FR2511702A1 - Anticorps monoclonaux antipoliovirus pour l'identification du type et la differenciation intratypique de souches isolees de poliovirus, hybrides cellulaires pour leur fabrication et procede de diagnostic in vitro mettant en jeu des anticorps - Google Patents
Anticorps monoclonaux antipoliovirus pour l'identification du type et la differenciation intratypique de souches isolees de poliovirus, hybrides cellulaires pour leur fabrication et procede de diagnostic in vitro mettant en jeu des anticorps Download PDFInfo
- Publication number
- FR2511702A1 FR2511702A1 FR8116174A FR8116174A FR2511702A1 FR 2511702 A1 FR2511702 A1 FR 2511702A1 FR 8116174 A FR8116174 A FR 8116174A FR 8116174 A FR8116174 A FR 8116174A FR 2511702 A1 FR2511702 A1 FR 2511702A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- strain
- antibodies
- attenuated
- category
- strains
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 76
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 title claims abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 12
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000013316 zoning Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229940124867 Poliovirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000000538 anti-polioviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229950011321 azaserine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229940127241 oral polio vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000006995 paralytic poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1009—Picornaviridae, e.g. hepatitis A virus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L'INVENTION A POUR OBJET DES ANTICORPS MONOCLONAUX POUR LE DIAGNOSTIC ET L'IDENTIFICATION DE POLIOVIRUS AINSI QUE LEUR PROCEDE DE FABRICATION. LES ANTICORPS SELON L'INVENTION COMPORTENT TROIS GROUPES D'ANTICORPS A L'EGARD DES POLIOVIRUS APPARTENANT RESPECTIVEMENT AUX SOUS-TYPES SEROLOGIQUES 1, 2 OU 3, LES ANTICORPS MONOCLONAUX DE CHAQUE GROUPE SE REPARTISSANT EN UNE PREMIERE CATEGORIE D'ANTICORPS ACTIFS, MAIS NE PRESENTANT PAS DE DIFFERENCIATION INTRATYPIQUE, UNE DEUXIEME CATEGORIE D'ANTICORPS ACTIFS CONTRE LES SOUCHES ATTENUEES, MAIS ESSENTIELLEMENT DEPOURVUS D'ACTIVITE A L'EGARD DES SOUCHES SAUVAGES CORRESPONDANTES ET UNE TROISIEME CATEGORIE D'ANTICORPS ACTIFS CONTRE LA SOUCHE SAUVAGE APPARTENANT AU SOUS-TYPE SEROLOGIQUE CONSIDERE, MAIS ESSENTIELLEMENT DEPOURVUS D'ACTIVITE A L'EGARD DES SOUCHES ATTENUEES CORRESPONDANTES. CES ANTICORPS MONOCLONAUX PEUVENT ETRE UTILISES POUR EFFECTUER DES DIAGNOSTICS RELATIFS AU CARACTERE ATTENUE OU SAUVAGE D'UNE SOUCHE INCONNUE NOUVELLEMENT ISOLEE.
Description
ANTICORPS MONOCLONAUX ANTIPOLIOVIRUS POUR L'IDENTIFICA-
TION DU TYPE ET LA DIFFERENCIATION INTRATYPIQUE DE
SOUCHES ISOLEES DE POLIOVIRUS, HYBRIDES CELLULAIRES POUR
LEUR FABRICATION ET PROCEDE DE DIAGNOSTIC IN VIffiO
METTANT EN JEU DES ANTICORPS.
TION DU TYPE ET LA DIFFERENCIATION INTRATYPIQUE DE
SOUCHES ISOLEES DE POLIOVIRUS, HYBRIDES CELLULAIRES POUR
LEUR FABRICATION ET PROCEDE DE DIAGNOSTIC IN VIffiO
METTANT EN JEU DES ANTICORPS.
L'invention concerne des anticorps monoclonaux antipoliomyélitiques pour l'identification du type et la différenciation intratypique d'une souche isolée de poliovirus, notamment pour la détermination de l'origine sauvage ou vaccinale de cette souche de poliovirus, des hybrides cellulaires pour la fabrication de ces anticorps et un procédé pour réaliser les susdites identification et différenciation.
Les anticorps secrétés par les lignées d'hybridomes étant monoclonaux, ils sont en principe dirigés contre un seul déterminant antigénique, et constituent donc un matériel de choix pour l'étude de la variation antigénique.
On sait qu ril existe trois types sérologiques de poliovirus (types 1, 2 et 3) qui ont les mêmes carac tères biologiques et la même propriété de provoquer chez l'homme la poliomyélite paralytique. Les trois types sont séparables les uns des autres par réaction avec les anticorps respectifs dans des tests de- reconnaissance sérologique. En effet les anticorps relatifs à des antigènes appartenant à un type déterminé neutralise spécifiquement la propriété du poliovirus correspondant de se répliquer dans la cellule animale.
En sus des souches sauvages virulentes qui existent dans l'environnement, provenant d'individus excréteurs de virus, on trouve aussi dans la nature des souches atténuées non virulentes. Les souches atténuées non virulentes proviennent essentiellement de sujets qui ont reçu le vaccin antipoliomyélitique oral (appelé vaccin Sabin). Les sujets vaccinés deviennent porteurs de virus et excrètent dans les selles, pendant de longues périodes, le virus du vaccin.
La présence chez l'individu sain ou dans l'environnement (eaux potables eu résiduelles) du poliovirus pose le problème de l'origine de ce virus. Il faut savoir par un test simple, si ce virus provient du vaccin oral, ou s'il s'agit d'un virus sauvage. Ce problème a été abordé par l'O.M.S. (J. Biol. Standard 9-163 (1981)), pendant plusieurs études collaboratives, sans pouvoir dégager un procédé efficace, dans un rapport intitulé Markers of poliovirus strains from cases temporarily associated with the use of live poliovirus vaccine (Marqueurs de souches de poliovirus associés à l'utilisation du vaccin vivant de poliovirus).
L'invention a pour but de remédier à ces difficultés, de fournir des moyens et plus particulièrement des batteries d'anticorps permettant de réaliser les identifications de type et différenciations intratypiques de souches à l'intérieur d'un même type de poliovirus, une technique de fabrication de ces anticorps et une méthode pour les mettre en oeuvre dans ces essais d'identification et de différenciation intratypique.
L'invention met à profit la découverte qui a été faite qu'il était possible d1 isoler des anticorps spécifiquement dirigés contre un nombre réduit, voire un seul déterminant antigénique, à partir de cultures d'hybrides cellulaires, préalablement formés dans les conditions qui seront indiquées ci-après, ces spécificités pouvant être orientées selon les besoins, soit à ltégard à la fois des souches sauvages et des souches atténuées ou seulement à l'égard de l'une ou de l'autre dans un type donné.
L'invention tire profit de la capacité de certains hybrides cellulaires ou "hybridomes" de produire des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre un seul déterminant antigénique. L'invention propose encore une méthode permettant de les identifier et de les discriminer.
