KR100311252B1

KR100311252B1 - 융합세포주 및 이들이 생산하는 단클론항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR100311252B1
Application number: KR1019990030929A
Authority: KR
Inventors: 손동화; 곽보연; 권창희; 권병준
Original assignee: 김길환; 한국식품개발연구원; 농업협동조합중앙회
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 1999-07-28
Publication date: 2001-11-03
Also published as: KR20010011530A

Abstract

본 발명은 유합세포주(hybridoma) 및 이들이 생산하는 항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 병원성 곰팡이인 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)의 세포외 다당류인 EPS (extracellular polysacchar

ide)를 생쥐에 면역후 세포융합기술에 의하여 두 종류의 항 EPS 단클론항체(anti-EPS monoclonal antibody)를 생산하는 융합세포주를 개발하고, 이중 하나의 세포주

(1G11)가 생산하는 단클론항체를 이용한 샌드위치 효소면역측정법(sandwich ELISA)으로 식품이나 농산물에 흔히 오염된 아스퍼질러스(Aspergillus)와 페니실리움 (Penicillium) 속의 곰팡이를 신속, 간편, 정밀하게 검출할 수 있고, 다른 하나의세포주(1B8)가 생산하는 단클론항체를 이용한 샌드위치 효소면역측정법(sandwich E

LISA)로 푸자리움(Fusarium) 속의 곰팡이를 신속, 간편, 정밀하게 검출할 수 있으며, 이들 두 종류의 단클론항체를 혼합 사용한 샌드위치 효소면역측정법(sandwich ELISA)로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium) 및 푸자리움(Fus

arium)속의 곰팡이를 모두를 신속, 간편, 정밀하게 동시에 검출할 수 있는 것이다.

Description

융합세포주 및 이들이 생산하는 단클론항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법 {Methods for Detection of Mold Using Monoclonal Antibodies and for Establishment of Hybridoma Cell Lines}

본 발명은 항 EPS 단클론항체(anti-EPS monoclonal antibody)의 생산과 이를 이용한 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay)으로 곰팡이를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 특히 병원성 곰팡이인 아스퍼질러스 플라버스(Aspergill

us flavus)의 세포외 다당체인 EPS(extracellular polysaccharide)를 생쥐에 면역하여 단클론항체를 생산하는 세포융합주를 개발하고, 이를 이용하여 효소면역법으로 식품이나 식품원료에서 발생하는 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Pen

icillium) 및 푸자리움(Fusarium) 속 곰팡이를 신속하고, 간편하게 진단하는 유합세포주 및 이들이 생산하는 단클론항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

세계적으로 알려진 곰팡이독소 수는 200여 가지가 넘는다고 알려져 있으며, 식품 중에 발생하는 곰팡이독소의 종류는 100여 가지가 넘고 이들 곰팡이독소들을 따로 따로 분석하는 것은 거의 불가능한 일이다. 그 중에서도 식품 또는 식품원료, 농산물 등에 오염되어 부패 및 곰팡이독소를 생산하는 곰팡이는 크게 아스퍼질러스

(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 푸자리움(Fusarium)속의 세가지 곰팡이 속이 존재한다. 이러한 곰팡이의 검출을 통하여 곰팡이독소의 존재 가능성을 예상할 수 있고 또한 식품의 위생적인 처리 여부를 판가름 할 수 있기 때문에 곰팡이의 검출은 식품위생과 인간의 생명 또는 건강과 밀접하게 관련이 있으므로 상당히 중요하다. 곰팡이의 검출 방법으로는 전통적인 방법인 직접 시료를 배지에서 배양하는 방법과 현미경으로 균사를 관찰하는 방법(Howard mould count), 곰팡이 균사의 한 성분인 키틴(chitin), 에르고스테롤(ergosterol) 등을 화학적으로 정량하는 방법, 3중인산아데노신 시험(ATP assay)과 같은 효소적 방법 등등 여러 가지 방법이 있으나, 이들 방법은 모두 시간과 경비, 노력이 상당히 소요되는 작업일 뿐만 아니라 키틴(chitin) 분석은 곤충의 오염으로 인한 정확한 결과를 얻기가 힘들다고하는 문제가 있다.

곰팡이 중 아스퍼질러스, 페니실리움, 그리고 푸자리움 속 곰팡이는 식품 및 식품원료의 부패를 일으키는 원인 곰팡이이고, 이들에 오염된 식품에 곰팡이독소의 존재 가능성 때문에 식품의 폐기에 따른 경제적 손실뿐만 아니라 공중보건위생의 위험성을 항상 가지고 있다. 따라서 이들 곰팡이의 빠른 분석은 매우 중요한 데 곰팡이를 검출하는 종래의 배양에 의한 방법은 시간이 너무 걸리고 살아 있는 곰팡이에 대해서만 검출이 가능하였는 데 몇몇 연구자에 의해 곰팡이의 EPS를 토끼에 면역하여 생산한 다클론항체를 이용한 효소면역측정법에 대한 연구가 활발히 이루어져 왔고, 페니실리움 프레켄탄스의 균사체를 이용해 생쥐의 단클론항체를 생산하여 아스퍼질러스와 페니실리움의 여러균주에 대해 비경합간접엘리자 방법으로 균사체를 검출한 경우가 있었다. 그러나 아스퍼질러스 플라버스 EPS를 이용해 생쥐에 면역하여 단클론항체를 생산한 적이 없고 또한 단클론항체로 스파이크 테스트와 곰팡이의 항체에 대해 항체를 혼합하여 샌드위치엘리자를 행한 경우도 없었다.

이와 같이 배지에 직접 배양하는 곰팡이 검출방법은 살아 있는 곰팡이만 검출이 가능하고 이전에 오염되었다가 사멸된 것의 검출이 어렵다고 하는 문제가 있다.

