CN106244682A - Trem‑2基因在鉴别猪对蓝耳病毒易感性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TREM‑2基因在鉴别猪对蓝耳病毒易感性中的应用，并提供了一组TREM‑2基因表达量检测引物，包括上游引物TREM2‑F和下游引物TREM2‑R，序列分别如SEQ ID NO.1~2所示。本发明研究显示，猪体内TREM‑2基因表达量与PRRSV感染息息相关，TREM‑2可以通过调节CD163的表达进而调节PRRSV的复制；当TREM‑2表达量低时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。TREM‑2基因可以作为一种新型的判定PRRSV易感性的标准，为鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗性猪的筛选和培育奠定了坚实的基础，对猪蓝耳病的防控具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及TREM-2基因在鉴别猪对蓝耳病毒易感性中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductiveandrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起，于1987年最早出现在美国，随后在欧洲出现报道。我国于1996年由郭宝清等首次分离到PRRSV，将分离毒株命名为CH-1a，证实了该病在我国存在。早在1992年，世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）就将该病列为B类传染病。目前，PRRS是养猪业中最重要的传染病之一，在全球对养猪业造成巨大的经济损失。2005年，PRRS对美国养猪业造成的经济损失高达56,000万美元，而现在，每年损失估计将高达66,400万美元。PRRS几乎分布在所有的养猪国家。猪感染PRRSV后，一般会继发细菌如副猪嗜血杆菌、链球菌等感染。在临床上，PRRS与猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）混合感染病例较多。2006年，我国大部分省份及越南爆发了猪高热病（Porcine high fever syndrome，PHFS），给养猪业造成了巨大的经济损失，此病是由变异的PRRSV引起，命名为高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highlypathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）。HP-PRRSV特征为高热、高致病性及高死亡率。目前，农业部已将该病列入重大动物疫病强制免疫计划。
PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；（3）疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；（4）抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；（5）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；（6）混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。
目前研究显示，PRRSV感染的必需受体为CD163，故若能找到调控CD163表达的基因即可调节PRRSV感染，从而可针对此基因开展新的猪蓝耳病防控技术。并且，若能找到调控CD163表达的基因，还可以以此基因作为猪对PRRSV抗性或易感性的判定标准，筛选猪对蓝耳病病毒的抗性或者易感性，这可能是未来蓝耳病防治的重要途径之一，通过建立猪对PRRSV抗性或易感性的判定标准，为PRRSV抗病育种奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术的缺陷和不足，提供TREM-2基因在鉴别猪对蓝耳病毒易感性的应用，TREM-2基因通过调控CD163表达进而调节PRRSV复制，PRRSV感染PAMs细胞后促进TREM-2基因表达。TREM-2基因的表达量与PRRSV的复制息息相关，有望成为一种新型的判定猪对PRRSV易感性的标准，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有很好的临床应用价值。
本发明的目的是提供TREM-2基因在鉴别猪对蓝耳病毒易感性中的应用。
本发明的另一目的是提供一种鉴别评价猪对蓝耳病毒易感性的方法。
本发明的再一目的是提供TREM-2基因在提高猪对蓝耳病毒抗性以及在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。
本发明的再一目的是提供TREM-2基因在培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现。
TREM-2基因在鉴别猪对蓝耳病毒（PRRSV）易感性中的应用。所述猪TREM-2基因的序列号为NM_001256777.1。
所述蓝耳病毒包括经典毒株和高致病性毒株。
一种鉴别评价猪对蓝耳病毒易感性的方法（也即上述应用的方法），是检测猪体内TREM-2基因的表达水平，根据TREM-2基因的表达水平鉴别猪对蓝耳病毒（PRRSV）是具有抗性还是具有易感性。
所述鉴别的标准是：TREM-2表达量低时，猪对蓝耳病毒（PRRSV）具有抗性；反之具有易感性。
另外，本发明对于TREM-2基因表达量的检测方法不作限制。可以是本领域内任意的基因表达量检测方法。
作为一种可优选的实施方案，本发明提供了一种检测猪TREM-2基因表达量的引物组，所述引物组包括上游引物TREM2-F和下游引物TREM2-R，序列分别如SEQ ID NO.1~2所示。
另外，以下所述的应用均应在本发明的保护范围之内：
TREM-2基因在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用。
TREM-2基因在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。
TREM-2基因在筛选和/或培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。
TREM-2基因表达抑制剂在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用。
