ES2302383T3

ES2302383T3 - Metodos para obtener anticuerpos contra las bacterias del acido lactico que deterioran la cerveza y su uso diagnostico.

Info

Publication number: ES2302383T3
Application number: ES99929882T
Authority: ES
Inventors: Youichi Sapporo Breweries Ltd. TSUCHIYA
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2008-07-01
Anticipated expiration: 2019-07-16
Also published as: JP3614779B2; EP1100828A1; WO2000005267A1; DE69938553D1; US6395500B1; DE69938553T2; CN1309665A; DK1100828T3; JP2002521650A; CA2333302A1; ATE392434T1; CN1246334C; EP1100828B1

Abstract

Un método de elaboración de un anticuerpo, que comprende: (a) hacer crecer una bacteria del ácido láctico que posee capacidad de deterioro de la cerveza en la cerveza, (b) inmunizar un mamífero, distinto de un ser humano, con la bacteria del ácido láctico desarrollada, y (c) aislar el anticuerpo del mamífero.

Description

Métodos para obtener anticuerpos contra las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza y su uso diagnóstico.

Campo técnico

La presente invención se refiere a anticuerpos que reconocen las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza capaces de crecer en la cerveza, a un método para detectar las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza utilizando los anticuerpos, y a un kit para la identificación de las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza.

Técnica anterior

Existe el riesgo reconocido de que una vez que cierta clase de bacterias del ácido láctico ha contaminado el procedimiento de producción de cerveza, la turbidez, los sabores no deseados o similares, causados por la bacteria, pueden dañar la calidad de la cerveza producida. Por ejemplo, las bacterias que deterioran la cerveza representativas incluyen ciertas especies de bacterias del ácido láctico pertenecientes al género Lactobacillus, especialmente aquellas pertenecientes a Lactobacillus brevis y Lactobacillus lindneri, así como incluyen ciertas especies de bacterias del ácido láctico pertenecientes al género Pediococcus. De este modo, se han realizado intentos para desarrollar métodos para una detección rápida y de alta sensibilidad de estas bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza.

Se menciona específicamente un método en el que después de filtrar con un filtro de membrana la cerveza que se va a analizar, se hace crecer en un medio adecuado y se observan las colonias desarrolladas. Sin embargo, puesto que las bacterias que deterioran la cerveza existentes en la cerveza se presentan en cantidades diminutas y su crecimiento en el medio es lento, existen problemas con la sensibilidad y la naturaleza del consumo de tiempo de su detección utilizando este método.

Se ha desarrollado un método para la detección de bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza en la cerveza que utiliza la reacción antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, se han preparado anticuerpos policlonales (antisueros) contra las bacterias del ácido láctico. (Sharpe, M.E., J. Gen. Microbiol., 12, 107 (1955); Sharpe, M.E., Int. J. Syst. Bacteriol., 20, 509 (1970); Knox, M.W. et al., Infect. Immun., 24, 12 (1979); Shimoshashi, H. y Mutai, M., J. Gen. Microbiol., 103, 337 (1977); y Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei 4-72570). En la actualidad, ajustando las diferentes condiciones, se ha hecho posible preparar antisueros de tal calidad que tanto su especificidad como su sensibilidad son, hasta cierto punto, aceptables para su uso práctico. Sin embargo, todavía se desean mejoras en los siguientes aspectos, entre otros: el título de anticuerpo o la especificidad del antisuero fluctúan inevitablemente con su lote; el antisuero contra una cierta clase de bacteria del ácido láctico se vuelve positivo también frente a bacterias que no producen el deterioro de la cerveza; y ciertos antisueros requieren tratamiento con NaOH.

Por estas razones, se han propuesto métodos de detección que emplean anticuerpos monoclonales. (Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-6-46881 y Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-6-105698). De acuerdo con la descripción de la Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-6-46881, se preparan anticuerpos monoclonales utilizando como antígenos, Lactobacillus brevis, Lactobacillus collinoides y Lactobacillus suebicus que pertenecen al Grupo 3 del género Lactobacillus y que se desarrollan en el medio; y se utilizan estos anticuerpos monoclonales para detectar el Grupo 3 del género Lactobacillus en la cerveza.

No obstante, las bacterias del ácido láctico, que se demostrará que crecen en la producción de cerveza, solamente son una parte de aquellas pertenecientes al Grupo 3 del género Lactobacillus. Por lo tanto, el método descrito en la Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-6-46881 tiene el problema de que también se pueden detectar otras bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza, esto es, con este método se obtienen resultados falsos positivos.

De acuerdo con la descripción de la Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-6-105698, se prepara un anticuerpo monoclonal utilizando como antígeno, Lactobacillus plantarum que pertenece al género Lactobacillus y que crece en un medio; y se utiliza este anticuerpo monoclonal para detectar el Lactobacillus y el
Lactobacillus coryniformis en la cerveza. No obstante, este anticuerpo descrito tiene el mismo problema ya que también detecta las bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza (falsos positivos).