상기한 실정으로 보다 간편하고 식품의 오염 이력(history)을 알 수 있는 곰팡이의 검출법이 요구되었는데, Noterman 등은 1985년에 곰팡이의 EPS에 대한 항체를 생산하여 효소면역측정법으로 식품중에 존재하는 곰팡이의 신속, 정확한 검출 가능성을 보여 주었다. 세포외 다당체인 EPS는 열에 안정할 뿐만 아니라 pH에도 안정하여 열처리를 받은 가공식품에서도 검출이 가능하기 때문에 효소면역측정법에 의해 EPS를 검출하여 곰팡이가 오염되었거나 오염된 것을 검출할 수 있다.

따라서 본 발명의 발명자들은 식품 및 농산식품 중에 주로 발생하는 주요 곰팡이인 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 푸자리움(Fusar

ium)속의 검출을 기존의 여러 방법에 비해 보다 신속하고, 간편하게 검출하고자 하였다. 즉, 다른 연구자들에 의해 항체를 생산한 적이 없고 강력한 곰팡이독소를 생산하는 곰팡이인 아스퍼질러스 플라버스(Asp. flavus)EPS(extracellular polysacc

haride)에 대한 특이적인 단클론항체를 생산하고, 단클론항체의 특이성을 검토하였고, 곰팡이의 검출을 위한 ELISA의 조건을 확립하여 공통 항원을 가지는 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속의 면역분석법에 의한 검출 방법을 확립하였다. 또한 푸자리움(Fusarium)속 곰팡이에 대한 특이 단클론항체를 생산하였고 이 단클론항체를 이용하여 푸자리움 속 곰팡이 EPS 검출을 위한 면역분석법을 확립하였다. 그리고 이들 두 가지 단클론항체를 이용하여 아스퍼질러스 프라버스, 페니실리움 씨트리넘, 푸자리움 모닐리포메를 액체 배양후 EPS의 양과 곰팡이 건조중량과의 관계, 농산물에서 면역분석법에 의한 곰팡이 EPS검출 방법을 확립하여 식품이나 식품원료 중의 곰팡이 오염을 신속, 간편하게 검출 할 수 있었다. 또 혼합-단클론항체 샌드위치 ELISA 시스템을 구축하여 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 푸자리움(Fusarium)속 곰팡이를 동시에 검출할 수 있는 방법을 확립하였다.

본 발명은 상기한 실정을 감안하여 종래 곰팡이 검출방법에서 야기되는 각종 문제점들을 해결하고자 발명한 것으로서, 병원성 곰팡이인 아스퍼질러스 플라버스(

Aspergillus flavus)의 세포외다당체인 EPS(extracellular polysaccharide)를 생쥐에 면역하여 단클론항체를 생산하는 세포융합주를 개발하고, 이를 이용하여 효소면역측정법(ELISA)으로 식품이나 식품원료에서 발생하는 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium) 및 푸자리움(Fusarium) 속 곰팡이를 신속하고, 간편하고, 효과적으로 진단하는 융합세포주 및 이들이 생산하는 단클론항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 비경합 간접 효소면역측정법으로 아스퍼질러스 플라버스 EPS를 검출

하는 공정도,

도 2는 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스, 페니실리움 및 푸자리움

EPS를 검출하는 공정도,

도 3은 혼합-단클론항체 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스, 페니실

리움 및 푸자리움 EPS를 동시에 검출하는 공정도,

도 4은 피디용액(PD broth)에서 배양한 페니실리움 씨트리넘의 EPS와 곰팡이

와의 상관관계도,

도 5는 피디용액(PD broth)에서 배양한 아스퍼질러스 플라버스의 EPS와 곰팡

이와의 상관관계도,

도 6은 피디용액(PD broth)에서 배양한 푸자리움 모닐리포메의 EPS와 곰팡

이와의 상관관계도,

도 7은 감자에서 배양한 페니실리움 씨트리넘의 EPS와 곰팡이와의 상관관계

도,

도 8은 쌀에서 배양한 페니실리움 씨트리넘의 EPS와 곰팡이와의 상관관계도,

도 9는 감자에서 배양한 아스퍼질러스 플라버스의 EPS와 곰팡이와의 상관관

계도,

도 10은 쌀에서 배양한 아스퍼질러스 플라버스의 EPS와 곰팡이와의 상관관계

도,

도 11은 감자에서 배양한 푸자리움 모닐리포메의 EPS와 곰팡이와의 상관관계

도,

도 12는 완충액에서 단클론항체 1G11을 이용하여 샌드위치 엘리자에 의한 아

스퍼질러스 플라버스 EPS에 대한 표준곡선을 나타낸 도면,

도 13은 완충액에서 단클론항체 1B8을 이용하여 샌드위치 엘리자에 의한 푸

자리움 모닐리포메 EPS에 대한 표준곡선을 나타낸 도면,

도 14는 완충액에서 단클론항체 1G11, 1B8을 이용한 혼합-항체 샌드위치 엘

리자에 의한 페니실리움 씨트리넘과 푸자리움 모닐리포메 EPS에 대

한 표준곡선을 나타낸 도면이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)를 배양한 후, 여과하여 EPS(extracellular polysaccharide)를 회수하고, 동결건조하여 이를 완충액에 용해시키고, 프로인트 어쥬번트(Freund's adjuvant)로 유탁액을 제조하여 생쥐에 면역시킨 후, 골수종세포(Myeloma cell)와 세포 융합시켜 제조한 융합세포를 생쥐의 복수에 주사하여 분리하고 정제하여 아스퍼질러스(As

pergillus), 페니실리움 속 곰팡이의 EPS에 특이적인 단클론항체 생산용으로 얻은 대한민국 생명공학연구소 유전자은행에 기탁된 융합세포주(1G11)를 생성하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)를 배양한 후, 여과하여 EPS(extracellular polysaccharide)를 회수하고, 동결건조하여 이를 완충액에 용해시키고, 프로인트 어쥬번트(Freund's adjuvant)로 유탁액을 제조하여 생쥐에 면역시킨 후, 골수종세포(Myeloma cell)와 세포 융합시켜 아스퍼질러스(Asper

gillus), 푸자리움 속 곰팡이의 EPS에 특이적인 단클론항체 생산용으로 얻은 대한민국 생명공학연구소 유전자은행에 기탁된 융합세포주(1B8)를 생성하는 것을 특징으로 한다.

