CN1309665A - 检测啤酒腐败乳酸细菌的抗体,使用该抗体的检测方法,和使用该抗体的试剂盒 - Google Patents

检测啤酒腐败乳酸细菌的抗体,使用该抗体的检测方法,和使用该抗体的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能检测啤酒腐败乳酸细菌的抗体。具有啤酒腐败能力的乳酸细菌在啤酒中生长,免疫哺乳动物产生用于检测啤酒腐败乳酸细菌的抗体,并且使用该抗体检测啤酒腐败乳酸细菌。用来产生抗体的乳酸细菌是短乳杆菌,林氏乳杆菌和有害片球菌。杂交瘤细胞系是BLb2F37(BP－6744),BG3A5b4(BP－6745)和PQ3H8a9(BP－6746)。

Description

检测啤酒腐败乳酸细菌的抗体，使用该抗体的检测方法，               和使用该抗体的试剂盒
技术领域
本发明涉及识别能在啤酒中生长的啤酒腐败乳酸细菌的抗体，使用该抗体检测啤酒腐败乳酸细菌的方法，和鉴定啤酒腐败乳酸细菌的试剂盒。
背景技术
有一种意识到的危险，即一旦某些类型的乳酸细菌污染啤酒生产的过程，则由该细菌引起的浑浊，味道不正等等可能会损害生产出的啤酒的质量。例如，有代表性的啤酒腐败乳酸细菌包括一些属于乳杆菌属的乳酸细菌菌种，特别是属于短乳杆菌和林氏乳杆菌那些，以及包括一些属于片球菌属的乳酸细菌菌种。因此，曾试图开发快速而且高敏感性的检测这些啤酒腐败乳酸细菌的方法。
具体提到的是一种方法，其中用膜过滤器过滤要分析的啤酒之后，在合适的培养基中培养并且观察生长的菌落。但是，因为啤酒中存在的啤酒腐败菌存在的量小，而且它们在培养基中生长慢，使用该方法存在检测它们的敏感性和费时性的问题。
开发出了应用抗原-抗体反应检测啤酒中啤酒腐败乳酸细菌的方法。例如，制备出了抗乳酸细菌的多克隆抗体(抗血清)(Sharpe,M.E.,遗传微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.),12,107(1955)；Sharpe,M.E.,国际系统细菌学杂志(Int.J.Syst.Bacteriol.),20,509(1970)；Knox,M.W.等，感染免疫学(Infect.Immun.),24,12(1979)；Shimohashi,H.和Mutai,M.,J.Gen.Microbiol.,103,337(1977)；和日本未审专利申请公开平4-72570)。现在，通过调节各种条件，有可能制备这样一种品质的抗血清，使得它们的特异性和它们的敏感性在一定程度上为实际应用所接受。但是其中在下面的几方面还存在期望的进一步改进：抗体滴定度或抗血清的特异性不可避免地随着批次而不稳定；抗某种类型乳酸细菌的抗血清对抗非啤酒腐败菌也呈现阳性；一些抗血清需要NaOH处理。
因为这些原因，提出过使用单克隆抗体的检测方法(日本未审专利申请公开平6-46881和日本未审专利申请公开平6-105698)。根据日本未审专利申请公开平6-46881的描述，使用属于乳杆菌属第3族并且在培养基中培养的短乳杆菌属，丘状菌落乳杆菌和猪双臼乳杆菌作为抗原制备单克隆抗体；并且使用这些单克隆抗体来检测啤酒中的第3族的乳杆菌属。
但是证明在啤酒生产中生长的乳酸细菌只是属于乳杆菌属第3族的那些的一部分。因此，根据日本未审专利申请公开平6-46881描述的方法的问题是也可以检测到其它非啤酒腐败乳酸细菌，即用该方法获得假阳性结果。
根据日本未审专利申请公开平6-105698的描述，使用属于乳杆菌属并且在培养基中培养的植物乳杆菌属作为抗原制备单克隆抗体；使用该单克隆抗体检测啤酒中的乳杆菌和棒状乳杆菌。但是该公开的抗体具有相同的也检测非啤酒腐败乳酸细菌的问题(假阳性)。
因此，提出过只检测可以在啤酒中生长的啤酒腐败细菌的方法(下文称之为“啤酒腐败能力”)(日本未审专利申请公开平10-104238)。根据日本未审专利申请公开平10-104238中描述的方法，使用在缺氧条件下不具备葡萄糖同化作用能力并且在培养基中培养的短乳杆菌作为抗原用兔制备抗血清；使用该抗血清检测具有啤酒腐败能力的短乳杆菌。据信这样制备的抗血清特异性地与短乳杆菌和有害片球菌反应，这两者都引起啤酒腐败能力。
