CN109265521A - PCV2 Loop EF区的突变体、引物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PCV2Loop EF区的突变体、引物及其制备方法和应用，PCV2Loop EF区的突变体，其Loop EF区第133位丙氨酸形成供外源表位替换和/或插入的可突变位点以便在体外组装成完整的VLPs。电镜结果表明，Loop EF中第133位氨基酸的突变不影响VLPs组装，表明PCV2VLPs Loop EF区展示外源抗原表位具有可行性。为Loop EF区结构功能研究奠定基础，同时也为展示外源表位构建嵌合型多价疫苗研究提供重要的实验依据。

Description

PCV2 Loop EF区的突变体、引物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒领域，特别地，涉及一种PCV2 LoopEF的突变体。此外，本发明还涉及一种包括上述PCV2 Loop EF的突变体的引物及其制备方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，简称PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)，是一类无囊膜、正十二面体的单链环状DNA病毒，基因组大小约为1.7Kb。目前PCV有3个基因型，分别为猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1，简称PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus 2，简称PCV2)及最新发现的猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3，简称PCV3)。据相关报道证实，PCV1不具有致病性，而PCV2则可产生许多相关疾病，而PCV3是否具有致病性仍在进一步探究中。
PCV2是猪圆环病毒相关性系统疾病(PCV2-systemic disease)的主要病原，在世界普遍流行，常与其他病原混合感染，造成巨大的经济损失。Cap蛋白(capsid protein)是PCV2的衣壳蛋白和主要的抗原决定簇，60个Cap蛋白亚基能够在体外自主组成一个正二十面体、直径约为17nm的病毒样颗粒(VLPs)，可诱导机体产生免疫反应(赵晓云.PCV2病毒样颗粒疫苗的制备及免疫原性研究[D]；扬州大学,2014.)。目前已证实Cap蛋白也是PCV3的主要抗原决定簇，其功能的进一步研究还在进行中。PCV2 Cap单体由8个β-折叠片组成，正确折叠后形成一个典型的jelly-roll结构，β-折叠结构由7个loops环连接而成，即loopBC、loop CD、loop DE、loop EF、loop FG和loop HI(KHAYAT R,BRUNNN,SPEIRJA,etal.The2.3-angstrom structure of porcine circovirus2[J].Journal ofvirology,2011,85(15):7856-62.)。由于PCV2是非囊膜病毒，loops结构在病毒入侵、病毒与宿主细胞受体的相互作用以及随后的病毒内化等过程起到了关键性的作用，并且capsid表面许多氨基酸是中和抗体的识别表位及关键位点。
猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus，简称PPV)引起的疾病，以初产母猪的繁殖障碍，例如屡配不孕、流产和死胎等，仔猪皮肤炎症和肠炎型腹泻为主要特征。PPV1含有2个主要开放阅读框：ORF1编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3，ORF2编码结构蛋白VP1、VP2和VP3(宋文博.表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病病毒构建及其特性研究[D]；华中农业大学,2017)，研究表明VP2蛋白在诱发病毒中和抗体中发挥主导作用。
相对于弱毒疫苗、灭活疫苗和以Cap蛋白为基础的亚单位疫苗而言，VLPs具有更强的免疫原性和更高的生物安全性，以PCV2 VLPs为主要成分的疫苗相继开发生产。李艳丽等(李艳丽,曹轶梅,卢曾军,等.N端嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达及其免疫原性[J].中国兽医科学,2013,9:907-14.)将口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)的中和表位替换PCV2衣壳蛋白N端的核定位信号序列，结果表明PCV2N端不适合插入FMDV中和表位。Zhang等(ZHANG H,QIAN P,LIU L,et al.Virus-likeparticles of chimeric recombinant porcine circovirus type 2as antigen vehiclecarrying foreign epitopes[J].Viruses,2014,6(12):4839-55.)结合猪瘟B细胞线性表位和T细胞表位形成新的抗原表位，替换PCV2衣壳蛋白N端的核定位信号序列，未产生猪瘟抗体，结果表明缺失核定位信号序列的PCV2 Cap蛋白的N端不适合插入外来抗原表位。PCV2capsid表面loops结构的研究受到越来越多的重视，已成为PCV2疫苗、抗体识别，特别是PCV2细胞侵染机理及分子致病机理研究领域的热点之一。