또 융합세포주(1G11)를 생쥐의 복수에 주사한 후, 분리하고 정제하여 얻은 단클론항체를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 곰팡이 배양액 및 샘플을 가한 다음, 상기 단클론항체에 효소의 결합체를 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응 시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스와 페니실리움 속 곰팡이를 검출하는 것을 특징으로 한다.

그리고 본 발명은 융합세포주(1B8)를 생쥐의 복수에 주사한후,분리하고 정제하여 얻은 단클론항체를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 곰팡이 배양액 및 샘플을 가한 다음, 상기 단클론항체에 효소의 결합체를 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응 시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 샌드위치 효소면역측정법으로 푸자리움 속 곰팡이를 검출하는 것을 특징으로 한다.

또한 융합세포주(1G11),(1B8) 각각을 생쥐의 복수에 주사한후,분리하고 정제하여 얻은 두 종류의 단클론항체를 혼합하여 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 곰팡이 배양액 및 샘플을 가한 다음, 상기 단클론항체에 효소의 결합체를 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응 시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 혼합-항체 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스와 페니실리움 및 푸자리움 속 곰팡를 동시에 검출하는 것을 특징으로 한다.

이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 이용한 단클론항체 생산 융합세포주(하이브리도마 1G11, 하이브리도마 1B8)는 생쥐의 비장세포와 골수종세포(Myeloma cell,SP2/0-Ag14)와 융합하여 이를 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0628BP, 수탁번호: KCTC 0627BP).

하이브리도마 1G11의 특성은 아스퍼질러스 및 페니실리움 속 곰팡이의 EPS에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 생산하고 하이브리도마 1B8은 푸자리움 속 곰팡이의 EPS에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 생산한다.

아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus) 곰팡이를 24℃에서 7일간 100rpm으로 액체배양하고 여과 등의 수단으로 배양액 중에 있는 EPS를 분리회수하고 정제한 후, 동결건조하여 단클론항체 생산을 위한 면역원으로 준비한다. 아스퍼질러스 플라버스(Asp. flavus)의 EPS에 대한 단일클론항체를 얻기 위한 실험은 Coyle 등 (1992)의 방법을 변형하여 행하였다. 골수종세포(Myeloma cell), 피더 셀(feederce

ll), 융합세포의 배양에 사용한 배양 배지는 1X DMEM, 소디움 파이루베이트(Sodium pyruvate), L-글루타메이트(L-glutamate), 소디움 바이카보네이트(Sodium bicarbon

ate), FBS 를 사용한다.

아스퍼질러스 플라버스에 특이성이 있는 단클론항체를 생산하기 위하여 생쥐가 바람직하다. 면역은 생후 6주된 BALB/c 생쥐에 정제된 아스퍼질러스 플라버스(A

spergillus flavus) EPS를 멸균된 완충액 예컨대 프로인트 어쥬번트(Freund's adjuvant)와 1:1로 유탁액을 만들어 마리당 100μg을 뒷발바닥에 피하주사 면역한다. 생쥐 피더층(Mouse feeder layer)은 융합 1일전에 BALB/c 생쥐 복강 세포를 96웰(well) 마이크로플레이트(microplate)의 배양 배지에 마리당 2판을 준비한다. 골수종세포(Myeloma cell, SP2/O-Ag14)는 면역 BALB/c 생쥐 한 마리당 75cm²플라스크

(flask)에 세포를 준비하는데, 융합 일주일전 쯤 동결된 세포를 꺼내 배양 배지에 배양하고 융합 3일전에 계대한 후 융합 하루전 배지를 교환해 주어 최적의 상태로 세포를 유지한다.

꼬리에서 채혈한 혈액으로 EPS에 대한 항체가 생성되었는 가를 보기 위해 간접 비경합 효소면역측정법(ELISA)을 실시한 후 양성으로 확인되면 면역후 13일에 생쥐의 슬와 임파절(popliteal lymph node)을 떼내어 100 매쉬(mesh) 위에서 주사기의 피스톤 고무를 이용하여 잘게 잘랐다.

차가운 배양 배지 10ml을 천천히 부어 찌꺼기(debris)가 없도록 임파구(lymp

hocyte)를 50ml 원뿔 튜브(conical tube)에 회수한 후 최종 부피가 40ml이 되게 배양 배지를 채워 놓아둔다. 80∼90%의 단일층(monolayer)을 형성한 생육력(viabilit

y)이 양호 (95%이상)한 골수종세포(Myeloma cell)를 50ml 원뿔 튜브(conical tube)에 회수하고, 앞서 준비한 임파구와 함께 1,000rpm으로 10분간 원심 분리를 행한다. 10ml의 따뜻한 배양배지에 현탁 한 후, 골수종세포(Myeloma cell)와 임파구를 잘 섞은 다음 배양배지를 최종 부피가 40ml이 되게 채운 후 다시 한번 1,000rpm으로 10분간 원심 분리한다.

배지를 가능한 한 남지 않게 버린 후 침강된 세포를 원뿔 튜브(conical tube)의 밑면에 골고루 퍼지게 가볍게 손으로 쳐준다. PEG 용액(50%)은 0.6ml PEG 1500,0.5ml 배양배지, 10μl, 0.1M HCl을 가하여 56℃에서 잘 섞은 후 이를 37℃에서 미리 배양한 것을 사용한다.

