CN101906486A - 检测多种鱼类病原的基因芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测多种鱼类病原的基因芯片及其检测方法。基因芯片的构建是将质控系统的探针和17种鱼类病原的探针点在同一固相载体尼龙膜上制成。17种鱼类病原的探针包括：用于检测14种病毒的探针，用于检测淀粉卵涡边虫和三代虫的探针以及用于检测鱼立克次氏体的探针。本发明的基因芯片的检测是应用地高辛杂交显色方法，根据杂交点是否出现蓝色或蓝紫色来进行信号判断。本发明基因芯片上质控体系的构建保证了检测的特异性和灵敏性，并且可在同一尼龙膜上对多种鱼类病原微生物进行同时检测，具有高通量的特点，可以替代之前的鱼类病原微生物相关检测方法，是现有鱼类病原微生物鉴定技术的突破。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物的病原的分子生物学检测领域，具体涉及一种检测多种鱼类病原的基因芯片及其检测方法。
背景技术
目前，病原微生物检测方法的报道有很多，除了传统的生理生化检测之外，还有免疫学检测如间接荧光抗体技术、核酸印迹杂交及PCR检测等方法。传统的生化鉴定操作繁琐、且需要数天才能得到结果；免疫学方法荧光抗体技术从制样到完成检测只需3～4h，缺点是免疫检测需要制备抗血清；探针杂交技术也存在特异性和灵敏度的问题；常规PCR方法一次只能检出一种致病微生物，而对多种病原感染的样品则显的无从下手。
新近发展起来的基因芯片技术达到在同一个支持物上对多种病原同时进行检测和鉴定的目的，不但大大缩短了检测时间，而且能够提高灵敏度和准确率，弥补了其它分子生物学检测手段的不足。国内在基因芯片技术应用于水产动物疾病检测上也进行了尝试，但尚未见应用该技术同时对鱼类病毒类、原生动物类和鱼立克次氏体等多种病原微生物进行检测的相关基因芯片应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测多种鱼类病原的基因芯片及其检测方法，用于检测淋巴囊肿病毒、流行性造血器官坏死症病毒、鱼细胞肿大病毒、石斑鱼虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒RGNNV型、病毒性神经坏死病毒BFNNV型、病毒性神经坏死病毒SJNNV型、病毒性神经坏死病毒TPNNV型、病毒性神经坏死病毒TNV型、传染性造血器官坏死症病毒、病毒性出血败血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒、獅鱼病毒性腹水病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、淀粉卵涡边虫、三代虫和鱼立克次氏体共17类鱼类病原，以弥补现有技术的不足。
本发明的技术方案包括
一、基因芯片的构建
1、基因芯片上的探针选择
本发明共提供了两大类探针，1)质控体系的探针，包括表面化学质控的探针、阴性对照质控的探针以及杂交阳性外对照质控探针和整个流程监控的阳性内对照质控的探针，同时提供各探针对应的正向引物及反向引物；2)用于检测淋巴囊肿病毒等17类鱼类病原微生物的探针，同时提供各探针对应的正向引物及反向引物。
质控体系各成员，包括表面化学质控、阴性对照质控、杂交阳性外对照质控、整个流程监控的阳性内对照质控的探针引物序列及各病原微生物的探针及其序列信息如下：
(1)表面化学质控QC1探针P序列、正向引物F序列和反向引物A序列分别对应于表1中的序号1、2和3；阴性对照质控QC4探针P序列对应于表1中序号4；杂交阳性外对照质控QC2探针P序列、正向引物F序列和反向引物A序列分别对应于表1中序号5、6和7；整个流程监控的阳性内对照质控QC3探针P序列、正向引物F序列和反向引物A的序列分别对应于表1中序号8、9和10；
表1：质控体系的探针及引物序列信息
其中：“F”表示正向引物序列；“A”表示反向引物序列；“P”表示探针序列；
(2)淋巴囊肿病毒探针序列P、正向引物序列F1、反向引物序列A1、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号1、2、3、4和5；
(3)流行性造血器官坏死症病毒探针序列P、正向引物序列F1、反向引物序列A1、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号6、7、8、9和10；
(4)鱼细胞肿大病毒探针序列P、正向引物序列F1、反向引物序列A1、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号11、12、13、14和15；
(5)石斑鱼虹彩病毒探针序列P、正向引物序列F、反向引物序列A1和反向引物序列A2分别对应于表2中序号16、17、18和19；石斑鱼虹彩病毒另一个探针序列P3、正向引物序列F3和反向引物序列A3分别对应于表2中序号20、21和22；