到目前为止，对于loops结构的功能仍知之甚少，位于capsid最外表面的loops结构，有可能不是核衣壳组装的关键元件，在应用中可以作为外源功能肽或抗原决定簇插入的靶点，从而将外源功能肽或抗原决定簇展示于PCV2核衣壳的表面。
发明内容
本发明提供了一种PCV2 Loop EF区的突变体、引物及其制备方法和应用，以解决现有技术中loops结构在PCV2组装过程中作用机理不清楚，无法为外源功能肽或抗原表位引入提供支持的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种PCV2 Loop EF区的突变体，Loop EF区第133位丙氨酸形成供外源表位替换和/或插入的可突变位点以便体外组装成完整的VLPs。
进一步地，PCV2 Loop EF区可突变位点可用于外源抗原表位插入和/或替换；外源抗原表位插入于Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间；外源抗原表位插入于Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间；外源抗原表位替换Loop EF区第133位丙氨酸；Loop EF区第132位氨基酸为赖氨酸，Loop EF区第134位氨基酸为天冬氨酸或苏氨酸。
进一步地，在Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S1；或者，将Loop EF区第133位丙氨酸替换成PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S2；或者，在Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S3；PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
根据本发明的另一方面，还提供了一种PCV2 Loop EF区的突变体扩增的引物，引物S1-R核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物S1-F核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者，引物S2-R核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物S2-F核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或者，引物S3-R核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物S3-F核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述PCV2 Loop EF区的突变体的制备方法，包括以下步骤：
针对Loop EF区的突变体，利用DNAstar设计相关引物，引物S1-R核苷酸序列如SEQID NO：1所示，引物S1-F核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者引物S2-R核苷酸序列如SEQID NO：3所示，引物S2-F核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或者引物S3-R核苷酸序列如SEQID NO：5所示，引物S3-F核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
利用over-lap PCR技术和胶回收得到突变体的目的片段；
将突变体的目的片段插入到载体中得到重组表达质粒；
将表达质粒转化进入表达菌株中得到重组基因工程菌；
将重组基因工程菌进行发酵诱导、破损，分离得到Loop EF区的突变体。
进一步地，还包括PCV2 Loop EF区中突变位点的筛选，筛选步骤包括：对PCV2 Cap蛋白进行三维结构同源建模，发现Loop EF区130VTKATRLT137氨基酸序列位于PCV2 VLPs的外表面，并将PCV1、PCV2和PCV3毒株的氨基酸序列比对分析，通过氨基酸序列比对发现第133位不带电荷的丙氨酸在PCV3毒株中缺失，在PCV1毒株中对应为丝氨酸，在PCV2毒株中是不严格保守的丙氨酸或丝氨酸；对Loop EF区第133位丙氨酸位点突变预测，该位点可以突变成多个带不同电荷或不同极性的氨基酸，而且不同电荷或不同极性氨基酸的突变会对PCV2免疫原性有不同的影响，因此，选取第133位丙氨酸可作为PCV2 Loop EF的可供外源表位插入和/或替换的候选位点。
进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤包括：将Loop EF区的突变体进行镍柱层析纯化，得到Loop EF区的突变体蛋白。
进一步地，将Loop EF区的突变体蛋白在体外进行VLPs组装，获得病毒样颗粒。
