FR2652902A1 - Anticorps monoclonaux specifiques de la bacterie clavibacter michiganense pathovar michiganense, procede de selection de ces anticorps et leurs utilisation dans la detection du chancre de la tomate. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des anticorps monoclonaux spécifiques de la bactérie Clavibacter michiganense pathovar michiganense. Les anticorps monoclonaux de l'invention se caractérisent en ce qu'ils présentent un des profils de reconnaissance suivants: I') A+; B+; C+; D+; II) A+; B-; C-; D+; III) A+; B+; C-; D-; ces profils étant déterminés par rapport aux isolats bactériens suivants: A: Isolat "14" (C.N.C.M. I-904) B: Isolat "1496" (NCPPB 1496) C: Isolat "170" (NCPPB 170) D: Isolat "16" (C.N.C.M. I-903) chacun de ces isolats représentant un des plusieurs types immunologiques existant parmi les différents isolats de Clavibacter michiganense pathovar michiganense, et pouvant être remplacé ou additionné par un ou plusieurs isolats présentant le même type immunologique.

Description

L'invention a pour objet des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre la bactérie
Clavibacter michiganense pathovar michiganense, responsable du chancre bactérien de la tomate, un procédé de sélection de ces anticorps et leur utilisation dans la détection du chancre de la tomate.

Le "chancre bactérien" de la tomate (Lycopersicum esculentum) se manifeste par un flétrissement total et irréversible de la plante. Cette maladie, répandue dans le monde entier, est provoquée par une bactérie
Clavibacter michiganense pathovar michiganense, et se transmet essentiellement par les graines.

Les moyens de lutte contre cette maladie étant, à l'heure actuelle, très limités, l'utilisation de graines certifiées saines demeure un objectif primordial.

La mise au point d'un tel diagnostic est délicate en raison des caractéristiques particulières inhérentes à la bactérie et à l'infection elle-même.

En effet, le pourcentage de graines infectées dans un lot de semences peut être faible. De plus, la bactérie, dans une graine infectée, est minoritaire parmi la flore saprophyte totale. Enfin, la présence qualitative et quantitative de la bactérie dans la semence, ne peut pas être directement corrélée au développement de la maladie sur les hôtes.

Différentes méthodes de diagnostic ont cependant été proposées, incluant - la culture sur milieu sélectif (Kado C.I., Heskett
M.G. (1970) - Selective media for Isolation of
Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas
and Xanthomonas. Phytopathology 60, pp 969-976;
Wesley W.C.C. (1982) - Identification and detection
of Corynebacterium michagenense in tomato seed using
the indirect Enzyme linked Immunosorbent Assay.

Master thesis, University Hawaï; Fatmi M. et Schaad
N.W. (1988) - Semi selective agar medium for
isolation of Clavibacter michagenense subsp.

michiganensis from tomato seed. Phytopathology 78
pp. 121-126, - l'utilisation de bactériophages spécifiques
(Wakimoto S., Uelatsu T. et Mizukami T. (1969)
Bacterial canker disease of Tomato in Japan -2
Properties of bacteriophages specific for
Corynebacterium michiganense (Smith) Jensen. Ann
Phytopath. Soc. Japan 35 pp. 168-173; Echandi E. et
Sun M. (1973) - Isolation and characterization of a
bacteriophage for the identification of
Corynebacterium michiganense. Phytopathology 63, pp.

1398-1401, - l'inoculation d'hôtes sensibles (Thyr B.D. (1969)
Assaying tomato seed for Corynebacterium
michiganense. Plant. Dis. Rep. 53, pp858-860, - des techniques sérologiques variées, principalement
d'immunofluorescence (Trigalet A. et Rat B. (1976)
Immunofluorescence as a tool for detecting the
internally borne bacterial diseases: Corynebacterium
michiganense (E.F. Smith) Jensen and Pseudomonas
phaseolicola (Burkholder) Dowson - 15th
International workshop on seed pathology - Paris
International seed Testing Association. CH8046.

Zurich - Suisse et d'ELISA (Stevens W.A. et Tsiantos
J. (1979) - The use of Enzyme linked Immunosorbent
Assay (ELISA) for the detection of Corynebacterium
michiganense in tomatoes. Microbios letters 10,
pp29-32; Wesley W.C.C. (1982) - Identification and
detection of Corynebacterium michiganense in tomato
seed using the indirect Enzyme linked Immunosorbent
Assay. Master thesis, University Hawai.

Les techniques sérologiques mettant en jeu des anticorps comme outils de diagnostic se sont de plus en plus développées ces dernières années dans le domaine de la pathologie végétale, en particulier pour la détection de bactéries. Cependant, compte tenu de la présence de constituants de paroi communs à de nombreuses bactéries, les avantages de ces techniques sont sévèrement limités, cela en raison du caractère fondamentalement hétérogène de la réponse immunitaire qui, conduisant à une population polyclonale d'anticorps contre une bactérie donnée, entraîne très souvent des réactions croisées importantes des immunsérums avec d'autres bactéries. De plus, une standardisation des essais immunologiques réalisés avec des immunsérums s'avère difficile, ces essais étant intimement liés à la nature des immunsérums utilisés.

Le développement de la technologie d'hybridation lymphocytaire (Kohler G et Milstein C. (1975)
Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, pp 495-497) permet maintenant, en partie, de contourner ces difficultés. Cette technologie consiste à faire fusionner des cellules d'origine myélomateuse (transmettant les informations assurant le caractère tumoral : culture in vitro, prise en tumeur chez l'animal), et des lymphocytes immunocompétents. Les cellules hybrides qui en résultent, ou hybridomes, possèdent à la fois le caractère immortel du myélome et la propriété lymphocytaire de produire des anticorps spécifiques de l'antigène choisi pour l'immunisation. Après élimination des cellules parentales sur milieu sélectif, les hybridomes sont sélectionnés pour leur spécificité vis-à-vis de l'antigène, puis clonés.Chaque clone produit de grandes quantités d'anticorps monoclonaux identiques, dirigés contre un déterminant unique, et peut être conservé indéfiniment. Le puissant pouvoir discriminatoire de ces anticorps capables de reconnaître un épitope d'une molécule au sein de mélanges très complexes, et leur reproductibilité absolue, conséquence de leur production illimitée dans le temps, sont, ces dernières années, à la source du développement massif de tels outils dans la plupart des secteurs du diagnostic biologique et plus récemment dans le domaine de la pathologie végétale.

L'homogénéité, la spécificité et la disponibilité des anticorps monoclonaux font de ces derniers des réactifs immunologiques très bien adaptés à la mise au point de tests d'immunodiagnostic.

Il n'en demeure pas moins que de tels anticorps ne trouveront tout leur intérêt que s'ils sont dirigés contre un épitope spécifique de la bactérie responsable de la maladie, inexistant sur d'autres types de bactéries susceptibles d'être présentes sur le matériel végétal à tester. Très peu de données sur les antigènes de surface cellulaire de Clavibacter michiganense pathovar michiganense (C.m.p.m.), sont disponibles.

De plus, non seulement il est essentiel de viser un épitope qui n' existe pas chez d'autres types de bactéries, mais il faut aussi être sûr que l'épitope visé est présent sur tous les différents isolats de C.m.p.m., ceux-ci pouvant varier entre eux dans leurs propriétés immunologiques. Lors d'une détection de
C.m.p.m. dans des lots de semences, l'identité exacte de l'isolat susceptible d'être présent n'est pas connu - donc un criblage efficace doit mettre en oeuvre des anticorps monoclonaux capables de reconnaître tous les isolats susceptibles d'être présents.