PEG 용액을 파스테르 피펫을 이용하여 천천히 원뿔 튜브(conical tube)에 1ml을 넣은 후 파스테르 피펫을 이용하여 1분간 부드럽게 섞는다. 여기에 따뜻한 배양배지를 1ml 첨가하고 1분간 다시 부드럽게 섞는다. 차례로 1ml, 2ml, 7ml의 배양배지를 넣은 후 1분간 천천히 파스테르 피펫으로 섞는다. 배지를 최종 부피가 40ml이 될 때까지 조심스럽게 채운 후 700rpm으로 10분간 원심 분리한다.

상징액을 버리고 융합된 세포를 100X HAT를 1:100으로 따뜻한 배양배지에 희석한 것 30ml에 현탁하고 700rpm에서 10분간 원심 분리하여 상징액을 버리고 다시 HAT 첨가 배양배지 30ml을 넣어 현탁시켜 미리 준비한 피더 층 플레이트(feeder layer plate)에 100μl/웰(well)씩 분주하여 5% CO₂배양기에 배양한다.

융합세포주(Hybridoma)의 선발은 융합 후 5일째에 HAT첨가 배양배지를 100μl씩을 첨가해 주고 3일 간격으로 2회정도 마이크로플레이트 웰의 상징액을 100μl 버린 후 100μl의 HAT첨가 배양배지로 교체한다.

융합 후 5일이 되면 2일 마다 관찰하여 노랗게 변한 웰(well)의 상징액을 채취해 간접 비경합 엘리자 방법으로 아스퍼질러스 플라버스(Asp. flavus) EPS에 특이적인 항체를 생산하는 융합세포를 선발하는데, 면역원으로 사용한 아스퍼질러스 플라버스(Asp. flavus) EPS를 코팅 용액에 희석한 것 100μl를 마이크로플레이트 웰에 각각 분주하여 냉장고에서 하룻밤 정치하여 항원을 코팅한다.

이것을 세정용액(PBST)으로 세 번 세척한 다음 물기를 완전히 제거한다. 여기에 세정 용액으로 4배 희석한 배양 상징액을 100μl씩 처리하여 3반복으로 1시간 동안 상온에서 반응시키고 다시 세정 용액으로 위와 같은 방법으로 세척하고 여기에 염소에서 생산한 항생쥐 다가(IgG, A, M)-효소 접합체를 100μl를 1시간 동안 상온에서 반응시킨다.

그 다음, 기질용액 [0.01% 티엠비(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine, dihydr

ochloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer, 0.05

M), pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100μl씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50μl를 첨가하고 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정한다.

단클론항체의 서브클로닝(subcloning)은 ELISA에 의하여 특이항체의 생성이 확인된 웰의 융합세포를 한계 희석법(Harlow등, 1988)에 의하여 3회 실시하여 확실한 단클론을 선발한다. 선발된 단클론을 대량 배양하여 회수하여 PBS 버퍼(buffer)로 2회 세척한 후 동결건조하고, 일부 세포는 단일클론항체를 생산하기 위하여, 1 주일 전에 생쥐 복강에 프리스테인 0.1 ∼ 0.2 ㎖을 주입한 BALB/c 생쥐에 마리당 1 ∼ 2 X 10⁶셀들(cells)의 융합 B세포 클론을 0.5ml 복강 주사하고 약 2 주일 후 복수액을 얻은 후 소디움 아자이드를 0.02%되도록 첨가한 후 -70℃ 디프리져에 보관하면서 필요한 경우 꺼내 사용한다.

생산된 단클론항체 1G11은 IgG1 타입으로서 고정화 프로테인 G 칼럼(Immobil

ized Protein G column )을 이용하여 정제하고, 단클론항체 1B8은 IgM 타입으로서 세파덱스 G-200을 사용하여 정제하여 -20℃에 냉동보관한다.

이들 단클론항체는 아스퍼질러스, 페니실리움속의 검출과 푸자리움속 곰팡이의 검출을 각각 수행하고 또한 이 두가지 항체를 혼합하여 아스퍼질러스, 페니실리움, 푸자리움 속 곰팡이를 동시에 간편하고, 신속하게 검출하는 혼합-항체 샌드위치 엘리자법에 사용하는 것이다.

항체-효소 결합체의 제조 방법은 다음과 같다.

정제된 단클론항체 1G11 또는 1B8 1mg과 양고추냉이 퍼록시다제 1mg을 소디움 디카보네이트 용액에 녹인 후 상온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시킨다. 위 반응액에 5M 소디움 시아노보로하이드라이드 10μl를 넣고 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, 3M 에탄올아민(pH 9.0)을 20μl를 가하고 상온에서 15분간 반응시킨다. 반응 후의 항체-효소 결합체를 PBS 버퍼(buffer)로 4℃에서 4번 투석하여 항체-효소 결합체를 제조하였다.

실험에 사용된 방법인 비경합 간접 효소면역측정법은 마이크로플레이트 웰에 아스퍼질러스 플라버스 또는 페니실리움 씨트리넘 및 푸자리움 모닐리포메 EPS를 코팅 용액으로 희석하여 100μl씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 항원을 코팅한다. 세정 용액으로 세 번 세척한 다음 단클론생산 하이브리도마의 배양 상징액 및 단클론항체를 세정 용액에 희석하여 100μl씩 분주하여 1시간 동안 반응시킨다. 세정 용액으로 3번 세정한 다음 염소 항생쥐 다가 Ig(M+G+A)-효소 결합체를 3,000배액 세정 용액에 희석하여 100μl씩 분주하여 1시간 상온에서 반응시킨다. 기질 용액을 넣고 30분 동안 반응시킨다. 2M 황산용액 50μl를 넣고 발색반응을 정지시키고 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정한다. 이와 같은 비경합 간접 효소면역측정법으로 아스퍼질러스 플라버스 EPS를 일실시예로서 검출하였는 바, 그 검출공정은 도 1에 나타낸 바와 같다.