尽管如此，根据日本未审专利申请公开平10-104238中描述的方法，为了从抗血清中去除与短乳杆菌属反应的非特异性抗体(即与非啤酒腐败乳酸细菌反应的非特异性抗体)，必须使用碱处理过的非啤酒腐败短乳杆菌通过吸附来有效去除非特异性抗体。另外，存在一个问题，就是以要用作抗原的短乳杆菌为基础，得到的抗血清倾向于假性识别。此外，既然使用抗血清，其抗体滴定度和特异性不可避免地批次与批次之间不稳定。
提到的作为代表性啤酒腐败乳酸细菌是林氏乳杆菌；但是在日本未审专利申请公开平10-104238中没有提到该抗血清抗这样的细菌的效力。
综上所述，在发酵工业需要改进的检测使啤酒腐败的细菌的方法。
本发明的公开
本发明的一个目的是提供能检测使啤酒腐败损害啤酒质量的乳酸细菌的试剂。
本发明的另一个目的是提供一种特异性的，快速，方便和可重复检测在啤酒生产过程中污染的且在生产出的啤酒中生长的并降低啤酒质量的啤酒腐败乳酸细菌的方法。
本发明的另一个目的是提供一种有效而彻底地检测例如短乳杆菌，林氏乳杆菌或有害片球菌的啤酒腐败乳酸细菌的方法。
本发明的另一个目的是提供一种精确而方便地预测用培养基常规培养出现的乳酸细菌的啤酒腐败能力的鉴定试剂盒。
本发明的这些目的和其它目的可以用通过在啤酒中生长具有啤酒腐败能力的乳酸细菌和通过用该啤酒免疫哺乳动物而产生的检测啤酒腐败乳酸细菌的抗体来实现。
本发明的目的还可以用一种单克隆抗体来实现，所述单克隆抗体具有抗使啤酒腐败的乳酸细菌的反应性并且对非啤酒腐败乳酸细菌没有反应性，其中通过在啤酒中生长具有啤酒腐败能力的乳酸细菌和通过用该啤酒免疫哺乳动物而产生所述抗体。
本发明的目的可以用用来检测啤酒腐败乳酸细菌的所述抗体以及上述单克隆抗体来实现，其中具有啤酒腐败能力的乳酸细菌是在缺氧条件下具备葡萄糖同化作用能力的乳酸细菌。
本发明的目的可以用用来检测啤酒腐败乳酸细菌的所述抗体以及上述单克隆抗体来实现，其中具有啤酒腐败能力的乳酸细菌是选自啤酒腐败短乳杆菌，啤酒腐败林氏乳杆菌或啤酒腐败有害片球菌的乳酸细菌。
本发明的目的也可以用使用上述抗体来检测具有啤酒腐败能力的啤酒腐败乳酸细菌的方法来实现，其中所述啤酒腐败能力的啤酒腐败乳酸细菌例如是短乳杆菌，林氏乳杆菌或有害片球菌的乳酸细菌。
本发明的目的也可以用一种生产与啤酒腐败乳酸细菌特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞系来实现，例如，BLb2F37(FERMBP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)或PQ3H8a9(FERM BP-6746)。
本发明的目的也可以用使用所述杂交瘤生产的单克隆抗体的组合来检测具有啤酒腐败能力的啤酒腐败乳酸细菌的方法来实现，其中所述啤酒腐败能力的啤酒腐败乳酸细菌例如是短乳杆菌，林氏乳杆菌或有害片球菌的乳酸细菌。
本发明的目的也可以用鉴定啤酒腐败乳酸细菌的试剂盒来实现，所述试剂盒具有至少以下成分：(1)装备有截留细菌的过滤器的离心管；(2)根据本发明的杂交瘤生产的单克隆抗体；(3)抗上述抗体的第二抗体或抗体-样物质，各自用酶标记；和(4)与第二抗体或抗体-样物质的标记酶反应和显色的底物。
本发明的目的也可以用制备上述抗体和杂交瘤的方法来实现。
附图的简要说明
结合附图考虑时，通过参照下面详细说明，更好地理解容易实现的本发明的更完全的价值及其带来的利益，其中：图1是实施例3中获得的结果的照片，即使用三种类型的抗体的快速鉴定。
实施本发明的最佳模式
啤酒腐败乳酸细菌
如这里使用的，术语“啤酒腐败乳酸细菌”指能在啤酒中生长并且由于其在其中生长而引起啤酒浑浊的细菌。
这里关于本发明抗体和乳酸细菌之间的相互作用所使用的反应，结合等等术语指抗体和细菌之间形成复合体，即一种抗体-抗原反应。形成或不形成这样的复合体是根据啤酒生产中使用的分析相关条件，例如在25℃下在磷酸缓冲盐水(PBS)中(参见下面的实施例)。
有代表性的啤酒腐败乳酸细菌包括例如分类为短乳杆菌，林氏乳杆菌或有害片球菌的细菌(Back,W.等；Brauwlt,31/32,1358(1988)，这里引作参考)；但是并不是所有这些细菌都使啤酒腐败。