Les inventeurs ont sélectionné quatre hybridomes sécréteurs d'anticortps monoclonaux dont chacun reconnaît spécifiquement un épitope présent sur un plus ou moins grand nombre de différents isolats de
C.m.p.m. (anticorps monoclonaux à spectre de reconnaissance plus ou moins large vis-à-vis des isolats pathogènes) et ce, avec une affinité plus ou moins élevée selon l'anticorps et selon l'isolat.

Sur la base de la répartition des épitopes reconnus par ces anticorps monoolonaux, il a été constaté que les différents isolats de C.m.p.m.

peuvent être divisés en 4 groupes ou "types immunologiques" (A à D), chaque groupe présentant un ou plusieurs de ces 4 épitopes. La constatation de l'existence de ces 4 groupes facilite d'une manière importante le criblage des anticorps monoclonaux.

De plus, les inventeurs ont identifié deux autres types d'isolats bactériens, appelés E et F. Les bactéries du type E sont des Clavibacter non pathogènes.L'identité précise des isolats du type F n' pas pu être établie. Des isolats du type E et F peuvent être utilisés dans le criblage des anticorps monoclonaux pour permettre la distinction entre des anticorps ayant des profils de reconnaissance semblables pour la majorité des isolats de C.m.p.m.

L'invention concerne des anticorps monoclonaux spécifiques de la bactérie Clavibacter michiganense pathovar michiganense, caractérisé en ce qu'ils présentent un des profils de reconnaissance suivants, ces profils étant donnés par rapport à l'ensemble des isolats bactériens A, B, C, D définis ci-après
I) A+; B+; C+; D+;
II) A+; B-; C-; D+;
III) A+; B+; C-; D-; "+" signifiant l'existence d'une réaction entre l'anticorps monoclonal et l'isolat concerné "-" signifiant l'absence de réaction entre l'anticorps monoclonal et l'isolat concerné les isolats bactériens respectifs A, B, C et D étant définis de la façon suivante
A : Isolat "14" (déposé le 14.09.89 sous le NOI-904 à la C.N.C.M., Institut Pasteur)
B : Isolat "1496" (NCPPB 1496)
C : Isolat "170" (NCPPB 170)
D :Isolat "16" (déposé le 14.09.89 sous le NOI-903 à la C.N.C.M., Institut Pasteur) chacun de ces isolats représentant un des plusieurs types immunologiques existant parmi les différents isolats de Clavibacter michiganense pathovar michiganense, et pouvant être remplacé par ou additionné d'un ou de plusieurs isolats présentant le même type immunologique.

Les isolats 1496 et 170 sont accessibles au public car ils ont été déposés depuis plusieurs années à la NCPPB (National Collection of Plant Pathogenic
Bacteria ou Collection Nationale de bactéries pathogènes de plantes, Ministry of Agriculture,
Fisheries and Food, Hatching Green, Harpenden,
Hertfordshire AL52BD, Angleterre).

L'invention vise également des anticorps monoclonaux spécifiques de la bactérie C.m.p.m. comme décrits ci-dessus, et qui sont caractérisés en ce qu'ils présentent un des profils de reconnaissance suivants
I') A+; B+; C+; D+; E-; F
I") A+; B+; C+; D+; E-; F+
II) A+; B-; C-; D+; E+; F
III) A+; B+; C-; D-; E-; F ces profils étant donnés par rapport aux isolats bactériens A à D définis ci-dessus et des isolats E et F définis de la façon suivante
E : Isolat "20" (déposé le 14.09.89 sous le NOI-902 à la C.N.C.M., Institut Pasteur)
F : Isolat "38" (déposé le 14.09.89 sous le NOI-901 à la C.N.C.M., Institut Pasteur).

L'invention concerne également un procédé de production d'anticorps monoclonaux spécifiques de la bactérie Clavibacter michiganense pathovar michiganense, ledit procédé mettant en oeuvre lors de l'étape de sélection l'ensemble d'isolats bactériens
A à D et éventuellement E et F indiqués ci-dessus.

L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour effectuer ce criblage ainsi que l'utilisation de ces anticorps monoclonaux dans la détection de la bactérie, par exemple dans la détection du chancre de la tomate.

L'invention concerne aussi de nouveaux isolats de
C.m.p.m. : isolat "14" (déposé le 14.09.89 sous le NOI-904 à la C.N.C.M., Institut Pasteur), isolat "16" (déposé le 14.09.89 ,sous le NOI-903 à la C.N.C.M.,
Institut Pasteur), isolat "20" (déposé le 14.09.89 sous le NOI-902 à la C.N.C.M., Institut Pasteur) et isolat "38" (déposé le 14.09.89 sous le NOI-901 à la
C.N.C.M., Institut Pasteur).

Les anticorps monoclonaux de l'invention sont obtenus selon un procédé impliquant l'obtention et l'isolement d'hybridomes secrétant les anticorps monoclonaux.

Un procédé de préparation des hybridomes selon l'invention comprend - l'utilisation de cellules de rate d'un animal, par
exemple souris ou rat, préalablement immunisé in
vivo ou l'utilisation de cellules de rate de tel
animal préalablement immunisé in vivo avec une
préparation de C.m.p.m. définie ci-après, - la fusion de cellules immunocompétentes obtenues à
l'étape ci-dessus avec des cellules de myelome dans
des conditions permettant la formation d'hybridomes
et - la sélection parmi les anticorps de ceux qui
sécrètent les anticorps monoclonaux qui présentent
l'un des profils de reconnaissance par rapport aux
isolats bactériens A à D et éventuellement E et F
tel qu'indiqué ci-dessus.

Un procédé de production des anticorps monoclonaux correspondants comprend - la mise en culture des hybridomes sélectionnés comme
indiqué ci-dessus dans un milieu de culture
approprié et - la récupération des anticorps monoclonaux secrétés
par lesdits hybridomes sélectionnés ou
alternativement - la mise en culture des hybridomes sélectionnés dans
le péritoine d'une souris (formation d'ascites) - la récupération des anticorps monoclonaux alors
formés à partir des dits ascites.

Plus particulièrement la production des anticorps monoclonaux selon l'invention comprend plusieurs étapes - l'immunisation d'un animal par exemple une souris
avec des bactéries C.m.p.m., - la récupération des cellules immunocompétentes de l'animal, - la fusion de ces cellules avec des cellules de
myélome pour l'obtention d'hybridomes, - la culture des hybridomes, - la sélection des hybridomes producteurs d'anticorps
spécifiques de la bactérie Clavibacter michiganense
pathovar michiganense, cette sélection étant
effectuée avec l'ensemble de bactéries A à D et
éventuellement E et F, - le sous-clonage des hybridomes sélectionnés, - la production en ascites des hybridomes
sélectionnés, - la purification de ces ascites, - éventuellement, le marquage des anticorps
monoclonaux, par exemple la conjugaison à la
peroxydase et à l'isothiocyanate de fluoresceïne.

La première étape de la production des anticorps monoclonaux de l'invention est l'immunisation d'un animal avec une préparation de C.m.p.m. Le matériel d'immunisation peut être constitué par des bactéries natives, ou dénaturées, ou encore les protéines extraites de la bactérie. Il est avantageux d'utiliser des bactéries dénaturées, par exemple par un traitement de chauffage à environ 1000C pendant environ 2 heures.

Parmi les isolats différents de C.m.p.m. qui peuvent être utilisés dans l'immunisation, il est possible d'utiliser un isolat seul, par exemple un représentant du type A, B, C ou D, ou une combinaison d'isolats de types différents, par exemple du type B et du type C, ou encore type A et type B et type C. Il est avantageux d'utiliser un cocktail d'isolats de types A, B, C et D.Ces différents types d'isolats sont exemplifiés par les isolats suivants:
A: isolat '14' (C.N.C.M. I-904)
B: isolat '1496' (N.C.P.P.B. 1496)
C: isolat '170' (N.C.P.P.B. 170)
D: isolat '16' (C.N.C.M. I-903)
Il est aussi possible d'utiliser plusieurs isolats du même type pour améliorer la réponse immunitaire si nécessaire par exemple, les isolats 9 (déposé le 14.09.89 sous le NOI-906 à la C.N.C.M.,
Institut Pasteur), 13 (déposé le 14.09.89 sous le NOI-905 à la C.N.C.M., Institut Pasteur) et 1496, tous appartenant au type B.

