dens innervegger (en polypeptid-dekket brønn).

100 /ul av hver serumprøve fortynnet 1:64 i ELISA fortynningsmiddel, ble blandet i en polypeptid-dekket brønn. Den resulterende, fast/flytende-fase-immunreaksjonsblanding ble inkubert ved omtrent 23°C i 90 minutter for å tillate dannelse av polypeptidholdige immunreaksjonsprodukter. De fortynnede sera ble så fjernet fra brønnene ved aspirasjon ved å bruke en ELISA washer (Immuno Wash 12, Nunc). Hver brønn ble så vasket 4 ganger med ELISA-vask (PBS som inneholdt 0,2% Tween20) og aspirert til tørrhet.

100 /ul av et pepperrotperoxydasemerket geite-anti-humant IgG, affinitetsrenset, (Boehringer Mannheim Biochemicals) fortynnet 1:30.000 i PBS som inneholdt 10% varme-inaktivert FCS og 0,5 mM thimerosol, ble så blandet til hver brønn. Den resulterende merkings-reaksjonsblanding ble inkubert i 90 minutter ved omtrent 23°C for å tillate dannelse av polypeptidholdige, merkede komplekser. De ikke-reagerte, merkede antistoffer ble fjernet ved risting, og hver brønn ble vasket og aspirert til tørrhet som tidligere beskrevet.

100 /ul av en kromogen substratløsning (citratbuffer (500 ml deionisert vann som inneholdt 5,0 g citratsyre-anhydrid og 7,0 g Na2HP04, pH 5) som inneholdt 0,4 mg/ml O-fenylendiamin (OPD) og 0,01% H202) ble tilblandet hver brønn for å lage en utviklings-reaksjonsblanding. Etter inkubasjon av utviklings-reaksjonsblandingen i 30 minutter ved omtrent 23°C, ble 100 /ul av 1 M HC1 blandet til hver brønn for å stoppe utviklingsreaksjonen. De resulterende løsninger ble målt for absorpsjon ved 492 nanometer (OD^^) ved å bruke en ELISA-leser (Titertek Multiscan, Flow

Laboratories, Inglewood, CA). Seropositivitet (HIV-infek-sjon) ble definert som enhver OD4g2-verdi større enn den gjennomsnittlige OD^c^<->verdi pluss 3 standarddeviasjoner av 24 normale kontroll- (ikke infiserte) sera. Alle sera ble målt minst 3 ganger.

Sera fra HIV-l-infiserte pasienter fra De forente stater ble samlet i San Diego, CA (n=84) og ved Sentra for sykdomskontroll- (CDC) stedene i De forente stater (n=79). Panelet på 40 HIV-l-positive sera inkluderte prøver fra 12 asymptomatiske, seropositive pasienter (CDC gruppe II), 13 pasienter med generalisert lymfadenopati (CDC gruppe III) eller AIDS-relatert kompleks ARC; CDC gruppe IV-A) og 15 pasienter med manifest AIDS (CDC gruppe IV-C eller IV-D). Se Sentra for sykdomskontroll, Morbid. Mortal Weekly Rep., 35:3.34 (1976)..

Sera fra HIV-l-infiserte pasienter fra .Zaire og friske, normale zairske kontrollpersoner ble samlet i Kinshasa i 1983 og ble karakterisert av Brun-Vezinet et al., Science, 226:453 (1984).

De HIV-2-positive sera ble samlet i Guinea Bissau i 1980 og karakterisert ved immunblotting og immunfluorescens mot HIV-1, HIV-2 og STLV-antigener. Fultz et al., Third International Conference on AIDS, sammendrag MP.72 (1987).

Alle serumprøver ble kodet, delt i prøver og lagret ved -20°C.

Resultatene fra målingen av de ovenfor beskrevne sera for nærvær av anti-HIV-antistoffer ved bruk av polypeptidene pl, p2, p3, p4 og p5, er vist i tabell 3.

Fra tabell 3 kan det ses at polypeptid p2 hvis aminosyrerestsekvens er homolog til de carboxyterminale 12 rester i peptid 39 beskrevet i Cosand-patentskriftet, immunreagerte med 100% av HIV-l-infiserte sera oppnådd fra pasientene fra De forente stater, men bare 88,2% av de HIV-l-infiserte zairske sera ble oppdaget.

a + = positive; - = negative (diskrimineringspunkter for positivitet for peptidet ELISA ble definert som gjennomsnittlig ^ a^ 2 Pluss 3 standarddeviasjoner for et panel av 24 negative kontrollsera. Prøvene ble vurdert som positive eller negative ved en

serumfortynning av 1:64).

b ND = ikke utført, utilstrekkelig mengde prøvemateriale.