在本发明中用作抗原的乳酸细菌是具有啤酒腐败能力的那些，例如属于短乳杆菌，林氏乳杆菌或有害片球菌属的乳酸细菌。
通过直接将环境中产生的样品加入到啤酒中，或生长乳酸细菌后，利用乳酸细菌选择培养基和通过选择引起浑浊的那些，可以获得这些啤酒腐败乳酸细菌。
以下面的方法进行啤酒腐败乳酸细菌的传代培养和保藏：所述细菌在啤酒中生长，在4℃下保藏，每几个月传代培养；或者，加入甘油使最后浓度是20％；所述细菌在-70℃下保藏。
可以以下面的方法进行啤酒腐败的测定：向含有市售啤酒的小瓶(334ml)加入大约107个细菌细胞，所述市售啤酒为100％麦芽，pH大约4.4，苦味单位是大约28；盖上盖子并且在25℃下贮存2个月；然后用眼观察判断啤酒中是否产生浑浊。
单克隆抗体
根据公知的方法，用上述选择的啤酒腐败乳酸细菌免疫小鼠。接着制备杂交瘤并且建立生产期望单克隆抗体的杂交瘤克隆。制备单克隆抗体和杂交瘤的方法描述于当代分子生物学方法(Current Protocolsin Molecular Biology),Vol.1-3,Ausubel等编著，John Wiley和Sons,1998，这里其全文引作参考。
1．制备抗原和免疫
具体地说，收获在啤酒中生长的啤酒腐败乳酸细菌。用生理盐水洗涤后，细菌细胞悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中并且用来免疫小鼠。以合适的时间间隔进行另外的免疫，当血液中抗体滴定度增大时进行最后的免疫。
2．细胞融合
最后免疫后三天取出免疫小鼠的脾。在合适的细胞融合剂存在下脾细胞与骨髓瘤细胞融合。融合的细胞接种到96孔微量培养板上并且在合适的选择培养基例如HAT培养基中进行培养。
3．筛选和克隆
根据ELISA这样的方法，选择产生期望的抗体的杂交瘤并且进行筛选。
使用例如有限稀释这样的方法对产生期望的抗体的杂交瘤进行克隆并且建立杂交瘤克隆。
4．大量制备单克隆抗体
产生所述抗体的杂交瘤克隆在培养基中生长之后，回收细胞，然后腹膜内接种到使用之前用降植烷刺激的小鼠体内。从小鼠的腹膜内收集合有所述抗体的腹水。接着使用硫酸铵沉淀法或者亲和柱，例如ProteinA或ProteinG柱，从腹水纯化单克隆抗体。或者杂交瘤克隆大规模在培养基中培养后，使用硫酸铵沉淀法或者离子交换柱等方法从根据本发明的培养物纯化所述单克隆抗体。
这样获得的单克隆抗体具有下面的性质：表现出抗具有啤酒腐败能力的乳酸细菌的反应性；对非啤酒腐败乳酸细菌没有反应性。
5．检测啤酒腐败乳酸细菌
举例的检测啤酒腐败乳酸细菌的方法包括ELISA(生物科学。生物技术。生物化学(Biosci.Biotech.Biochem),59,2039(1995)，这里引作参考)，以膜上截留的细菌的抗原-抗体反应为基础的方法(日本未审专利申请公开平6-46881，这里引作参考)，等等。
具体地说，用膜过滤器过滤生产出的啤酒以截留啤酒中的细菌。接着，在用合适的缓冲液如磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤后，使细菌与上面获得的单克隆抗体反应，用PBS洗涤膜。然后使用与过氧化物酶缀合的抗-小鼠抗体检测留在膜上的单克隆抗体，其能检测啤酒腐败乳酸细菌。
此外，如果直接标记本发明获得的抗体(例如使用酶，荧光染料或放射性同位素)，则不需要第二抗体直接检测啤酒腐败乳酸细菌成为可能；并且检测的敏感性也被提高了。
6．快速鉴定方法和试剂盒
具有高特异性并且使快速鉴定的根据本发明的方法具有下列组分：就是(1)装备有截留细菌的过滤器的离心管；(2)根据本发明获得的抗啤酒腐败乳酸细菌的三种单克隆抗体；(3)都用酶标记的抗上述抗体的第二抗体或抗体-样物质；和(4)与第二抗体或抗体-样物质的标记酶反应和显色的底物。此外，可以优选获得用作阳性对照的乳酸细菌。
下文将详细解释根据本发明的快速鉴定方法，检测方法和快速鉴定试剂盒。