L'invention fait application des techniques décrites par KOHLER et MILSTEIN (1975 - "Continuous cultures of fused tells secreting antibody of predefined specificity" - Nature, 256, 495), qui ont montré que des cellules provenant de tumeurs myélomateu- ses de souris pouvaient être fusionnées avec des cellules immunocytes, plus particulièrement des cellules spléniques d'un animal immunisé au préalable, pour obtenir des cellules hybrides qui acquièrent la propriété 8rimmortalité des cellules de tumeurs myélomateuses et la capacité des cellules d'immunocytes, notamment des cellules spléniques, de secréter des quantités importantes d'anticorps homogènes.
Il est remarquable que l'on ait pu, par la sélection de lignées d'hybridomes monoclonaux, dans les conditions qui seront indiquées plus loin, isoler des hybridomes producteurs d'anticorps qui, -d'une part, sont suffisamment différenciés pour distinguer des souches sauvages et des souches atténuées et, d'autre part, des anticorps distincts, capables de reconnaître à la fois et les unes et les autres à l'intérieur du même type.
L'originalité deltinvention réside entre autres dans le fait d'avoir posé dans ces termes le problème de la recherche des anticorps distincts, qui permettrait d'opérer les discriminations voulues, et d'en avoir tiré les conséquences pour la mise au point d'une méthode d'identification et de différenciation applicable à des souches nouvellement isolées sur le terrain, dans des conditions n impliquant pas des essais techniquement délicats ou compliqués.
Dans l'un de ses premiers aspects, l'inven- tion concerne donc une batterie d'anticorps monoclonaux pour le diagnostic et l'identification de poliovirus, ca ractérisée par trois groupes d'anticorps à l'égard de poliovirus, appartenant respectivement aux sous-types sérologiques (1), (2) ou (3), les anticorps monoclonaux de chaque groupe se répartissant en - une première catégorie d'anticorps actifs, mais ne pré
sentant pas de différenciation intratypique, - une deuxième catégorie d'anticorps actifs contre les
souches atténuées, mais essentiellement dépourvus d'ac
tivité à ltégard des souches sauvages correspondantes, - une troisième catégorie d'anticorps actifs contre la
souche sauvage appartenant au sous-type sérologique
considéré, mais essentiellement dépourvus d'activité
à l'égard des souches atténuées correspondantes.
sentant pas de différenciation intratypique, - une deuxième catégorie d'anticorps actifs contre les
souches atténuées, mais essentiellement dépourvus d'ac
tivité à ltégard des souches sauvages correspondantes, - une troisième catégorie d'anticorps actifs contre la
souche sauvage appartenant au sous-type sérologique
considéré, mais essentiellement dépourvus d'activité
à l'égard des souches atténuées correspondantes.
De préférence, les anticorps appartenant aux première et deuxième catégories dans chacun des groupes susdits sont respectivement actifs contre - la souche LSc 2ab, - la souche P 712 CH 2ab, - la souche Leon 12alb.
Ces dernières souches, appelées aussi souches Sabin, sont en effet celles qui sont le plus couramment utilisées dans le monde entier pour la constitution des vaccins vivement atténués. Elles sont disponibles dans la plupart des laboratoires et peuvent être obtenues auprès de l'Organisation Mondiale de la Santé. Elles sont essentiellement a l'origine de la plupart des souches atténuées que l'on trouve maintenant dans l'environnement, aux cotés des souches sauvages, en particulier des souches Mahoney, MEF 1 et Saukett, dont elles ont en fait été dérivées. Comme déjà indiqué plus haut, on sait que les techniques usuelles ne permettent pas, à l'intérieur d'un même type, de distinguer les souches sauvages et les souches atténuées.
Dans une batterie préférée d'anticorps selon l'invention, les anticprps appartenant aux première et troisième catégories, dans chacun. des groupes susdits, sont respectivement actifs contre ces souches, c'est à-dire - la souche Mahoney, - la souche MEF 1 et - la souche Saukett.
On sait en effet que les souches atténuées
LSc 2ab, P 712 CH 2ab et Leon 12a1b sont dérivées des souches sauvages.
LSc 2ab, P 712 CH 2ab et Leon 12a1b sont dérivées des souches sauvages.
L'invention concerne aussi la batterie d'hybrides cellulaires pour la production des groupes d'anticorps monoclonaux qui ont été définis plus haut et qui sont caractérisés en ce qu'ils résultent de la fusion des cellules d'une lignée myélomateuse et de cellules immunocytes, notamment de rates d'animaux, respectivement vaccinés au préalable contre des poliovirus atténués, d'une part, sauvages, d'autre part, provenant de cultures des trois types correspondants.
Les techniques de culture mises en oeuvre, dont un exemple sera d'ailleurs indiqué plus loin, sont en elles-mêmes connues. On peut à cet égard se reporter à l'article de SABLER etMILSTEIN déjà mentionné plus haut. En ce qui concerne des types de cellules de myélomes, des techniques préférées d'immunisation de l'animal contre les antigènes auxquels correspondent les anticorps destinés à être produits par les cellules d'immunocytes, notamment les cellules spléniques qui seront fusionnées avec les cellules des lignées myélomateuses préférées, les animaux d'épreuve préférés et les conditions de culture aboutissant à la formation des hybrides cellulaires du genre en question, on peut encore se reporter par exemple aux demandes de brevet européen nO 004516 0018794 et 0018795 ou à la demande de brevet français nO 78 17545, publiée sous le nO 2.394.607.
La batterie préférée d'hybrides selon l'invention est caractérisée par trois groupes de lignées aptes à respectivement secréter des anticorps actifs à l'égard de virus appartenant aux types (1)-, (2) et (3), et caractérisés en ce que (1) le premier groupe comprend trois catégories d'hybrides
respeeivement capables de produire des anticorps
- actifs à la fois contre les souches LSc 2ab et
Mahoney
- actifs contre la souche LSc 2ab, mais inactifs
contre la souche Mahoney,
- actifs contre la souche Mahoney, mais inactifs contre 1 n .sol hO 2b (2) le deuxième groupe comprend trois catégories d'hy
brides respectivement capables de produire des anti
corps
- actifs à la fois contre les souches P 712 CH 2ab et
MEF 1,
- actifs-contre la souche P 712 CH 2ab, mais inactifs
contre la souche MEF 1,
- actifs contre la souche MEF 1, mais inactifs contre
la souche P 712 CH 2ab (3) le troisième groupe comprend trois catégories d'hy
brides respectivement capables de produire des anti
corps
- actifs à la fois contre les souches Leon 12alb et
Saukett,
- actifs contre la souche Leon 12alb, mais inactifs
contre la souche Saukett,
- actifs contre la souche Saukett, mais inactifs
contre la souche Leon 12a1b.
respeeivement capables de produire des anticorps
- actifs à la fois contre les souches LSc 2ab et
Mahoney
- actifs contre la souche LSc 2ab, mais inactifs
contre la souche Mahoney,
- actifs contre la souche Mahoney, mais inactifs contre 1 n .sol hO 2b (2) le deuxième groupe comprend trois catégories d'hy
brides respectivement capables de produire des anti
corps
- actifs à la fois contre les souches P 712 CH 2ab et
MEF 1,
- actifs-contre la souche P 712 CH 2ab, mais inactifs
contre la souche MEF 1,
- actifs contre la souche MEF 1, mais inactifs contre
la souche P 712 CH 2ab (3) le troisième groupe comprend trois catégories d'hy
brides respectivement capables de produire des anti
corps
- actifs à la fois contre les souches Leon 12alb et
Saukett,
- actifs contre la souche Leon 12alb, mais inactifs
contre la souche Saukett,
- actifs contre la souche Saukett, mais inactifs
contre la souche Leon 12a1b.