På lignende vis immunreagerte polypeptid pl hvis aminosyrerestsekvens inneholder et leucin for isoleucin-substitusjon, relativt til polypeptid p2, med 99,4% av HIV-l-infiserte av De forente stater-sera, men bare 86,8% av de HIV-l-infiserte, zairske sera.

I kontrast til polypeptidene pl og p2 indikerer resultatene i tabell 3 at polypeptidene i den foreliggende oppfinnelse, dvs. polypeptidene p3 og p4, oppdaget anti-HIV-1 TMP-antistoffer i hhv. 94,1% og 97,1% i de zairske AIDS-sera som ble testet. Forskjellen i graden av sensitivitet mellom polypeptidene i denne oppfinnelse og polypeptidene pl og p2 var uventet fordi 1) polypeptidene pl og p2 synes å ha lik sensitivitet for HIV-l-TMP-antistoffene i både De forente stater og zairske sera, og 2) aminosyrerestsekvensene til polypeptidene pl, p3 og p4 og er alle utgått fra zairske HIV-l-isolater, men de har uventede forskjeller i sensitivitet for anti-HIV-l-TMP-antistoffer.

Grunnen(e) for de ovenfor beskrevne forskjeller i sensitivitet er ukjent. Imidlertid antyder disse for-skjellene at polypeptidene p3 og/eller p4 kan bli brukt med polypeptidene slik som pl og p2, for å oppnå en større grad av sensitivitet for eksponering til HIV-1. I tillegg indikerer forskjellen i sensitivitet vist i tabell 3, at et polypeptid av denne oppfinnelse kan bli benyttet i kombinasjon med et HIV-2-spesifikt polypeptid slik som p5 for å oppnå en høyere grad av sensitivitet for eksponering til HIV-1 eller HIV-2 enn det kan bli oppnådd ved bruk av et HIV-2-derivert polypeptid alene.

5 av de zairske AIDS-sera som ikke reagerte med polypeptid pl, 1 som ikke reagerte med noen av polypeptidene p3 eller p4, og 8 som reagerte med pl og p4, ble målt for nærvær av infektiøs HIV-1 ifølge kulturmetoden til McCormick et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 36:102 (1987). I tillegg ble disse seraene målt for nærvær av anti-HIV-1-antistoffer ved bruk av et kommersielt ELISA diagnostisk system som bruker helt virus- (viralt lysat) antigener (Litton Bionetics, Kensington, MD) og for antistoffer til spesifikke HIV-l-proteiner ved Western immunoblotting ved bruk av CDC HIV-l-stammen 451 som antigenkilde. Resultatene

fra disse målinger, vist i tabell 4, indikerer at polypeptidene p3 og p4 reagerte med alle 5 zairske sera som var ikke-reaktive mot polypeptid pl. I tillegg, fordi alle 5 av polypeptid pl negative sera ble funnet å inneholde infektiøst HIV-1, men var negative eller flertydige ved Western blotanalyse, representerer de diagnostiske systemer av foreliggende oppfinnelse immunoassaysystemer som har en forbedret sensitivitet for anti-HIV-1 TMP-antistoffer. 3. Antistoffproduksjon og nøytraliseringsmetode Polypeptid pl ble koplet til "keyhole limpet" hemocyanin (KLH) bæreprotein gjennom den carboxyterminale cysteinrest ved bruk av kryssbinder m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester ifølge metoden til Lin et al., Biochem. 18:690-697 (1979). Etter at preimmuniserings-seraprøver ble oppnådd, ble to kaniner hver injisert på dag 0 med 6 subkutane lokaliseringer med 250 /ug av koplet polypeptid, emulgert i 1 ml av fullstendig Freunds adjuvans. På dag 14 ble kaninene injisert subkutant med 250 /ug koplet polypeptid i ufullstendig Freunds adjuvans. På dag 21 ble de injisert intraperitonealt med 250 /ug koplet polypeptid i 1 ml av en alunsuspensjon. Kaninsera ble samlet etter 7 og 14 dager etter den tredje injeksjon og ble lagret ved -20°C. Antistoffnivåene ble bestemt ved ELISA-prosedyren beskrevet i eksempel 2.

Evnen til kanin-anti-polypeptid pl-antiserum til å nøytralisere HIV-l-infektiøsitet ble bestemt ved en revers-transkriptase- (RT) aktivitetsmetode lik den som ble beskrevet av Chanh et al., EMBO, 5:3065-71 (1986). Resultatene av denne studie vist i tabell 4, indikerer at immunisering med et inokulum av denne oppfinnelse induserer HIV-1-nøytraliserende antistoffer.

a CPM = tellinger pr. minutt av [<3>H]TTP.

b % inhibering av RT-aktivitet (% nøytralisering) =

c Kontroll = preimmunt kaninserum.

Den tidligere spesifikasjon som inkluderer de spesifikke utførelsesformer og eksempler, har til hensikt å være illustrerende for den foreliggende oppfinnelse.

