CN117947056A - Ngpv vp2单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物免疫技术领域，提出了NGPV VP2单克隆抗体及其制备方法和应用。所述NGPV VP2单克隆抗体，重链型的重链恒定区为IgG1；轻链恒定区为Kappa型，腹水抗体效价不低于8×106；所述制备方法包括以重组蛋白制备免疫抗原；使用免疫抗原免疫小鼠；融合小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；对杂交瘤细胞的上清液进行特异性筛选，对检测阳性的细胞进行克隆化培养，获得单克隆抗体杂交瘤细胞株；将单克隆抗体杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔得到单克隆抗体。通过上述技术方案，开展单克隆抗体效果评价，利用单克隆抗体筛选出位于VP2的抗原表位，为鸭短喙‑侏儒综合征防治提供技术支撑。

Description

NGPV VP2单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物免疫技术领域，具体的，涉及NGPV VP2单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
新型鸭细小病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒（NGPV）同属于细小病毒亚科依赖病毒属，为单股链状DNA病毒。在电镜下番鸭细小病毒和鹅细小病毒的病毒粒子分为实心和空心两种形态，直径为20~24nm，无囊膜，正二十面体对称，衣壳由32个管桩排列的壳粒构成。番鸭细小病毒和鹅细小病毒在病毒大小、形态、基因组结构等都很相似；新型鸭细小病毒与番鸭细小病毒和鹅细小病毒基因组序列差别不大，各分离株都在5.1kb左右，三者基因组都包括2个开放阅读框，左侧开放阅读框（LORF）编码非结构蛋白，右侧开放阅读框（RORF）编码结构蛋白。非结构蛋白有2个，分别为NS1和NS2，肽链长度NS1>NS2，并且共用一个终止密码子；结构蛋白有3个，分别为VP1、VP2和VP3，肽链长度VP1>VP2>VP3，也具有同一个终止密码子。非结构蛋白重要功能为参与病毒复制和转录的调节。结构蛋白VP是病毒衣壳的组成成分，番鸭细小病毒结构蛋白VP1、VP2、VP3大小分别为91、78、58 kDa；新型鸭细小病毒和鹅细小病毒结构蛋白VP1、VP2、VP3蛋白大小分别为87、70、60 kDa。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，其可通过杂交瘤细胞技术制备，且纯度高、成本低、特异性强、高效、无残留，可用于相应疾病预防与治疗。
发明内容
本发明提出NGPV VP2单克隆抗体及其制备方法和应用，通过表达新型鹅细小病毒VP2蛋白，制备鹅细小病毒单克隆抗体，开展单克隆抗体效果评价，利用单克隆抗体筛选出位于VP2的抗原表位，从而为鸭短喙-侏儒综合征防治提供技术支撑。
本发明的技术方案如下：
一种VP2重组基因，所述VP2重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。即：
ACGGCTCCTGCAAAAAAAAATACAGGGAAGCTTACTGACCATTACCCAGTAGTTAAGAAGCCTAAACTCACCGAGGAAGT
CAGTGCGGGAGGTGGTAGCAGTGTCGTACAAGACGGAGGAGCCACCGCGGAGGGCACCGAACCTGTGGCAGCATCTGAAA
TGGCAGAGGGAGGAGGCGGAGCTATGGGCGACTCTTCAGGGGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCTCGGGAAATTGGCAT
TGCGATTCCCAATGGATGGGAAACACAGTCATCACAAAGACCACCAGAACCTGGGTCCTGCCAAGCTACAACAATCACAT
CTACAAAGCAATTACCAGTGGAACCTCTCAAGATGCAAATGTCCAGTATGCTGGATACAGTACCCCCTGGGGGTACTTTG
ATTTCAATCGCTTCCACTGCCACTTCTCCCCTAGAGACTGGCAGAGACTTATCAACAACCACTGGGGAATCAGGCCCAAG
TCTCTTAAATTCAAGATCTTCAATGTTCAAGTCAAGGAAGTCACAACGCAGGATCAGACAAAGACCATTGCAAACAATCT
CACCTCAACAATCCAAGTTTTTACGGATGATGAGCACCAACTCCCGTATGTCCTGGGCTCGGCTACGGAAGGGACCATGC
CGCCGTTCCCGTCGGATGTATATGCCCTGCCGCAGTACGGGTACTGCACAATGCACACCAACCAGAATGGAGCACGGTTC
AATGACCGTAGCGCATTCTACTGCTTAGAGTACTTCCCTAGTCAGATGCTGAGAACAGGTAACAACTTTGAGTTCACATT