(6)病毒性神经坏死病毒RGNNV型特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号23、24和25；病毒性神经坏死病毒RGNNV型特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号26、27和28；
(7)病毒性神经坏死病毒BFNNV型特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号29、30和31；病毒性神经坏死病毒BFNNV型特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号32、33和34；
(8)病毒性神经坏死病毒SJNNV型特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号35、36和37；病毒性神经坏死病毒SJNNV型特征基因探针序列P2、、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号38、39和40；
(9)病毒性神经坏死病毒TPNNV型特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号分别对应于表2中序号41、42和43；病毒性神经坏死病毒TPNNV型特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号44、45和46；
(10)病毒性神经坏死病毒TNV型特征基因探针序列P、正向引物序列F1、正向引物序列F2和反向引物序列A分别对应于表2中序号47、48、49和50；
(11)传染性造血器官坏死症病毒N基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号51、52和53；传染性造血器官坏死症病毒N基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号54、55和56；传染性造血器官坏死症病毒G基因探针序列P3、正向引物序列F3和反向引物序列A3分别对应于表2中序号57、58和59；传染性造血器官坏死症病毒G基因探针序列P4、正向引物序列F4和反向引物序列A4分别对应于表2中序号60、61和62；
(12)病毒性出血败血症病毒G基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号63、64和65；病毒性出血败血症病毒G基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号66、67和68；
(13)传染性胰脏坏死病病毒特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号69、70和71；传染性胰脏坏死病病毒特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号72、73和74；
(14)獅鱼病毒性腹水病毒特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号75、76和77；獅鱼病毒性腹水病毒特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号78、79和80；
(15)传染性鲑鱼贫血病毒特征基因1探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号81、82和83；传染性鲑鱼贫血病毒特征基因1探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号84、85和86；
(16)淀粉卵涡边虫特征基因1探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号87、88和89；淀粉卵涡边虫特征基因1探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号90、91和92；淀粉卵涡边虫特征基因2探针序列P3、正向引物序列F3和反向引物序列A3分别对应于表2中序号93、94和95；淀粉卵涡边虫特征基因2探针序列P4、正向引物序列F4和反向引物序列A4分别对应于表2中序号96、97和98；
(17)三代虫特征基因1探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号99、100和101；三代虫特征基因1探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号102、103和104；三代虫特征基因2探针序列P3、正向引物序列F3和反向引物序列A3分别对应于表2中序号105、106和107；三代虫特征基因2探针序列P4、正向引物序列F4和反向引物序列A4分别对应于表2中序号108、109和110；