根据本发明的用于啤酒腐败乳酸细菌的快速鉴定试剂盒基于通过利用装有过滤器的离心管截留细菌，并去除未反应的抗体，与酶免疫测定相结合；其通过其颜色色调的程度判断预测涉及试验细菌的啤酒腐败能力。在本发明方法中，向带有过滤器的离心管加入细菌悬浮液和酶标记的抗体(例如单克隆抗体和酶标记抗体，或者直接用酶标记的单克隆抗体)并且使离心。当抗体与试验细菌反应时，其和标记酶一起留在过滤器中；而当抗体不反应时，通过过滤器与滤液一起去除标记酶。因此，当加入一种酶底物溶液时，只有抗体与试验细菌反应时才发生着色。这使得容易预测试验细菌的啤酒腐败能力。另外，特异性很高，因为基本原理与直接荧光抗体技术的原理相同。
要求在带有过滤器的离心管中使用的过滤器(filter)具有一定的孔径，其足够大以截留为测定目的的乳酸细菌并且使去除未反应的抗体。本领域技术人员容易选择该孔径。例如，可以使用具有0.2-0.45μm级孔径并且由使蛋白质吸附作用最小化的材料例如聚偏氟乙烯(PVDF)制备的过滤器；优选地，其在用酪蛋白，牛血清白蛋白等等封闭后使用。
所述试验细菌悬浮于生理盐水或适合抗原-抗体反应的缓冲液中；然后，加入单克隆抗体和酶标记第二抗体或用酶直接标记的单克隆抗体。
使它们与试验细菌反应之后，离心去除未反应的单克隆抗体和酶标记第二抗体或未反应的用酶直接标记的单克隆抗体。
此外，向抗体中加入性质和浓度不抑制反应的洗涤溶液，例如含有0.05％Tween20的10mM Tris-HCl(pH8.0)。然后离心进行洗涤并且去除清洗溶液。根据本发明，通过使用带有过滤器(或过滤装置)的离心管，能够进行洗涤并且同时去除清洗溶液，而且有可能以极大的效率进行彻底的清洗而没有将试验细菌洗涤掉的危险。
优选的是，显色底物在可见区具有其吸收最大波长，是高度敏感性和容易区别的，并且具有对时间的高度稳定性。为了符合这些要求，优选过氧化物酶型的显色底物，例如，可以使用四甲基联苯胺(TMBZ)和邻苯二胺(OPD)。
根据本发明的试剂盒要用来鉴定啤酒腐败乳酸细菌。下面说明根据该实施方案的一系列操作的具体实例：
1．生理盐水，100μl，和啤酒腐败乳酸细菌悬浮液--悬浮于生理盐水中，通过热处理灭菌，并且将其在660nm处的吸收度调节到0.3--，用作阳性对照的100μl，各放置于凝集皿上。
2．将一接种环的试验细菌悬浮于生理盐水中：其浓度调节到接近和啤酒腐败乳酸细菌悬浮液相同的水平。
3．各细菌悬浮液各25μl加入到三个过滤装置中：三个过滤装置用于一个细菌并且标记为Ⅰ至Ⅲ。
4．抗体溶液，50μl，加入到各过滤装置：通过用PBS稀释，单克隆抗体和酶标记第二抗体或用酶直接标记的单克隆抗体等等给出合适的浓度获得抗体溶液；向Ⅰ中加入BLb2F37溶液用作单克隆抗体，向Ⅱ中加入BG3A5b4溶液备用，向Ⅲ中加入PQ3H8a9溶液备用。
5．搅拌后，使过滤装置在室温下静置15分钟。
6．该装置以2000rpm离心5分钟。
7．向该装置加入350μl的清洗溶液。
8．该装置以2000rpm离心10分钟。
9．向该装置加入50μl的底物溶液。
10．搅拌后，使过滤装置在室温下静置5分钟。
11．向该装置加入50μl的猝灭溶液。
12．搅拌后，首先确认向其中加入阳性对照的过滤装置显示出足够的颜色。
13．接着，将加入试验细菌的三个过滤装置的显色模式与下面的表相比较并且作出判断。
判断表
(“+”：强显色，“-”：没有显色或弱显色)
抗体溶液                       判断结果
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
-  -  -              没有啤酒腐败菌
+  -  -             啤酒腐败短乳杆菌或有害片球菌
-  +  -             啤酒腐败林氏乳杆菌
-  -  +             啤酒腐败有害片球菌
+  -  +             啤酒腐败短乳杆菌或有害片球菌
当分别使所有啤酒腐败乳酸细菌与三种单克隆抗体反应时，它们确实与一种或两种单克隆抗体反应，同时不与至少一种单克隆抗体反应。另一方面，非啤酒腐败菌不与三种单克隆抗体的任何一种反应。本发明判断方法使用下面：参见实施例中抗体特异性测定部分。换句话说，除非最初提供的细菌悬浮液的浓度太低或太高，当使悬浮液与相当量的三种抗体反应时，与其余装置相比，所有啤酒腐败菌在至少一个或两个过滤装置中表现出非常强的显色；而在非啤酒腐败菌情况下，三种抗体中没有一种抗体显色，或者所有三种抗体发生程度相似的弱显色。因此，在该方法中试验细菌的量无需精确；而且当判断细菌具有啤酒腐败能力时，也可以以过滤装置产生显色为基础鉴定细菌的种类。另外，因为同时处理啤酒腐败乳酸细菌的悬浮液并且在比较中作为阳性对照，就有可能确定所述抗体是否被灭活，以及确定操作方法是否发生错误。同时，使得能够更精确地判断。