根据本发明的另一方面，还提供了一种猪圆环病毒和/或猪细小病毒抗体，包括上述PCV2 Loop EF的突变体作为抗原检测猪圆环病毒和/或猪细小病毒抗体。
根据本发明的另一方面，还提供了一种外源抗原表位载体，包括上述PCV2 LoopEF的突变体的PCV2 Loop EF区作为外源抗原表位载体。
根据本发明的另一方面，还提供了一种多价基因工程疫苗，包括上述PCV2 LoopEF的突变体作为抗原形成多价基因工程疫苗。
本发明具有以下有益效果：
本发明的PCV2 Loop EF区的突变体，Loop EF区第133位丙氨酸形成供外源表位替换和/或插入的可突变位点以便体外组装成完整的VLPs。电镜结果表明，Loop EF中第133位氨基酸的突变不影响VLPs组装，表明PCV2 VLPs Loop EF展示外源抗原表位具有可行性。并保证外源功能肽或抗原决定簇稳定的插入Loop EF区内，符合正二十面体的PCV2 VLPs的基本条件，说明PCV2 Loop EF区突变体稳定性高。为Loop EF区结构功能研究奠定基础，同时也为展示外源表位构建嵌合型多价疫苗研究提供重要的实验依据。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的PCVs Cap氨基酸序列比对示意图；
图2是本发明优选实施例的PCV2 Cap蛋白亚基和VLP 3D模拟示意图；
图3是本发明优选实施例的突变体目的片段PCR扩增示意图；
图4是本发明优选实施例的重组质粒的酶切鉴定示意图；
图5是本发明优选实施例的重组蛋白SDS-PAGE电泳示意图；
图6是本发明优选实施例的重组蛋白Western Blotting鉴定示意图；以及
图7是本发明优选实施例的电镜观察VLPs形态示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
图1是本发明优选实施例的PCVs Cap氨基酸序列比对示意图；图2是本发明优选实施例的PCV2 Cap蛋白亚基和VLP 3D模拟示意图；图3是本发明优选实施例的突变体目的片段PCR扩增示意图；图4是本发明优选实施例的重组质粒的酶切鉴定示意图；图5是本发明优选实施例的重组蛋白SDS-PAGE电泳示意图；图6是本发明优选实施例的重组蛋白WesternBlotting鉴定示意图；图7是本发明优选实施例的电镜观察VLPs形态示意图。
本发明的优选实施例提供了一种PCV2 Loop EF区的突变体，Loop EF区第133位丙氨酸形成供外源表位替换和/或插入的可突变位点以便体外组装成完整的VLPs。本发明的PCV2Loop EF区的突变体，Loop EF区第133位丙氨酸形成供外源表位替换和/或插入的可突变位点以便自组装成完整的VLPs。电镜结果表明，Loop EF中第133位氨基酸的突变不影响VLPs组装，表明PCV2 VLPs Loop EF展示外源抗原表位具有可行性。并保证外源功能肽或抗原决定簇稳定的插入Loop EF区内，符合正二十面体的PCV2 VLPs的基本条件，说明PCV2LoopEF区突变体稳定性高。为Loop EF区结构功能研究奠定基础，同时也为展示外源表位构建嵌合型多价疫苗研究提供重要的实验依据。
上述PCV2 Loop EF区的突变体，外源表位插入和替换可以同时进行，形成多价疫苗。扩大PCV2 Loop EF区的突变体的应用范围。
本实施例中，PCV2 Loop EF区可突变位点可用于外源抗原表位插入和/或替换，外源抗原表位插入于Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间；外源抗原表位插入于Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间；外源抗原表位替换Loop EF区第133位丙氨酸；Loop EF区第132位氨基酸为赖氨酸，Loop EF区第134位氨基酸为天冬氨酸或苏氨酸。
本实施例中，在Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S2；或者，将Loop EF区第133位丙氨酸替换成PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S1；或者，在Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S3；PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。上述PPV1 VP2 B细胞基于Jianhui Sun等(SUN J,HUANG L,WEI Y,et al.Identification of three PPV1 VP2protein-specific B cell linearepitopes using monoclonal antibodies against baculovirus-expressedrecombinant VP2 protein[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2015,99(21):9025-9036.)利用3个PPV1 VP2单克隆抗体和PEPSCAN技术分析鉴定，发现228QQITDA233是PPV1 VP2的最小B细胞线性抗原表位，进行氨基酸序列的优化及修饰，获得SEQ ID NO：7。