(18)鱼立克次氏体特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号111、112和113；鱼立克次氏体特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号114、115和116。
表2：病源的探针以及相关的引物序列
其中：“F”表示正向引物序列；“A”表示反向引物序列；“P”表示探针序列；
2、基因芯片的点制
将上述设计完成的质控探针及淋巴囊肿病毒、流行性造血器官坏死症病毒、鱼细胞肿大病毒、石斑鱼虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒RGNNV型、病毒性神经坏死病毒BFNNV型、病毒性神经坏死病毒SJNNV型、病毒性神经坏死病毒TPNNV型、病毒性神经坏死病毒TNV型、传染性造血器官坏死症病毒、病毒性出血败血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒、獅鱼病毒性腹水病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、淀粉卵涡边虫、三代虫和鱼立克次氏体共17类鱼类病原的探针经由生物公司合成后按设计好的阵列布局(表3)固定于固相载体尼龙膜上即构成本发明的基因芯片。
表3：检测多种鱼类病原的基因芯片上探针的阵列布局
其中：每一个单元格代表一组探针(三个探针重复点)；除空白对照质控“双蒸水”外，每一个单元格里的数字对应探针信息表1或2的相应数字序号的探针，例如“表1：1”表示该芯片此处点制的是探针信息表1中序号为1的表面化学质控QC1探针；“表2：1”表示该芯片此处点制的是探针信息表2中序列为1的淋巴囊肿病毒(LCDV)基因的探针。其中灰色背景的探针为质控系统的基因探针组。
二、基因芯片的应用
利用上述构建的基因芯片作为检测17类鱼类病原微生物的应用包括以下步骤：
(1)待测样品准备：
按照DNA抽提方法对待检样品的DNA进行提取，按照Trizol法对待检样品的RNA进行提取。检测DNA病原以提取的DNA为模板，检测RNA病原以经反转录所得的cDNA为模板；
(2)地高辛标记PCR产物
地高辛标记的PCR反应体系包括：10×Buffer 2.5μl，DIG PCR Mix 0.5μl(PCR DIG标记混合物，Roche，德国，含0.7mmol/L DIG-11-dUTP，1.3mmol/L dTTP，2mmol/L dATP，dCTP，dGTP)，5U/μl rTaq酶0.25μl，无菌去离子水18.75μl，10μmol/L正反向引物各1μl，5ng/ul模板1μ，该反应体系总体积25μL。
地高辛标记的PCR反应程序：94℃ 4min，1个循环；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 10min，1个循环；4℃保存。
(3)预杂交和杂交
(4)加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体
(5)显色
(6)结果判读
显色结束后的芯片可根据杂交点出现的位置人工肉眼判读，若显示蓝色或蓝紫色杂交点，则表示该样品相对应的病原检测结果呈阳性，若不显示任何颜色，则表示该样品相对应的病原检测结果呈阴性。
本发明所述的共检芯片检测方法有如下优点：
(1)本发明实现了在同一尼龙膜上对多种鱼类病原微生物同时进行检测(共检性)和鉴定的目的，大大缩短了检测时间；
(2)本发明的检测方法成本低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都安全；
(3)质控体系的构建使得在芯片检测中有假阳性或假阴性结果出现时，能及时的找到问题环节，迅速地对实验错误进行判断和更正，实现了对整个实验流程的有效监控，能更好的保证特异性；
(4)操作简单、结果明显。整个检测过程不涉及复杂的仪器或设备，检测结果清晰明显，直接用眼睛观察就可以判断。
综上，本发明的具有比普通PCR检测方法更高的特异性和灵敏性，可以替代鱼类病原微生物之前的相关检测方法如电镜观察法、TE染色法、病理切片法、抗体检测法、核酸探针杂交法和PCR检测法等。同时本发明具有高通量的特点，是现有鱼类病原微生物鉴定技术的突破。
具体实施方式
实施例1：基因芯片的构建
1、基因芯片上的探针选择
(1)特征基因的确定
针对质控体系及鱼类常见的病原微生物，通过查阅相关文献确定拟检测的特征基因。
质控体系分为5部分，分别是表面化学质控、杂交阳性外对照质控、整个流程监控的阳性内对照质控、阴性质控以及空白质控。表面化学质控以牛β-肌动蛋白基因为特征基因，用来监控核酸在片基上的固定；杂交阳性外对照质控以牛β-珠蛋白基因为特征基因，用来监控杂交步骤；整个流程监控的阳性内对照质控以鲆鲽鱼类宿主的内参基因β-肌动蛋白基因为特征基因；阴性质控选用人神经元烯醇化酶基因为特征基因；空白对照则用双蒸水。