TGACTTTGAAGAAGTTCCTTTCCACAGCATGTTCGCTCATTCACAGGACTTAGACAGGCTTATGAACCCCCTAGTGGATC
AATACCTCTGGAATTTCAATGAGGTAGACAGCAACAGAAATGCTCAATTTAAAAAAGCTGTGAAAGGGGCTTATGGCACC
ATGGGCCGCAATTGGCTGCCGGGACCTAAATTCCTGGATCAGAGAGTTAGGGCCTACACAGGAGGAACAGACAATTATGC
AAACTGGAACATCTGGAATAATGGGAACAAGGTGAATTTAAAGGACAGGCAGTATCTCCTACAACCCGGACCTGTGTCAG
CTACTCACACAGAAGGGGAGGCTTCCAGCATCCCAGCTCAGAATATTTTAGGGATAGCTAAAGATCCATACAGATCTGGC
AGCACTACAGCAGGAATAAGTGATATTATGGTCACGGACGAGCAGGAAGTAGCACCCACGAATGGAGTAGGGTGGAAACC
ATATGGTAGGACTGTAACGAATGAACAAAACACTACTACAGCTCCTACAAGTTCAGATCTGGATGTTCTTGGAGCTTTAC
CAGGAATGGTGTGGCAGAACAGAGATATATATCTGCAGGGACCTATTTGGGCAAAAATACCGAAGACTGATGGCAAATTC
CATCCTTCTCCAAATCTCGGAGGATTTGGCCTGCACAATCCACCACCACAGGTCTTCATCAAGAATACACCAGTACCTGC
AGACCCTCCAGTAGAATATGTGAACCAGAAGTGGAACTCCTACATAACTCAATACTCTACAGGCCAGTGTACAGTAGAAA
TGGTGTGGGAGCTGAGAAAAGAGAATTCAAAGAGATGGAACCCAGAAATCCAGTTCACCAGCAATTTCAGTAACAGAACT
AGTATAATGTTTGCACCTAATGAAACTGGTGGATATGTAGAAGATAGATTGATTGGAACCAGATATCTAACTCAAAATCT
GTAA
本发明还提出了一种引物组，用于扩增得到所述VP2重组基因，包括正向引物和反向引物，
所述正向引物为5'-CGCGGATCCATGGCAGAGGGAGGAGGCGGAGC-3'；
所述反向引物为5'-CCGCTCGAGTTACAGATTTTGAGTTAGATATC-3'。
本发明还提出了一种VP2蛋白的原核表达，VP2与pET-32a上的His标签融合表达。
一种VP2重组蛋白，由所述的VP2重组基因编码得到，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。即：
TAPAKKNTGKLTDHYPVVKKPKLTEEVSAGGGSSVVQDGGATAEGTEPVAASEMAEGGGGAMGDSSGGADGVGNASGNWHCDSQWMGNTVITKTTRTWVLPSYNNHIYKAITSGTSQDANVQYAGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNHWGIRPKSLKFKIFNVQVKEVTTQDQTKTIANNLTSTIQVFTDDEHQLPYVLGSATEGTMPPFPSDVYALPQYGYCTMHTNQNGARFNDRSAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFTFDFEEVPFHSMFAHSQDLDRLMNPLVDQYLWNFNEVDSNRNAQFKKAVKGAYGTMGRNWLPGPKFLDQRVRAYTGGTDNYANWNIWNNGNKVNLKDRQYLLQPGPVSATHTEGEASSIPAQNILGIAKDPYRSGSTTAGISDIMVTDEQEVAPTNGVGWKPYGRTVTNEQNTTTAPTSSDLDVLGALPGMVWQNRDIYLQGPIWAKIPKTDGKFHPSPNLGGFGLHNPPPQVFIKNTPVPADPPVEYVNQKWNSYITQYSTGQCTVEMVWELRKENSKRWNPEIQFTSNFSNRTSIMFAPNETGGYVEDRLIGTRYLTQNL。
本发明还提出了单克隆抗体，由所述的重组蛋白制备得到。
作为进一步的技术方案，所述的单克隆抗体，包括以下单克隆抗体中的至少一种：
命名为4B12的单克隆抗体，命名为4G6的单克隆抗体，命名为7C8的单克隆抗体。
作为进一步的技术方案，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1；轻链恒定区为Kappa型。
作为进一步的技术方案，腹水抗体效价不低于8×106。
作为进一步的技术方案，GST-VP2为更换表达载体及融合表达的标签并用于所述的单克隆抗体与VP2反应性的鉴定；
所述GST-VP2的表达载体为pGEX-4T-1。
作为进一步的技术方案，所述反应性通过Western-Blot和IFA进行测定。
本发明还提出了单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1、以所述重组蛋白制备免疫抗原；