Un procédé d'obtention préférée d'une batterie d'hybrides cellulaires susceptibles de former la batterie d'anticorps susdite est caractérisé par les étapes qui consistent - à immuniser des animaux respectivement contre des
virus appartenant aux trois types principaux (1), (2)
et (3) et, à l'intérieur de chacun de ces types, à,
d'une part, une souche sauvage et, d'autre part, à
une souche atténu-ée ; - à prélever sur les animaux les cellules immunocytes,
de préférence les cellules de la rate et à les mettre
en culture ;; - à fusionner les cellules de ces cultures avec des cel
lules d'une lignée myélomateuse ou analogue, propres
à former des lignées d'hybrides cellulaires avec les
précédentes, séparables des cellules myélomateuses
non fusionnées, et à récupérer des clones cellulaires
individualisés résultant de la fusion ;; - à incuber ces clones cellulaires et à tester la capa
cité de leurs surnageants respectifs à inhiber l'effet
cytopathogène de cultures de virus homologues dans des
essais de séroneutralisation, - à recueillir et à répartir en groupes les cultures
d'hybrides cellulaires recueillies par types, selon les
activités des anticorps qu'ils sont susceptibles de
produire à l'égard des trois types de virus homologues
considérés et, à l'intérieur de chaque groupe, par
catégorie d'hybrides cellulaires, en fonction de l'acti
vité des anticorps qu'ils sont susceptibles de produire
à l'égard des souches respectivement atténuées et sau
vages homologues correspondantes, - à sélectionner et récupérer dans chaque groupe et dans
chacune des deux catégories correspondantes, dans des
essais répétés de séroneutralisation de cultures cellu
laires sensibles, en présence, d'une part, de virus sau
vages et, d'autre part, de virus atténués appartenant
tous deux au même type, ceux des clones qui inhibent
(1) à la fois le virus sauvage et le virus inactivé,
(2) le virus sauvage, à l'exclusion des virus atténués,
(3) le virus atténué, à ltexclusion des virus sauvages.
virus appartenant aux trois types principaux (1), (2)
et (3) et, à l'intérieur de chacun de ces types, à,
d'une part, une souche sauvage et, d'autre part, à
une souche atténu-ée ; - à prélever sur les animaux les cellules immunocytes,
de préférence les cellules de la rate et à les mettre
en culture ;; - à fusionner les cellules de ces cultures avec des cel
lules d'une lignée myélomateuse ou analogue, propres
à former des lignées d'hybrides cellulaires avec les
précédentes, séparables des cellules myélomateuses
non fusionnées, et à récupérer des clones cellulaires
individualisés résultant de la fusion ;; - à incuber ces clones cellulaires et à tester la capa
cité de leurs surnageants respectifs à inhiber l'effet
cytopathogène de cultures de virus homologues dans des
essais de séroneutralisation, - à recueillir et à répartir en groupes les cultures
d'hybrides cellulaires recueillies par types, selon les
activités des anticorps qu'ils sont susceptibles de
produire à l'égard des trois types de virus homologues
considérés et, à l'intérieur de chaque groupe, par
catégorie d'hybrides cellulaires, en fonction de l'acti
vité des anticorps qu'ils sont susceptibles de produire
à l'égard des souches respectivement atténuées et sau
vages homologues correspondantes, - à sélectionner et récupérer dans chaque groupe et dans
chacune des deux catégories correspondantes, dans des
essais répétés de séroneutralisation de cultures cellu
laires sensibles, en présence, d'une part, de virus sau
vages et, d'autre part, de virus atténués appartenant
tous deux au même type, ceux des clones qui inhibent
(1) à la fois le virus sauvage et le virus inactivé,
(2) le virus sauvage, à l'exclusion des virus atténués,
(3) le virus atténué, à ltexclusion des virus sauvages.
De préférence, les tests de séroneutralisation mis en oeuvre dans le susdit procédé sont realisés sur des cultures de cellules semblables, telles que;cellules d'origine cancéreuses humaines couramment utilisées pour l'étude des poliovirus,par exemple les cellules HEp-2 ou Helo en presence de doses de 102 à 10 DCP 50 de virus homologues et hétérologues , dans les épreuves de sélection finale, on recueille dans chacun des groupes considérés les clones qui produisent respectivement - les anticorps monoclonaux d'une première catégorie qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à
2, de préférence supérieur à 3, tant vis-à-vis de la
souche atténuée que de la souche sauvage correspondante, - les anticorps monoclonaux d'une deuxième catégorie qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à 2,
de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche
atténuée, et un index de neutralisation pratiquement nul
vis-à-vis de la souche sauvage, - les anticorps monoclonaux d'une troisième catégorie, qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche sauvage, et un index de neutralisation pratiquement nul vis-à-vis de la souche atténuée.
présentent un index de neutralisation au moins égal à
2, de préférence supérieur à 3, tant vis-à-vis de la
souche atténuée que de la souche sauvage correspondante, - les anticorps monoclonaux d'une deuxième catégorie qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à 2,
de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche
atténuée, et un index de neutralisation pratiquement nul
vis-à-vis de la souche sauvage, - les anticorps monoclonaux d'une troisième catégorie, qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche sauvage, et un index de neutralisation pratiquement nul vis-à-vis de la souche atténuée.
On rappellera, pour mémoire, que les unités
DCP 50 dont question dans ce qui précède représentent les doses cytopathogènes 50 de virus qui correspondent à la dilution de virus entraînant la mort de 50 % des hôtes sensibles à leur contact.
DCP 50 dont question dans ce qui précède représentent les doses cytopathogènes 50 de virus qui correspondent à la dilution de virus entraînant la mort de 50 % des hôtes sensibles à leur contact.
On rappellera aussi que l'expression "index de neutralisation" correspond à la différence entre les logarithmes des titres correspondant aux doses de virus nécessaires à la destruction de 50 % des cultures cellulaires sensibles au contact desquelles ils se trouvent placés, dans les conditions qui ont été rappelées cidessus, lorsque les mesures sont effectuéesjd'une part, en présence et, d'autre part, en l'absence de la catégorie d'anticorps monoclonaux dont le niveau d'activité est recherché.En l'occurrence, on dira qu'unie catégorie d'anticorps monoclonaux présente un index de neutralisation égal à 2, lorsque, en sa présence,le titre des virus nécessaires à l'obtention d'une destruction de 50 % des hôtes cellulaires à leur contact est égal à îoe fois la valéur du titre conduisant au meme résultat, en l'absence de ces anticorps.