根据本发明的另一方面，还提供了一种PCV2 Loop EF区的突变体扩增的引物，引物S1-R核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物S1-F核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者，引物S2-R核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物S2-F核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或者，引物S3-R核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物S3-F核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。上述引物的设计，依据在Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞、Loop EF区第133位丙氨酸替换成PPV1 VP2 B细胞、Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞，利用DNAstar设计特异引物，进行PCV2 Loop EF区的突变体的扩增。
根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述PCV2 Loop EF区的突变体的制备方法，包括以下步骤：
针对Loop EF区的突变体，利用DNAstar设计相关引物，引物S1-R核苷酸序列如SEQID NO：1所示，引物S1-F核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者引物S2-R核苷酸序列如SEQID NO：3所示，引物S2-F核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或者引物S3-R核苷酸序列如SEQID NO：5所示，引物S3-F核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
利用over-lap PCR技术和胶回收得到突变体的目的片段；
将突变体的目的片段插入到载体中得到重组表达质粒；
将表达质粒转化进入表达菌株中得到重组基因工程菌；
将重组基因工程菌进行发酵诱导、破损，分离得到Loop EF区的突变体。
上述PCV2 Loop EF区的突变体，通过在PCV2 Loop EF区的可突变位点插入或替换外源抗原表位，将突变体的目的片段插入到载体中获得重组表达质粒，再通过转化、表达、发酵和分离等工艺获得Loop EF区的突变体，其操作方法简单，能介导外源基因稳定高效的表达。
如图1和图2所示，本实施例中，还包括PCV2 Loop EF区中突变位点的筛选，筛选步骤包括：对PCV2 Cap蛋白进行三维结构同源建模，发现Loop EF区130VTKATRLT137氨基酸序列位于PCV2 VLPs的外表面，并将PCV1、PCV2和PCV3毒株的氨基酸序列比对，通过氨基酸序列比对发现第133位不带电荷的丙氨酸在PCV3毒株中缺失，在PCV1毒株中对应为丝氨酸，在PCV2毒株中是不严格保守的丙氨酸或丝氨酸；对Loop EF区第133位丙氨酸位点突变预测，该位点能够突变成多个带不同电荷或不同极性的氨基酸，而且不同电荷或不同极性氨基酸的突变会对PCV2免疫原性有不同的影响。第133位丙氨酸可作为PCV2 Loop EF的可供外源表位插入和/或替换的候选位点。
如图2所示，经过前期研究发现，Loop EF环长度为24个氨基酸，长loops环对稳定PCV2 capsid结构有重要作用(PCV2 Capsid晶体结构PDB数据库登录号：3R0R)。与Loop CD相类似，Loop EF的部分氨基酸位于PCV2病毒粒子的表面，并且高度不保守。根据序列的保守性，Loop EF可以大致分为3个片段。第一个片段包含6个氨基酸(124～129)，除第127位氨基酸外，其他5个氨基酸在PCV1和PCV2之间均是保守的，其中第127、128、129位于病毒粒子的表面；第2个片段含有从130位至137位的8个氨基酸，这8个氨基酸充分地暴露在病毒粒子表面，此片段的氨基酸残基在PCV1和PCV2之间高度不保守，但在PCV1毒株中相对较保守；第3个片段的氨基酸残基除了第138位的酪氨酸，其他全部处于病毒粒子的内部，且在此片段上的氨基酸在PCV1和PCV2都是高度保守。经过上述分析，将Loop EF中的第2个片段作为主要研究对象。
本实施例中，还包括纯化步骤，纯化步骤包括：将Loop EF区的突变体进行镍柱层析纯化，得到Loop EF区的突变体蛋白。上述纯化步骤采用镍柱填料，室温条件下，利用含低浓度和高浓度的咪唑作为洗脱液，分别洗脱非目的蛋白和目的蛋白，获得Loop EF区的突变体蛋白。
本实施例中，将Loop EF区的突变体蛋白在体外进行VLPs组装，获得病毒样颗粒。
根据本发明的另一方面，还提供了一种猪圆环病毒和/或猪细小病毒抗体，包括上述PCV2 Loop EF的突变体作为抗原检测猪圆环病毒和/或猪细小病毒抗体。