또한 실험에 사용된 방법인 샌드위치 효소면역측정법은 마이크로플레이트 웰에 항체를 코팅 용액으로 희석하여 100μl씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 항체를 코팅한다. 세정 용액으로 세 번 세척한 다음 아스퍼질러스 플라버스 EPS 및 푸자리움 모닐리포메 EPS를 0.001∼10μg/ml 또는 샘플을 희석하여 100μl씩 마이크로플레이트 웰에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시킨다. 세정용액으로 3번 세척한 다음 앞서 제조한 항체-효소 결합체를 마이크로플레이트 웰에 100μl씩 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시키고 세정 용액으로 세 번 세척후 기질 용액을 넣고 30분 동안 반응시킨다. 2M 황산용액 50μl를 넣고 발색반응을 정지시키고 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정한다. 이와 같은 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스, 페니실리움 속 곰팡이 및 푸자리움 속 곰팡이를 일실시예로서 검출하였는 바, 그 검출공정은 도 2에 나타낸 바와 같다.

또 실험에 사용된 혼합-단클론항체 샌드위치 효소면역측정법을 수행하기 위해 단클론항체 1B8에는 반응성이 있고 단클론항체 1G11에는 반응성이 없는 푸자리움 모닐리포메 EPS와 단클론항체 1B8에는 반응성이 없고 단클론항체 1G11에는 반응성이 있는 페니실리움 씨트리넘 EPS를 표준물질로 사용한다. 단클론항체 1B8과 단클론항체 1G11를 각각 1μg/ml씩 되게 코팅 완충액(coating buffer: 0.02M tris-HCl, 0.15M 염화나트륨, pH 9.0)에 희석하여 마이크로플레이트 웰에 100μl씩 넣고 냉장고에 하룻밤 보관하여 항체를 코팅하고 세정 용액으로 세 번 세척한 다음, 표준 물질(0.001 ∼ 10 μg/ml)과 곰팡이 배양액을 100,000 배 까지 희석하여 100μl씩 넣고 1시간 상온에서 반응시키고 다시 세정 용액로 세 번 세척하였다. 단클론항체 1B8-효소 결합체와 단클론항체 1G11-효소 결합체를 한 용액에 1/6,000배 희석하여 100μl씩 처리한 후 다시 1시간 상온에서 반응시키고, 그 다음, 기질용액 [0.01% 티엠비(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine, dihydrochloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer, 0.05M), pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100μl씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50μ를 첨가하고 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 이와 같은 혼합-단클론항체 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스, 페니실리움 및 푸자리움 속 곰팡이를 일실시예로서 동시 검출하엿는 바, 그 검출공정은 도 3에 나타낸 바와 같다.

한편 액체 배양액에서 배양액 속에 생산된 EPS의 양과 건조 균체량과의 관계는 다음과 다음과 같이 한다.

아스퍼질러스와 페니실리움 속 곰팡이, 푸자리움 속 곰팡이 중의 몇 개 균주

, 예를 들면 아스퍼질러스 플라버스, 페니실리움 씨트리넘, 푸자리움 모닐리포메를 액체 배양용 배지에 접종하고 24℃, 100rpm으로 1∼7일간 배양하면서 미리 칭량된 와트만 필터 페이퍼(No.2)로 여과한 후 60℃의 오븐에 넣고 5일 동안 말린 다음 데시케이터에 넣은 후 무게를 칭량하여 건조균체의 양을 측정하고 각각의 배양액에 대해서 아스퍼질러스 플라버스와 페니실리움 씨트리넘의 경우 단클론항체 1G11을 이용하고, 푸자리움 모닐리포메의 경우 단클론항체 1B8을 이용하여 샌드위치 효소면역측정법으로 생성된 EPS의 양을 측정하여 결과를 도 4, 도 5, 도 6에 각각 나타냈다. 도 4 내지 도 5로부터 아스퍼질러스 플라버스, 페니실리움 씨트리넘, 푸자리움 모닐리포메를 액체배양하여 생성된 EPS와 균체 생성량은 일정하게 비례하는 것으로 나타남을 알 수 있다. 이는 균체량의 양이 많으면 EPS가 많이 생성되어 샌드위치 효소면역측정법으로 EPS를 검출하면 곰팡이의 검출이 가능하다는 것을 보여주고 있다

농산물에, 예를 들면 쌀, 감자에 인위적으로 아스퍼질러스와 페니실리움 속 곰팡이, 푸자리움 속 곰팡이 중의 몇 개 균주, 예를 들면 아스퍼질러스 플라버스, 페니실리움 씨트리넘, 푸자리움 모닐리포메를 접종하여 농산물 중에서 곰팡이에 의해 생성된 EPS양을 샌드위치 효소면역측정법으로 측정하고 농산물중의 곰팡이 형성은 콜로니 포밍 유닛트(cfu/g)와의 상관관계를 도 7 내지 도 11에 나타냈다. 도 7 내지 도 11로 부터 생성된 EPS와 유기된 콜로니 포밍 유닛트와의 관계는 상관적으로 비례하였고, 따라서 농산물중의 아스퍼질러스, 페니실리움, 푸자리움속 곰팡이를 각각 단클론항체 1G11과 1B8을 이용한 샌드위치 엘리자로 분석할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 1

(아스퍼질러스 및 페니실리움 속 곰팡이 및 푸자리움 속 곰팡이에 특이적인 단클론항체 생산을 위한 면역원 제조)