TREM-2基因表达抑制剂在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。
本发明经过大量的研究和探索，首次发现猪体内TREM-2可以通过调控金属蛋白酶ADAM17活性，进而调节CD163表达，最终影响调节PRRSV的复制；PRRSV感染靶细胞后促进TREM-2基因表达，以利于病毒复制。即TREM-2基因表达量与PRRSV感染息息相关，当TREM-2表达量低时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。
本发明还通过体外siRNA干扰和过表达分析了TREM-2基因与PRRSV复制的关系。另外还研究了TREM-2基因调节PRRSV复制的分子机制，TREM-2基因通过激活金属蛋白酶ADAM17，进而切割CD163胞外域，最终抑制PRRSV复制。
另外，本发明选用了不同品种猪研究TREM-2基因在鉴别猪对PRRSV易感性中的应用。分别选取我国地方品种通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪为例，进行PRRSV攻毒，根据TCID50及PRRSV N蛋白表达水平确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力，根据TREM-2基因表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。结果显示，本发明说明的利用TREM-2基因鉴别猪对蓝耳病毒的抗性或易感性的方法是可靠的、准确的。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次研究发现了猪体内TREM-2基因表达量与PRRSV感染息息相关，TREM-2可以通过调控金属蛋白酶ADAM17活性，进而调节CD163表达，最终影响PRRSV复制；PRRSV感染靶细胞后促进TREM-2基因表达。因此TREM-2基因可以作为一种新型的判定PRRSV易感性的标准；当TREM-2表达量低时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。
本发明的发现为鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗病育种奠定基础，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有很好的临床应用价值，对于猪蓝耳病的防控具有重要的意义。同时，本发明也为TREM-2基因提供了一种新的应用。
附图说明
图1为LPS刺激PAMs细胞后以及PRRSV感染PAMs细胞后，TREM-2表达量变化。图中，A和B表示PAMs经LPS刺激后，TREM-2基因表达水平显著下降； C和D表示PAMs经LPS刺激后，PRRSV复制被抑制；E和F表示PRRSV感染PAMs后，TREM-2基因表达量显著升高。
图2为LPS刺激PAMs细胞后，金属蛋白酶ADAM17和CD163表达量变化。（A）LPS刺激PAMs细胞后，ADAM17表达量升高；（B）LPS刺激PAMs细胞后，抑制CD163表达。
图3为TREM-2基因经siRNA干扰后，TREM-2表达量下降，同时PRRSV复制受到抑制；（A）siRNA干扰后，相对于NC对照组，S1与S2干扰组TREM-2基因mRNA表达量显著地被抑制；（B）siRNA干扰后，相对于NC对照组，S1与S2干扰组PRRSV N基因mRNA表达量显著地被抑制。
图4为LPS刺激细胞后，TREM-2基因调控PRRSV机制图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
实施例1 PAMs细胞分离和培养
1、经检测无PRRSV、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪瘟病毒（CSFV）等特定病原感染的SPF级6-8周龄的断奶仔猪绑定后，前腔静脉放血致死，结扎气管，剖开胸部，连同心脏取出完整的肺脏，用无菌PBS液充分漂洗肺表面，清除血块和污物，清除完毕后摘除心脏。灌入PBS缓冲液，轻轻拍打捏揉肺表面5-10 min，回收支气管肺泡灌洗液。重复步骤2至3次，直至共回收约1000 mL灌洗液。将回收得到的肺泡灌洗液用移液器轻轻来回吹打，使细胞团块分开，4℃，1000 rpm离心灌洗液10 min，弃去上清。RPMI 1640培养基重悬细胞，4℃，1000 rpm离心5 min，弃去上清。用含20%的FBS的 RPMI-1640 营养液轻轻吹打重悬细胞，为防止操作污染，加入双抗，将分离得到的细胞均匀分到培养板中，于37℃、5% CO2加湿培养箱中培养。
2、观察PAMs细胞形态、活性，液氮保存备用。
实施例2 TREM-2基因体外调节PRRSV复制的研究
1、用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养PAMs细胞，加入LPS刺激2 h后，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培养液中37℃继续培养24 h，收集细胞，分别对TREM-2基因和PRRSV N蛋白做qRT-PCR和Western-Blot检测。结果如图1中A、B、C、D所示，LPS刺激PAMs细胞后，TREM-2基因表达量下降，同时PRRSV被抑制。
2、另外，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养PAMs细胞，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培养液中37℃继续培养24 h，收集细胞，分别对TREM-2基因做qRT-PCR和Western-blot检测。结果如图1中E、F所示，PRRSV感染PAMs细胞后，TREM-2表达量显著升高。
实施例3 TREM-2基因与ADAM17及CD163关系验证
1、用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养PAMs细胞，加入LPS刺激2 h后，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培养液中37℃继续培养24 h，收集细胞，分别对CD163及ADAM17基因做qRT-PCR检测。
2、结果如图2所示，LPS刺激PAMs细胞后，金属蛋白酶ADAM17表达量升高，而CD163表达被抑制。
实施例4 体外TREM-2基因干扰