Por consiguiente, se ha propuesto un método para detectar solamente las bacterias que deterioran la cerveza que pueden crecer en la cerveza (en adelante referida como "capacidad para deteriorar la cerveza"). (Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-10-104238). De acuerdo con el método descrito en la Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-10-104238, se prepara un antisuero con conejos utilizando como antígeno, Lactobacillus brevis que no posee capacidad de asimilación de glucosa en condiciones anaerobias y que se desarrolla en un medio; y se utiliza el antisuero para detectar el Lactobacillus brevis que posee la capacidad para deteriorar la cerveza. Se cree que el antisuero así preparado reacciona específicamente con Lactobacillus brevis y Pediococcus damnosus, ambos los cuales dan lugar a la capacidad de deterioro de la cerveza.

Con todo, para separar del antisuero los anticuerpos no específicos que reaccionan con Lactobacillus brevis (esto es, anticuerpos no específicos que reaccionan con las bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza), se deben utilizar las células tratadas con álcali de Lactobacillus brevis que no deterioran la cerveza para efectuar la eliminación de los anticuerpos no específicos por adsorción, de acuerdo con el método descrito en la Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-10-104238. Además, existe el problema de que dependiendo del Lactobacillus brevis que se vaya a utilizar como antígeno, el antisuero resultante es propenso a un falso reconocimiento. Adicionalmente, ahora que se utiliza antisuero, su título de anticuerpo y su especificidad fluctúan inevitablemente entre lote y lote.

Como bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza representativa se menciona Lactobacillus lindneri; pero la eficacia del antisuero frente a semejante bacteria no se indica en la Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei-10-104238.

A la vista de lo anterior, se necesitan métodos mejorados para detectar bacterias que deterioran la cerveza en la industria de la fermentación.

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Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar reactivos capaces de detectar una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza en cuanto a la calidad de la cerveza.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la detección específica, rápida, conveniente, y reproducible de una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza que contamina el proceso de producción de cerveza y crece en la cerveza producida y que degrada la calidad de la cerveza.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la detección eficaz y exhaustiva de una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza tal como Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri, o Pediococcus damnosus.

Los objetos de la invención, y otros, se pueden lograr con un anticuerpo para la detección de una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza que es producido haciendo crecer en cerveza una bacteria del ácido láctico con capacidad para deteriorar la cerveza e inmunizando un mamífero con la cerveza.

Los objetos de la invención también se pueden lograr con un anticuerpo monoclonal que muestra reactividad frente a una bacteria del ácido láctico que muestra deterioro de la cerveza y que no muestra reactividad frente a una bacteria del ácido láctico que no deteriora la cerveza, donde el anticuerpo es producido haciendo crecer una bacteria del ácido láctico con capacidad para deteriorar la cerveza en cerveza e inmunizando un mamífero con la cerveza.

Los objetos de la invención se pueden lograr con el anticuerpo para la detección de una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza, así como el anticuerpo monoclonal descrito antes, donde la bacteria del ácido láctico con capacidad para deteriorar la cerveza es una bacteria del ácido láctico que posee capacidad para asimilar glucosa en condiciones anaerobias.

Los objetos de la invención también se pueden lograr con el anticuerpo para la detección de una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza, así como el anticuerpo monoclonal descrito antes, donde la bacteria del ácido láctico con capacidad para deteriorar la cerveza es una bacteria del ácido láctico seleccionada del grupo que consiste en Lactobacillus brevis que deteriora la cerveza, Lactobacillus lindneri que deteriora la cerveza, y Pediococcus damnosus que deteriora la cerveza.

Los objetos de la invención también se pueden lograr con un método para la detección de una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza con capacidad para deteriorar la cerveza tal como Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri, y Pediococcus damnosus utilizando el anticuerpo descrito antes.

Llevando a cabo el método de elaboración de una línea celular de hibridoma de acuerdo con la presente invención, se pueden obtener las siguientes líneas celulares de hibridoma: BLbF37 (FERM BP-6744), BG3A5b4 (FERM BP-6745) o PQ3H8a9 (FERM BP-6746), que producen el anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza.

Los objetos de la invención también se pueden lograr con un método para la detección de una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza con capacidad para deteriorar la cerveza tal como Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri, y Pediococcus damnosus, utilizando una combinación de los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas.

Los objetos de la invención también se pueden lograr con los métodos de elaboración de anticuerpos e hibridomas descritos antes.

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Breve descripción de los dibujos

Una apreciación más completa de la invención y muchas de las ventajas de la misma se obtendrán fácilmente a medida que se comprenda mejor la misma mediante la referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera a propósito del dibujo acompañante, donde:

La Fig. 1 es una fotografía que muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 3, esto es, la identificación rápida utilizando tres tipos de anticuerpos.

Mejor modo de llevar a cabo la invención Bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza

Según se utiliza en la presente memoria, el término "bacteria (o bacterias) del ácido láctico que deterioran la cerveza" hace referencia a una bacteria que es capaz de crecer en cerveza y que ocasiona turbidez en la cerveza debido a su crecimiento en ella.

Los términos hacer reaccionar, reaccionar con, unirse, etc., utilizados en la presente memoria en referencia a la interacción entre el anticuerpo de la invención y la bacteria del ácido láctico, hacen referencia a la formación de un complejo entre el anticuerpo y la bacteria, esto es, una reacción anticuerpo-antígeno. La formación de tales complejos, o la carencia de los mismos, tiene que ver con las condiciones analíticamente relevantes utilizadas en la producción de la cerveza, por ejemplo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 25ºC (véanse los Ejemplos de más abajo).