포도당(glucose) 30g을 900ml의 증류수에 넣고 121℃에서 15분동안 멸균한다음 효모 질소염기(yeast nitrogen base;YNB) 6.7g을 100ml의 증류수에 녹이고 다시 멤브레인 필터(membrane filter;pore size 0.22μm)를 사용하여 제균된 것을 상기 멸균한 포도당에 무균적으로 첨가하여 만든 액체 배양 배지에다 아스퍼질러스 플라버스를 접종한 후, 24℃에서 100rpm으로 7일간 진탕한 다음, 배양액을 와트먼 필터지(Whatman filter paper;No.2)로 여과하여 한외여과장치 (Amicon ultrafiltra

tion cell)로 농축한 후 100℃에서 10분간 가열하였다. 황산암모늄(Ammonium sulfa

te)을 80% 되게 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 격렬하게 교반(stirring)하였다. 이것을 20,400xg로 4℃에서 30분 동안 원심 분리하여 상징액을 취하고 증류수로 4번 투석한 후 다시 한외여과장치로 농축한 다음 와트먼 필터지(Whatman filter paper;No.2)로 여과하였다. 5배 부피의 -20℃, 95% 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 16시간 동안 보관한 후 원심 분리(20,400xg, 30분, 4℃)하여 상징액을 버리고 60℃ 오븐에서 1시간 동안 말린 다음 증류수를 넣고 잘 녹였다. 녹지 않은 부분을 제거하기 위하여 여과하고 디프리져(-70℃)에 넣고 1일간 방치한 후, -50℃, 72시간 동결 건조하여 단클론항체 생산용 면역원을 제조하였다.

실시예 2

(아스퍼질러스 및 페니실리움과 푸자리움에 특이적인 단클론항체의 생산)

아스퍼질러스 및 페니실리움과 푸자리움에 특이적인 단클론항체를 생산하기 위하여 실험동물로는 BALB/c 생쥐를 사용하였다. 동결건조된 아스퍼질러스 플라버스 EPS를 멸균된 완충액, 예를 들면 포스페이트 완충액(phosphate buffed saline,PBS:1.9mM 인산나트륨, 154mM 염화나트륨, pH 7.4)에 용해시키고(1mg/ml), 프로인트 어쥬벤트와 동량비(1:1, v/v)로 유탁액을 만들어 생쥐에 마리당 100μg을 피하주사하였다. 꼬리에서 채혈한 혈액으로 EPS에 대한 항체가 생성되었는 가를 보기위해 비경합 ELISA를 실시한 후 양성으로 확인한 후 슬와 임파절(popliteal lymph node)을 떼내어 100 메쉬(mesh)로 잘게 잘랐다. 차가운 배양 배지를 천천히 부어 임파구(lymphocyte)를 회수한 후 골수종세포(Myeloma cell, SP2/O-Ag14)와 잘 섞은 다음 PEG 용액을 이용하여 세포 융합을 하였다.

융합세포주의 선발은 융합 후 5일이 되면 2일 마다 관찰하여 노랗게 변한 웰의 상징액을 채취해 간접 비경합 효소면역측정법으로 아스퍼질러스 플라버스 EPS에 특이적인 항체를 생산하는 융합세포주를 선발하였는데, 면역원으로 사용한 아스퍼질러스 플라버스 EPS를 코팅용액에 희석한 것 100μl를 마이크로플레이트 웰에 각각 분주하여 냉장고에서 하룻밤 정치하여 항원을 코팅하였다. 이것을 세정용액으로 세 번 세정한 다음 물기를 완전히 제거하였다. 여기에 세정용액으로 4배 희석한 배양 상징액을 100μl씩 처리하여 3반복으로 1 시간 동안 상온에서 반응시키고 다시 세정용액으로 상기와 같은 방법으로 세정하고 여기에 염소에서 생산한 항생쥐 다가 Ig (goat anti-mouse immunoglobulins) M, G, A-효소 접합체를 100μl를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 다음 기질용액[0.01% 티엠비(3,3',5,5'-tetramet

hyl benzidine, dihydrochloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate

-citrate buffer, 0.05M), pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100μl씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산)50μl를 첨가하고 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.

실시예 3

(아스퍼질러스, 페니실리움 속 곰팡이 EPS 검출을 위한 샌드위치 엘리자)

정제된 단클론항체 1G11을 코팅 완충액(coating buffer: 0.02M tris-HCl,0.15

M 염화나트륨, pH 9.0)으로 희석한 액을 마이크로플레이트의 웰(well)당 100μl씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 코팅한 다음, 세정 완충액(0.01M phosphate buffer

ed saline: 0.138 염화나트륨, 0.00027M 염화칼륨, 0.05% Tween-20, pH 7.4)150μl

로 3회 세정한 후, 아스퍼질러스 및 페니실리움 속, 다른 속 곰팡이 배양액 및 샘플을 100μl씩 넣고, 상온에서 1시간 항원ㆍ항체반응 시켰다. 그런 다음 다시 세정 완충액으로 3회 세정하고, 단클론항체 1G11의 효소 접합체인 양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트-1G11를 상기와 동일한 세정 완충액에 1/6,000배 희석하여 100μl씩 넣고, 상온에서 1시간 항원ㆍ항체 반응을 추가로 시킨 다음, 세정 완충액으로 3회 세정하였다.

그 다음, 기질용액 [0.01% 티엠비(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine,dihydro

chloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer,0.05M)

,pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100μl씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50μl를 첨가하고 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 결과를 도 12에나타내고, 즉, 상기 실시예 1, 2에 따라 생산한 단클론항체 1G11과 1B8을 이용하여 샌드위치 엘리자로 표준 아스퍼질러스 플라버스 EPS에 대한 표준곡선을 구하여 도 12에 나타내고, 오염된 샘플 및 곰팡이 배양액의 EPS는 아스퍼질러스 플라버스 EPS의 흡광도를 기준으로 분석하였다.