偶尔情况下，当从啤酒中分离后在培养基中传代太多次时，一些啤酒腐败菌实验降低了抗抗体反应性。在这样的情况下，例如，首先将细菌悬浮于大约0.1％氢氧化钠溶液中并且使其在室温下静置10分钟。然后，将它们加入过滤装置。离心去除氢氧化钠溶液后，加入抗体溶液。这样获得足够的显色。
已一般性描述了本发明，通过参照这里提供的只是为了详细说明的目的而不是限制本发明范围的一些具体实施例进一步理解本发明。
实施例
实施例1
[制备对于啤酒腐败乳酸细菌特异性的单克隆抗体]
(1)制备抗原
从啤酒中分离的啤酒腐败乳酸细菌短乳杆菌，林氏乳杆菌和有害片球菌用作抗原。根据Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology中描述的分类体系鉴定这些菌株，所述文献在这里引作参考。注意，根据该分类体系所述，使用的短乳杆菌在厌氧条件下具有葡萄糖同化作用能力。这些在4℃下在啤酒中保存的菌株接种新鲜啤酒并且在25℃下生长直到啤酒变得浑浊，离心收集细胞。然后，在新鲜啤酒中传代培养细菌溶液等份，在每一次免疫的时候使用新鲜细菌细胞。
离心收集细胞后用生理盐水洗涤，将它们悬浮于磷酸缓冲盐水(PBs)中并且将其在660nm处的吸收度调节到0.5用于免疫。
(2)免疫小鼠
从日本SLC购得雌性BALB/C小鼠(8周龄)。初步喂养10天后将它们免疫。
对于免疫，将上述制备的三种类型的细菌悬浮液腹膜内接种到各小鼠体内。注射时间的间隔设定为一周一次，注射的悬浮液的量是，从开始时计，0.1,0.5,1.0,1.0,1.0和1.0，共计6次：总共注射了4.6ml。
(3)细胞融合
根据单克隆抗体实验手册，Toyama,S；Yasuto,T.，编著；Kodansha,最后免疫后三天，从小鼠体内取出脾，并且在没有胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基-Nissui Pharmaceutical Co.Ltd.--中分离脾细胞。接着，在聚乙二醇(在细胞融合中使用，从Behringer Manheim AG购得)存在下，使细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0.Ag14,DainipponPharmaceutical Co.Ltd.)进行细胞融合。接着，在含有15％FCS和HAT(H-0.262，从Sigma Inc.购得)的RPMI1640培养基中悬浮杂交瘤。该悬浮液在96孔微量培养板(从Nunc Inc.购得的No.167008)中平板培养，在37℃下在CO2培养箱中培养，此后，以合适的时间间隔更换培养基。当生长杂交瘤时，根据如下所述通过ELISA测定上清液的抗体滴定度并且筛选抗体阳性细胞。
(4)筛选抗体
向96孔微量培养板(从Nunc Inc.购得的No.168055)的每一个孔加入2.5％戊二醛溶液各50μl。在室温下静置3小时后倾析该溶液。分别制备已经在啤酒中经过传代培养的三种类型的啤酒腐败乳酸细菌的制剂，和在MRS培养基中传代培养的非啤酒腐败乳酸细菌干酪乳杆菌AHU1057菌株(对照)的制剂，使得它们在660nm处的吸收度是0.3∶AHU∶微生物培养收集实验室，农业系，Hokkaido大学，Sapporo，日本。向各孔中加入50μl等份的各制剂。在2000rpm下离心5分钟后，使孔在4℃下静置直到第二天。然后，弃除上清液，并且向各孔中加入100μl含有1％明胶的PBS。在室温下静置2小时后弃除上清液，制备已包被细菌的测试平板。