Las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza representativas incluyen, por ejemplo, las bacterias clasificadas como Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri, o Pediococcus damnosus (véase Back, W. et al., Brauwlt, 31/32, 1358 (1988)); pero no todas estas bacterias deterioran la cerveza.

Las bacterias del ácido láctico que se utilizan como antígenos en esta invención son aquellas que poseen capacidad para deteriorar la cerveza tales como las bacterias del ácido láctico pertenecientes a los géneros Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri, o Pediococcus damnosus.

Estas bacterias que deterioran la cerveza se pueden obtener añadiendo una muestra derivada del entorno de la cerveza, directamente o después de haber hecho crecer las bacterias del ácido láctico mediante el uso de un medio de selección de una bacteria del ácido láctico y seleccionado aquellas que ocasionan turbidez.

El subcultivo y la conservación de las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza se llevan a cabo de la siguiente manera: se hacen crecer las bacterias en cerveza, conservada a 4ºC, y se subcultivan cada pocos meses; o alternativamente, se añade glicerol con el fin de proporcionar una concentración final de 20%; y las bacterias se conservan a -70ºC.

La determinación que deteriora la cerveza se puede realizar de la siguiente manera: se añaden aproximadamente 10^{7} células bacterianas a una botella pequeña (334 ml) que contiene una cerveza disponible en el mercado - - malta 100%, pH de aproximadamente 4,4, y una unidad de amargor de aproximadamente 28 - -; se tapa y se almacena a 25ºC durante dos meses; y después, se realiza una inspección visual para evaluar si se ha producido o no turbidez en la cerveza.

Anticuerpos monoclonales

De acuerdo con métodos bien conocidos, se inmunizaron ratones con las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza que se seleccionaron como se ha descrito antes. Con posterioridad, se prepararon hibridomas y se establecieron los clones de los hibridomas que producían los anticuerpos monoclonales deseados. Los procedimientos para preparar los anticuerpos monoclonales y los hibridomas se describen en Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-3, Ausubel et al., Eds., John Wiley and Sons, 1998.

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1. Preparación de antígenos e inmunización

Específicamente, la bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza que se ha hecho crecer en cerveza se cosecha. Después de lavar con solución salina fisiológica, las células bacterianas se suspenden en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se utilizan para inmunizar los ratones. Se realizan inmunizaciones adicionales varias veces a intervalos apropiados y la inmunización final se debe realizar cuando aumenta el título de anticuerpo en sangre.

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2. Fusión celular

Tres días después de la inmunización final se extrae el bazo de los ratones inmunizados. Las células del bazo se fusionan con células de mieloma en presencia de un agente de fusión celular adecuado. Las células fusionadas se inoculan sobre una microplaca de 96 pocillos y se realiza el cultivo en un medio de selección apropiado, p. ej. medio HAT.

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3. Escrutinio y clonación

De acuerdo con un método tal como ELISA, se selecciona un hibridoma que producirá el anticuerpo deseado y se realiza el escrutinio.

La clonación se lleva a cabo sobre el hibridoma que produce el anticuerpo deseado utilizando un método tal como la dilución limitante y se establece un clon del hibridoma.

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4. Preparación de anticuerpo monoclonal en una gran cantidad

Después de hacer crecer en el medio el clon del hibridoma que produce el anticuerpo, las células se recuperan y después, se inoculan intraperitonealmente en un ratón estimulado con pristano antes de su uso. Se recoge una ascitis de su peritoneo que contiene el anticuerpo. Con posterioridad, se purifica un anticuerpo monoclonal de la ascitis utilizando la precipitación con sulfato de amonio o una columna de afinidad, p. ej., una columna de Proteína A o Proteína G. Alternativamente, después de hacer crecer el clon del hibridoma en medio a gran escala, se purifica el anticuerpo monoclonal del cultivo de acuerdo con un método en el que se utiliza la precipitación con sulfato de amonio, una columna de intercambio iónico o similar.

Los anticuerpos monoclonales obtenidos de este modo tienen las propiedades de: presentar reactividad contra las bacterias del ácido láctico que muestran capacidad de deterioro de la cerveza; y no presentar reactividad contra las bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza.

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5. Detección de bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza

Los métodos ilustrativos para la detección de las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza incluyen ELISA (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 2039 (1995), un método que cuenta con la reacción antígeno-anticuerpo de bacterias atrapadas en membranas (Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Hei 6-46881), y similares.

Específicamente, la cerveza producida se filtra con un filtro de membrana para atrapar las bacterias de la cerveza. Con posterioridad, después de lavar la membrana con un tampón adecuado tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS), se deja que las bacterias reaccionen con los anticuerpos monoclonales obtenidos antes y se lava la membrana con PBS. Después, se detectan los anticuerpos monoclonales que quedan en la membrana utilizando un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa, lo que permitirá la detección de las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza.

Adicionalmente, si los anticuerpos obtenidos en esta invención están marcados directamente (p. ej., con enzimas, colorantes fluorescentes o radioisótopos), la detección directa de las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza se hace posible sin requerir anticuerpos secundarios; y también se puede intensificar la sensibilidad de la detección.

