CN109932504B - 用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，属于生物诊断技术领域，本发明试剂盒包括捕获抗体(4H81F11抗体)和检测抗体(生物素标记的4E121F3抗体)，捕获抗体和检测抗体均能良好识别SCRV病毒，4H81F11抗体和4E121F3抗体具有不同的表位，在此基础上，建立了一种用于检测SCRV病毒的双抗体夹心ELISA法。

Description

用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒

技术领域

本发明属于生物诊断技术领域，尤其涉及用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒。

背景技术

鳜鱼弹状病毒病是由鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV) 引起并对鳜鱼(Siniperca chuatsi)有高危影响。鳜鱼弹状病毒病发病迅速且死亡率高，严重影响我国鳜鱼养殖业。鳜鱼弹状病毒是弹状病毒(rhabdoviruses) 中的一种，弹状病毒是一类有包膜且不分节的单股负链RNA病毒。目前国际病毒分类委员会(InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses,ICTV)将弹状病毒分为18个属，但还有一些尚未分类[1]。第一株鱼类弹状病毒是1962年由丹麦的Jensen等从患病虹鳟鱼体中分离得到[2]，现在已知的鱼类弹状病毒有二十多种。

弹状病毒有五种蛋白，分别为N、P、M、G、L，它们依次编码核蛋白 (nucleoprotein,N)，磷酸化蛋白(P)，M蛋白(matrix protein,M)，糖蛋白 (glycoprotein,G)，RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymer rase protein,L)。其中，G蛋白是编码抗原的主要蛋白，可以激发宿主细胞产生免疫应答并产生抗体，G蛋白也与病毒毒力相关。

然而，现在尚没有用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，采用双抗体夹心ELISA法进行定量检测鳜鱼病毒。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于分泌鳜鱼弹状病毒抗体的杂交瘤细胞株，其命名为弹状病毒单抗细胞株4H81F11，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2019年1 月8日，保藏编号为CCTCC NO:C201917。

另外，本发明还提供一种用于分泌鳜鱼弹状病毒抗体的杂交瘤细胞株，其命名为弹状病毒单抗细胞株4E121F3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2019年1月8日，保藏编号为CCTCC NO:C201918。

另外，本发明还提供一种鳜鱼弹状病毒的捕获抗体，所述捕获抗体由弹状病毒单抗细胞株4H81F11分泌，弹状病毒单抗细胞株4H81F11已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2019年1月8 日，保藏编号为CCTCC NO:C201917。

另外，本发明还提供一种鳜鱼弹状病毒的检测抗体，所述检测抗体由弹状病毒单抗细胞株4E121F3分泌，弹状病毒单抗细胞株4E121F3已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2019年1月8 日，保藏编号为CCTCC NO:C201918。

另外，本发明还提供一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，其包括所述的捕获抗体和所述的检测抗体。

作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还包括亲和素标记的酶和底物，所述捕获抗体包被在Elisa孔板中，所述检测抗体标记有生物素。

作为上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括用于稀释鳜鱼弹状病毒的样品稀释液、封闭液、洗涤液、终止液、阴性对照品和阳性对照品，所述封闭液为2％BSA。

作为上述技术方案的更进一步改进，亲和素标记有辣根过氧化酶。

作为上述技术方案的更进一步改进，所述捕获抗体的浓度为2μg/ml，所述检测抗体稀释成1:400，所述亲和素标记的辣根过氧化酶稀释成1:4000。

本发明的有益效果在于：本发明提供用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，试剂盒包括捕获抗体(4H81F11抗体)和检测抗体(生物素标记的4E121F3抗体)，捕获抗体和检测抗体均能良好识别SCRV病毒，4H81F11抗体和4E121F3抗体具有不同的表位，在此基础上，建立了用于检测SCRV病毒的双抗体夹心ELISA 法；另外，并对检测方法进行验证，实验结果可靠；本发明为SCRV病毒定量检测试剂盒的开发，以及对疾病监测和疫苗的效果监测提供了技术基础。

附图说明

图1为SCRV病毒的SDS-PAGE电泳图，1表示SCRV病毒，M表示marker；

图2为重组G蛋白的SDS-PAGE电泳图，1表示重组G蛋白，M表示marker；

图3间接ELISA法测定小鼠血清效价；其中，图3A是以重组G蛋白包被酶标板，3B是SCRV病毒包被酶标板；

图4显示SCRV病毒与重组G蛋白对杂交瘤细胞株的筛选；

图5为腹水制备的抗体纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，1表示腹水制备的8G31H2抗体，由杂交瘤细胞8G31H2分泌，2表示腹水制备的4E121F3 抗体，由杂交瘤细胞株4E121F3分泌，3表示腹水制备的4H81F11抗体，由杂交瘤细胞株4H81F11分泌，M表示marker；