S2、使用所述免疫抗原免疫小鼠；
S3、融合所述小鼠的免疫脾细胞与所述小鼠的骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
S4、对所述杂交瘤细胞的上清液进行特异性筛选，对上清液检测阳性的细胞进行克隆化培养，获得单克隆抗体杂交瘤细胞株；
S5、将所述单克隆抗体杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔得到单克隆抗体。
作为进一步的技术方案，所述重组蛋白的免疫量为50~100mg；
所述单克隆抗体杂交瘤细胞株的接种量为106。
本发明还提出了所述的单克隆抗体或所述制备方法制备得到的单克隆抗体在NGPV抗原表位鉴定上的应用。
作为进一步的技术方案，所述单克隆抗体或所述制备方法制备得到的单克隆抗体应用于NGPV抗原表位的鉴定，确定的表位序列为：
4B12："38DGGATAE44"；
4G6："546WNPEIQF552"；
7C8："461RDIYLQGPIWAK472"。
作为进一步的技术方案，所述NGPV抗原表位鉴定的截短肽的表达载体为pGEX-4T-1。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明提供了一种引物组，并构建了一种VP2蛋白表达载体，通过表达新型鹅细小病毒VP2蛋白，制备鹅细小病毒单克隆抗体，开展单克隆抗体效果评价，利用单克隆抗体筛选出位于VP2的抗原表位，从而为鸭短喙-侏儒综合征防治提供技术支撑。
2、本发明中单克隆抗体的重链型为：IgG1，轻链型为：Kappa型，腹水抗体效价不低于8×106，具有较强的特异性，成本低，操作简便快速，显示检测结果直观准确，不依赖于大型仪器，易于在科研和临床诊断中广泛应用推广。该单克隆抗体可用于探测、诊断、预防和治疗水禽细小病毒，特别是新型鹅细小病毒。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实施例1中重组载体pET-32a-VP2鉴定的凝胶电泳图；
图2为本发明实施例2中His-VP2可溶性鉴定图；
图3为本发明实施例4中单克隆抗体的Western-Blot鉴定图；
图4为本发明实施例5中间接免疫荧光鉴定图；
图5、图6、图7和图8为本发明实施例6中抗原表位鉴定图；
图9为本发明实施例7中表位保守性分析结果图；
图10为本发明实施例8中表位在VP2三维结构模型中的定位图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法如无特别说明，均为常规方法。
T7通用引物序列如下：
T7-F:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
T7-R: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
实施例1：NGPV VP2基因重组表达载体的构建
基于NGPV VP2序列（GenBank登录号KY511124），设计一对特异扩增引物VP2-F:5'-CGCGGATCCATGGCAGAGGGAGGAGGCGGAGC-3'/VP2-R: 5'-CCGCTCGAGTTACAGATTTTGAGTTAGATATC-3'，并用RT-PCR方法扩增VP2衣壳蛋白的全长序列。PCR产物经凝胶纯化后插入pET-32a载体，得到重组载体pET-32a-VP2，将重组质粒pET-32a-VP2转化大肠杆菌BL21（DE3），用T7通用引物进行菌液PCR鉴定。重组载体pET-32a-VP2鉴定的凝胶电泳如图1所示。
实施例2：重组蛋白的表达与纯化
原核表达出6×His标记的VP2蛋白，阳性菌落在300mL Luria Bertani（LB）培养基中培养过夜，并在37℃下培养，当培养物处于对数中期时，通过添加异丙基-β-d-硫代乙酰胺（IPTG）至最终浓度1mM诱导蛋白质表达，通过离心（10000 r/min）收集细胞，并将其重新悬浮在20mL 0.01M PBS缓冲液中，通过冰上超声波从细胞中释放目标蛋白，并于12000 r/min离心30 min收集上清液，利用SDS-PAGE对纯化的重组蛋白进行分析。His-VP2可溶性鉴定如图2所示。
实施例3：抗His-VP2小鼠单克隆抗体的制备
使用BALB/c小鼠，用His-VP2重组蛋白每隔2周皮下免疫一次，产生VP2衣壳蛋白特异性抗体，一旦在血清中检测到抗体效价高于10万，最后一次给小鼠腹腔注射无佐剂His-VP2，并进行细胞融合，用ELISA法对杂交瘤上清液进行特异性筛选，对上清液检测阳性的细胞孔进行克隆和扩增，用于单克隆抗体的生产和纯化。
表1 实施例3中单克隆抗体特性的鉴定数据以及所识别表位
实施例4：抗His-VP2小鼠单克隆抗体的鉴定
将所选克隆培养在雌性BALB/c小鼠的腹腔内，用无菌石蜡液对小鼠腹腔致敏，以注射杂交瘤细胞获得腹水；同时在体外大量制备单克隆抗体，以重组蛋白为抗原，采用间接ELISA法测定细胞上清与腹水中的单克隆抗体效价。此外，根据说明，使用小鼠单克隆抗体亚类鉴定用ELISA试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类。