1、将设计好的3对TREM-2 siRNA（S1、S2、S3）及1对Negative Control （NC对照）送Thermo Fisher Scientific公司合成，使用Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂（ThermoFisher Scientific），在2个6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养PAMs细胞至60-70%密度，分别将siRNA（3对siRNA和1个对照）及Lipofectamine™ RNAiMAX用Opti-MEM®Reduced Serum Medium稀释，稀释后按1：1比例混合并室温培养5 min，然后加入到换有新鲜RPMI 1640培养液的PAMs细胞上37℃、5% CO2培养箱中培养6 h，弃上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养48 h，收集细胞通过qRT-PCR验证TREM-2干扰效果。另外一个6孔板培养48 h后，在培养基中加入PRRSV，再培养24 h，收集细胞通过qRT-PCR验证TREM-2干扰后对PRRSV复制影响。
2、结果如图3所示，TREM-2基因经siRNA干扰后，相对于NC对照组，siRNA S1、S2都显著性地抑制了TREM-2 mRNA表达（图3 A所示）。同时，TREM-2基因干扰后，PRRSV接毒，相对于NC对照组，S1与S2干扰组PRRSV N基因mRNA表达都显著地被抑制了（图3 B所示）。综上所述，TREM-2基因经siRNA干扰后，PRRSV复制被抑制。
实施例5 体外TREM-2基因过表达
1、构建pcDNA3.1-TREM-2过表达载体，在2个6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养PAMs细胞至60-70%密度，使用Lipofectamine™ 2000 （Thermo FisherScientific）分别将pcDNA3.1-TREM-2和pcDNA3.1空载体转入PAMs细胞，在37℃、5% CO2培养箱中培养6 h，弃上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养48 h，收集细胞检测过表达效果。另外一个6孔板培养48 h后，在培养基中加入PRRSV，再培养24 h，收集细胞检测TREM-2过表达后对PRRSV复制影响。
2、根据结果可判断，TREM-2转染PAMs细胞过表达后使TREM-2表达量升高；同时，TREM-2过表达后，使PRRSV 复制升高。
另外，经过大量的研究显示，LPS刺激细胞后，TREM-2基因调控PRRSV复制的机制如图4所示。
实施例6 TREM-2基因在鉴别猪对PRRSV易感性中的应用
1、选取我国地方品种通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪作为实验对象，验证本发明利用TREM-2基因鉴别猪对蓝耳病毒易感性的方法。
其中，已知通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，即具有抗性；而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。
2、实验方法
选择通城猪、梅山猪、长白猪、大白猪各6头，每3头1组，即分成2组，其中1组进行PRRSV攻毒，另外1组不做任何处理（对照），分别在攻毒后第7、14、21、28 d采血，对照组同步采血，第28 d处死，采集肺组织。
取一部分血清进行TCID50测定，剩余血清及肺组织提取RNA、反转，对TREM-2基因及PRRSV N蛋白进行qRT-PCR检测。
根据TCID50及PRRSV N蛋白表达水平确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力，根据TREM-2基因表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。
3、根据结果可判断，通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。
同时，TREM-2基因表达水平检测结果显示，通城猪和梅山猪体内TREM-2基因表达水平显著低于长白猪和大白猪。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> TREM-2基因在鉴别猪对蓝耳病毒易感性中的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgagtctcc tggttctg 18
<210> 2
<211> 19
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<400> 2
acacacaaat ctccacttc 19
Claims (9)
1.TREM-2基因在鉴别猪对蓝耳病毒易感性中的应用。
2.一种鉴别评价猪对蓝耳病毒易感性的方法，其特征在于，是检测猪体内TREM-2基因的表达水平，根据TREM-2基因的表达水平鉴别猪对蓝耳病毒是具有抗性还是具有易感性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鉴别的标准是：TREM-2表达量低时，猪对蓝耳病毒具有抗性；反之具有易感性。
4.一种检测猪TREM-2基因表达量的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物TREM2-F和下游引物TREM2-R，序列分别如SEQ ID NO.1~2所示。
5.TREM-2基因在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用。
6.TREM-2基因在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。
7.TREM-2基因在筛选和/或培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。
8.TREM-2基因表达抑制剂在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用。
9.TREM-2基因表达抑制剂在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。
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