对于淋巴囊肿病毒、流行性造血器官坏死症病毒、鱼细胞肿大病毒、石斑鱼虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒RGNNV型、病毒性神经坏死病毒BFNNV型、病毒性神经坏死病毒SJNNV型、病毒性神经坏死病毒TPNNV型、病毒性神经坏死病毒TNV型、传染性造血器官坏死症病毒、病毒性出血败血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒、獅鱼病毒性腹水病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、淀粉卵涡边虫、三代虫和鱼立克次氏体等17类鱼类病原微生物，主要以核衣壳蛋白基因(VP gene)，主要衣壳蛋白基因(MCP gene)，腺苷三磷酸酶基因(ATPasegene)，DNA聚合酶基因(DNA polymerase gene)，RNA聚合酶基因(RNA polymerase gene)，糖蛋白基因(glycoprotein gene)和核蛋白基因(nucleoprotein gene)等为特征基因。
(2)探针引物设计
根据已确定的特征基因开展相关核酸序列的检索。序列检索借助Entrez检索系统，利用GenBank数据库完成。选取种属特异性保守区设计引物，并在引物扩增区设计检测探针用于靶基因的鉴别。本发明使用常用的微阵列引物设计软件AlleleID6.0，按照引物和探针的设计要求进行设计。质控体系及每一种病原微生物中特征基因探针序列和正反向引物序列见表1和表2。
2、基因芯片制作
将设计好的引物和探针进行商业性合成(如上海生物工程有限公司)。
将带正电的尼龙膜(Roche德国)剪成2.5cm×3.5cm大小，于2×SSC中浸泡2min，取出放置在滤纸上自然晾干，然后固定在玻片上备用；将合成回的浓度为100μM的表面化学质控探针、杂交阳性外对照探针、整个流程监控的阳性内对照探针、阴性对照探针、病原微生物中各特征基因探针以及空白对照探针分别取1μl，在金属浴中95℃热变性2min，立即置于冰水中冰浴1min；每微升寡核苷酸探针加入0.1μl浓度为1mg/ml的二甲苯青做指示剂，然后按预先设定好的阵列布局加到384孔板中；手动点样仪(V&P Scientific，Inc.SAN DIEGO.美国)在尼龙膜上点样；
将点好的膜芯片置于紫外交联仪(Ultra-violet Products Ltd英国)中，正面朝上，交联3min，使探针牢固地固定在尼龙膜上；膜放入杂交袋，封口保存。
3、基因芯片检测
本发明所述的基因芯片检测方法包括以下步骤：(1)待测样品准备(2)地高辛标记PCR产物(3)预杂交和杂交(4)加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(5)显色(6)结果判读
(1)待检样品准备：按照DNA抽提方法对待检样品的核酸进行提取，将提取的DNA稀释或浓缩至5ng/μl作为模板；按照Trizol法对待检样品的RNA进行提取，将以DNAase1处理过的RNA用随机引物反转录至cDNA，稀释或浓缩至5ng/ul即可作为模板。
(2)地高辛标记PCR扩增：PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5μl，DIG PCR Mix(PCR DIG标记混合物，Roche，德国，含0.7mmol/L DIG-11-dUTP，1.3mmol/L dTTP，2mmol/L dATP，dCTP，dGTP)0.5μl，rTaq酶(5U/μl)0.25μl，无菌去离子水18.75μl，10μmol/L正反向引物各1μl，模板1μ，该反应体系总体积25μL；PCR反应程序：94℃4min，1个循环；94℃ 30s，57℃30s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 10min，1个循环；4℃保存。
所得的PCR扩增产物用于后续杂交。
(3)预杂交和杂交：按照膜芯片面积的大小配制预杂交液(0.2ml/cm2)，每1ml预杂交液中含：5×SSC 0.5ml，50％去离子甲酰胺0.5ml，封闭剂(Blocking Reagent Ⅱ)10mg，20％N-十二烷基肌氨酸钠5μl，10％SDS 2μl。预杂交液在60～80℃水浴中溶解5～10min，不断晃动。将制备好的膜芯片置于杂交带中，按比例加入合适体积的预杂交液，封口，在42℃水浴中孵育2h进行预杂交；用相同体积的预杂交液加入DIG标记的PCR产物制备样品杂交液(0.2ml/cm2)在42℃水浴中孵育1h进行杂交。
(4)加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体：杂交结束后取出膜，用2×SSC/0.1％SDS室温洗膜两次，每次5min；在42℃水浴中用3mL0.1×SSC/0.1％SDS洗两次，每次15min；将膜放进2mLbuffer I(0.1mol/LTris Base，0.15mol/LNaCl，pH7.5)中室温洗2min；用0.3mlbufferII(1mLbuffer II含5mg封闭剂和1mLbuffer I)室温封闭30min；剪开杂交袋的一角，在袋中加入1/50体积的100×碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1∶100)，在室温震荡30min；