L'invention conerne également l'application des batteries d'anticorps monoclonaux selon l'invention à un diagnostic relatif au caractère atténué ou sauvage d'une souche inconnue nouvellement isolée, caractérisée par les étapes qui consistent - dans une premièrPétape, en des essais de séroneutrali
sation de cultures de cellules sensibles en présence
respectivement des trois anticorps monoclonaux de
"première catégorie" des trois groupes susdits, le
virus isolé étant présumé comme appartenant aux premier,
second ou troisième type, selon que le virus isolé est
inhibé par l'anticorps appartenant aux susdits premier,
deuxième et troisième groupes susdits, et - dans une seconde étape, en des essais de séroneutrali
sation répétés dans des conditions semblables vis-à
vis d'anticorps respectivement de "deuxième catégorie"
et"troisième catégorie" du groupe correspondant au
type déterminé dans les premiers essais de séroneutra lisation, le virus isolé étant présumé comme appartenant à une souche atténuée ou sauvage, selon qu'il est inhibé par les anticorps de deuxième catégorie" ou par les anticorps de "troisième catégorie".
sation de cultures de cellules sensibles en présence
respectivement des trois anticorps monoclonaux de
"première catégorie" des trois groupes susdits, le
virus isolé étant présumé comme appartenant aux premier,
second ou troisième type, selon que le virus isolé est
inhibé par l'anticorps appartenant aux susdits premier,
deuxième et troisième groupes susdits, et - dans une seconde étape, en des essais de séroneutrali
sation répétés dans des conditions semblables vis-à
vis d'anticorps respectivement de "deuxième catégorie"
et"troisième catégorie" du groupe correspondant au
type déterminé dans les premiers essais de séroneutra lisation, le virus isolé étant présumé comme appartenant à une souche atténuée ou sauvage, selon qu'il est inhibé par les anticorps de deuxième catégorie" ou par les anticorps de "troisième catégorie".
De préférence, on réalise à des fins de contrôle les mimes essais de séroneutralisation avec les mêmes anticorps à l'égard des virus homologues, tant en ce qui concerne le type qu'en ce qui concerne les catégories de virus homologues à l'intérieur de ce même type, la présomption de rattachement du virus isolé à un type et à une catégorie particulière de souches à l'intérieur de ce type étant alors d'autant plus forte que les index de neutralisation mesurés sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus avec la souche homologue, de même type et de même catégorie.
D'autres caractéristiques de l'invention apparateront encore au cours de la description qui suit d'exemples de fabrication de lignées cellulaires productrices des différents anticorps monoclonaux entrant dans les groupes et catégories sus-définis, ainsi que des conditions de leur utilisation, notamment dans des épreuves dé diagnostic du type et de la catégorie auxquels peut se rattacher un poliovirus nouvellement isolé chez un individu ou dans le milieu ambiant.
I - Préparation des hybridomes.
Les anticorps monoclonaux qui ont été préparés sont diriges contre les souches suivantes
Type 1 : a) souche Manoney - prototype de laboratoire
pour le virus sauvage et virulent
b) souche LSc 2ab - prototype de virus atténué
utilisé dans la préparation du vaccin oral ;
Type 2 : c) souche MEF 1 - prototype de laboratoire pour
le virus sauvage et virulent ;
d) souche P 712 CH 2ab - prototype de virus
atténué utilisé dans la préparation du vaccin
oral ;
Type 3 : e) souche Saukett - prototype de laboratoire de
virus saurage virulent ;
f) souche Leon 12alb - prototype de laboratoire
de virus atténué, utilisé dans la prépara
tion du vaccin oral.
Type 1 : a) souche Manoney - prototype de laboratoire
pour le virus sauvage et virulent
b) souche LSc 2ab - prototype de virus atténué
utilisé dans la préparation du vaccin oral ;
Type 2 : c) souche MEF 1 - prototype de laboratoire pour
le virus sauvage et virulent ;
d) souche P 712 CH 2ab - prototype de virus
atténué utilisé dans la préparation du vaccin
oral ;
Type 3 : e) souche Saukett - prototype de laboratoire de
virus saurage virulent ;
f) souche Leon 12alb - prototype de laboratoire
de virus atténué, utilisé dans la prépara
tion du vaccin oral.
Plus particulièrement, on a préparé des anticorps monoclonaux qui ont en principe deux propriétés fondamentales a) ils sont capables de reconnaître le type de polio
virus (1, 2 ou 3) b) ils sont capables, à l'intérieur de chaque type, de
reconnaître le sous-type. Cette spécificité de sous
type permet la différenciation des souches sauvages
de celles provenant du vaccin oral.
virus (1, 2 ou 3) b) ils sont capables, à l'intérieur de chaque type, de
reconnaître le sous-type. Cette spécificité de sous
type permet la différenciation des souches sauvages
de celles provenant du vaccin oral.
Les séquences successives de la préparation ont été les suivantes A A - Immunisation des souris.
1. Antigène.
L'antigène pour l'immunisation des animaux est constitué d'une suspension de poliovirus active en partant des souches
type 1 : Mahoney et LSc 2ab,
type 2 : MEF 1 et P 712 CH2ab,
type 3 : Saukett et Leon 12alb.
type 1 : Mahoney et LSc 2ab,
type 2 : MEF 1 et P 712 CH2ab,
type 3 : Saukett et Leon 12alb.
Les virus sont d'abord inoculés sur des cultures de cellules humaines, HEp-2 qui proviennent d'un cancer humain. Lorsque les cellules sont complètement détruites par le virus, on récolte le liquide surnageant qui contient le virus. Cette suspension virale est ensuite ultracentrifugée pendant 3 heures à 100.000 x g pour concentrer le virus.
La suspension finale doit contenir une quantité de virus d'environ 109 unités infectieuses par millilitre.
2. Schéma d'immunisation.
Des groupes de 3-4 souris Balb/c reçoivent par voie intrapéritonéale une première injection de virus (0,2 ml). Après quatre semaines, une deuxième injection avec la même quantité de virus est effectuée, cette fois par voie intraveineuse.
Trois à quatre jours après la dernière injection, les souris sont sacrifiées et la rate est prélevée et mise en culture.
B - Mise en culture, fusion et sélection (myélome +
cellules de rate).
cellules de rate).
Les cellules spléniques sont fusionnées avec les cellules HGPRT déficientes de la lignée myélomateuse Sp2/0-Agl4 (SHULMAN M., TILDE C.D. and KOHLER d. (1978)
IT A better cell line for making hybridomas secreting spe- cific antibodies" - Nature, 276, 269-270). Les mélanges des celludes-parentales sont incubés en présence de polyéthylène-glycol (PEG) 1000 à 30 %. Après élimination du
PEG, les cellules sont distribuées dans des plaques à cupules multiples. Après 48 heures d'incubation, le milieu sélectif contenant de l'azasérine (10 pM) et de l'hypoxanthine (50 vM) est ajouté.Ce milieu ne permet la croissance que des seules cellules hybrides dont les colonies deviennent visibles vers le huitième jour. A partir du quatorzièeme jour, les surnageants des cupules contenant les colonies hybrides suffisamment développees sont testés pour la présence des anticorps antipolio (voir ≈C). Les hybridomes positifs sont sous-clonés par la technique des dilutions limites pour, d'une part, s'assurer du caractère monoclonal des anticorps secrétés etss d'autre part, dans certains cas obtenir la stabilité de la secrétion.