根据本发明的另一方面，还提供了一种外源抗原表位载体，包括上述PCV2 LoopEF的突变体的PCV2 Loop EF区作为外源抗原表位载体。上述PCV2 Loop EF区不仅限于插入PPV1 VP2 B细胞，也可插入其他外源表位的基因片段，进行多功能的表位，为多种外源抗原表位的PCV2嵌合VLPs的分子设计奠定结构信息基础，为研究表位展示疫苗提供依据。
根据本发明的另一方面，还提供了一种多价基因工程疫苗，包括上述PCV2 LoopEF的突变体作为抗原形成多价基因工程疫苗。上述Loop EF中第133位氨基酸的突变不影响VLPs组装，表明PCV2 VLPs Loop EF展示外源抗原表位具有可行性，也为展示外源表位构建嵌合型多价疫苗研究提供重要的实验依据。
实施例1
pET100-PCV2质粒、PCV2阳性血清、感受态细胞均为实验室自备。
EasyTaq聚合酶购自北京全式金公司；Gel Extraction Kit(DNA胶纯化试剂盒)、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。
DL 2000Marker、DL 5000Marker(DNA分子量标准)购自TaKaRa公司。
26619、26616(蛋白分子量标准)、限制性内切酶、T4连接酶、AP显色液均购自ThermoFisher公司。
其他为市销。
1-1、PCV2 VLPs的3D结构模拟及Loop EF区有效位点的筛选
首先以PCV2 Cap蛋白(PDBID：3R0R)为模板，利用Modeller蛋白质分子模拟软件(版本号9.17；https://salilab.org/modeller/)对PCV2 Cap蛋白进行三维结构同源建模。所有蛋白质三维结构用蛋白质结构软件Pymol(版本号1.8.4.0；https://www.pymol.org/)进行展示和标记。结合PCV1、PCV2与PCV3毒株的氨基酸序列比较分析(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin)和Loop EF有效位点的突变预测(http://www.iedb.org)。
如图1和图2所示，分析结果可知，Loop EF区130VTKATRLT137氨基酸序列位于PCV2VLPs的外表面，且在PCV1、PCV2和PCV3毒株的氨基酸序列比对发现，第133位不带电荷的丙氨酸(A)在PCV3中缺失，在PCV1中对应为丝氨酸(S)，而且在PCV2毒株中是不严格保守的(A或S)，提示该位点可能不是核衣壳组装的关键氨基酸位点。同时利用位点突变预测在线服务器发现133位丙氨酸可以突变成多个带不同电荷和不同极性氨基酸，而上述突变经IEDB数据库分析发现，不同的突变对应的Median Difference数值不同，结果如表1所示。MedianDifference数值增大，表明突变后PCV2的预测的免疫原性有降低趋势，提示不同电荷和不同极性氨基酸的突变可能会影响PCV2免疫原性。上述结果表明第133位丙氨酸可作为PCV2Loop EF的可供外源表位插入或替换的候选位点。
表1第133位丙氨酸氨基酸替换突变预测
1-2、PCV2 Loop EF区的突变体扩增的引物设计
在Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S1；
PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
利用DNAstar设计引物，送至长沙擎科公司合成，
引物S1-R核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，
引物S1-F核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，
引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，
引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
1-3、突变体的目的片段
采用pET100-PCV2质粒为模板，通过over-lap PCR技术利用引物F、S1-R扩增A片段，利用引物S1-F、R扩增B片段；然后以A、B片段为模板，利用引物F、R扩增PCV2-Cap-S1基因序列。
扩增A和B片段的PCR反应体系：pET100-PCV2质粒1μL，2×高保真PCR酶25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，双蒸水20μL；PCR温度与循环的设定：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环扩增，最后72℃延伸7min。
扩增目的片段的PCR反应体系：A片段4μL，B片段4μL，2×高保真PCR酶25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，双蒸水13μL；PCR温度与循环的设定：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，进行35个循环扩增，最后72℃延伸7min。将50μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段进行凝胶电泳检测。
1-4、重组表达质粒及重组基因工程菌的构建