La voie d'immunisation utilisée dans la production des anticorps monoclonaux selon l'invention est généralement la voie intrasplénique décrite par
Spitz, M., et al., J. Immunol. Methods, 20 (1984) pp. 39-43. Selon cette méthode, la préparation bactérienne est injectée, sans adjuvant directement dans la rate de l'animal anesthésié. L'animal utilisé est généralement une souris BALB/C.

La deuxième étape de la production des anticorps monoclonaux de l'invention est la récupération des cellules immunocompétentes de l'animal (par exemple les cellules spléniques). Une fusion de ces cellules avec des cellules de myélome est ensuite effectuée pour obtenir des hybridomes. Ces hybridomes sont cultivés et les surnageants de culture sont testés pour leur spécificité vis-à-vis des isolats.

L'étape de sélection des hybridoies sécréteurs d'anticorps spécifiques de Clavibacter michiganense pathovar michiganense est réalisée selon l'invention avec un ensemble de bactéries appelées A, B, C, et D.

Cet ensemble de bactéries a été caractérisé par les inventeurs et représente les différents types immunologiques existants parmi un grand nombre d'isolats différents de C.m.p.m. En outre, deux autres types d'isolats E et F peuvent être utilisés dans la sélection. La manière dont cet ensemble a été identifié, ainsi que la façon de déterminer quels isolats appartiennent à quel groupe sera décrite en détail dans les paragraphes suivants.Les surnageants de cultures des hybridomes sont donc lis en contact avec chacune des bactéries du type A à D et, éventuellement E et F, et les hybridomes qui produisent des anticorps monoclonaux présentant l'un des profils de reconnaissance suivants sont sélectionnés :
I) A+; B+; C+; D+;
II) A+; B-; C-; D+;
III) A+; B+; C-; D-; ou
I') A+; B+; C+; D+; E-; F-;
I") A+; B+; C+; D+; E-; F+;
II) A+; B-; C-; D+; E+; F-;
III) A+; B+; C-; D-; E-; F-;
L'utilisation du type F a pour avantage de permettre la distinction entre les anticorps monoclonaux de profil I' et de profil I".

Les anticorps monoclonaux qui présentent le profil I ont un spectre de reconnaissance très large vis-à-vis des souches pathogènes et sont donc très intéressants pour la mise au point d'un test de diagnostic. Comme indiqué ci-dessus, ces anticorps monoclonaux peuvent être divisés en deux souscatégories, le I' et le I", à l'aide de l'isolat F, la différence principale entre ces deux sous-catégories étant le fait que I" reconnaît la bactérie F, ce qui n'est pas le cas de I'. Etant donné que les profils de reconnaissance de I' et de I" sont identiques vis-àvis des isolats de C.m.p.m. (A à D), et que la bactérie F n'est pas un C.m.p.m., il est préférable d'utiliser les anticorps monoclonaux de profil I', plutôt que I", dans un test de diagnostic.

Les anticorps monoclonaux de profil II et de profil III, bien que reconnaissant la majorité des isolats pathogènes, reconnaissent un nombre d'isolats plus restreint que les anticorps monoclonaux de profil
I' et I", mais l'affinité de la reconnaissance est très forte.

Les différents types immunologiques d'isolats A à
F, ont été identifiés par les inventeurs lors de la recherche des anticorps monoclonaux spécifiques du
C.m.p.m.

Les isolats testés lors de ce criblage étaient d'une part des isolats disponibles dans des collections, et d'autre part un nombre élevé d'isolats isolés par les inventeurs. De cette manière, l'ensemble d'isolats de C.m.p.m. testés contenait des bactéries d'origine géographique et temporelle très variée.

Ont également été testées, certaines bactéries saprophytes isolées de graines de tomates, par exemple Erwinia sep., Bacillus sp., Enterobacter sp.

ainsi que des bactéries plus ou soins proches taxonomiquement de C.m.p.m., par exemple différents pathovars de Clavibacter michiganense et autres.

Un certain nombre d'hybridoies ont été sélectionnés car les anticorps qu'ils sécrètent permettent la reconnaissance de la majorité des isolats de C.m.p.m. testés, voire de la totalité, mais avec une affinité plus ou moins importante selon l'hybridome et selon l'isolat bactérien.

En étudiant les réactions des anticorps avec tous les isolats de C.m.p.m., il a été constaté que les isolats testés peuvent être divisés en quatre groupes
A à D sur la base de la répartition des épi topes reconnus par ces 4 anticorps monoclonaux, (voir
Tableau 1). Chaque groupe est constitué d'isolats qui présentent la même réponse (c'est-à-dire soit la reconnaissance soit la non-reconnaissance) avec un anticorps monoclonal donné. La réponse indique la présence ou non de cet épitope sur cet isolat. Chaque groupe d'isolats de C.m.p.m. représente donc un type immunologique différent.De cette tanière, il est possible de regrouper les propriétés immunologiques d'un nombre élevé d'isolats de C.m.p.m. en quatre immunotypes : A, B, C et D, chaque groupe d'isolats de
C.m.p.m. étant défini par les épitopes présents sur sa surface et reconnus par les anticorps ionoclonaux de profil I', I", Il et III.

En outre, un des anticorps reconnaît un
Clavibacter michiganense non-pathogène (le type E), et un autre reconnaît une bactérie morphologiquement différente de C.m.p.m. (type "F"). Il est intéressant de noter que plus de 65% des isolats de C.m.p.m.

testés sont du type "A".

La Figure 1 illustre les différents types immunologiques des isolats de bactéries testés. Ces immunotypes ont été déduits à partir des réponses des anticorps monoclonaux de profil I', I", II et III exemplifiés par les anticorps monoclonaux produits par les hybridomes 2D11, 259, 38 et 9G6, avec des isolats testés. Il est à noter que les isolats du type A, B, C et D sont des C.m.p.m., tandis que les isolats E et F ne le sont pas.

Comme indiqué dans les paragraphes précédents, chaque anticorps monoclonal de l'invention peut être défini en termes de profils de reconnaissance vi s-à- vis de chaque type d'isolat bactérien. Un criblage des anticorps monoclonaux avec un nombre élevé d'isolats n'est donc plus nécessaire; il est possible d'utiliser quatre isolats qui, pris ensemble, représentent les principaux immunotypes différents existant parmi les isolats de C.m.p.m.Les quatre isolats utilisés sont, à titre d'exemple
A : 14 (C.N.C.M. I-904)
B : 1496 (NCPPB 1496)
C : 170 (NCPPB 170)
D : 16 (C.N.C.M. I-903)
L'utilisation d'isolats de types E et F, exemplifiés par l'isolat '20' (C.N.C.M. I-902) et l'isolat '38' (C.N.C.M. I-901) respectivement, lors de l'étape de sélection permet d'aller plus loin dans la caractérisation des anticorps.

Après sélection des anticorps nonoclonaux ceux-ci peuvent servir à leur tour pour identifier l'immunotype de la plupart des isolats de C.m.p.m. Le type A est identifié par le fait qu'il est reconnu par les quatre anticorps monoclonaux de profil I', I", II et III, le type B par sa reconnaissance par les anticorps de profil I', I" et III. Le type C est reconnu par les anticorps de profil I' et I" et le type D est reconnu par les anticorps de profil I', I" et II. Le type E, isolat non pathogène n'est reconnu que par l'anticorps de profil II, et le type F isolat non-C.m.p.m. par l'anticorps de profil I".