IT A better cell line for making hybridomas secreting spe- cific antibodies" - Nature, 276, 269-270). Les mélanges des celludes-parentales sont incubés en présence de polyéthylène-glycol (PEG) 1000 à 30 %. Après élimination du
PEG, les cellules sont distribuées dans des plaques à cupules multiples. Après 48 heures d'incubation, le milieu sélectif contenant de l'azasérine (10 pM) et de l'hypoxanthine (50 vM) est ajouté.Ce milieu ne permet la croissance que des seules cellules hybrides dont les colonies deviennent visibles vers le huitième jour. A partir du quatorzièeme jour, les surnageants des cupules contenant les colonies hybrides suffisamment développees sont testés pour la présence des anticorps antipolio (voir ≈C). Les hybridomes positifs sont sous-clonés par la technique des dilutions limites pour, d'une part, s'assurer du caractère monoclonal des anticorps secrétés etss d'autre part, dans certains cas obtenir la stabilité de la secrétion.
C - Sélection des hybridomes secrétant des anticorps
antipolio.
antipolio.
Tous les clones cellulaires obtenus après la fusion et la sélection ne secrètent pas les anticorps souhaités. Il est donc nécesaaire de sélectionner 1 ) les clones cellulaires fabriquant des anticorps et 20) les clones secrétant une certaine catégorie d'anti
corps.
corps.
Dans ce but, on utilise la réaction de neutralisetion et la réaction immunoenzymatique appelée ELISA (AVRAMEAS S. and TERNYNCK T. (1971) - "Peroxidase labelled antibody and Fab conjugates with enhanced intracellular penetratioflft - Immunochem., 8, 1175 et
VOLLER A., BIDWELL D. & BARTLETT A. (1976) - "Microplate enzyme immunodiagnosis of virus infeetion" - Manual of
Clinicla Immunology (Eds Rose N.R. & Friedman H.).
VOLLER A., BIDWELL D. & BARTLETT A. (1976) - "Microplate enzyme immunodiagnosis of virus infeetion" - Manual of
Clinicla Immunology (Eds Rose N.R. & Friedman H.).
Amer. Soc. Microbiol., p. 506) II - Détection des anticorps monoclonaux.
A - Séroneutralisation
Le surnageant de culture d'hybridomesà tester est mis en contact deux heures à 370C avec 100 DCP 50 de virus homologue (le même que celui utilisé pour l'immunisation des souris). L'effet cytopathogène restant est déterminé sur une culture de cellules HEp-2. Les surnageants qui inhibent 11 effet cytopathogène sont considérés comme positifs et les clones de cellules qui l'ont produit sont sélectionnés et utilisés comme source d'anticorps monoclonaux (AM).
Le surnageant de culture d'hybridomesà tester est mis en contact deux heures à 370C avec 100 DCP 50 de virus homologue (le même que celui utilisé pour l'immunisation des souris). L'effet cytopathogène restant est déterminé sur une culture de cellules HEp-2. Les surnageants qui inhibent 11 effet cytopathogène sont considérés comme positifs et les clones de cellules qui l'ont produit sont sélectionnés et utilisés comme source d'anticorps monoclonaux (AM).
On effectue ensuite la sélection des AM spécifiques dans les conditions qui ont été indiquées plus haut par le titrage, pour chaque type, du pouvoir neutralisant des AM correspondants contre la souche homologue (par exemple la souche sauvage) et hétérologue (par exemple la souche atténuée) du même type sérologique, pour déterminer leurs index de neutralisation dans les conditions qui ont été mentionnées plus haut et qui seront rappelées plus loin, lorsque le même type de mesure sera fait à l'égard de l'identification de souches sauvages dans des essais de diagnostic in vitre.
B - Test immunoenzymatique.
L'antigène de référence (le virus utilisé comme antigène immunisant) est fixé sur un support solide (par exemple des plaques à 96 cupules en polystyrène, membranes de nitrate de cellulose). Les surnageants des cultures d'hybridomes sont mis en contact avec les surfaces recouvertes d'antigène. Si des AM homologues à l'antigène existent, ils vont être retenus par l'antigène. Leur présence peut être ensuite détectée avec des anticorps anti-souris de chèvre marqués à la péroxydase.
La présence de la péroxydase détermine le changement de couleur d'un réactif qui contient le substrat spécifique de l'enzyme (H202). Donc, tout changement de couleur va indiquer la présence dans le surnageant respectif des AM reconnaissant 11 antigène utilisé dans le test.
III - Utilisation des anticorps monoclonaux antipolio
virus.
virus.
Exemple 1. Identification du type de poliovirus par
les anticorps monoclonaux.
les anticorps monoclonaux.
Le type sérologique d'un virus polio isolé en terrain peut être déterminé à l'aide des anticorps monoclonaux neutralisants spécifiques de type. On utilise une batterie de trois AM, correspondant aux trois types du virus polio, dans un test de séroneutralisation. Une dose d'environ 102 - 103 DCP 50 de virus à tester est mise en contact avec chacun des trois types d1AN. Ensuite, l'effet cytopathogène (ECP) restant dans chaque mélange virus-anticorps est déterminé sur une culture de cellules
HEp-2. Le type de virus est établi par rapport au type d'AM qui ont neutralisé le virus (Tableau I). De préférence, on a recours à des essais comparatifs confirmatifs.
HEp-2. Le type de virus est établi par rapport au type d'AM qui ont neutralisé le virus (Tableau I). De préférence, on a recours à des essais comparatifs confirmatifs.
Tableau I
<tb> <SEP> Virus <SEP> ECP <SEP> après <SEP> contact <SEP> avec <SEP> <SEP> t <SEP> Type <SEP>
<tb> <SEP> polio <SEP> culture <SEP> de <SEP> antipolio <SEP> AN1 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> virus
<tb> <SEP> antipolio <SEP> typ <SEP> e3 <SEP> du
<tb> réf. <SEP> type <SEP> 1 <SEP> + <SEP> -- <SEP> - <SEP> <SEP> + <SEP> + <SEP> 1
<tb> réf. <SEP> type <SEP> 2 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> 2
<tb> réf.<SEP> type <SEP> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> 3
<tb> souche <SEP> 2/73 <SEP> F <SEP> <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> 2
<tb> souche <SEP> 35/74 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> 3
<tb> souche <SEP> 6/80 <SEP> + <SEP> LÀ <SEP> + <SEP> + <SEP> 1
<tb>
Les types des trois souches testées (les trois dernières dans le tableau) sont indiqués dans la colonne de droite.