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6. Método y kit de identificación rápida

Se proporciona un método de acuerdo con esta invención que tiene una elevada especificidad y que permite una rápida identificación con al menos los siguientes componentes: a saber (1) un tubo de centrifugación equipado con un filtro para atrapar bacterias; (2) las tres clases de anticuerpos monoclonales contra las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza obtenidos de acuerdo con la invención; (3) anticuerpos secundarios o sustancias de tipo anticuerpo contra los anticuerpos monoclonales mencionados antes, ambos los cuales están marcados con enzimas; y (4) un sustrato que reacciona con y colorea las enzimas de marcaje de los anticuerpos secundarios o de las sustancias de tipo anticuerpo. Además, pueden estar contenidas preferiblemente las bacterias del ácido láctico que se utilizan como controles positivos.

El método de identificación rápida, el método de detección y el kit de identificación rápida de acuerdo con la invención, se explicarán con detalle más abajo.

El kit de identificación rápida para las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza de acuerdo con la invención cuenta con la captura de bacterias mediante el uso de un tubo de centrifugación equipado con un filtro y la eliminación de los anticuerpos que no han reaccionado, combinado con un inmunoanálisis enzimático; evalúa la predicción de la capacidad de deterioro de la cerveza referente a una bacteria de ensayo por la magnitud de su tono de color. En el método de la presente invención, se añaden una suspensión bacteriana y anticuerpos marcados con enzima (p. ej., anticuerpos monoclonales y anticuerpos secundarios marcados con enzima, o anticuerpos monoclonales directamente marcados con enzima) al tubo de centrifugación con un filtro y se someten a centrifugación. Cuando el anticuerpo reacciona con la bacteria de ensayo, permanece en el filtro junto con la enzima de marcaje; mientras que, cuando el anticuerpo no reacciona, la enzima de marcaje se elimina junto con el producto filtrado bajo el filtro. De este modo, cuando se añade una solución de sustrato de la enzima, se produce la coloración solamente donde el anticuerpo reacciona con la bacteria de ensayo. Esto permite realizar la predicción de la capacidad de deterioro de la cerveza de la bacteria de ensayo con facilidad. Además, la especificidad es elevada debido a que el principio fundamental es el mismo que el de la técnica directa con anticuerpos fluorescentes.

Se requiere que el filtro a utilizar en el tubo de centrifugación con filtro tenga un diámetro de poro que sea suficientemente grande para atrapar las bacterias del ácido láctico que son objeto de la medida y que permita la separación de los anticuerpos que no han reaccionado. Este puede ser seleccionado fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear un filtro que tenga un diámetro de poro del orden de 0,2-0,45 \mum y de un material que minimice la adsorción de proteínas, p. ej., poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF); preferiblemente, se utiliza después de bloquear con caseína, seralbúmina bovina o similar.

La bacteria de ensayo se suspende en solución salina fisiológica o un tampón adecuado para la reacción antígeno-anticuerpo; y después, se añaden los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos secundarios marcados con enzima o los anticuerpos monoclonales marcados directamente con enzimas.

Después de permitir que reaccionen con la bacteria de ensayo, los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos secundarios marcados con enzima que no han reaccionado o los anticuerpos monoclonales directamente marcados con enzima que no han reaccionado se separan por centrifugación.

Además, se añade a los anticuerpos una solución de lavado de una naturaleza y concentración tales que no inhiban la reacción, p. ej., Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) que contiene Tween 20 al 0,05%. Después de eso, se llevan a cabo el lavado y la separación de la solución de lavado mediante centrifugación. De acuerdo con esta invención, empleando el tubo de centrifugación con filtro (o una unidad de filtro), es posible llevar a cabo el lavado y la separación de la solución de lavado simultáneamente y también se hace posible llevar a cabo completamente el lavado con gran eficacia sin riesgo de que las bacterias de ensayo sean lavadas.

Se prefiere que el sustrato colorante tenga su longitud de onda de absorción máxima en una región visible, sea altamente sensible y fácilmente distinguible, y posea una gran estabilidad a lo largo del tiempo. Para satisfacer tales requerimientos, son preferibles las sustancias colorantes de tipo peroxidasa. Por ejemplo, se pueden utilizar tetrametilbendizina (TMBZ) y ortofenilendiamina (OPD).

El kit de acuerdo con esta invención se va a utilizar para identificar las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza. Un ejemplo específico de una serie de manipulaciones de acuerdo con esta realización se ilustra en lo que sigue:

1.: Se colocan respectivamente en una placa de aglutinación una solución salina fisiológica, 100 \mul, y una suspensión bacteriana de ácido láctico de deterioro de la cerveza - - suspendida en solución salina fisiológica, esterilizada mediante tratamiento con calor y ajustada su absorbancia a 660 nm a 0,3 - - 100 \mul que se utiliza como control positivo.

2.: Se suspende la cantidad contenida en un asa de siembra de platino de la bacteria de ensayo en la solución salina fisiológica: su concentración se ajusta para que tenga casi el mismo nivel que el de la suspensión bacteriana de ácido láctico de deterioro de la cerveza.