向如上所述制备的测试平板的每一个孔加入50μl的细胞融合的培养上清液。此外，向各孔中加入25μl的用含有0.1％明胶的PBS稀释250倍的商业购得的过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG+M抗体(Wako纯化学品)。室温下静置1小时之后，弃除上清液。然后各孔用含有0.05％Tween20的100μl所Tris缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0)洗涤两次。接着向各孔中加入50μl的底物溶液(含有1mg/ml邻-苯二胺二盐酸盐的0.25M柠檬酸钠缓冲液(pH4.2))。室温下静置5分钟之后，向各孔中加入50μl的猝灭溶液(10mM NaN3)终止反应。测定“A492-A630”(从492nm处的吸收度减去630nm处的吸收度获得的值)。如果用啤酒腐败乳酸细菌包被的孔具有比用干酪乳杆菌(对照)包被的孔更高的吸收度，则测定为阳性。
(5)克隆
根据有限稀释，对呈现阳性的杂交瘤进行克隆。以这种方法，从使用短乳杆菌为抗原的杂交瘤获得4个产生单克隆抗体的杂交瘤。其中，一株命名为“BLb2F37”并且于1998年7月8日保藏在国际贸易和工业部工业科学技术局国立生命科学和人体技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology,Agency ofIndustrial Science and Technology,Ministry of InternationalTrade and Industry)(保藏号FERM P-16884)。该菌株进一步在1999年6月4日在国际保藏单位国际贸易和工业部工业科学技术局国立生命科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-8566，日本)进行“国际保藏”(国际保藏号FERM BP-6744)。还从使用林氏乳杆菌为抗原的杂交瘤获得生产单克隆抗体的两个杂交瘤。其中，一株命名为“BG3A5b4”并且于1998年7月8日保藏在国际贸易和工业部工业科学技术局国立生命科学和人体技术研究所(保藏号FERM P-16885)。该菌株进一步在1999年6月4日在国际保藏单位国际贸易和工业部工业科学技术局国立生命科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566，日本)进行“国际保藏”(国际保藏号FERM BP-6745)。另外，从使用有害片球菌为抗原的杂交瘤获得生产单克隆抗体的两个杂交瘤。其中一株命名为“PQ3H8a9”,并且于1998年7月8日保藏在国际贸易和工业部工业科学技术局国立生命科学和人体技术研究所(保藏号FERM P-16886)。该菌株进一步在1999年6月4日在国际保藏单位国际贸易和工业部工业科学技术局国立生命科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566，日本)进行“国际保藏”(国际保藏号FERM BP-6746)。
(6)制备单克隆抗体
培养所述杂交瘤直到大约80％的细胞矮化并且看起来带黑色，然后离心取出细胞。4℃下以与培养上清液相当量的量缓慢向其中加入饱和的硫酸铵。离心后，弃除上清液。沉淀物再溶解于PBS后，在4℃下将溶解的溶液对PBS透析过夜制备单克隆抗体。
(7)测定抗体特异性
研究上面获得的单克隆抗体(BLb2F37,BG3A5b4，和PQ3H8a9抗体)对下面在啤酒酿造厂和研究实验室分离的菌株的特异性：44株表现出使啤酒腐败，18株表现出不使啤酒腐败，都属于短乳杆菌；7株表现出使啤酒腐败并且属于林氏乳杆菌；3株表现出使啤酒腐败，1株表现出不使啤酒腐败，都属于有害片球菌；47株其它乳酸细菌，表现出不使啤酒腐败，包括干酪乳杆菌，Lactobacillus parvus，植物乳杆菌，食果糖乳杆菌，棒状乳杆菌，嗜酸乳杆菌，布氏乳杆菌，丘状菌落乳杆菌，希氏乳杆菌，Lactobacillus kandleri，高加索酸奶乳杆菌，戊糖片球菌和糊精片球菌。
培养各菌株并且收获细胞；类似于(4)中描述的方法，使用它们来测定抗各菌株的反应性。这里，啤酒腐败菌株在啤酒中生长，非啤酒腐败菌株在MRS培养基中生长。作为对照，使用不使啤酒腐败的干酪乳杆菌AHU1057的菌株。AHU1057情况下的吸收度认为是空白，而表现出0.08或更高值的那些判断为“反应”。表1给出了结果。