도 12로 부터 흡광도 평균에서 단클론항체 1G11의 역가는 아스퍼질러스 프라버스 EPS의 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 나타냄을 알 수 있고, 표준 아스퍼질러스 플라버스 EPS의 흡광도(A450) 평균은 10^-3, 10^-2, 10^-1, 100μg/ml EPS농도에서 각각 0.13, 0.65, 1.78, 2.30(EPS를 처리하지 않은 처리구의 흡광도 평균은 0.055)으로 나타났고, 완충액에서 아스퍼질러스 플라버스 EPS의 탐색한계농도는 0.001μg/ml로 나타났다.

실시예 4

(푸자리움 속 곰팡이 EPS 검출을 위한 샌드위치 엘리자)

정제된 단클론항체 1B8을 코팅 완충액(coating buffer: 0.02M tris-HCl, 0.15

ed saline: 0.138 염화나트륨, 0.00027M 염화칼륨, 0.05% Tween-20, pH 7.4)150μl로 3회 세정한 후, 푸자리움 속 그리고 다른 속 곰팡이 배양액 및 샘플을 100μl씩 넣고, 상온에서 1시간 항원ㆍ항체반응 시켰다. 그런 다음 다시 세정 완충액으로 3회 세정하고, 단클론항체 1B8의 효소 접합체인 양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트-1B8를 상기와 동일한 세정 완충액에 1/6,000배 희석하여 100μl씩 넣고, 상온에서 1시간 항원ㆍ항체 반응을 추가로 시킨 다음 세정 완충액으로 3회 세정하였다.

chloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer, 0.05M

),pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100μl씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50μl를 첨가하고 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 결과를 도 13에 나타내고, 즉, 상기 실시예 1, 2에 따라 생산한 단클론항체 1G11과 1B8을 이용하여 샌드위치 엘리자로 표준 푸리자리움 모닐리포메 EPS에 대한 표준곡선을 구하여 도 13에 나타내고, 오염된 샘플 및 곰팡이 배양액의 EPS는 푸자리움 모닐리포메 EPS의 흡광도를 기준으로 분석하였다.

도 13으로 부터 흡광도 평균에서 단클론항체 1B8의 역가는 푸자리움 모닐리포메 EPS의 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 나타냄을 알 수 있고, 푸자리움 모닐리포메 EPS의 흡광도(A450) 평균은 10^-3, 10^-2, 10^-1, 100μ/ml EPS농도에서 각각 0.15, 6.90, 1.75, 2.30 (EPS를 처리하지 않은 처리구의 흡광도 평균은 0.06)으로 나타났고, 완충액에서 아스퍼질러스 플라버스 EPS의 탐색한계농도는 0.001μg/ml로 나타났다.

실시예 5

(아스퍼질러스, 페니실리움 및 푸자리움 속 곰팡이 EPS 검출을 위한 혼합-항체 샌드위치 엘리자)

정제된 단클론항체 1G11과 1B8을 코팅 완충액(coating buffer: 0.02M tris-HCl, 0.15M 염화나트륨, pH 9.0)으로 희석한 액을 마이크로플레이트의 웰(well)당 100μl씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 코팅한 다음, 세정 완충액(0.01M phospha

te buffered saline: 0.138 염화나트륨, 0.00027M 염화칼륨, 0.05% Tween-20,pH7.4

) 150μl로 3회 세정한 후, 아스퍼질러스 및 페니실리움, 푸자리움, 다른 속 곰팡이 배양액 및 샘플을 100μl씩 넣고, 상온에서 1시간 항원ㆍ항체반응 시켰다. 그런 다음 다시 세정 완충액으로 3회 세정하고, 단클론항체 1G11의 효소 접합체인 양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트-1G11과 단클론항체 1B8의 효소 접합체인 양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트-1B8을 상기와 동일한 세정 완충액에 1/6,000배 희석하여 100μl씩 넣고, 상온에서 1시간 항원ㆍ항체 반응을 추가로 시킨 다음, 세정 완충액으로 3회 세정하였다.

ochloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer,0.05M

), pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100μl씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50μl를 첨가하고 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 결과를 도 14에 나타내고, 즉, 즉, 상기 실시예 1, 2에 따라 생산한 단클론항체 1G11과 1B8을 이용 혼합-항체 샌드위치 엘리자로 표준 페니실리움 씨트리넘과 푸자리움 모닐리포메 EPS에 대한 표준곡선을 구하여 도 14에 나타내고, 오염된 샘플 및 곰팡이 배양액의EPS는 페니실리움 씨트리넘 EPS와 푸자리움 모닐리포메 EPS의 흡광도를 기준으로 분석하였다.

도 14로 부터 흡광도 평균에서 단클론항체 1B8과 단클론항체 1G11의 역가는 페니실리움 씨트리넘 또는 푸자리움 모닐리포메 EPS의 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 나타냄을 알 수 있고, 각각 EPS의 탐색한계농도가 완충액 상태에서 각각을 개별적으로 수행한 상기 실시예 3과 실시예 4의 탐색한계농도와 비슷하게 나타나 페니실리움 씨트리넘 EPS의 탐색한계농도는 완충액 상태에서 3 × 10^-3ug/ml의 농도로 탐색이 가능하고 푸자리움 모닐리포메 EPS의 탐색한계농도는 완충액 상태에서 10^-3ug/ml의 농도로 탐색이 가능함을 알 수 있다.

그리고 다양한 곰팡이 배양액에 대한 교차반응성을 검사하고, 그 결과 단클론항체 1G11과 1B8을 사용해 샌드위치 엘리자로 측정한 여러 가지 곰팡이 배양액의반응성을 하기 표1.에, 단클론항체 1G11과 1B8을 혼합하여 사용한 혼합-항체 샌드위치 엘리자에 의한 여러 가지 곰팡이 배양액의 반응성을 하기 표2.에 각각 나타냈다.

하기 표1,2에 나타낸 바와 같이 단클론항체 1G11은 아스퍼질러스와 페니실리움 속 곰팡이에 대해 반응성이 있고 다른 속 곰팡이와는 거의 반응성을 나타내지 않고 있더라도 미약하게 반응을 하고 있어 아스퍼질러스와 페니실리움 속 곰팡이의 탐색에 문제가 없다. 따라서 선택성이 아스퍼질러스와 페니실리움 속에 한정돼 있다. 또한 단클론항체 1G11을 이용한 샌드위치 엘리자에서 대부분의 아스퍼질러스와페니실리움 속 곰팡이 배양액이 10,000배 희석했을 때도 반응성을 보이고 있었고, 나머지 속의 곰팡이 배양액은 반응성을 나타내지 않았다. 또한 단클론항체 1B8을 이용한 샌드위치 엘리자에서 대부분의 페니실리움 속 곰팡이 배양액이 10,000배 희석했을 때도 반응성을 보이고 있었고, 나머지 속의 곰팡이 배양액은 반응성을 나타내지 않았다. 단클론항체 1G11과 1B8을 이용하 혼합-항체 샌드위치 엘리자에서 아스퍼질러스, 페니실리움, 푸사리움 속 곰팡이 배양액이 10,000배 희석하였을 때도 반응성을 보이고 있었고, 나머지 속의 곰팡이 배양액은 반응성을 나타내지 않았다.

¹대한민국 생명공학연구소 유전자 운행(KCTC)의 균주번호

²곰팡이 배양액의 희석배수(각각 100, 1000, 10000, 100000배)

³샌드위치 엘리자의 반응성(+,양성; -,음성)

¹대한민국 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)의 균주번호

²샌드위치 엘리자의 반응성(+,양성; -,음성)

상기한 바와 같이 본 발명에 의하면 아스퍼질러스, 페니실리움 및 푸자리움 속이 생산하는 EPS에 공통으로 작용하는 특이항체 또는 이들 두 가지 특이항체를 혼합하여 실시한 혼합-항체 샌드위치 엘리자를 이용하여 식품 또는 식품 원료의 시료에서 아스퍼질러스, 페니실리움 및 푸자리움 속 곰팡이의 EPS를 신속, 간편하게 검출함으로서 식품 또는 식품 원료의 가공 전, 후의 이 들 곰팡이의 오염 여부를 판단할 수 있다.

따라서 이러한 검출은 아스퍼질러스, 페니실리움, 푸라지움 속 곰팡이의 오염여부를 판단할 수 있고 또한 이들 곰팡이가 생산할 수 있는 각종 곰팡이독소의 존재 개연성을 판단할 수 있어 이들 식품 또는 식품원료를 사람이나 가축이 섭취함으로써 발생하는 곰팡이독소에 의한 중독증 또는 사망을 미연에 방지할 수 있는 예방 시스템에 탁월한 효과가 있을 것으로 기대된다.

Claims

아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)를 배양한 후, 여과하여 EPS(ext

racellular polysaccharide)를 회수하고, 동결건조하여 이를 완충액에 용해시키고, 프로인트 어쥬번트(Freund's adjuvant)로 유탁액을 제조하여 생쥐에 면역시킨 후, 골수종세포(Myeloma cell)와 세포 융합시켜 제조한 융합세포주를 생쥐의 복수에 주사하여 분리하고 정제하여 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움 속 곰팡이의 EPS에 특이적인 단클론항체 생산용으로 얻은 대한민국 생명공학연구소 유전자은행에 수탁번호 KCTC 0628BP 로 기탁된 융합세포주(1G11).
아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)를 배양한 후, 여과하여 EPS(ext

racellular polysaccharide)를 회수하고, 동결건조하여 이를 완충액에 용해시키고, 프로인트 어쥬번트(Freund's adjuvant)로 유탁액을 제조하여 생쥐에 면역시킨 후, 골수종세포(Myeloma cell)와 세포 융합시켜 푸자리움(Fusarium) 속 곰팡이의 EPS에 특이적인 단클론항체 생산용으로 얻은 대한민국 생명공학연구소 유전자은행에 수탁번호 KCTC 0627BP 로 기탁된 융합세포주(1B8).
융합세포주(1G11)를 생쥐의 복수에 주사한 후, 분리하고 정제하여 얻은 단클론항체를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 곰팡이 배양액 및 샘플을 가한 다음, 상기 단클론항체에 효소의 결합체를 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여효소반응 시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스와 페니실리움 속 곰팡이를 검출하는 것을 특징으로 하는 융합세포주가 생산하는 단클론항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법.
융합세포주(1B8)를 생쥐의 복수에 주사한 후, 분리하고 정제하여 얻은 단클론항체를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 곰팡이 배양액 및 샘플을 가한 다음, 상기 단클론항체에 효소의 결합체를 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응 시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 샌드위치 효소면역측정법으로 푸자리움 속 곰팡이를 검출하는 것을 특징으로 하는 융합세포주가 생산하는 단클론항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법.
융합세포주(1G11),(1B8) 각각을 생쥐의 복수에 주사한 후, 분리하고 정제하여 얻은 두 종류의 단클론항체를 혼합하여 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 곰팡이 배양액 및 샘플을 가한 다음, 상기 단클론항체에 효소의 결합체를 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 혼합-항체 샌드위치 효소면역측정법으로 아스퍼질러스와 페니실리움 및 푸자리움 속 곰팡를 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 융합세포주가 생산하는 단클론항체를 이용하여 곰팡이를 검출하는 방법.