(5)显色：将膜取出，用bufferI洗两次，每次15min；再用buffer III(0.1mol/LTris Base，0.1mol/LNaCl，pH9.5，0.05mol/LMgCl2·6H2O)洗2min；膜置于袋中，封口，再剪开一角加入显色液(NBT-BCIP，1ml显色液中含：buffer III 1ml；NBT 4.5ul；BCIP 3.5ul)，置于暗处显色10～30min，可短暂取出观察，勿摇晃。待样品显色而本底刚好不显色时取出膜，在蒸馏水中浸泡30min终止显色，自然晾干。
(6)结果判读：在检测的鱼类病原微生物中，每种病原有一条以上目标基因探针作为检测点，一条以上探针为阳性，则判读为阳性点；每个目标基因有三个重复检测点，两个以上为阳性即判读为阳性点。显色结束后的芯片可根据杂交点出现的位置人工肉眼判读，若显示蓝色或蓝紫色杂交点，则表示该样品相对应的病原检测结果呈阳性；若不显示任何颜色，则表示该样品相对应的病原检测结果呈阴性，即颜色作为检测病原的定性数据。
实施例2：基因芯片的效果验证
1、质控体系中各质控的效果验证
利用上述基因芯片检测方法的步骤：(1)待测样品准备、(2)地高辛标记PCR产物、(3)预杂交和杂交、(4)加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体、(5)显色、(6)结果判读；分别以赤点石斑鱼、鲑鱼、牙鲆、大菱鲆、大黄鱼、鳜鱼、虹鳟、獅鱼八种鱼鳃的总DNA及小牛胸腺DNA为模板，对检测鱼类多种病原的基因芯片的表面化学质控QC1、杂交阳性外对照质控QC2、整个流程监控的内对照质控QC3、阴性对照质控QC4的引物及其对应的探针进行验证。
鱼类基因芯片的制备方法、鱼样品核酸的提取、RNA反转录、DIG标记纯化和定量、预杂交和杂交、杂交后处理、芯片结果判读等方法与上述采用的方法基本相同。对于购自上海生工的小牛胸腺DNA，需在5mL双蒸水中溶解2.5mg DNA，用一次性注射器通过小号针头反复吹打溶液20次，配制成500μg/mL的小牛胸腺DNA溶液，将该溶液稀释成5ng/μl作为PCR反应模板。
结果表明：(1)根据牛β-肌动蛋白的基因保守区设计的表面化学质控QC1引物对(对应表1：2、3)，只以小牛胸腺DNA溶液为模板扩增出与实验设计大小相符的目的片段，而与鱼类宿主(赤点石斑鱼、鲑鱼、牙鲆、大菱鲆、大黄鱼、鳜鱼、虹鳟、獅鱼)没有交叉反应；根据牛β-肌动蛋白的基因保守区设计的表面化学质控QC1探针(对应表1：1)只与小牛胸腺DNA的PCR产物有特异性的杂交阳性信号。从而证实了该引物对作为鱼类芯片表面化学质控QC1引物对的可行性。
(2)根据牛HBB基因设计的杂交阳性外对照质控QC2引物(对应表1：6、7)，只以小牛胸腺DNA溶液为模板扩增出与实验设计大小相符的目的片段，而与鱼类宿主(赤点石斑鱼、鲑鱼、牙鲆、大菱鲆、大黄鱼、鳜鱼、虹鳟、獅鱼)没有交叉反应；根据牛HBB基因设计的杂交阳性外对照质控QC2探针(对应表1：5)只与小牛胸腺DNA的PCR产物有特异性的杂交阳性信号。从而证实了该对引物作为鱼类芯片杂交阳性外对照质控QC2引物对的可行性、验证了探针(对应表1：5)作为鱼类芯片杂交阳性外对照质控QC2探针的特异性。
(3)利用用蝶形目、鲈形目和鲑目鱼类β-actin基因的保守区设计整个流程监控的内对照质控QC3的引物PF-actin(表1：9、10)，均能以赤点石斑鱼、鲑鱼、牙鲆、大菱鲆、大黄鱼、鳜鱼、虹鳟、獅鱼八种鱼鳃的总DNA为模板，成功地扩增出与实验设计分子量大小相符的目的产物；经DIG标记后成功地与鱼类膜芯片进行杂交，结果在相应的探针检测点出现阳性信号。从而证实了这两对引物作为鱼类芯片整个流程监控的内对照质控QC3引物对的可行性、验证了探针(对应表1：8)作为鱼类芯片整个流程监控的内对照质控QC3探针的特异性。
(4)根据人神经元烯醇化酶基因设计的阴性对照质控QC4探针(表1：4)不与上述任何种类的PCR产物有杂交反应，从而证实该探针用于作为检测多种鱼类病原的基因芯片的特异性。
2、实际样品检测的效果验证
利用上述基因芯片检测方法的步骤：(1)待测样品准备、(2)地高辛标记PCR产物、(3)预杂交和杂交、(4)加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体、(5)显色、(6)结果判读；对含LCDV、TRBIV的大菱鲆病料，ISKNV核酸DNA，RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV、YAV、EHNV、LYCIV的病毒核酸进行验证。其中，鱼类基因芯片的制备方法、鱼样品核酸的提取、RNA反转录、DIG标记纯化和定量、预杂交和杂交、杂交后处理、芯片结果判读等方法与上述采用的方法基本相同。
试验的结果与分析：