图6显示腹水制备的8G31H2抗体、4E121F3抗体和4H81F11抗体识别重组G蛋白和SCRV病毒的结果；其中，图6A为8G31H2抗体，图6B为4E121F3 抗体，图6C为4H81F11抗体；

图7显示生物标记的4E121F3抗体的稀释倍数；

图8显示生物标记的4E121F3抗体的表位测试；

图9为双抗体夹心ELISA法的标准曲线；

图10显示不同滴度病毒抗原浓度的检测。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实验和附图对本发明作进一步说明。

材料与方法

细胞、病毒、菌株与实验动物

鳜鱼脑组织细胞系(CPB)由本实验室建立并保藏[3]；鳜鱼弹状病毒(SCRV) QY株由本实验室分离保存[3]；重组菌pet-β2M-SCRV/BL21由本实验室构建保存；鼠骨髓瘤细胞株SP2/0由本实验室冻存；Balb/c小鼠购置于湖北省实验动物研究中心，等级SPF级，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。

实验试剂

培养基Hyclone DMEM、L-15以及胎牛血清购自Thermo公司；PEG1450为 MERCK公司产品；蔗糖、HAT培养基、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂由Sigma 公司提供；生物素标记羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记亲和素购自金斯瑞公司；单克隆抗体分型试剂盒购自ThermoScientific公司；亲核层析柱料购自GE Healthcare；PBS、ELISA试剂购自博士德生物公司。

病毒培养及纯化

将SCRV以MOI＝0.01同步接种至CPB细胞，当细胞产生90％病变后收毒，采用蔗糖密度梯度离心法进行病毒纯化。于4℃以4400×g离心20min；取上清，于4℃以32000rpm离心2h，弃上清；用适量TN buffer(50Mm Tris-HCl且pH 值为7.4，150mM NaCl)重悬沉淀，将病毒液铺在不连续蔗糖梯度(10％，20％， 35％，50％)垫上，4℃、28000rpm、离心1.5h；收集病毒条带，补加TN缓冲液，30000rpm、4℃、2h；弃上清，加入TN缓冲液，重悬病毒。SDS-PAGE 检测纯化病毒质量。

如图1所示，SDS-PAGE结果显示纯化病毒有多条蛋白条带，主要的抗原分布在约40～55kDa的位置，其中G蛋白分子量是45kDa，占病毒蛋白总量的 40％～50％左右，与前期报道相符。

重组G蛋白的表达及纯化

挑取含重组质粒的单菌落(pet-β2M-SCRV G蛋白/BL21)至3ml液体LB培养基(kan⁺)；取过夜培养菌液加入到LB培养基中(1％接种)，37℃震荡培养至OD600约0.6，加入IPTG，继续震荡培养3h；6000g离心10min收集菌体；将菌体悬浮于40ml预冷的NTA-0缓冲液中，冰浴超声波破碎细菌，经Ni2⁺亲和层析法纯化后冻存于-80℃备用。

对纯化后的重组G蛋白稀释10倍进行SDS-PAGE检测，如图2所示，表达纯化的重组G蛋白在45kDa位置，并与SCRV病毒G蛋白一致。

动物免疫及细胞融合

以纯化的SCRV病毒及重组G蛋白作为抗原，分别免疫小鼠1-A，1-B，1-C， 1-D和2-A，2-B，2-C，2-D。抗原与等体积完全佐剂(一免)和不完全佐剂(加强免疫)混合乳化后，皮下多点注射免疫小鼠，剂量为50μg/只，每次免疫间隔 14d，免疫4次。免疫完成后取血清，间接ELISA测定效价。

间接ELISA以1μg/ml蛋白或4μg/ml病毒包被酶标板，4℃放置过夜。次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗1次。加200μl/孔封闭液，37℃放置2h。用洗涤液洗3 次，加待测样品(一抗)：以每孔100μl加入待测样，样品用1×PBS以1:1000， 1:2000，1:4000，1:8000，1:16000等稀释度稀释，温育1h。弃掉待测样品，用洗涤液洗3次。加酶标二抗抗体：加入HRP标记羊抗鼠IgG(1:10000)，100μl/孔， 37℃孵育40min，用洗涤液洗5次。加新鲜配制的底物溶液90μl/孔，37℃暗处放置15min。终止反应，加50μl/孔终止液。颜色变黄，用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。