L'invention concerne donc également un procédé d'identification de l'immunotype d'un isolat de
C.m.p.m., ce procédé étant caractérisé par la mise en contact de l'isolat à identifier avec chacun des anticorps monoclonaux de profil I', I", II et III, l'immunotype de cet isolat étant ensuite identifié par le fait qu'il présente l'un des profils suivants
: Reconnaissance ou non
: par les anticorps Immunotye : monoclonaux
: de l'invention
:I' I@ II III
A : + + + +
B : + + - +
C : + + - -
D : + + + -
La possibilité d'identifier le groupe immunologique auquel un isolat de C.m.p.m. appartient permet de repérer des isolats autres que les six isolats particuliers et indiqués à titre d'exemple, qui peuvent servir dans le criblage des anticorps monoclonaux.

Les isolats qui ont servi pour la caractérisation des anticorps ont subi une étude systématique des propriétés morphologiques, biochimiques, métaboliques, sérologiques et de pathogénicité. A exception de l'isolat 38 (type "F"), tous les isolats ont été identifiés comme étant des Clavibacter michiganense.

Le pathovar michiganense est apparu après analyse d'acides gras de parois (System Hewlett Packard) dans la grande majorité des cas. La bactérie 38, bien qu'isolée sur un lot de semences de tomates contaminées s'est avérée différente morphologiquement des C.m.p.m. Son identité exacte n'a pas été établie.

Cet isolat permet de faire la distinction entre les réponses des anticorps de profils I' et I". Les isolats du type E ont une morphologie typique de
Clavibacter mais ont une croissance plus rapide que
C.m.p.m. sur milieu L.P.G. I1 sont non pathogènes et sont reconnus uniquement par l'anticorps de profil II.

Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent être utilisés dans la détection de la bactérie
C.m.p.m. dans les semences de tomates.

Les anticorps de profil I' seuls permettent la détection de la totalité des isolats de C.m.p.m.

testés à ce jour. I1 est intéressant de noter que le
I' a le même spectre de reconnaissance qu'un sérum polyclonal dirigé contre l'isolat 14 et purifié sur colonne de Sépharose couplé à des anti-immunoglobulines G de lapin (voir Tableau 1 ci-après), mais un cocktail "poly-monoclonal" des anticorps de profils II, III, I' et/ou I" améliore la sensibilité de la détection. Dans la mesure où l'anticorps de profil I' reconnaît les types A, B, C, D, sans reconnaître la bactérie du type F (qui n'est pas un C.m.p.m.), il peut être préférable d'incorporer un anticorps de profil I' dans un tel cocktail au lieu d'un anticorps du profil I". Dans le cas d'étude d'isolat de type particulier, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés à titre individuel.Par exemple, l'anticorps de profil Il reconnaît les isolats des types A, D, et
E, et ce avec une très forte affinité. Dans une situation oh ce spectre de reconnaissance est suffisant (par exemple dans le cas d'étude d'un isolat du type A), le II peut être utilisé seul, comme outil de diagnostic (voir Tableau 1 ci-après).

TABLEAU 1

<tb> <SEP> Caractérisation <SEP> de
<tb> <SEP> Anticorps <SEP> l'isolat <SEP> @
<tb> Bactérie <SEP> SLBC2 <SEP> 259 <SEP> 38 <SEP> 9G6 <SEP> 2D11 <SEP> 5C4 <SEP> H.P. <SEP> Pathogéncité
<tb> Violat <SEP> Po
<tb> <SEP> 1 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP>
<tb> <SEP> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> 4 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> 6 <SEP> + <SEP> + <SEP> | <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm <SEP> +
<tb> <SEP> 7 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> <SEP> 10 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> il <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> <SEP> 12 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> <SEP> 14 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> <SEP> B47 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> <SEP> 37 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> 382 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> <SEP> 399 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP>
<tb> <SEP> 515 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP>
<tb> <SEP> 886 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> 1064 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
<tb> 1379 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP>
<tb> 1397 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Cm.m <SEP> +
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TABLEAU I (suite)

<tb> <SEP> Caractérisation <SEP> de
<tb> <SEP> Anticorps <SEP> l'isoiat
<tb> Bactérie <SEP> SLBC2 <SEP> 259 <SEP> 38 <SEP> 9G6 <SEP> 2D11 <SEP> 5C4 <SEP> H.P.<SEP> Pathogéncité
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<tb> <SEP> 33 <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Cmi <SEP>
<tb> <SEP> 38 <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP>
Légende : SLBC2 PO : anticorps polyclonaux purifiés
de lapin
C.m.m : Clavibacter Michiganensis michiganensis
C.m.i : Clavibacter michiganensis insidiosum
H.P. : Analyse Hewlett Packard
(acides gras de cellules bactériennes)
* (présomption et non pas certitude au niveau pathovar)
L'utilisation des anticorps monoclonaux de l'invention dans la détection des C.m.p.m., à croissance lente, minoritaires parmi la flore microbienne de semences de tomates, apporte donc une amélioration nette en terme de spécificité et de sensibilité de détection vis-à-vis du chancre, comparativement aux anticorps polyclonaux.

EXEMPLES
I - PREPARATION D'HYBRIDOMES PRODUCTEURS D'ANTICORPS
MONOCLONAUX SPECIFIQUES d'UN EPITOPE DE LA
BACTERIE CLAVIBACTER MICHIGANENSE PATHOVAR
MICHIGANENSE.

La préparation des anticorps monoclonaux spécifiques à la bactérie C.m.p.m. est réalisée en plusieurs étapes a) le contrôle de l'identité de la (ou des)
bactérie(s) Clavibacter michiganense pathovar
michiganense, b) la multiplication de ces bactéries pathogènes, c) l'immunisation de souris avec ces bactéries, d) la récupération des cellules immunocompétentes de
la souris1 e) la fusion de ces cellules avec des cellules de
myélome pour l'obtention d'hybridomes, f) la culture des hybridomes, g) la sélection des hybridomes producteurs d'anticorps
spécifiques de la bactérie Clavibacter michiganense
pathovar michiganense, h) le sous-clonage des hybridomes sélectionnés, i) la production en ascites des hybridomes
sélectionnés, j) la purification de ces ascites, k) la conjugaison des anticorps monoclonaux à la
peroxydase et à l'isothiocyanate de fluoresceïne.

Les divers milieux utilisés sont répertoriés dans les Tableaux 4A, 4B et 4C ci-après.

TABLEAU 4A @@ MILIEUX DE CULTURE DES BACTERIES
Milieu L.P.G.A.

Extrait de levure (Difco) 10 g
Bactopeptone (Difco) 5 g
Glucose 10 g
Agar 15 g
H2O q.s.p. 1 i - Ajuster le pH à 7,4 avant autoclavage.

Ce milieu est également utilisé liquide sans agar (L.P.G.)
Milieu S.M.C.