(1)根据实验材料，选择设计的9对引物(对应于表2：2、3；表2：7、8；表2：12、13；表2：24、25；表2：52、53；表2：55、56；表2：64、65；表2：70、71；表2：76、77)PCR扩增10种鱼类病原核酸(LCDV、EHNV、TRBIV、LYCIV、ISKNV、RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV、YAV)靶序列。结果9对均能特异性地扩增出相应的目的序列，经DIG标记后，测定产物产量约在10ng/μl～40ng/μl之间。全部种类混合或仅质控体系和单个病原种类混合后分别与膜芯片进行杂交。NBT-BCIP显色结果表明质控体系显色正常，各种DIG标记的扩增产物都能与芯片上相对应的寡核苷酸探针发生反应，出现阳性结果。而与其他探针不发生反应，无交叉反应。
(2)引物对(对应于表2：2、3；表2：7、8)是针对淋巴囊肿病毒(LCDV)和流行性造血器官坏死症病毒(EHNV)主要衣壳蛋白基因(MCP)设计的引物，与实验预期相符，这两对引物对均扩增出了预期设计大小的DNA片段，而与其他病毒核酸的模板无扩增反应；且与对应的探针(对应于表2：1、6)特异性地杂交出阳性信号，从而证实了上述2对引物及其对应的探针作为检测鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)和流行性造血器官坏死症病毒基因芯片引物及探针的可行性。
(3)引物对(对应于表2：12、13)是针对细胞肿大病毒属设计的引物，该引物对分别以TRBIV、LYCIV和ISKNV为模板也均能特异性的扩增出与实验设计大小相符的DNA扩增产物，而与其他病毒核酸的模板没有交叉反应；且与对应的探针(对应于表2：11)特异性地杂交出阳性信号，从而证实了该引物对及其对应的探针作为检测鱼类细胞肿大病毒基因芯片引物及探针的可行性。
(4)RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV和YAV是鱼类常见的RNA病毒，针对这些病毒设计的特异性引物对(对应于表2：24、25；表2：52、53；表2：55、56；表2：64、65；表2：70、71；表2：76、77)分别以各自相对应的病毒核酸为模板均能特异性地扩增出与实验设计大小相符的核酸扩增带，而与其他病毒核酸的模板无扩增反应；且与对应的探针(对应于表2：23、51、54、63、69、75)特异性地杂交出阳性信号，从而证实了该6对引物对及其对应的探针分别作为检测鱼类病毒RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV和YAV基因芯片引物及探针的可行性。
Claims (5)
1.一种检测多种鱼类病原的基因芯片，其特征在于将淋巴囊肿病毒、流行性造血器官坏死症病毒、鱼细胞肿大病毒、石斑鱼虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒RGNNV型、病毒性神经坏死病毒BFNNV型、病毒性神经坏死病毒SJNNV型、病毒性神经坏死病毒TPNNV型、病毒性神经坏死病毒TNV型、传染性造血器官坏死症病毒、病毒性出血败血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒、獅鱼病毒性腹水病毒和传染性鲑鱼贫血病毒的探针；淀粉卵涡边虫和三代虫的探针以及鱼立克次氏体的探针点在基因芯片载体上，各探针的序列信息如下：
2.如权利要求1所述的一种检测多种鱼类病原的基因芯片，其特征在于上述的基因芯片载体上还点制有表面化学质控的探针、阴性对照质控的探针、杂交阳性外对照质控探针和整个流程监控的阳性内对照质控的探针；探针的序列信息如下：
3.如权利要求1或2所述的一种检测多种鱼类病原的基因芯片，其特征在于上述的基因芯片载体为固相载体尼龙膜。
4.权利要求书1或2所述的一种检测多种鱼类病原的基因芯片的检测方法，依次包括以下步骤：(1)待检样品准备、(2)地高辛标记的PCR扩增、(3)预杂交和杂交、(4)加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体、(5)显色、(6)结果判读步骤，其特征在于步骤(2)中的地高辛标记的PCR扩增体系是：无菌去离子水17.25μL，10×PCR buffer 2.5μL，20mM的MgCl2 1.5μL，PCR地高辛标记混合物0.5μL，各探针对应的10μM正向引物和10μM反向引物各1μL，5unit/μL的rTaq DNA聚合酶0.25μL，待检样品DNA 1μL，该反应体系总体积25μL；PCR扩增程序：94℃ 4min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其中各正向引物和反向引物的序列信息如下：
5.如权利要求4所述的一种检测多种鱼类病原的基因芯片的检测方法，其特征在于上述淋巴囊肿病毒LCDV、流行性造血器官坏死症病毒EHNV、鱼细胞肿大病毒、石斑鱼虹彩病毒GIV、病毒性神经坏死病毒TNV型病原的正向引物和反向引物存在替补引物，替补引物的序列信息如下：
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