3.: Se añaden 25 \mul de cada una de las respectivas suspensiones bacterianas a tres unidades de filtro: se utilizan tres unidades de filtro para una bacteria y se designan con los números I-III.

4.: Se añade una solución de anticuerpo, 50 \mul, a las respectivas unidades de filtro: la solución de anticuerpo se obtiene diluyendo con PBS, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo secundario marcado con enzima, un anticuerpo monoclonal marcado directamente con una enzima, o similar para dar una concentración apropiada; y a I se le añade una solución de Blb2F37 para su uso como anticuerpo monoclonal, a II se le añade una solución de BG3A5b4 para su uso, y a III se le añade una solución de PQ3H8a9 para su uso.

5.: Después de agitar, se permite que las unidades del filtro permanezcan a la temperatura ambiente durante 15 minutos.

6.: Las unidades se centrifugan a 2.000 rpm durante 5 minutos.

7.: A las unidades se les añaden 350 \mul de una solución de lavado.

8.: Las unidades se centrifugan a 2.000 rpm durante 10 minutos.

9.: A las unidades se les añaden 50 \mul de una solución sustrato.

10.: Después de agitar, se permite que las unidades del filtro permanezcan a la temperatura ambiente durante 5 minutos.

11.: A las unidades se les añaden 50 \mul de una solución de extinción.

12.: Después de agitar, se debe averiguar primero que las unidades del filtro a las que se ha añadido el control positivo muestran una coloración adecuada.

13.: A continuación, se compara el modo de coloración con respecto a las tres unidades del filtro, a las cuales se ha añadido la bacteria de ensayo, con la siguiente Tabla y se realiza una evaluación.

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TABLA DE EVALUACIÓN

1

Cuando se permite que cualquier bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza reaccione respectivamente con los tres anticuerpos monoclonales, ésta reacciona con uno o dos cualesquiera de los anticuerpos monoclonales y, al mismo tiempo, no reacciona con al menos un anticuerpo monoclonal. Por otra parte, una bacteria que no deteriora la cerveza no reacciona con ninguno de los tres anticuerpos monoclonales. El método de evaluación de la presente invención utiliza lo anterior: véase la sección de Análisis para la especificidad del anticuerpo en los Ejemplos. En otras palabras, a menos que la concentración de la suspensión bacteriana proporcionada inicialmente sea demasiado baja o demasiado alta, cualquier bacteria que deteriora la cerveza desarrolla un color notablemente fuerte en al menos una o dos unidades del filtro en comparación con la unidad o las unidades restantes cuando se permite que la suspensión reaccione con cantidades equivalentes de los tres anticuerpos; mientras que, en los casos de bacterias que no deterioran la cerveza ninguna de las tres desarrolla color, o se produce un débil coloración de magnitud similar en las tres. Por consiguiente, en este método no se necesita que la cantidad de bacteria de ensayo sea precisa; y por otra parte, cuando se ha evaluado que la bacteria tiene la capacidad de deteriorar la cerveza, también es posible la identificación de la clase de bacteria basándose en qué unidad de filtro ha desarrollado color. Además, puesto que la suspensión de bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza es preparada simultáneamente y utilizada en una comparación como control positivo, es posible determinar si los anticuerpos han sido inactivados, así como determinar si el procedimiento de manipulación es erróneo. Al mismo tiempo, se permiten evaluaciones más exactas.

A veces sucede que ciertas bacterias que deterioran la cerveza experimentan una reactividad reducida frente a los anticuerpos cuando su subcultivo se repite en el medio demasiadas veces después de haber sido aisladas de la cerveza. En tales casos, las bacterias se suspenden primero, por ejemplo, en solución de NaOH a aproximadamente 0,1% y se dejan estar a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Después, se añaden a las unidades del filtro. Después de separar la solución de NaOH por centrifugación, se deben añadir las soluciones de anticuerpo. De este modo, se puede obtener una coloración adecuada.

Habiendo descrito generalmente esta invención, se puede obtener una comprensión adicional mediante la referencia a ciertos ejemplos específicos que se proporcionan en la presente memoria con fines ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique de otro modo.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de anticuerpos monoclonales específicos para las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza (1) Preparación de antígenos

Se utilizaron como antígenos Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri y Pediococcus damnosus, que eran las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza aisladas de la cerveza. Estas cepas se identificaron de acuerdo con el sistema de clasificación descrito en el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática. Notablemente, como se establece en el sistema de clasificación, el Lactobacillus brevis utilizado poseía capacidad de asimilación de glucosa en condiciones anaerobias. Estas cepas que se habían conservado en cerveza a 4ºC fueron inoculadas en cervezas de nueva aportación y desarrolladas a 25ºC hasta que las cervezas se volvieron turbias, y se recogieron las células mediante centrifugación. Después, se subcultivaron porciones de las soluciones bacterianas en cervezas de nueva aportación, y se utilizaron células bacterianas de nueva aportación en cada momento de la inmunización.

Después de recoger las células cosechadas mediante centrifugación se lavaron con solución salina fisiológica, se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se ajustó su absorbancia a 660 nm a 0,5 para la inmunización.