为了确定单抗与GST-VP2的抗原特异性以及与GST标签缺乏反应性，通过Westernblot实验对单抗进行进一步确认，向GST-VP2重组蛋白中添加4×SDS-PAGE负载缓冲液，并通过沸水浴降解10min，用12.5%的SDS-PAGE凝胶分离目标蛋白并转移到PVDF膜上，在室温下用5%脱脂牛奶在TBST缓冲液中封闭膜1h，在4℃下加入阳性杂交瘤细胞上清孵育过夜，三次洗涤后，通过在室温下与HRP结合的山羊抗小鼠IgG孵育1h来监测特异性抗体的结合，然后再进行3次洗涤，用化学发光法检测PVDF膜。单克隆抗体的Western-Blot鉴定图如图3所示。
实施例5：间接免疫荧光鉴定
为了鉴定单克隆抗体与天然NGPV和GPV的反应性，将鸭胚成纤维细胞（DEF）铺于48孔板中，接种NGPV病毒液，感染后24h，弃去培养基，PBS洗3次；加入4%组织细胞固定液，4℃固定过夜，PBS洗3次；加入PBS+BSA，37℃培养箱中封闭30min，PBS洗3次；将VP2单克隆抗体按1:100稀释作为一抗，在37℃孵育1h，PBS洗3次，FITC标记 goat anti-mouse IgG 按 1:5000稀释作为二抗，37℃孵育1h，PBS洗3次；倒置荧光显微镜下观察结果并拍照，GPV以与上述相同的方法感染鹅胚成纤维细胞（GEF）并进行IFA鉴定，如图4所示。
实施例6：NGPV VP2衣壳蛋白线性B细胞表位的鉴定
为了绘制NGPV VP2衣壳蛋白的线性B细胞表位，构建并表达了NGPV VP2蛋白与GST标记融合的五个重叠多肽（A-E）。VP2蛋白由587个氨基酸构成，截短蛋白A-E分别占据VP2蛋白序列中的150个氨基酸左右，其中50个氨基酸为重叠部分。经原核表达后，通过Western-Blot验证这些截短肽与单抗的反应，根据结果，再次截短筛选出的阳性GST融合肽，然后用相同的方法进行分析。
为了精确最小的B细胞表位，分别从N端与C端对VP2截短肽（A-E）进行逐步截短，并与GST融合表达，通过Western blot进行测试，如图5~8所示。
实施例7：单克隆抗体抗原表位保守性分析
将鉴定出的表位序列与GenBank上不同基因型的代表性水禽病毒毒株VP2氨基酸序列进行比对，通过Mega软件进行比对，分析单克隆抗体抗原表位的保守性，如图9所示。
实施例8：VP2三维结构模型中表位的定位
由于蛋白数据库没有NGPV VP2三维结构的可用模型，通过AlphaFold体外模拟了NGPV VP2的三维结构，用PyMOL软件在模拟三维结构上显示本研究中表征的线性B细胞表位的位置，如图10所示。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种VP2重组基因，其特征在于，所述VP2重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种引物组，其特征在于，用于扩增得到权利要求1所述VP2重组基因，包括正向引物和反向引物，
所述正向引物为5'-CGCGGATCCATGGCAGAGGGAGGAGGCGGAGC-3'；
所述反向引物为5'-CCGCTCGAGTTACAGATTTTGAGTTAGATATC-3'。
3. 一种VP2重组蛋白，其特征在于，由权利要求1所述的VP2重组基因编码得到，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.单克隆抗体，其特征在于，由权利要求3所述的重组蛋白制备得到。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，包括以下单克隆抗体中的至少一种：
命名为4B12的单克隆抗体，命名为4G6的单克隆抗体，命名为7C8的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1；轻链恒定区为Kappa型。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，腹水抗体效价不低于8×106。
8.根据权利要求4~7任意一项所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以所述重组蛋白制备免疫抗原；
S2、使用所述免疫抗原免疫小鼠；
S3、融合所述小鼠的免疫脾细胞与所述小鼠的骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
S4、对所述杂交瘤细胞的上清液进行特异性筛选，对上清液检测阳性的细胞进行克隆化培养，获得单克隆抗体杂交瘤细胞株；
S5、将所述单克隆抗体杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔得到单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白的免疫量为50~100mg；
所述单克隆抗体杂交瘤细胞株的接种量为106。
10.如权利要求4~7任意一项所述的单克隆抗体或权利要求8~9所述制备方法制备得到的单克隆抗体在NGPV抗原表位鉴定上的应用。
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