如图3所示，小鼠血清经效价检测均满足要求。

细胞融合和单克隆抗体筛选

取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取处于对数期的SP2/0细胞，按5:1比例混合，50％PEG1450作用1min，再用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×10⁷/孔铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO₂，37℃下培养。

采用间接ELISA法检测克隆细胞团培养上清液效价，以两种抗原包被，蛋白包被为浓度1μg/ml，病毒包被为浓度10μg/ml，挑出融合板中能识别纯化病毒和重组G蛋白、且检测阳性值高的孔进行有限稀释，挑取单克隆，反复重复此步骤，直至得到能够稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞。

单克隆抗体亚型鉴定

采用Sigma公司的单抗亚类鉴定试剂盒鉴定抗体亚型，即采用间接ELISA法测定杂交瘤培养上清，将SP2/0细胞培养上清作为阴性对照，分别加入抗小鼠IgG1、IgG2a酶标二抗，判断抗体亚类。

将两种免疫原免疫的小鼠均安排融合，共筛选出杂交瘤细胞9株，分别为 4F53E6，8G31H2，12A52B7，2D74C4，3F124B2，6F101F7，5H42G11，4H81F11， 4E121F3。经亚型鉴定结果显示均为单一亚型，4F53E6，8G31H2，3F12 4B2杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG2a；12A5 2B7，2D7 4C4，6F10 1F7，5H4 2G11，4H8 1F11，4E121F3杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1。经间接ELISA检测重组G蛋白、病毒，如图4所示，杂交瘤细胞8G31H2，4H81F11和4E121F3分泌的抗体能同时较好地识别SCRV病毒与重组G蛋白识别的结果较好，所以选取这三种细胞株制备抗体。

单抗腹水制备及单抗表位测试

腹水制备

参考付小哲[4]的方法制备腹水，选用ProteinA-琼脂糖亲和层析柱纯化。先用10倍柱床体积的去离子水冲洗，1ml/min；再用10倍柱体积的1％NaAc冲洗，1ml/min柱子；将腹水，022μl滤膜过滤，加入40ml 1％NaAc，0.5ml/min 上样。洗去杂质，1％NaAc冲洗至无蛋白流出，1ml/min。3.5％冰乙酸冲洗，收集洗脱产物至无蛋白流出。饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性，10kDa超滤管，超滤浓缩至10ml左右，5L 1×PBS透析过夜，第二天换液1次。去离子水冲洗层析柱至中性，5倍柱床体积20％乙醇重新层析柱后，4℃保存。纯化抗体纯度用SDS-PAGE凝胶电泳检测，间接ELISA检测不同浓度的单抗对SCRV病毒和重组G蛋白的识别，蛋白包被浓度为1μg/ml，病毒包被浓度为5μg/ml。单克隆抗体表位测试

先用间接ELISA法测定生物素标记抗体的最适检测浓度，采用竞争性ELISA 法检测抗体配对。以5μg/ml纯化病毒包板，样品为50μl标记抗体加上50μl检测抗体，阴性对照为50μl标记抗体和50μl自身抗体，阳性对照50μl标记抗体和50μl SP2/0培养上清，酶标二抗羊抗鼠IgG稀释1/10000。

杂交瘤细胞株8G31H2制备出腹水4.5ml，杂交瘤细胞株4E121F3制备出腹水4ml，杂交瘤细胞株4H81F11制备出7.5ml。将制备出的腹水进行层析柱纯化，得到的3种抗体进行SDS-PAGE检测，如图5所示，结果均显示出两条带，一条重链(约45KDa)，一条轻链(约25KDa)。杂交瘤细胞株8G31H2、4E121F3、和4H81F11通过腹水制备和纯化后，抗体浓度分别为6.3mg/ml，6mg/ml，4 mg/ml。

用间接ELISA的方法，分别以1μg/ml浓度包被重组G蛋白，以5μg/ml 包被病毒，将三种抗体梯度稀释进行检测。结果如图6所示，8G31H2抗体只对重组G蛋白识别，对病毒识别效果不明显；4E121F3抗体和4H8 1F11抗体对病毒识别明显。

选择4E121F3抗体进行生物素标记，如图7所示，标记后的抗体梯度稀释用间接ELISA法测定最佳稀释比为1:100。再将生物素标记的4E121F3抗体与 4H81F11等5种抗体用间接ELISA法进行表位识别，如图8所示，OD₄₅₀值大于 1，说明4E121F3抗体与4H81F11抗为不同表位，则可以建立双抗体夹心ELISA 检测方法。