Claims (12)

1. Polypeptid som består i hovedsak av 12 aminosyrerester, karakterisert ved at det har en aminosyrerestsekvens vist ved formelen: LGZWGCSGKHIC hvor Z er enten isoleucin eller methionin.

2. Preparat som omfatter en blanding av minst to polypeptider, karakterisert ved at et av de nevnte poly peptider består i hovedsak av 12 aminosyrerester som har en sekvens vist ved formelen: hvor Z er enten isoleucin eller methionin, og et annet av nevnte polypeptider har en aminosyrerestsekvens vist ved en formel valgt fra gruppen som består av:

3. Anvendelse av et polypeptid ifølge krav 1 til å måle nærværet av anti-HIV-l-antistoffer i en kroppsvæskeprøve, karakterisert ved at den omfatter trinnene: a) dannelse av en immunreaksjonsblanding ved å blande en kroppsvæskeprøve med et polypeptid som består i hovedsak av 12 aminosyrerester som har en sekvens vist ved en formel: hvor Z er enten isoleucin eller methionin, og eventuelt et annet av nevnte polypeptider vist ved en formel valgt fra gruppen som består av: b) inkubasjon av nevnte immunreaksjonsblanding under biologiske testbetingelser i en tid som er tilstrekkelig for at ethvert anti-HIV-l-antistoff til stede i prøven, skal kunne immunreagere med nevnte polypeptid og danne et polypeptidholdig immunreaksjonsprodukt; og c) måling av nærværet av ethvert polypeptidholdig immunreaksjonsprodukt som er dannet, og derved nærværet av ethvert anti-HIV-l-antistoff i nevnte prøve.

4. Anvendelse for ifølge krav 3, karakterisert ved trinnene: dannelse av en immunreaksjonsblanding ved å blande en kroppsvæskeprøve med et preparat som omfatter en blanding av minst to polypeptider hvor det første av de nevnte polypeptider består i hovedsak av 12 aminosyrerester og har en sekvens vist ved formelen: hvor Z er enten isoleucin eller methionin, og et annet av nevnte polypeptider er vist ved en formel valgt fra gruppen som består av:

5. Anvendelse ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte polypeptidholdige immunreaksjonsprodukt blir videre behandlet for be-stemmelse ifølge trinn (c) ved: (i) dannelse av en merket reaksjonsblanding ved tilsetning av nevnte polypeptidholdige immunreaksjonsprodukt-merkede antistoffmolekyler som er i stand til å binde til ethvert humant immunglobulin til stede i nevnte immun-reaksj onsprodukt, og (ii) inkubasjon av nevnte merkede reaksjonsblanding som er dannet under biologiske testbetingelser, i en tidsperiode som er tilstrekkelig for nevnte, merkede antistoffer til å immunreagere med ethvert anti-HIV-l-antistoff til stede som polypeptidholdig immunreaksjonsprodukt for å danne et merket kompleks.

6. Anvendelse ifølge krav 5, karakterisert ved at polypeptidet bindes til en fast matriks før sammenblandingen ifølge trinn (a). 34

7. Diagnostisk system i kitform for å måle nærværet av anti-HIV-l-antistoffer i en kroppsvæskeprøve, karakterisert ved en pakke som inneholder et polypeptid som har en aminosyrerestsekvens vist ved formelen: hvor Z er enten isoleucin eller methionin, og eventuelt et annet polypeptid vist ved en formel som er valgt fra gruppen som består av:

8. Diagnostisk system ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte første og andre polypeptid er blandet.

9. Diagnostisk system ifølge krav 7, karakterisert ved at det videre inkluderer, i en separat pakke, et merket, spesifikt bindingsmiddel for å gi signal om tilstedeværelse av et polypeptidholdig immun-reaksj onsprodukt.

10. Diagnostisk system ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte polypeptid er bundet til en fast matriks.

11. Diagnostisk system i kitform, karakterisert ved: (a) et første, fast underlag bestående av en fast matriks som har et hertil operativt bundet polypeptid med en aminosyrerestsekvens vist ved formelen: hvor Z er enten isoleucin eller methionin; og (b) et andre, fast underlag bestående av en fast matriks som har et hertil operativt bundet polypeptid med en aminosyrerestsekvens vist ved en formel valgt fra gruppen som består av:

12. Diagnostisk system i kitform, karakterisert ved: (a) et første, fast underlag bestående av en fast matriks som har en hertil operativt bundet blanding av minst to polypeptider hvor det første av nevnte polypeptider har en aminosyrerestsekvens vist ved formelen: hvor Z er enten isoleucin eller methionin, og det andre av nevnte polypeptider har en aminosyrerestsekvens vist ved en formel som er valgt fra gruppen som består av: (b) et andre, fast underlag bestående av en fast matriks som har et hertil operativt bundet polypeptid med en aminosyrerestsekvens vist ved formelen