(2) Inmunización de ratones

Se adquirieron ratones BALB/C hembra (8 semanas de edad) de Japan SLC. Después de alimentarlos preliminarmente durante 10 días, se inmunizaron.

Para la inmunización, se inocularon las tres clases de suspensión bacteriana preparadas antes intraperitonealmente en los respectivos ratones. El intervalo de las inyecciones se programó para que fuera una vez a la semana, y las cantidades de suspensión inyectada fueron, desde el momento de partida, 0,1, 0,5, 1,0, 1,0, 1,0, y 1,0 - 6 veces en total: se inyectaron un total de 4,6 ml.

(3) Fusión celular

Tres días después de la inmunización final, se separaron los bazos de los ratones y se separaron las células de los bazos en medio RPMI1640 sin suero de ternera fetal (FCS) - Nissui Pharmaceutical Co. Ltd. - de acuerdo con Monoclonal Antibody Experimental Manual; Toyama, S; Yasuto, T. Ed.; Kodansha. A continuación, se sometieron las células a fusión celular con células de mieloma (SP2/0\cdotAg14, Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.) en presencia de polietilenglicol (para su uso en la fusión celular, asequible de Boehringer Manheim AG). Con posterioridad, se suspendió el hibridoma en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 15% y HAT (H-0262, asequible de Sigma Inc.). La suspensión se cultivó en placa en una microplaca de 96 pocillos (Núm. 167008 asequible de Nunc Inc.), se desarrolló a 37ºC en una incubadora con CO_{2}, y después de eso, se cambió el medio a intervalos apropiados. Cuando se hubo desarrollado el hibridoma, se midió el título de anticuerpo del sobrenadante mediante ELISA como se describe más abajo y se escrutaron las células positivas para el anticuerpo.

(4) Escrutinio de anticuerpos

A cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Núm. 168055 asequible de Nunc Inc.) se le añadieron 50 \mul de solución de glutaraldehído al 2,5%. Después de dejarla estar a la temperatura ambiente durante 3 horas, la solución se descartó. Se elaboraron preparaciones de bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza de las tres clases, que habían sido subcultivadas en cerveza, y una preparación de Lactobacillus casei cepa AHU1057 (control), que no era una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza que había sido subcultivada en medio MRS, respectivamente de manera que su absorbancia a 660 nm pudiera ser de 0,3: AHU: Laboratory of Culture Collection of Microorganisms, Faculty of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Japón. Se añadieron las respectivas preparaciones a cada pocillo en porciones de 50 \mul. Después de centrifugar a 2.000 rpm durante 5 minutos, los pocillos se dejaron estar a 4ºC hasta el día siguiente. Después, se descartó el sobrenadante, y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de PBS que contenía gelatina al 1%. Después de dejar estar a la temperatura ambiente durante 2 horas, se descartó el sobrenadante y se preparó una placa de análisis que se había recubierto con la bacteria.

El sobrenadante de cultivo de la fusión celular, 50 \mul, se añadió a cada pocillo de la placa de análisis preparada antes. Adicionalmente, se añadieron a cada pocillo 25 \mul de un anticuerpo anti-IgG+M de ratón conjugado con peroxidasa disponible en el mercado (Wako Pure Chemicals), se diluyeron 250 veces con PBS que contenía gelatina al 0,1%. Después de dejar estar a la temperatura ambiente durante 1 hora, se descartó el sobrenadante. Luego, se lavó cada pocillo dos veces con 100 \mul de un tampón Tris (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) que contenía Tween 20 al 0,05%. Con posterioridad, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de una solución sustrato (tampón citrato de sodio 0,25 M (pH 4,2) que contenía 1 mg/ml de dihidrocloruro de o-fenilendiamina). Después de dejar estar a la temperatura ambiente durante 5 minutos, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de una solución de extinción (NaN_{3} 10 mM) para terminar la reacción. Se midió "A492-A630" (valores obtenidos restando la absorbancia a 630 nm de la absorbancia a 492 nm). Si el pocillo recubierto con una bacteria del ácido láctico que deteriora la cerveza tenía una absorbancia mayor que la del pocillo recubierto con Lactobacillus casei (el control), se determinaba que era positivo.

(5) Clonación

La clonación se realizó en los hibridomas que habían presentado carácter positivo, de acuerdo con la dilución limitante. De esta manera, se obtuvieron cuatro hibridomas productores de anticuerpo monoclonal a partir de los hibridomas que utilizaron Lactobacillus brevis como antígeno. Entre ellos, una cepa se denominó "BLb2F37" y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria el 8 de Julio de 1998 (Núm. de Acceso FERM P-16884). Se constituyó el "depósito internacional" de la cepa en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria (1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken 305-8566, JAPON), una autoridad internacional de depósito, el 4 de Junio de 1999 (Núm. de Acceso Internacional FERM BP-6744). Asimismo, se obtuvieron dos hibridomas productores de anticuerpo monoclonal a partir de los hibridomas que utilizaron Lactobacillus lindneri como antígeno. Entre ellos, una cepa se denominó "BG3A5b4" y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria el 8 de Julio de 1998 (Núm. de Acceso FERM P-16885). Se constituyó el "depósito internacional" de la cepa en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria (1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, JAPON), una autoridad internacional de depósito, el 4 de Junio de 1999 (Núm. de Acceso Internacional FERM BP-6745). Además se obtuvieron dos hibridomas productores de anticuerpos monoclonales que utilizaban Pediococcus damnosus como antígeno. Entre ellos, una cepa se denominó "PQ3H8a9" y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria el 8 de Julio de 1998 (Núm. de Acceso FERM P-16886). Se constituyó el "depósito internacional" de la cepa en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria (1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, JAPON), una autoridad internacional de depósito, el 4 de Junio de 1999 (Núm. de Acceso Internacional FERM BP-6746).

(6) Preparación de los anticuerpos monoclonales

Los hibridomas se hicieron crecer hasta que casi el 80% de las células totales se volvieron pequeñas y parecieron negruzcas, y después, se separaron las células por centrifugación. A estas se les añadió lentamente sulfato de amonio saturado en cantidades equivalentes a los sobrenadantes de cultivo a 4ºC. Después de la centrifugación, se descartaron los sobrenadadantes. Después de disolver de nuevo los productos precipitados en PBS, las soluciones disueltas se sometieron a diálisis en PBS a 4ºC durante la noche para preparar los anticuerpos monoclonales.

(7) Análisis para la especificidad del anticuerpo

La especificidad de los anticuerpos monoclonales obtenidos antes (anticuerpos PLb2F37, BG3A5b4 y PQ3H8a9) se investigó frente a las siguientes cepas aisladas en fábricas de cerveza y laboratorios de investigación: 44 cepas que presentaban deterioro de la cerveza y 18 cepas que no presentaban deterioro de la cerveza, ambas las cuales pertenecen al género Lactobacillus brevis; siete cepas que presentaban deterioro de la cerveza y pertenecientes Lactobacillus lindneri; tres cepas que presentaban deterioro de la cerveza y una cepa que no presentaba deterioro de la cerveza, ambas pertenecientes a Pediococcus damnosus; y 47 cepas de otras bacterias del ácido láctico que no presentaban deterioro de la cerveza, incluyendo Lactobacillus casei, Lactobacillus parvus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefir, Pediococcus pentosaceus, y Pediococcus dextrinicus.

Se hicieron crecer las respectivas cepas y se cosecharon las células; se utilizaron para analizar la reactividad contra cada cepa de un modo similar al método descrito en el apartado (4). Aquí, se hicieron crecer las cepas que deterioraban la cerveza en cerveza y se hicieron crecer las cepas que no deterioraban la cerveza en medio MRS. Como control, se utilizó la cepa de Lactobacillus casei AHU1057, que no presentaba deterioro de la cerveza. La absorbancia en el caso de AHU1057 fue considerada como el blanco, y aquellas que mostraron un valor de 0,08 o más fueron evaluadas como "reactivas". Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

2

Como resulta evidente a partir de la Tabla 1, el anticuerpo BLb2F37 mostró reactividad contra todos los Lactobacillus brevis que deterioran la cerveza y una mayoría de los Pediococcus damnosus, pero no presentó reactividad contra el Lactobacillus brevis que no deteriora la cerveza y otras bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza, incluyendo Pediococcus damnosus. El anticuerpo BG3A5b4 presentó reactividad contra todos los Lactobacillus lindneri que deterioran la cerveza pero no presentó reactividad contra las bacterias que no deterioran la cerveza. El anticuerpo PQ3H8a9 presentó reactividad contra todos los Pediococcus damnosus que deterioran la cerveza y una mayoría de los que deterioran la cerveza y una mayoría de los Lactobacillus brevis que deterioran la cerveza, pero no presentó reactividad contra las bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza excepto la cepa de Pediococcus damnosus que no deteriora la cerveza.

A partir de los descubrimientos se ha comprendido que los anticuerpos descritos antes se pueden utilizar para detectar específicamente las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza, esto es sin hacer reaccionar con las bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza. Además, se ha demostrado que cuando se combinan para su uso las tres clases de anticuerpos, se pueden detectar específicamente todas las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza.

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Ejemplo 2

Análisis de clasificación de los anticuerpos monoclonales obtenidos

Se utilizó un kit disponible en el mercado (Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit asequible de Amersham Inc.) para investigar los tipos de clases y subclases, y la cadena L con respecto a los tres anticuerpos obtenidos en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

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TABLA 2

3

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Ejemplo 3

Método de identificación rápida y kit de identificación

Se obtuvieron para su uso las tres clases de anticuerpo monoclonal que habían reconocido las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza mediante el método explicado antes.

(1) Preparación del tubo de centrifugación equipado con un filtro (bloqueo ya realizado)

Se añadieron 100 \mul de caseína al 1% (en PBS) a un tubo de centrifugación con un filtro (SUPREC®-0,1, asequible de Takara Shuzo Co. Ltd.). Después de dejarla estar a la temperatura ambiente durante 1 hora, se centrifugó a
2.000 rpm durante 5 minutos utilizando una centrífuga de tipo "swing" que tenía un radio de 16,5 cm. A continuación, se añadió una solución de lavado (Tris-HCl 10 mM/pH 8,0/Tween 20 al 0,05%), 200 \mul, y se realizó la centrifugación a 2.000 rpm durante 10 minutos. Esto dio como resultado un tubo de centrifugación con un filtro (bloqueo ya realizado) que se almacenó a 4ºC.

(2) Soluciones de anticuerpo

Se diluyeron el Anticuerpo BLb2F37 (para la Solución de Anticuerpo I), el Anticuerpo BG3A5b4 (para la Solución de Anticuerpo II), y el Anticuerpo PQ3H8a9 (para la Solución de Anticuerpo III), respectivamente, con el fin de proporcionar fondos a niveles similares. Se diluyó IgG + IgM anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (H+L) (asequible de Wako Pure Chemicals Co. Ltd.) 50 veces. Se mezclaron cinco partes en volumen del primero, 5 partes en volumen del último, 7 partes en volumen de caseína al 1% (en PBS), y 33 partes en volumen de PBS y se hicieron partes pequeñas para almacenarlas a -20ºC. Las respectivas soluciones de anticuerpo se indicaron como Soluciones de Anticuerpo I-III.

Se utilizaron cincuenta microlitros de cada una de estas soluciones por tubo de centrifugación con un filtro.

(3) Solución de lavado

Se utilizaron 350 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) que contenía Tween 20 al 0,05% por unidad de filtro.

(4) Soluciones de coloración y de extinción

Se utilizó un kit de coloración para peroxidasa (OPD) (asequible de Sumitomo Bakelite Co. Ltd.). Se utilizaron 50 microlitros de agente de fijación de color (un comprimido) disuelto en 5 ml de solución sustrato por tubo de centrifugación con filtro. Se utilizaron las mismas cantidades de las soluciones de extinción.

Se suspendió la cantidad de un asa de siembra de platino de las bacterias que deterioran la cerveza conservadas en cultivos inclinados NBB después del cultivo en cerveza o la cantidad de un asa de siembra de platino de las bacterias que no deterioran la cerveza conservadas en cultivos inclinados NBB en 100 \mul de solución salina fisiológica, y se añadieron 25 \mul de cada una a las tres unidades de filtro, dejándolas reaccionar con las Soluciones de Anticuerpo I-III, respectivamente. Se realizó el lavado y la coloración. Por consiguiente, en los casos de las bacterias que no deterioran la cerveza se observó una coloración débil casi similar en las tres unidades de filtro; en los casos de las bacterias que deterioran la cerveza se observó una coloración notablemente más fuerte con una o dos unidades de filtro que con el resto de las unidades de filtro. Véase la Fig. 1.

Los resultados obtenidos han indicado que si se emplea el método de la presente invención, no es necesario que las cantidades de bacterias sometidas a ensayo sean exactas y que cuando se evalúa que la bacteria es una que deteriora la cerveza, la identificación de su clase se hace posible basándose en qué tubo (anticuerpo) desarrolla color.

Adicionalmente, cuando se aplicó semejante método de identificación rápida a todas las bacterias del ácido láctico enumeradas en la Tabla 1, se obtuvieron resultados que no contradecían las reactividades de los anticuerpos mostradas en la Tabla 1, aunque no se muestre en las figuras.

Aún más, se ha demostrado claramente que de acuerdo con el método de identificación rápida de la presente invención, son posibles evaluaciones adecuadas con cantidades de bacterias a niveles de la cantidad de un asa de siembra de platino.

Aplicabilidad industrial

La presente invención tiene una amplia aplicabilidad. Los anticuerpos de esta invención presentan reactividad contra las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza, pero no presentan reactividad contra las bacterias del ácido láctico que no deterioran la cerveza; por lo tanto, son útiles para la detección rápida, conveniente, y de gran exactitud de las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza. Además, debido a que los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales y de este modo se pueden preparar reproduciblemente, son útiles como reactivos para la detección de las bacterias del ácido láctico que deterioran la cerveza. Adicionalmente, combinando los anticuerpos de la invención, es posible detectar las bacterias del ácido láctico de todas las clases que son consideradas problemáticas. Por otra parte, el método de identificación rápida y el estuche para ello de acuerdo con la invención emplean un tubo de centrifugación disponible en el mercado equipado con un filtro y obtienen ventaja de la especificidad que los tres anticuerpos de la invención poseen. Esto permite evaluaciones convenientes y exactas de la capacidad de deterioro de la cerveza con respecto a las bacterias del ácido láctico que han emergido del cultivo con medio convencional.

Claims

1. Un método de elaboración de un anticuerpo, que comprende:

(a): hacer crecer una bacteria del ácido láctico que posee capacidad de deterioro de la cerveza en la cerveza,

(b): inmunizar un mamífero, distinto de un ser humano, con la bacteria del ácido láctico desarrollada, y

(c): aislar el anticuerpo del mamífero.

2. Un método de elaboración de una línea celular de hibridoma, que comprende:

(a): inmunizar un mamífero, donde el mamífero es distinto de un ser humano y tiene bazo, con una bacteria del ácido láctico que posee capacidad de deterioro de la cerveza desarrollada en cerveza, y

(b): fusionar las células del bazo del mamífero con células de mieloma.