K H2P O4 0,5 g
K2H P O 2 g
Mg S O4 7H20 0,25g
Acide borique 1,5 g
Saccharose 10 g
Extraits de levure 0,1 g
Agar 15 g
H2O q.s.p. il
- Ajouter après autoclavage
* Acide nicotinique 100 mg/l
* Acide nalidixique 30 mg/1
* Tellurite de potassium 10 mg/1 (1 ml
solution Difco 1 % pour milieu de Chapman)
* Cycloheximide 200 mg/l
TABLEAU 4B TABLEAU 4 (b):@@@@@@@@@@@@@@@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@.@ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@::

@veduits <SEP> @@@@eu <SEP> @ <SEP> @@@@@@@@@@@@@ <SEP> Mi@@e@ <SEP> 3 <SEP> Mi@@e@ <SEP> 4 <SEP> Mi@@e@ <SEP> 5 <SEP> Mi@@@@ <SEP> 6 <SEP> Mi@@@@ <SEP> 7
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TABLEAU 4C
C/ MILIEUX UTILISES DANS LES TESTS DE DIAGNOSTIC
TamDon carbonate de sodiun
Na2CO3 1,6 g
NaHCO3 2,9 g
NaN3 0,2 g
H2O q.s.p. 11 - Ajuster le pH à 9,6
Tampon P.B.S. (Phosphate Buffer Saline)
NaCl 8 g
KH2PO4 0,2 g
Na2HPO4,12H2O 2,9 g
KCl 0,2 g
NaN3 0,2 g
N2O q.s.p. 11 - Ajuster le pH à 7,4
Tampon T.B.S. (Tris Buffer Saline)
NaCl 11,69 g
Tris HCl 6,06 g
H2O q.s.p. 11 - Ajuster le pH à 7,4
D/ MILIEU DE NACERATION DES SEMENCES DE TOMATE
Tampon phosphate + inhibiteurs
Na2HPO4,12H2O 32,926 g
KH2PO4 1,088 g
NaCl 80 g
H20 q.s.p. Il - Diluer la solution mère 10 fois avant l'emploi - Ajouter
* Actidione 50 mg/l
* Acide nalidixique 4 mg/1.

a) CONTROLE DE L'IDENTITE DE LA BACTERIE CLAVIBACTER
MICHIGANENSE PATHOVAR MICHIGANENSE
Afin de s'assurer de la nature du matériel antigénique utilisé pour l'immunisation des souris et la caractérisation des anticorps produits, une étude systématique des caractéristiques iorphologiques, biochimiques, métaboliques, sérologiques et de pathogénicité des divers isolats de Clavibacter michiganense pathovar michiganense a été réalisée.

- Etude morphologique
Observation morphologique des colonies, de la bactérie, (coloration de Gram) de sa croissance et de sa pigmentation sur divers milieux LPGA, SMC.

- Etude biochimique et métabolique
Tests biochimiques et métaboliques classiques (galeries API20B et 20E)
. Test de tolérance au Chlorure de sodium
. Analyse chromatographique des acides gras de paroi (système Hewlett Packard).

- Etude sérologique
Reconnaissance des isolats par les anticorps polyclonaux anti-Clavibacter michiganense pathovar michiganense faits chez le lapin.

- Tests de pathogénicité
Le contrôle de la pathogénicité des isolats est réalisé par inoculation des isolats sur hôtes sensibles (jeunes plants de tomate).

b) MULTIPLICATION DES BACTERIES PATHOGENES
Après vérification de la pureté des souches bactériennes sur milieu solide (LPGA), les cultures sont effectuées en milieu liquide (LPG, 280C, agitation 48 heures environ). Le milieu LPG correspond au milieu LPGA sans agar.

c) IMMUNISATION DES SOURIS AVEC LES PREPARATIONS
BACTERIENNES
Animaux : souris BALB/C, femelles, de 5 à 6 semaines (IFFA CREDO).

Voie d'immunisation : voie intrasplénique (Spitz et ai. 1984).

j = O Les cultures bactériennes sont centrifugées, les culots étant repris dans de l'eau physiologique (3 lavages). Les bactéries soit natives, soit dénaturées (chauffage 1000C, 2 h.) sont injectées, sans adjuvant, directement dans la rate de la souris anesthésiée, à raison d'environ 108 bactéries/souris.

j = 3,5 Fusion.

d) RECUPERATION DES CELLULES IMMUNOCOMPETENTES
La souris est tuée par dislocation de la nuque.

La rate est prélevée en conditions stériles, rincée dans du milieu 2. Les cellules spléniques sont dispersées à l'aide de pince jusqu'à l'obtention d'une suspension cellulaire relativement homogène. Cinq minutes de sédimentation permettent ensuite d'éliminer les agrégats restants. Puis, les splénocytes sont lavés deux fois de suite (milieu 3, 200 g, 6 mn, 200C).

e) CULTURE DES CELLULES DE MYELOME ET HYBRIDATION
LYMPHOCYTAIRE
Des cellules de myélome X63Ag 8.6.5.3 (myélome donné par M. HIRN, laboratoire d'Immunologie,
Université de Marseille Luminy) sont décongelées une semaine avant la date de fusion et mises en culture dans du milieu 4 (incubateur 370C, 100% humidité, 7% Cor). La concentration et la viabilité des cellules sont contrôlées chaque jour. La croissance est optimale pour des concentrations de 1 à 5 x 105 cellules par ml. Le myélome doit être en phase exponentielle de croissance et contenir moins de 10% de cellules non viables le jour de la fusion.

Les deux partenaires de la fusion : cellules de myélome/ lymphocytes de la rate, dans un rapport 1/10, sont mis en contact intime (200 g, 10 mn, 200 C).

Après aspiration du surnageant, 0,7 ml de PEG 4000 50% (P/V) dans du tampon phosphate de sodium est ajouté goutte à goutte ( 1 mn, 370 C). Après repos du culot en présence de PEG (1 mn, 370 C), la réhydratation de la culture se fait avec le milieu 3, selon le protocole suivant : 2 ml en 2 mn, 5 mi en 3 mn et 14 ml en 2 mn (370 C). Le gradient d'entrée d'eau doit être le plus doux possible. Les cellules sont alors centrifugées (250 g, 10 mn, 200 C) et le culot cellulaire est remis délicatement en suspension à raison de 106 lymphocytes par ml de milieu 5.

f) ENTRETIEN DES CULTURES D'HYBRIDOMES
L'ensemencement a lieu en boîtes 96 puits à raison de 100 ul par puits, puits contenant depuis la veille un lit nourricier de macrophages. Les puits de culture sont remplis avec du milieu 5 et les boites sont transférées dans l'incubateur (370C, 100% humidité, 7% COz).

Tous les 5 jours, la moitié du surnageant de culture de chacun des puits est remplacé par du milieu frais 5. La croissance des clones est étalée dans le temps, les surnageants de culture sont testés pour leur spécificité et les clones intéressants sont transférés en boites 24 puits (milieu 5, mais sans aminoptérine). Après une deuxième vérification de la positivité des clones, ceux-ci sont sous-clonés (clonage par dilution limite), puis congelés (milieu 6).

g) SELECTION DES HYBRIDOMES SECRETEURS D'ANTICORPS
SPECIFIQUES DE CLAVIBACTER MICHIGANENSE PATHOVAR
MICHIGANENSE
La sélection des hybridomes est réalisée avec le système CROSS DOT (demande de brevet français
ANVAR/CNRS, N02584498, demande de brevet européen nO 0211777) selon les techniques développées par ALRIC et coll. (1986). Les antigènes utilisés sont, d'une part, un ensemble d'isolats de Clavibacter michiganense pathovar michiganense dont une partie a été isolée par les inventeurs, d'autre part, une collection de souches bactériennes composée de bactéries saprophytes de graines de tomates et de bactéries plus ou moins proches taxonomiquement de Clavibacter michiganense pathovar michiganense.Après incubation des surnageants de culture des hybridomes, les complexes "antigènes-anticorps" formés sont détectés avec des anticorps dirigés contre les immunoglobulines de souris, anticorps conjugués à la peroxydase. Le substrat enzymatique utilisé est du 4-chloro-1naphtol.

C'est ainsi qu'un certain nombre d'hybridomes de nomenclature 259, 595, 612, 2Dll et 9G6 ont été sélectionnés, non seulement pour la reconnaissance de leurs anticorps vis-à-vis de la bactérie pathogène, mais aussi pour l'absence de réactions croisées de ces anticorps avec toute bactérie saprophyte ou voisine testée. Chaque hybridome permet la reconnaissance de la majorité des isolats de Clavibacter michiganense pathovar michiganense testés, voire de la totalité, mais avec une affinité plus ou moins importante selon l'hybridome et selon l'isolat bactérien. Un hybridome appelé "38"a également été sélectionné. Cet hybridome produit des anticorps qui reconnaissent tous les
C.m.p.m. testés, mais reconnaît aussi un isolat bactérien non C.m.p.m., le type F.Ces anticorps se sont révélés être identiques aux anticorps produits par un autre hybridome sélectionné, le 5C4.

Les hybridomes 259, 612, 595 et 38 ont été obtenus après immunisation avec l'isolat C.m.p.m. 14 (C.N.C.M. I-904).

Parmi ces anticorps, ceux produits par les hybridomes 259, 612 et 595, ne reconnaissent pas tous les isolats de C.m.p.m. testés. Un mélange des isolats non reconnus (9, 13, 170, 1496; C.N.C.M. I-906,
C.N.C.M. I-905, NCPPB170, NCPPB1496 respectivement) a été alors utilisé pour immuniser une souris et les étapes nécessaires pour la production d'anticorps monoclonaux ont été effectuées. Les hybridomes 9G6, 2Dll et 5C4 a été alors sélectionnés. Le critère de sélection a été encore la reconnaissance d'un maximum d'isolats pathogènes de C.m.p.s. et l'absence de réaction croisée avec d'autres bactéries; aucune des bactéries saprophytes n'est reconnue par les anticorps monoclonaux de l'invention (voir Tableaux 3A et 3B ci-après).

TABLEAU 3A
ANALYSE HEWLETT PACKARD (HP)
Acides gras de cellules bacteriennes
Bactéries non reconnues par les anticorps monoclonaux de l'invention
PRESOMPTION de (et non certitude) * Al Corynebacterium flaccumfaciens * D1 Micrococcus luteus ? * El Micrococcus lut eus * F1 Clavibacter michiganesis insidiosium ? * G1 Clavibacter michiganesis insidiosium ? * Hl Micrococcus luteus ? * L1 Pseudomonas diminuta ? * M1 Arthrobacter globiformis * 1A Enterobacter agglomerans * 1D Acinetobacter calcoaceticus * 1E Acinetobacter calcoaceticus * 1F Pseudomonas diminuta ? * 2A Bacillus pumilus ? * 2B Escherichia vulneris * 2C Enterobacter agglomerans * 2D Enterobacter agglomerans * 2F Enterobacter agglomerans * 2G Flavobacterium indologenes ? * 2H Pseudomonas aeruginosa ? * 3A Bacillus pumilus ? * 3B Bacillus pumilus ? * 3C Kluyveras cryocrescens ? * 3D Bacillus thuringensis ? * 3F Enterobacter cloacae ?
TABLEAU 3A (suite) * 4B Enterobacter agglomerans * 4C Enterobacter agglomerans * 4D Erwinia salicis * 4E Escherichia vulneris * 4F Erwinia salicis * 4G Bacillus * 4H Jant hinobacterium lividum t 8B Enterobacter sazakii * 8C Enterobacter sazakii * 8D Enterobacter agglomerans ? * 8E Clavibacter michiganense insidiosum ? * 8F Salmonella entiritidis 8G Enterobacter sazakii * 8H Enterobacter agglomerans + 10 A Clavibacter michiganense insidiosum ? * 10 B Pseudomonas putida ? * 10 C Acinetobacter lwoffi ? * 10 E Enterobacter agglomerans * 10 F Pseudomonas putida ? * 10 H Pseudomonas putida ? ' 10 J Bacillus * B 2 Pseudomonas aureofaciens ? * E 2 Pseudomonas putida ? * I 2 Pseudomonas corrugata (NB : ? = présomption inférieure à 50 %)
TABLEAU 3B
Liste des bactéries isolées de la tomate

<tb> I@ol@@@nt
<tb> à <SEP> partir <SEP> @rigins <SEP> <SEP> Variété <SEP> I@olat
<tb> <SEP> de <SEP> ::
<tb> <SEP> F1 <SEP> Montfavst <SEP> A-B-C-D-E-F
<tb> <SEP> A1-B1-C1-D1-E1-F1-G1-H1-I1-J1-L1
<tb> <SEP> (Gran-)-M1-N1
<tb> <SEP> GRRINES
<tb> <SEP> Camaray <SEP> Nar@ande <SEP> <SEP> 1A-1B-1C-1D-1E-1F-1G
<tb> <SEP> DE <SEP> France
<tb> <SEP> TDMATE <SEP> Avignon <SEP> St <SEP> Plerrs <SEP> 2A-2B-2C-2D-2E-2F-2G
<tb> <SEP> Tafwan <SEP> F1 <SEP> Fourn@i@@ <SEP> <SEP> 3A-3B-3C-3D-3E-3F
<tb> <SEP> Chili <SEP> F1 <SEP> @ontfavst <SEP> <SEP> 4A-4B-4C-4D-4E-4F-4G <SEP> : <SEP> Bacillus
<tb> <SEP> 4H <SEP> : <SEP> Jant <SEP> hinobacteriu@ <SEP> livl@u@
<tb> GRAINES <SEP> DE
<tb> <SEP> TOMATE <SEP> 8A-8B-8C-8D-8E-8F-8G-8H
<tb> EBARBEES
<tb> <SEP> Espagne <SEP> F1 <SEP> Dons <SEP> 10A-10C-10D-10E-10F-10G-10H
<tb> <SEP> 10B <SEP> :<SEP> Paeudo@onse <SEP> <SEP> putid@
<tb> <SEP> 10I <SEP> : <SEP> Coryne@@cter@u@ <SEP> michige
<tb> <SEP> nense
<tb> <SEP> 10J <SEP> : <SEP> Bacillus
<tb> PLANTS <SEP> DE <SEP> F1 <SEP> Montravst <SEP> B2-C2-D2-E2-I2
<tb> <SEP> TOMATE
<tb>
Les spectres de reconnaissance des anticorps monoclonaux finalement sélectionnés, c'est- & dire ceux produits par les hybridomes 259, 38, 9G6, 2D11 (et le 5C4 qui est équivalent au 38) vis-à-vis des isolats de
Clavibacter michiganense sont représentés dans le
Tableau 1 ci dessus.

h) SOUS-CLONAGE DES HYBRIDOMES SELECTIONNES
Af in de s'assurer du caractère monoclonal des hybridomes sélectionnés pour leur spécificité vi s-à- vis de Clavibacter nichiganense pathovar michiganense, ceux-ci sont sous-clonés par dilution limite (méthode classiquement utilisée).

i) PRODUCTION EN ASCITES DES ANTICORPS DES
HYBRIDOMES SELECTIONNES
Une production des anticorps des hybridomes sélectionnés est réalisée, en ascites, chez des souris
BALB/C femelles, de 5 à 6 semaines. Quatorze jours après une première injection intrapéritonéale de 2-6-10-14 tétraméthylpentadécane (0,5 ml par souris), l'injection de cellules hybrides des clones sélectionnés est réalisée, toujours par voie intrapéritonéale, à raison de 106 cellules/0,5 ml RPMI 1640/souris. Une dizaine de jours plus tard, des souris développent des ascites qui sont alors régulièrement prélevés. Une moyenne de 10 ml d'ascites est obtenue par souris.

j) PURIFICATION DES ASCITES
Après centrifugation (300 g, 7 mn, 200 C), les surnageants d'ascites sont purifiés sur colonne d'immunoaffinité Sépharose 4B couplé à des anticorps monoclonaux anti-immunoglobulines de souris, de classe correspondant à l'hybridome sélectionné (collaboration avec H. Bazin, Unité d'Immunologie expérimentale,
Université de Louvain, Bruxelles).

k) CONJUGAISON DES ANTICORPS MONOCLONAUX DES
HYBRIDOMES SELECTIONNES
Pour leur utilisation dans des tests ELISA, CROSS
DOT ou CROSS BLOT, et dans des tests d'immunofluorescence sur lames, les anticorps sont couplés
- soit à la peroxydase selon la technique de
Nakane P.J. et Kawaol A. (1974) - Peroxydase labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem.

Cytochem. 22, pp1084-1091,
- soit à la phosphatase alcaline selon la technique de Engvall E. et Perimann P. (1971)
Immunochemistry 8, pp871-874,
- soit à l'isothiocyanate de fluoresceince (FITC) selon une méthode développée dans le laboratoire de H.

Bazin (collaboration H. Bazin, Université d'Immunologie expérimentale, Université de Louvain,
Bruxelles).

II - ANALYSE DES RESULTATS, DEFINITION DES ANTICORPS
MONOCLONAUX EN TERMES DE SPECTRE DE
RECONNAISSANCE ET DEFINITION DES DIFFERENTS TYPES
D'ISOLATS BACTERIENS EN TERMES D'EPITOPES PORTES
A LEUR SURFACE
Parmi les hybridomes sélectionnés précédemment, quatre d'entre eux produisent des anticorps monoclonaux qui regroupent les propriétés recherchées.

Ces propriétés peuvent être résumées comme suit - Clone 2D11 reconnaissance de tous les isolats 1 à 16, qui
apparaissent dans la colonne gauche du Tableau 1,
identique à celle des anticorps polyclonaux dirigés
contre l'isolat 14 et purifiés sur colonne de
Sépharose couplé à des anti-immunoglobulines G de
lapin, clone très intéressant en terme de largeur de
spectre reconnu, affinité des anticorps plus faible que celle des
anticorps des hybridomes 9G6 ou 259, - Clone 38 se distingue du clone 2D11 par une réaction différente
au niveau de la bactérie 38 - Clone 9G6 . reconnaît fortement tous les isolats 1 à 16 (colonne
gauche du tableau 1), sauf 170, 870 et 16.

- Clone 259 . reconnaît tous les isolats de 1 à 16 (colonne gauche
du tableau 1), sauf 8, 9, 13, 170, 870, 1496 et B48.

Les isolats reconnus le sont très fortement.

reconnaît aussi les isolats de type E (C.m. non
pathogène).

Les isolats reconnus le sont très fortement.

L'affinité des anticorps monoclonaux a été estimée par une comparaison des réponses des différents anticorps vis-à-vis du même antigène (l'antigène étant le même au niveau nature, conformation et concentration), ces réponses étant quantifiées par passage sur lecteur ELISA ou densitomètre à réflexion.

Les isolats de C.m.p.m. indiqués dans le Tableau 1 qui représentent un échantillon des isolats testés peuvent être divisés en quatre groupes, appelés A, B,
C, D, un groupe étant composé d'isolats qui donnent la même réponse pour un anticorps monoclonal donné. Les isolats non C.m.p.m. peuvent être divisés, selon le même critère, en deux groupes, appelés E et F:
Isolats bactériens testés

<tb> 1 <SEP> à <SEP> 3342 <SEP> : <SEP> Groupe <SEP> A <SEP>
<tb> 8, <SEP> 9, <SEP> 13, <SEP> 1496, <SEP> B48 <SEP> : <SEP> Groupe <SEP> B <SEP> C.m.p.m.
<tb> 170, <SEP> 870 <SEP> : <SEP> Groupe <SEP> C
<tb> 16 <SEP> : <SEP> Groupe <SEP> D <SEP>
<tb> 5, <SEP> 20, <SEP> 33 <SEP> : <SEP> Groupe <SEP> E <SEP> non <SEP> C.m.p.m.
<tb>

38 <SEP> : <SEP> Groupe <SEP> F
<tb>
Les anticorps monoclonaux peuvent donc être définis en termes de spectre de reconnaissance (voir
Tableau 2 ci-après):
TABLEAU 2
Anticorps

Immunotype <SEP> SLBC2 <SEP> Po <SEP> 259 <SEP> 5C4 <SEP> ou <SEP> 9G6 <SEP> 2011
<tb> <SEP> B <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> C <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> <SEP> D <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> <SEP> E <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> F <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP>
De la même manière, chaque type d'isolat peut être défini par les épi topes présents sur sa surface et reconnus par les anticorps monoclonaux de l'invention. (voir Figure 3).

Typage des anticorps monoclonaux de l'invention:
2D11 : IgM
38 : IgM
259 : IgM
9G6 : IgG3
III - UTILISATION DES ANTICORPS DES HYBRIDOMES
SELECTIONNES POUR LA DETECTION DE LA BACTERIE
CLAVIBACTER MICHIGANENSE PATHOVAR MICHIGANENSE
DANS LES SEMENCES DE TOMATES
Les anticorps, conjugués ou non, peuvent être utilisés dans des méthodes classiques ELISA, CROSS
DOT, CROSS BLOT, ou IMMUNOFLUORESCENCE mettant en jeu des techniques de type D.A.P.C. (direct antigen plate coating), LAPC (indirect antigen plate coating),
D.D.A.S. (direct double antibody sandwich), I.D.A.S.

(indirect double antibody sandwich), méthodologies largement décrites dans la littérature. Leur fine spécificité permet de déterminer la présence ou non de bactéries Clavibacter michiganense pathovar michiganense dans des échantillons végétaux susceptibles d'être contaminés (par exemple, semences de tomates), sans mettre en jeu les réactions croisées observées jusque là avec les immunsérums classiques, mais ces méthodes classiques sont limites en terme de sensibilité.

Les anticorps de l'invention se prêtent d'une manière avantageuse à une nouvelle technique mettant en oeuvre une amplification sélective de bactéries à détecter (dans ce cas, le C.m.p.i.) sur un milieu semi-sélectif par rapport aux C.m.p.m. suivi de l'immunodétection des C.m.p.m., ce procédé de détection comportant plus particulièrement les étapes successives suivantes: a) mise en contact d'un échantillon d'un milieu biologique contenant les C.m.p.m.

- soit avec le milieu semi-sélectif,
- soit avec un premier support membranaire préalablement posé ou à poser directement sur la surface dudit milieu de culture, ce milieu de culture semi-sélectif étant solide ou solidifiable, b) amplification des C.m.p.m. jusqu'à l'obtention de colonies, lesdites colonies se trouvant alors sur la surface d'amplification, ladite surface d'amplification étant
- soit la surface du milieu de culture, lorsque la mise en contact de l'échantillon a été faite avec le milieu semi-sélectif,
- soit le premier support membranaire, lorsque la mise en contact de l'échantillon a été faite avec ce premier support membranaire, c) détection des colonies sur une surface de détection, ladite surface étant
- soit le premier support membranaire qui a servi de surface d'amplification,
- soit un support membranaire, dit "de transfert", qui est posé directement sur la surface d'amplification afin que les colonies se trouvant sur ladite surface soient au moins partielleient transféré par empreinte sur le support membranaire de transfert, cette détection étant effectuée avec au moins un des anticorps de profil I', I", II, III décrits ci-dessus.

Le support membranaire est avantageusement du nitrocellulose.

D'une manière générale, les milieux de base utilisés sont les tampons PBS ou TBS, pH 7,4, exception faite de la première étape d'immobilisation des anticorps dans le cas de sandwich, où le milieu est un tampon carbonate, pH 9,6.

Le matériel végétal est utilisé soit brut, soit plus ou moins purifié, les variantes étant dépendantes de la nature du matériel végétal à tester et de la méthodologie suivie. Dans le cas de lots de semences, une étape de macération est nécessaire à l'extraction des bactéries présentes à l'intérieur du tégument.

Elle est réalisée avec un tampon phosphate additionné d'inhibiteurs dans lequel seules les graines peuvent apporter une source carbonée.