<tb> <SEP> polio <SEP> culture <SEP> de <SEP> antipolio <SEP> AN1 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> virus
<tb> <SEP> antipolio <SEP> typ <SEP> e3 <SEP> du
<tb> réf. <SEP> type <SEP> 1 <SEP> + <SEP> -- <SEP> - <SEP> <SEP> + <SEP> + <SEP> 1
<tb> réf. <SEP> type <SEP> 2 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> 2
<tb> réf.<SEP> type <SEP> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> 3
<tb> souche <SEP> 2/73 <SEP> F <SEP> <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> 2
<tb> souche <SEP> 35/74 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> 3
<tb> souche <SEP> 6/80 <SEP> + <SEP> LÀ <SEP> + <SEP> + <SEP> 1
<tb>
Les types des trois souches testées (les trois dernières dans le tableau) sont indiqués dans la colonne de droite.
Exemple 2. Détermination du sous-type de virus polio
(différenciation du virus sauvage du virus
atténué).
(différenciation du virus sauvage du virus
atténué).
Les AM permettent, par leur capacité discriminatoire, l'identification de l'origine génétique des souches de poliovirus isolées en terrain. La caractérisation antigénique des poliovirus dont le type a déjà été établi se fait avec des AM spécifiques de souche (sauvage ou atténuée) avec un test d'index de neutralisation. La souche à contrôler est titrée en absence et en présence d'AM spécifiques des souches sauvage et atténuée du même type sérologique. L'appartenance antigénique est établie par rapport à la différence du log titre du virus en absence et en présence de chaque catégorie d'AM (index de neutralisation).On considère une souche comme ayant une origine sauvage ou atténuée quand l'index de neutralisation face aux AM respectifs est du même ordre que celui de la souche de référence homologue (tableau II).
Dans le tableau II, on présente un exemple de test d'identification intratypique des trois souches de poliovirus, pour établir leur origine sauvage (virus virulent
S) ou atténuée (virus provenant du vaccin : A).
S) ou atténuée (virus provenant du vaccin : A).
Tableau II
<tb> <SEP> Index <SEP> de <SEP> neutraisation <SEP> a)
<tb> [Index <SEP> de <SEP> neutralisation <SEP> a) <SEP> Caractérisation
<tb> I <SEP> Virus <SEP> polio <SEP> type <SEP> 1
<tb> <SEP> antigénique <SEP> b)
<tb> <SEP> Mahoney <SEP> LSc <SEP> 2ab
<tb> Références
<tb> <SEP> - <SEP> Mahoney <SEP> (sauvage) <SEP> 3,5 <SEP> O <SEP> S
<tb> <SEP> - <SEP> LSc <SEP> 2ab <SEP> (atténuée) <SEP> 0,5 <SEP> 4,0 <SEP> A
<tb> à <SEP> tester
<tb> - <SEP> souche <SEP> 8/79 <SEP> 3,5 <SEP> 0 <SEP> S
<tb> - <SEP> souche <SEP> 9/79 <SEP> 3,0 <SEP> o <SEP> S
<tb> - <SEP> souche <SEP> 21/80 <SEP> 0 <SEP> 4,5 <SEP> A
<tb> a) Index de neutralisation = différence entre le log titre du
virus en absence et en présence des AM respectifs ; b) S = sauvage (virulent, type Mahoney),
A = atténué (du vaccin, type LSc 2ab).
<tb> [Index <SEP> de <SEP> neutralisation <SEP> a) <SEP> Caractérisation
<tb> I <SEP> Virus <SEP> polio <SEP> type <SEP> 1
<tb> <SEP> antigénique <SEP> b)
<tb> <SEP> Mahoney <SEP> LSc <SEP> 2ab
<tb> Références
<tb> <SEP> - <SEP> Mahoney <SEP> (sauvage) <SEP> 3,5 <SEP> O <SEP> S
<tb> <SEP> - <SEP> LSc <SEP> 2ab <SEP> (atténuée) <SEP> 0,5 <SEP> 4,0 <SEP> A
<tb> à <SEP> tester
<tb> - <SEP> souche <SEP> 8/79 <SEP> 3,5 <SEP> 0 <SEP> S
<tb> - <SEP> souche <SEP> 9/79 <SEP> 3,0 <SEP> o <SEP> S
<tb> - <SEP> souche <SEP> 21/80 <SEP> 0 <SEP> 4,5 <SEP> A
<tb> a) Index de neutralisation = différence entre le log titre du
virus en absence et en présence des AM respectifs ; b) S = sauvage (virulent, type Mahoney),
A = atténué (du vaccin, type LSc 2ab).
Les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés tels quels, dans les surnageants de culture, après séparation des hybrides cellulaires.
Ces surnageants peuvent être conservés par congélation. Ils peuvent aussi être lyophilisés.
On pèut également obtenir les anticorps à l'état purifié, notamment par précipitation à l'aide d'un agent, tel que le sulfate d'ammonium, susceptible de modifier la force ionique du milieu. Be caractère monoclonal des anticorps permet d'atteindre des concentrations élevées.
Ces anticorps peuvent être l'objet de nombreuses applications.
Par exemple, il est évident qu'un autre avantage considérable des anticorps monoclonaux est le fait qu'ils remplacent les animaux qui servent à produire les sérums hyperimmuns (lapin, cheval, veau, etc...).
A la place des animaux qui coûtent très chers et demandent un endroit spécial pour la mise en stabulation et qui produisent des sérums de spécificité mediocre (mélanges d'anticorps inconnus et variables d'un animal à l'autre), l'invention permet de préparer des anticorps dans une culture de cellules au niveau du laboratoire.
Ils peuvent aussi être utilisés pour laprépara- tion des colonnes de chromatographie d'affinité, par exemple pour la production du vaccin ; ou encore comme sonde immunologique pour la détection des polypeptides viraux dans la cellule bactérienne ou animale.
Ce dernier cas concerne surtout la situation quand une copie du génome ARN du poliovirus où un segment du génome est inséré dans la cellule bactérienne ou animale par les méthodes de recombinaison de l'ADN.
Les souches d'hybridomes appartenant à une batterie de souches préférées ont été déposées le 24 aout
1981 à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.) de INSTITUT PASTEUR sous les numéros (1) I-i?? 1-169 et I-171 , pour les souches
produisant des anticorps monoclonaux respectivement
actifs
- contre à la fois LSc 2ab et Mahoney,
- contre LSc 2ab seulement,
- contre Mahoney seulement (2) I-170 , I-173 et I-172 , pour les souches
produisant des anticorps monoclonaux respectivement
actifs
- contre à la fois P 712 CH 2ab et WF 1,
- contre P 712 CH 2ab seulement
- contre MEF 1 seulement (3) 1-174 , I-175 et I-176 , pour les souches
produisant des anticorps monoclonaux respectivement
actifs
- contre à la fois Leon 12a1b et Saukett,
- contre Leon 12alb seulement,
- contre Saukett seulement.