双抗夹心ELISA法建立

以4H81F11单克隆抗体作为包被单抗，生物素标记的4E121F3单克隆抗体作为检测抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)作为二抗，选取配对抗体按交叉设计原理确定最佳抗体使用浓度。将纯化的病毒进行2倍系列稀释，用 Curve Expert1.4软件绘制标准曲线，确定线性范围，建立生物素-亲和素双抗体夹心ELISA检测方法。

通过棋盘滴定法等优化确定双抗夹心ELISA法最佳工作条件为:捕获抗体(4H81F11抗体)2μg/ml，检测抗体(4E121F3-Bio)1:400，二抗(HRP-avidin) 1:4000；包被条件：4℃过夜；封闭条件：2％BSA，37℃封闭2h；抗体孵育条件：37℃，孵育1h。如图9所示，该夹心ELISA可能的线性范围为31.25～2000 ng/ml，经Curve Expert1.4分析出有理函数为y＝a+bx+cx^2(a＝-298.274665473， b＝7568.45583642，c＝-5835.60177415，R²＝0.999)。

方法验证

先对实验室收取的病毒进行TCID50的测定，再将病毒二倍梯度稀释作为样品，每个梯度三个副孔，用建立的方法对不同滴度的病毒进行抗原检测，检测结果用CurveExpert1.4软件进行分析。

将病毒从原液开始梯度稀释，用已经建立的ELISA方法进行检测，如图10 所示，结果发现ELISA测定的抗原含量与病毒滴度呈正相关，函数为 y＝a+bx+cx^2(a＝108315.205136；b＝-25228.6270054；c＝1470.95733566； R²＝0.999)。病毒的滴度越高，抗原含量越高，抗原含量可以敏感显示出病毒滴度的变化，说明此检测方法是可靠的。

在此需要说明的是：

1)现有技术普遍使用病毒进行生物感染，而本申请发现分别采用重组G蛋白和SCRV病毒进行感染，后续实验发现识别重组G蛋白的结果不理想，继而从识别SCRV病毒效果较好的杂交瘤细胞中筛选出两株，而且筛选出的4E121F3 抗体与4H81F11具有不同的表位；

2)另外，本发明也筛选过用其他抗体作捕获抗体和检测抗体，发现效果不理想，如4E121F3为捕获抗体，4H81F11为检测抗体。

实施例1

本实施例提供一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，其包括用于稀释鳜鱼弹状病毒的样品稀释液、封闭液、洗涤液、终止液、阴性对照品、阳性对照品、亲和素标记有辣根过氧化酶、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体为4H81F11抗体，检测抗体为生物素标记的4E121F3，捕获抗体包被在Elisa孔板中。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

参考文献

[1]Amarasinghe G.K.,Bao Y.,Basler C.F.,etc.Taxonomy of the orderMononegavirales:update 2017.Arch Virol,2017,162(8):2493-2504.

[2]Jensen M.H..Preparation of fish tissue cμlture for virus research[J].1963.

[3]Fu XZ,Li NQ,Lai YT,et al.A novel fish cell line derived from thebrain of Chinese perch Siniperca chuatsi:development and characterization[J].Journal of Fish Biology,2014,86(1):32-45

[4]付小哲,李宁求,林强,等.鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J].水产学报,2014,38(9),1573-1578.

Claims (5)

1.一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，其特征在于，包括鳜鱼弹状病毒的捕获抗体和鳜鱼弹状病毒的检测抗体；所述鳜鱼弹状病毒的捕获抗体由弹状病毒单抗细胞株4H81F11分泌，弹状病毒单抗细胞株4H81F11已保藏于武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201917；所述鳜鱼弹状病毒的检测抗体由弹状病毒单抗细胞株4E121F3分泌，弹状病毒单抗细胞株4E121F3已保藏于武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201918。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括亲和素标记的酶和底物，所述捕获抗体包被在Elisa孔板中，所述检测抗体标记有生物素。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于稀释鳜鱼弹状病毒的样品稀释液、封闭液、洗涤液、终止液、阴性对照品和阳性对照品，所述封闭液为2％BSA。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，亲和素标记有辣根过氧化酶。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的浓度为2μg/ml，所述检测抗体稀释成1:400，所述亲和素标记的辣根过氧化酶稀释成1:4000。

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