Les anticorps monoclonaux conjugués ou non, relatifs à un hybridome, ou en cocktail polymonoclonal, sont utilisés à des dilutions de 1/1 à 1/1000 (surnageant de culture in vitro), ou à des dilutions de 1/1000 à 1/10000 (surnageant de culture en ascites). Dans le cas particulier des techniques sandwich, des anticorps polyclonaux anti-Clavibacter michiganense pathovar michiganense ont été faits chez le lapin et peuvent être utilisés dans l'une des étapes du sandwich.

Dans la majorité des tests, la saturation des sites spécifiques est réalisée avec les tampons TBS ou
PBS additionnés de régilait 5%.

La détection des échantillons infectés et la quantification des résultats sont fonction de la sonde utilisée dans le cas de conjugaison à la phosphatase
alcaline, les substrats utilisés en puits de
microtitration (ELISA) et sur nitrocellulose (CROSS
DOT, CROSS BLOT et la technique décrite ci-dessus)
sont respectivement le paranitrophénylphosphate et
la composition 5 bromo 4 chloro 3 indolylphosphate/
nitroblue tetrazolium. La quantification des
réponses est alors respectivement réalisée à 405 mm
à l'aide d'un lecteur (Titertek Multiskan MCC), ou à
600 mm à l'aide d'un densitomètre à réflexion
(Shimadzu CS930 et DR.2).

dans le cas de conjugaison à la peroxydase, les
substrats utilisés en puits de microtitration
(ELISA) et sur nitrocellulose (CROSS DOT, CROSS BLOT
et la technique décrite ci-dessus), sont
respectivement l'orthophényldiamine et le 4 chlore 1
napthtol. La quantification des réponses est alors
respectivement réalisée à 450 mm, à l'aide d'un
lecteur (Titertek Multiskan MCC > ou à 600 mm à
l'aide d'un densitomètre à réflexion (Shimadzu CS930
et DR.2).

dans le cas de conjugaison des anticorps au FITC, la
présence des complexes "antigènes-anticorps" est détectée par utilisation d'un microscope à fluorescence.

dans le cas d'utilisation d'anticorps non conjugués, les complexes "antigènes-anticorps" sont visualisés à l'aide de sondes commercialisées, soit conjuguées à des enzymes, soit marquées par des agents radioactifs ou fluorochromes. La quantification des résultats dépend alors de la sonde utilisée.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonaux spécifiques de la bactérie Clavibacter michiganense pathovar michiganense, caractérisés en ce qu'ils présentent un des profils de reconnaissance suivants

I') A+; B+; C+; D+;

II) A+; B-; C-; D+;

III) A+; B+; C-; D-; ces profils étant déterminés par rapport aux isolats bactériens suivants

A : Isolat "14" (C.N.C.M. I-904)

B : Isolat "1496" (NCPPB 1496)

C : Isolat "170" (NCPPB 170)

D : Isolat "16" (C.N.C.M. I-903) chacun de ces isolats représentant un des plusieurs types immunologiques existant parmi les différents isolats de Clavibacter michiganense pathovar michiganense, et pouvant être remplacé ou additionné par un ou plusieurs isolats présentant le même type immunologique.

2. Anticorps monoclonaux spécifiques de la bactérie Clavibacter michiganense pathovar michiganense, selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il présentent un des profils de reconnaissance suivants

I') A+; B+; C+; D+; E-; F-;

I") A+; B+; C+; D+; E-; F+;

II) A+; B-. C-; D+; E+; F-;

III) A+; B+; C-; D-; E-; F-; ces profils étant déterminés par rapport aux isolats bactériens A à D indiqués dans la revendication 1, et en plus les isolats

E : Isolat "20" (C.N.C.M. I-902)

F : Isolat "38" (C.N.C.M. I-901)

3. Anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisé par le profil I' A+; B+; C+; D*+; E-; F

4. Anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisé par le profil I") A+; B+; C+; D+; E-; F+

5.Anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisé par le profil II) A+; B-; C-; D+; E+; F

6. Anticorps monoclonal selon la revendication 3, caractérisé par le profil III) A+; B+; C-; D-; E-; F

7. Cocktail d'anticorps monoclonaux caractérisé en ce qu'il est composé d'un mélange des anticorps I à

III selon les revendications 1 ou 2, et plus particulièrement les anticorps monoclonaux selon les revendications 3 à 7.

8. Hybridomes producteurs d'anticorps selon l'une des revendications 1 à 6

9. Procédé de production d'anticorps monoclonaux selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par les étapes successives suivantes a) immunisation d'un animal avec au moins un isolat de

Clavibacter michiganense pathovar michiganense, b) fusion des cellules immunocompétentes de l'animal

avec des cellules de myélomes pour obtenir des

hybridomes, c) culture des hybridomes, d) criblage des anticorps monoclonaux produits par les

hybridomes par mise en contact des surnageants des

cultures des hybridomes avec chacun des types

imrunologiques A à F existant parmi les isolats

bactériens A à D et éventuellement E et F indiqués

dans les revendication 1 et 2, suivie de sélection

des anticorps monoclonaux présentant un des profils

de reconnaissance selon la revendication 1 ou 2.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'isolat utilisé pour l'immunisation est un isolat d'immunotype A à D ou un mélange de tels isolats, et plus particulièrement l'isolat A ou un cocktail d'isolats B et C.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'immunisation s' effectue par voie intrasplénique.

12. Procédé de détection spécifique et d'identification de la bactérie Clavibacter michiganense pathovar michiganense, caractérisé par la mise en contact d'un échantillon végétal susceptible de contenir ladite bactérie avec au moins un des anticorps monoclonaux selon la revendication 2, suivie de la révélation des anticorps monoclonaux ayant reconnu ladite bactérie.

13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'échantillon végétal est composé de semences de tomates, la détection de

Clavibacter michiganense pathovar michiganense étant alors un diagnostic du chancre de la tomate.

14. Kit ou nécessaire pour la détection de la bactérie Clavibacter michiganense pathovar michiganense, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un des anticorps monoclonaux selon la revendication 2, et des moyens de visualiser la réaction anticorps-antigène.

15. Isolat bactérien "14" (C.N.C.M. I-904)

16. Isolat bactérien "16" (C.N.C.M. I-903)

17. Isolat bactérien "20" (C.N.C.M. I-902)

18. Isolat bactérien "38" (C.N.C.M. I-901)

19. Kit ou nécessaire pour le criblage d'anticorps monoclonaux spécifiques de la bactérie

Clavibacter michiganense pa thovar michiganense, caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité d'isolats bactériens dans des récipients séparés, ces isolats étant

A : Isolat "14" (C.N.C.M. I-904)

B : Isolat "1496" (NCPPB 1496)

C : Isolat "170" (NCPPB 170)

D : Isolat "16" (C.N.C.M. I-903) et éventuellement au moins un des isolats suivants

E : Isolat "20' (C.N.C.M.I-902)

F : Isolat "38" (C.N.C.M. I-901) chacun de ces isolats représentant un des plusieurs types immunologiques existant parmi les différents isolats de Clavibacter michiganense pathovar michiganense, et pouvant être remplacé ou additionné par un ou plusieurs isolats présentant le même type immunologique.

20. Procédé d'identification de l'immunotype d'un isolat de Clavibacter michiganense pathovar michiganense, caractérisé en ce que l'isolat à identifier est mis en contact avec chacun des anticorps monoclonaux de profil I', I", II et III selon la revendication 2, l'immunotype de cet isolat étant ensuite identifié par le fait qu'il présente l'un des profils suivants

I' I. II III

A + + + +

B + + - +

C + + - -

D + + + - dans lequel "+" signifie une réaction entre l'isolat et l'anticorps monoclonal concerné et "-" signifie l'absence d'une telle réaction.