表1
抗体 短乳杆菌 林氏乳杆菌 有害片球菌 其它非啤酒腐败乳酸细菌
啤酒腐败 非啤酒腐败 啤酒腐败 啤酒腐败 非啤酒腐败
 BLb2F37  44/44  0/18  0/7  2/3  0/1  0/47
 BG3A5b4  0/44  0/18  7/7  0/3  0/1  0/47
 PQ3H8a9  30/44  0/18  0/7  3/3  1/1  0/47
从表1明显看出，BLb2F37抗体表现出抗所有啤酒腐败短乳杆菌和大多数有害片球菌的反应性，但是对非啤酒腐败短乳杆菌和其它非啤酒腐败乳酸细菌，包括对有害片球菌，没有表现出反应性。BG3A5b4抗体对所有啤酒腐败林氏乳杆菌表现出反应性，但是对非啤酒腐败菌没有反应性。PQ3H8a9抗体表现出抗所有啤酒腐败有害片球菌和大多数啤酒腐败短乳杆菌的反应性，但是对非啤酒腐败乳酸细菌没有表现出反应性，除了非啤酒腐败有害片球菌的一个菌株外。
从这些发现认识到，上述抗体可以用来特异性检测啤酒腐败乳酸细菌，即不与非啤酒腐败乳酸细菌反应。此外，已表明当结合使用三种类型的抗体时，可以特异性检测所有啤酒腐败乳酸细菌。
实施例2
[获得的单克隆抗体的分类测定]
使用市售的试剂盒(从Amersham Inc.购得的小鼠单克隆抗体同型试剂盒)来研究实施例1中获得的三种抗体的类和亚类，和L-链的类型。表2给出了结果。
表2
抗体 类，亚类 L-链(类型 )
BLb2F37 IgG2b λ
BG3A5b4 IgG2b κ
PQ3H8a9 IgG2b κ
实施例3
[快速鉴定方法和鉴定试剂盒]
通过上述方法获得用来识别啤酒腐败乳酸细菌的三种类型的单克隆抗体。
(1)制备安装有过滤器(已经封闭)的离心管
向带有过滤器(SUPRECTM-01，从Takara Shuzo Co.Ltd.购得)加入1％的酪蛋白(于PBS中)100μl。室温下静置1小时后，使用半径16.5cm的甩平式离心机以2000rpm离心5分钟。接着加入200μl清洗溶液(10mM Tris-HCl/pH8.0/0.05％Tween20)，以2000rpm离心10分钟。这样就产生带有过滤器(已经封闭)的离心管，在4℃下贮存。
(2)抗体溶液
分别稀释抗体BLb2F37(抗体溶液Ⅰ)，抗体BG3A5b4(抗体溶液Ⅱ)和抗体PQ3H8a9(抗体溶液Ⅲ)，这样给出类似水平的背景。将过氧化物酶-缀合的山羊抗小鼠IgG-IgM(H+L)(从Wako纯化学品有限公司购得)稀释50-倍。混合5体积份数的前者，5体积份数的后者，7体积份数的1％酪蛋白(于PBS中)和33体积份数的PBS，分成小的等份在-20℃保存。各溶液标记为抗体溶液Ⅰ至Ⅲ。
对于每一个带有过滤器的离心管使用这些溶液各50微升。
(3)洗涤溶液
对于每个过滤器装置使用含有0.05％Tween20的10mM Tris-HCl(pH8.0)350微升。
(4)显色和猝灭溶液
使用过氧化物酶(OPD)的显色试剂盒(从Sumitomo BakeliteCo.Ltd.购得)。对于每一个带有过滤器的离心管使用溶解于5ml底物溶液中的颜色固定剂(1片)50微升。使用相同量的猝灭溶液。
(5)一接种环的在啤酒中培养之后的NBB斜面中保存的啤酒腐败菌或者一接种环的NBB斜面中保存的非啤酒腐败菌悬浮于100μl生理盐水中，向三个过滤装置各加入25μl，使分别与抗体溶液Ⅰ至Ⅲ反应。进行洗涤和显色。接着，在非啤酒腐败菌情况下，所有三种过滤装置观察到几乎相似的弱显色；在啤酒腐败菌情况下，观察到一个或两个过滤装置比剩下的过滤装置显示出明显强的显色。参见图1。
获得的结果表明，如果使用本发明方法，则试验菌的量不一定需要精确，并且当判断细菌为啤酒腐败菌时，以试管(抗体)显示的颜色为基础有可能鉴定其类型。
此外，当对表1中列出的所有乳酸细菌应用这种快速鉴定方法时，获得的结果与表1所示的抗体反应性不相矛盾，尽管在图中没有给出。
此外，已清楚地表明根据本发明的快速鉴定方法，用一接种环水平的细菌量可能进行足够的判断。
工业应用
本发明应用广泛。本发明的抗体表现出抗啤酒腐败乳酸细菌的反应性，但是对非啤酒腐败乳酸细菌没有反应性；因此，它们用于快速，方便和高精确性检测啤酒腐败乳酸细菌。另外，因为本发明的抗体是单克隆抗体，因此可以重复制备，它们用作检测啤酒腐败菌的试剂。此外，通过组合本发明的抗体，有可能检测认为有问题的所有类型的乳酸细菌。而且，根据本发明的快速鉴定方法和试剂盒使用市售的安装有过滤器的离心管并且利用了本发明三种抗体具有的特异性的优点。这使得方便而精确地判断对用培养基常规培养出现的乳酸细菌的啤酒腐败能力。
明显地，从上面的教导出发，本发明的多种改变和变化是可能的。因此要理解在后面的权利要求书范围内，除了这里具体说明的以外，也可以以其它方式实施本发明。
本发明以1998年7月22日提交的日本专利申请系列号平10-206484和1999年1月11日提交的日本专利申请系列号平11-4096为基础，其全文在这里引作参考。

Claims (17)

1．一种能检测啤酒腐败乳酸细菌的抗体，其中所述抗体是通过下面的方法产生的：
在啤酒中生长具有啤酒腐败能力的乳酸细菌，
用生长的乳酸细菌免疫非人的哺乳动物，和
从该哺乳动物分离抗体。
2．权利要求1的抗体，其是抗血清或者其纯化产物。
3．权利要求1的抗体，其中所述乳酸细菌能在厌氧条件下同化葡萄糖。
4．权利要求1的抗体，其中所述乳酸细菌选自啤酒腐败短乳杆菌，啤酒腐败林氏乳杆菌和啤酒腐败有害片球菌。
5．权利要求1的抗体，其是能与具有啤酒腐败能力的啤酒腐败乳酸细菌反应但是与不具有啤酒腐败能力的啤酒腐败菌不反应的单克隆抗体。
6．产生权利要求5的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
7．权利要求6的杂交瘤细胞系，其是BLb2F37(FERM BP-6744)。
8．权利要求6的杂交瘤细胞系，其是BG3A5b4(FERM BP-6745)。
9．权利要求6的杂交瘤细胞系，其是PQ3H8a9(FERM BP-6746)。
10．一种检测啤酒腐败乳酸细菌的方法，包括：
用权利要求1的抗体接触样品，和
分析抗体和乳酸细菌之间复合体的形成，
其中
存在复合体表明样品中存在该细菌，和
不存在复合体表明样品中不存在该细菌。
11．权利要求10的方法，其中抗体是由选自杂交瘤细胞系BLb2F37(FERM BP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)和PQ3H8a9(FERMBP-6746)的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
12．权利要求10的方法，其中抗体是由杂交瘤细胞系BLb2F37(FERM BP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)和PQ3H8a9(FERMBP-6746)产生的单克隆抗体的组合。
13．权利要求10的方法，其中啤酒腐败乳酸细菌是选自短乳杆菌，林氏乳杆菌和有害片球菌中的至少一员。
14．一种检测啤酒腐败乳酸细菌的试剂盒，包括：
(1)包括截留细菌的过滤器的离心管；
(2)权利要求1的抗体；
(3)抗所述单克隆抗体的第二抗体或抗体-样物质，其用酶标记；和
(4)与该第二抗体或抗体一样物质的标记酶反应并显色的底物。
15．权利要求14的试剂盒，其中抗体是由选自杂交瘤细胞系BLb2F37(FERM BP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)和PQ3H8a9(FERMBP-6746)的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
16．一种制备权利要求1的抗体的方法，包括：
在啤酒中生长具有啤酒腐败能力的乳酸细菌，
用生长的乳酸细菌免疫非人的哺乳动物，和
从该哺乳动物分离抗体。
17．一种制备权利要求6的杂交瘤的方法，包括：
用在啤酒中具有啤酒腐败能力的乳酸细菌免疫哺乳动物，其中所述哺乳动物不是人并具有脾，和
使该哺乳动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
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