利用BamHI和NdeI对pET100载体和胶回收产物的进行双酶切反应1h，回收酶切产物，载体与目的片段按照1:3比例，在22℃条件下进行连接。然后将连接产物导入大肠杆菌DH5α中进行转化，转化后的菌液均匀涂在含100μg/ml氨苄霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养，挑取单克隆菌落在37℃条件下5mL含氨苄霉素的LB液体培养基中培养14h～16h，最后利用质粒试剂盒进行质粒提取，对提取的质粒进行BamHI和NdeI双酶切验证，验证成功的质粒送去公司进行DNA测序验证，序列对比正确，获得重组表达质粒。
将测序成功的质粒转入大肠杆菌BL21，转化后的菌液均匀涂在含100μg/ml氨苄霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养，获得重组基因工程菌。
1-5、重组蛋白的分离纯化
挑取单克隆菌落在37℃条件下10mL含氨苄霉素的LB液体培养基中培养14h～16h，将菌液倒至1LTB液体培养基中，37℃220rpm/min震荡培养至OD600nm值为0.6～0.8，加入终浓度为1mM IPTG在37℃条件下180rpm/min诱导7h，4500rpm/min条件下收集菌液，弃掉上清液，加入裂解液进行裂解收集总蛋白，然后进行超声波破碎，13800rpm/min 4℃条件下离心收集上清液，将上清液与镍柱填料层析纯化，室温结合1h，利用含低浓度和高浓度的咪唑洗脱目的蛋白并收集8管1mL的重组蛋白，重组蛋白密封在无菌离心管中放置于4℃保存。
1-6、重组蛋白的SDS-PAGE电泳及Western Blotting鉴定
将上述收集的蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将SDS-PAGE胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上，用1％BSA封闭1h，以1％BSA为溶剂分别稀释PCV2阳性血清(1:500)和AP标记的二抗抗体(1:5000)，PCV2阳性血清室温孵育1h后，用PBST(PBS含0.05％吐温-20)清洗3次，每次5min，然后加入稀释好的二抗在室温条件下孵育1h，同上述的步骤，用PBST进行清洗。然后加入1mLAP显色液反复吹洗，进行显色拍照。
1-7、重组蛋白体外VLPs组装与电镜观察
将纯化鉴定好的蛋白在PBS中透析处理48h，10000g/min条件下离心5min，取上清液在4℃保存。
取20uL放置于铜网上，液体充分吸收后用3％的钨磷酸负染8min，待完全干燥后置于电镜(飞利浦CM100)观察VLPs的状态。
实施例2
2-1、PCV2 Loop EF区的突变体扩增的引物设计
将Loop EF区第133位丙氨酸替换成PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S2；
PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；
利用DNAstar设计引物，送至长沙擎科公司合成，
引物S2-R核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，
引物S2-F核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，
引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，
引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
其他步骤与实施例1相同。
实施例3
3-1、PCV2 Loop EF区的突变体扩增的引物设计
在Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间插入PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S3；
PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；
利用DNAstar设计引物，送至长沙擎科公司合成，
引物S3-R核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，
引物S3-F核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，
引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，
引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
其他步骤与实施例1相同。
检测结果如下所示：
如图3所示，琼脂糖电泳结果分析表明3个突变体目的条带大小与预期相符。
如图4所示，重组质粒通过限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ的双酶切鉴定，可见两条大小不一致的DNA条带，在5000bp的位置出现第一个条带(载体片段)，在750bp的位置出现第二个条带(目的片段)，该结果与预期相符，随后将酶切验证成功的质粒送至公司鉴定，测序结果正确，表明3个突变体目的片段成功连接到pET100载体。