1981 à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.) de INSTITUT PASTEUR sous les numéros (1) I-i?? 1-169 et I-171 , pour les souches
produisant des anticorps monoclonaux respectivement
actifs
- contre à la fois LSc 2ab et Mahoney,
- contre LSc 2ab seulement,
- contre Mahoney seulement (2) I-170 , I-173 et I-172 , pour les souches
produisant des anticorps monoclonaux respectivement
actifs
- contre à la fois P 712 CH 2ab et WF 1,
- contre P 712 CH 2ab seulement
- contre MEF 1 seulement (3) 1-174 , I-175 et I-176 , pour les souches
produisant des anticorps monoclonaux respectivement
actifs
- contre à la fois Leon 12a1b et Saukett,
- contre Leon 12alb seulement,
- contre Saukett seulement.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagé ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes.
Claims (10)
1 - Batterie d'anticorps monoclonaux pour le diagnostic et l'identification de poliovirus, caractérisée par trois groupes d'anticorps à l'égard de poliovirus, appartenant respectivement aux sous-types sérologiques (1), (2) ou (3), les anticorps monoclonaux de chaque groupe se répartissant en - une première catégorie d'anticorps actifs, mais ne pré
sentant pas de différenciation intratypique, - une deuxième catégorie d'anticorps actifs contre les
souches atténuées, mais essentiellement dépourvus d'ac
tivité à l'égard des souches sauvages correspondantes, - une troisième catégorie d'anticorps actifs contre la
souche sauvage appartenant au sous-type sérologique
considéré, mais essentiellement dépourvus d'activité à
l'égard des souches atténuées correspondantes.
2 - batterie d'anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisée en ce que les anticorps appartenant aux première et deuxième catégories dans chacun des groupes susdits sont respectivement actifs contre - la souche LSc 2ab, - la souche P 712 CH 2ab, - la souche Leon î2aîb.
3 - Batterie d'anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisée en ce que les anticorps appartenant aux première et troisième catégorie dans chacun des groupes susdits sont respectivement actifs contre - la souche Mahoney, - la souche MEF 1, - la souche Saukett.
4 - Batterie d'anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, caractérisée en ce que, dans chacun des susdits groupes - les anticorps de la première catégorie présentent un
index de neutralisation au moins égal à 2, tant vis-à
vis de la souche atténuée que des souches sauvages, - les anticorps de la deuxième catégorie présentent un
index de neutralisation au moins égal à 2 à l'égard de
souches atténuées et un index de neutralisation pratique
ment nul à l'égard des souches sauvages, - les anticorps de la troisième catégorie présentent un
index de neutralisation au moins égal à 2 à l'égard des
souches sauvages et un index de neutralisation pratique
ment nul à l'égard des souches atténuées.
5 - Batterie selon la revendication 4, caractérisée en ce que les index de neutralisation non nuls, témoignant de l'activité des anticorps vis-à-vis d'un type ou sous-type déterminé de poliovirus, sont au moins égaux à 3.
6 - Batterie d'hybrides cellulaires pour la production des groupes d'anticorps monoclonaux selon les revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'ils sont formés par des hybrides cellulaires résultant de la fusion des cellules d'une lignée myélomateuse et de cellules immunocytes, notamment de rates d'animaux, respectivement vaccinés au préalable contre des poliovirus atténuées, d'une part, sauvages, d'autre part, provenant de cultures des trois types correspondants.
7 - Batterie d'hybrides cellulaires selon la revendication 6, caractérisée par trois groupes de lignées aptes à respectivement secréter des anticorps actifs à l'égard de virus appartenant aux types (1), (2) et (3) > et caractérisée en ce que (1) le premier groupe comprend trois catégories d'hybrides
respectivement capables de produire des anticorps
- actifs à la fois contre les souches LSc 2ab et
Mahoney,
- actifs contre la souche LSc 2ab, mais inactifs
contre la souche Mahoney,
- actifs contre la souche Mahoney, mais inactifs
contre la souche LSc 2ab ;; (2) le deuxième groupe comprend trois catégories d'hybrides
respectivement capables de produire des anticorps
- actifs à la fois contre les souches P 712 CH 2ab et
MEF 1,
- actifs contre la souche P 712 CH 2ab, mais inactifs
contre la souche MEF 1,
- actifs contre la souche MEF 1, mais inactifs contre
la souche P -712 CH 2ab (3) le troisième groupe comprend trois catégories d'hybrides
respectivement capables de produire des anticorps
- actifs à la fois contre les souches Leon 12alb et
Saukett,
- actifs contre la souche Leon 12alb, mais inactifs
contre la souche Saukett,
- actifs contre la souche Saukett, mais inactifs contre
la souche Leon 12alb.
8 - Procédé d'obtention d'une batterie-d'hy-
brides cellulaires susceptibles de zoner respectivement
une batterie d'anticorps conformes à la revendication 7,
caractérisé par les étapes qui consistent
- à immuniser des animaux respectivement contre des
virus appartenant aux trois types principaux (1), (2)
et (3) et, à l'intérieur de chacun de ces types, à
d'une part, une souche sauvage et, d'autre part, à
une souche atténuée-;
à à prélever sur les animaux les cellules immunocytes,
de préférence les cellules de la rate et à les mettre
en culture ;;
à à fusionner les cellules de ces cultures avec des cel
lules d'une lignée myélomateuse ou analogue, propres
à former des lignées d'hybrides cellulaires avec les
précédentes, séparables des cellules myélomateuses
non fusionnées, et à récupérer des clones cellulaires
individualisés résultant de la fusion ;;
à à incuber ces clones cellulaires et à tester la capa
cité de leurs surnageants respectifs à inhiber l'effet
cytopathogène de cultures de virus homologues dans des
essais de séroneutralisation,
à à recueillir et à répartir en groupes les cultures
d'hybrides cellulaires recueillies par types, selon
les activités des anticorps qu'ils sont susceptibles de
produire à l'égard des trois types de virus homologues considérés et, à l'intérieur de chaque groupe, par
catégories d'hybrides cellulaires, en fonction de l'actifs
vité des anticorps qu'ils sont susceptibles de produire
à l'égard des souches respectivement atténuées et sauva
ges homologues correspondantes, - à sélectionner et récupérer dans chaque groupe et dans
chacune des deux catégories correspondantes, dans des
essais répétés de séroneutralisation de cultures cellu
laires sensibles, en présence, d'une part, de virus sau
vages et, d'autre part, de virus atténués appartenant
tous deux au même type, ceux des clones qui inhibent
(1) à la fois le virus sauvage et le virus inactivé,
(2) le virus sauvage, à l'exclusion des virus atténués,
(3) le virus atténué, à l'exclusion des virus sauvages.