如图5所示，通过镍柱层析纯化后的蛋白SDS-PAGE结果分析可知，纯化后的突变体蛋白分子质量(约26.2KD)大于野生型蛋白(约25.3KD)，证明在大肠杆菌原核表达系统中成功表达了可溶性的突变体蛋白，并纯化成功。
如图6所示，经过Western-blot蛋白免疫印迹反应，可知突变体蛋白能够被抗Cap蛋白的一抗识别，证明在大肠杆菌原核表达系统中成功表达纯化了可溶性的突变体蛋白，不影响抗体对其的识别能力。
如图7所示，电镜结果显示野生型PCV2 Cap蛋白和其他3个突变体蛋白均可在体外条件下组装成正二十面体的结构，直径大小约为17nm的病毒样颗粒，形状与野生型PCV2VLPs一致。Loop EF中第133位丙氨酸的突变不影响VLPs正确组装。结果表明，非保守的单个133位丙氨酸是VLPs组装过程中的非必需氨基酸。插入或者替换PPV1 VP2 B细胞线性抗原表位后，PCV2 VLPs可正确组装，说明Loop EF的位点，即Loop EF的第133位丙氨酸，对于外源片段的插入或替换具有包容性。
如图3泳道：M、marker，1、PCV2-Cap-S1目的片段，2、PCV2-Cap-S2目的片段，3、PCV2-Cap-S3目的片段。
如图4泳道：M、marker，1～3、PCV2-Cap-S1酶切产物，4～6、PCV2-Cap-S2酶切产物，7和8、PCV2-Cap-S3酶切产物。
如图5泳道：M1、marker，1、野生型PCV2 Cap蛋白，2、突变体PCV2-Cap-S1蛋白，3、突变体PCV2-Cap-S2蛋白，4、突变体PCV2-Cap-S3蛋白。
如图6泳道：M2、marker，1、野生型PCV2 Cap蛋白，2、突变体PCV2-Cap-S1蛋白，3、突变体PCV2-Cap-S2蛋白，4、突变体PCV2-Cap-S3蛋白。
如图7：A、野生型PCV2 VLPs，B、突变体PCV2-Cap-S1 VLPs，C、突变体PCV2-Cap-S2VLPs，D、突变体PCV2-Cap-S3VLPs。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> PCV2 Loop EF区的突变体、引物及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgccagcg tcggtaatct gctggctgcc tttagtaacg aagttgtcat ccag 54
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttactaaagg cagccagcag attaccgacg ctggcagcgc caccgctctg acttacgacc 60
c 61
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgccagcg tcggtaatct gctggctgcc tttagtaacg aagttgtcat ccag 54
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttactaaagg cagccagcag attaccgacg ctggcagcac cgctctgact tacgacccgt 60
ac 62
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgccagcg tcggtaatct gctggctgcc ggctttagta acgaagttgt catc 54
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tactaaagcc ggcagccagc agattaccga cgctggcagc accgctctga cttacgaccc 60
gtac 64
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcagccagc agattaccga cgctggcagc 30
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttccatatgc ggggttctca tcatcatcat catcatggta tggc 44
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgggatcct tatcacgggt tcagcggtgg gtc 33

Claims (11)

1.一种PCV2 Loop EF区的突变体，其特征在于，Loop EF区第133位丙氨酸形成供外源表位替换和/或插入的可突变位点以便在体外组装成完整的VLPs。
2.根据权利要求1所述的PCV2 Loop EF区的突变体，其特征在于，
所述PCV2 Loop EF区可突变位点用于外源抗原表位插入和/或替换；
所述外源抗原表位插入于Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间；
所述外源抗原表位插入于Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间；
所述外源抗原表位替换Loop EF区第133位丙氨酸；
所述Loop EF区第132位氨基酸为赖氨酸，所述Loop EF区第134位氨基酸为天冬氨酸或苏氨酸。
3.根据权利要求2所述的PCV2 Loop EF区的突变体，其特征在于，
在Loop EF区第132位氨基酸与第133位氨基酸之间插入PPV1VP2B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S1；或者
将Loop EF区第133位丙氨酸替换成PPV1VP2B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S2；或者
在Loop EF区第133位氨基酸与第134位氨基酸之间插入PPV1VP2B细胞线性抗原表位，即PCV2-Cap-S3；
所述PPV1VP2B细胞线性抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
4.一种PCV2 Loop EF区的突变体扩增的引物，其特征在于，
引物S1-R核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物S1-F核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者
引物S2-R核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物S2-F核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或者
引物S3-R核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物S3-F核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
5.一种权利要求1至3任一项所述PCV2 Loop EF区的突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对Loop EF区的突变体，利用DNAstar设计引物，引物S1-R核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物S1-F核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者，引物S2-R核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物S2-F核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或者，引物S3-R核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物S3-F核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，引物R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
利用over-lap PCR技术和胶回收得到突变体的目的片段；
将突变体的目的片段插入到载体中得到重组表达质粒；
将所述表达质粒转化进入表达菌株中得到重组基因工程菌；
将所述重组基因工程菌进行发酵诱导、破损，分离得到所述Loop EF区的突变体。
6.根据权利要求5所述的PCV2 Loop EF区的突变体的制备方法，其特征在于，还包括PCV2Loop EF区中突变位点的筛选，所述筛选步骤包括：
对PCV2Cap蛋白进行三维结构同源建模，发现Loop EF区130VTKATRLT137氨基酸序列位于PCV2VLPs的外表面，并将PCV1、PCV2和PCV3毒株的氨基酸序列比对，通过氨基酸序列比对发现第133位不带电荷的丙氨酸在PCV3毒株中缺失，在PCV1毒株中对应为丝氨酸，在PCV2毒株中是不严格保守的丙氨酸或丝氨酸；
对Loop EF区第133位丙氨酸位点突变预测，可以突变成多个带不同电荷或不同极性的氨基酸，而且不同电荷或不同极性氨基酸的突变会对PCV2免疫原性有不同的影响，因此，第133位丙氨酸可作为PCV2 Loop EF的可供外源表位插入和/或替换的候选位点。
7.根据权利要求5所述的PCV2 Loop EF区的突变体的制备方法，其特征在于，还包括纯化步骤，所述纯化步骤包括：
将Loop EF区的突变体进行镍柱层析纯化，得到Loop EF区的突变体蛋白。
8.根据权利要求7所述的PCV2 Loop EF区的突变体的制备方法，其特征在于，
将Loop EF区的突变体蛋白在体外进行VLPs组装，获得病毒样颗粒。
9.一种猪圆环病毒和/或猪细小病毒抗体，根据权利要求3所述的PCV2 Loop EF的突变体作为抗原检测猪圆环病毒和/或猪细小病毒抗体。
10.一种外源抗原表位载体，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的PCV2 LoopEF的突变体的PCV2 Loop EF区作为外源抗原表位载体。
11.一种多价基因工程疫苗，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的PCV2 LoopEF的突变体作为抗原形成多价基因工程疫苗。
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