9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que les tests de séroneutralisation susdits sont réalisés sur des cultures de cellules sensibles en présence de doses de virus de 102 à 107 DCP 50 de virus homologues et que, dans l'épeuve de sélection finale, on recueille dans chacun des groupes considérés les clones qui produisent respectivement - les anticorps monoclonaux d'une première catégorie qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à 2,
de préférence supérieur à 3, tant vis-à-vis de la
souche atténuée que de la souche sauvage correspondante, - les anticorps monoclonaux d'une deuxième catégorie qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à 2,
de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche
atténuée, et un index de neutralisation pratiquement nul
vis-à-vis de la souche sauvage, - les anticorps monoclonaux d'une troisième catégorie, qui
présentent un index de neutralisation au moins égal à 2,
de préférence supérieur à 3, à l'égard de la souche
sauvage, et un index de neutralisation pratiquement nul
vis-à-vis de la souche atténuée.
10 - Application des anticorps monoclonaux sur l'une quelconque des revendications 1 à 9 à un diagnostic relatif au caractère atténué ou sauvage d'une souche inconnue nouvellement isolée, caractérisée par les étapes qui consistent - dans une première étape, en des essais de séroneutra
lisation de cultures de cellules sensibles en présence
respectivement des trois anticorps monoclonaux de
"première catégorie" des trois groupes susdits, le virus
isolé étant présumé comme appartenant aux premier,
second ou troisième type, selon que le virus isolé est
inhibé par l'anticorps appartenant aux susdits premier,
deuxième et troisième groupes susdits, et - dans une seconde étape, en des essais de séroneutrali
sation répétés dans des conditions semblables vis-à
vis d'anticorps respectivement de "deuxième catégorie
et "troisième catégorie1, du groupe correspondant au
type déterminé dans les premiers essais de séroneutra
lisation, le virus isolé étant présumé comme apparte
nant à une souche atténuée ou sauvage, selon qu'il
est inhibé par les anticorps de "deuxième catégorie"
ou par les anticorps de "troisième catégorie
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8116174A FR2511702B1 (fr) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | Anticorps monoclonaux antipoliovirus pour l'identification du type et la differenciation intratypique de souches isolees de poliovirus, hybrides cellulaires pour leur fabrication et procede de diagnostic in vitro mettant en jeu des anticorps |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8116174A FR2511702B1 (fr) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | Anticorps monoclonaux antipoliovirus pour l'identification du type et la differenciation intratypique de souches isolees de poliovirus, hybrides cellulaires pour leur fabrication et procede de diagnostic in vitro mettant en jeu des anticorps |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2511702A1 true FR2511702A1 (fr) | 1983-02-25 |
| FR2511702B1 FR2511702B1 (fr) | 1985-09-13 |
Family
ID=9261639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8116174A Expired FR2511702B1 (fr) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | Anticorps monoclonaux antipoliovirus pour l'identification du type et la differenciation intratypique de souches isolees de poliovirus, hybrides cellulaires pour leur fabrication et procede de diagnostic in vitro mettant en jeu des anticorps |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2511702B1 (fr) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0347230A2 (fr) * | 1988-06-17 | 1989-12-20 | Biogenex Laboratories | Miniclones |
| FR2761698A1 (fr) * | 1997-04-04 | 1998-10-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Methode de titrage d'une composition virale complexe |
-
1981
- 1981-08-24 FR FR8116174A patent/FR2511702B1/fr not_active Expired
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0347230A2 (fr) * | 1988-06-17 | 1989-12-20 | Biogenex Laboratories | Miniclones |
| EP0347230A3 (fr) * | 1988-06-17 | 1990-05-30 | Biogenex Laboratories | Miniclones |
| FR2761698A1 (fr) * | 1997-04-04 | 1998-10-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Methode de titrage d'une composition virale complexe |
| WO1998045709A1 (fr) * | 1997-04-04 | 1998-10-15 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Methode de titrage d'une composition virale complexe |
| AU737465B2 (en) * | 1997-04-04 | 2001-08-23 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Method of titring a complex viral composition |
| US6890711B1 (en) | 1997-04-04 | 2005-05-10 | Aventis Pasteur | Titration method for a complex viral composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2511702B1 (fr) | 1985-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1272454A (fr) | Retrovirus associe aux lymphadenopathies et adapte a des lignees continues de cellules lymphoblastoides b, capables de produire en continu ledit retrovirus et procede pour leurobtention | |
| JPS5845407B2 (ja) | 悪性腫瘍抗体の製造方法 | |
| JPH03236794A (ja) | ヒトモノクローン抗体の製造法 | |
| LU87861A1 (fr) | Agent viral | |
| JPS60110289A (ja) | ジゴキシンに対し高い親和性を有するモノクロ−ナル抗体 | |
| CN1896102B (zh) | 抗HBsAg单克隆抗体 | |
| FR2543570A1 (fr) | Anticorps monoclonaux anticytomegalovirus humains, hybridomes secreteurs de ces anticorps et polypeptides porteurs d'un determinant antigenique sequentiel de cytomegalovirus humains | |
| EP0142345A2 (fr) | Vaccin anti-idiotypique à base d'anticorps monoclonaux anti-idiotypiques | |
| Perrin et al. | A modified rapid enzyme immunoassay for the detection of rabies and rabies-related viruses: RREID-lyssa | |
| RU2431667C2 (ru) | Слитые клетки-партнеры | |
| AU2010224370B2 (en) | Monoclonal antibody specific for an epitope of inactivated feline immunodeficiency-encoded glycoprotein | |
| CN116120437B (zh) | 抗HBsAg蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 | |
| Wilton et al. | Identification of antigenic determinants by polyclonal and hybridoma antibodies induced during the course of infection by vaccinia virus | |
| FR2511702A1 (fr) | Anticorps monoclonaux antipoliovirus pour l'identification du type et la differenciation intratypique de souches isolees de poliovirus, hybrides cellulaires pour leur fabrication et procede de diagnostic in vitro mettant en jeu des anticorps | |
| KR20120132227A (ko) | 다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법 | |
| Huss et al. | Grapevine fanleaf virus monoclonal antibodies: their use to distinguish different isolates | |
| JPH06153979A (ja) | 魚類イリドウイルスに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法 | |
| Mather et al. | Preparation of monoclonal antibodies to xanthine oxidase and other proteins of bovine milk-fat-globule membrane. | |
| JPH02219591A (ja) | 抗ヒトパピローマウイルスモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ並びに該抗体の製造方法 | |
| DK170393B1 (da) | Avirulent rabies-vaccine samt avirulent mutant af stammen SAD Berne | |
| TSUDA et al. | The demonstration of strain-specific antigenic determinants on nucleocapsid of tomato spotted wilt virus by monoclonal antibodies | |
| JPH04281796A (ja) | 土壌病原糸状菌の簡易検出法 | |
| Taweethavonsawat et al. | Specific monoclonal antibodies to Strongyloides stercoralis: a potential diagnostic reagent for strongyloidiasis. | |
| JPH1118767A (ja) | 新規モノクローナル抗体およびその用途 | |
| EP0112741A1 (fr) | Anticorps monoclonaux neutralisants à l'égard des structures peptidiques du poliovirus responsables de l'induction d'une immunité antipoliomyélitique; hybridomes secréteurs de tels anticorps et procédé pour leur production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |