CN103060227A - 一种粘杆菌素菌种筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粘杆菌素菌种筛选方法，包括将多粘芽孢杆菌（Bacilluscolistinus）加到含有L-天门冬氨酸的固体培养基中，单菌落成熟后传斜面保存，同时接入发酵培养基中，培养成熟后离心，取上清加入指示菌菌液中培养，制成被检测样品，检测被检测样品的吸光度，选择吸光度低的菌株保藏留用。本发明所提供的方法大大提高了多粘菌素菌种筛选速度；将筛选周期由原来的3-4周缩短到1周，筛选效率提高了70%以上。

Description

一种粘杆菌素菌种筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说涉及粘杆菌素菌种筛选方法。

背景技术

粘杆菌素（Colistin）国内又称粘菌素、抗敌素、克利斯汀，是1947年由美国和英国的学者在多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）培养液中与多粘菌素B（Polymyxin B）一起发现的，当时被称为多粘菌素E（Polymyxin E）。后来由粘杆菌素芽孢杆菌（Bacillus colistinus）发酵生产，改称为粘杆菌素。它是一种带有氨基酸环和脂肪酸侧链的碱性环肽类抗生素，能与细菌细胞膜上的脂类结合而扰乱细胞膜功能，并能破坏细胞壁的完整性，对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、流感杆菌、百日咳杆菌、产气杆菌、变形杆菌特别是绿脓杆菌有很强的杀菌作用，且不易产生抗药性。

多粘菌素菌种筛选是提高、稳定菌种质量的关键环节。一直以来，多粘菌素高产菌株筛选采用自然分离、紫外诱变等随机性较强的方法。这些方法筛选效率低，周期长。另外，菌株产能测定多采用高压液相色谱仪。由于菌株筛选经过初筛和复试两个阶段，每批需测样品均在150-180个以上，且发酵样品检测处理繁琐，工作量大，液相色谱检测所需时间较长，不仅降低了筛选效率，还影响高产菌株保存的最佳时期，对菌种活性造成一定损伤。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选效率高，周期短，检测方便的粘杆菌素菌种筛选方法。

本发明提供的粘杆菌素菌种筛选方法，包括将多粘芽孢杆菌（Bacillus colistinus）加到含有L-天门冬氨酸的固体培养基中，单菌落成熟后传斜面保存，同时接入发酵培养基中，培养成熟后离心，取上清加入指示菌菌液中培养，制成被检测样品，检测被检测样品的吸光度，选择吸光度低的菌株保藏留用。

本发明更为具体的多粘菌素菌种筛选方法，包括以下步骤：

a、固体培养：将多粘芽孢杆菌稀释至10^-3-10^-6个/mL，取0.2 mL涂布到含有0.2mg/mL的L-天门冬氨酸的固体培养基中，于28℃-37℃，40%-60%湿度条件下培养72-100 h；所述固体培养基由0.2mg/mL L-天门冬氨酸、1%-3%葡萄糖、1%-3%酵母膏、0.1%-0.5%蛋白胨、0.1%-0.5%氯化钠、2.2%琼脂、余量为水的组分组成，pH6.0-7.0；

b、斜面培养：在含有L-天门冬氨酸的固体培养基上挑取外形规则的单菌落，划线涂布于斜面培养基上，于28℃-37℃，40%-60%湿度条件下培养72-100 h；所述斜面培养基的成分与a步骤中的固体培养基成分相同；

c、发酵培养：将斜面培养基上成熟的斜面菌苔用接种针转接于发酵培养基中，于28℃-37℃，200 rpm条件下震荡培养72-96 h，离心，得发酵上清液；所述发酵培养基由3-5%豆粕粉、1-3%硫酸铵、0.05-0.10%磷酸二氢钾、0.01-0.07%七水硫酸亚铁、余量为水组分组成，pH6.0-7.0；

d、制备指示菌菌液：取-80℃保存的大肠杆菌于37℃-38℃水浴快速化冻，按照2%-3%的接种量接种于LB培养基中；所述LB培养基由0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化钠组成，pH7.0-7.2；

e、制备被检测样品：取c步所制发酵上清液30-50 μL加入250-270 μL d步所制指示菌菌液中，于37℃，200 rpm条件下用 96孔板震荡培养2-3 h；

f、高产菌株筛选：取被检测样品200 μL至96孔酶标板中，采用酶标仪进行吸光度检测，选择吸光值最低的菌株进行保藏留用。

本发明方法，在于所采用的酶标仪，其滤光片波长优选条件是设置在660 nm进行吸光度检测。

本发明是以大肠杆菌为指示菌，向含有大肠杆菌的指示菌菌液中加入经培养的多粘菌素菌株，再培养一定时间后，测定培养液的吸光度；吸光度越低，意味着培养液中大肠杆菌受到的抑制作用越强。经测定表明，大肠杆菌受到的抑制作用强弱与粘杆菌素效价高低成正比，因此，可据此挑选出粘杆菌素高产菌株。

本发明的方法大大提高了多粘菌素菌种筛选速度；将筛选周期由原来的3-4周缩短到1周，筛选效率提高了70%以上。

附图说明

图1本发明方法中被检测样品吸光度与菌株效价的对应性考察图。其中                                                

表示生物效益，表示HPLC检测效益，

表示吸光度。

图2 本发明方法中被检测样品的菌株效价检测值与被检测样品吸光度之间的对应关系。其中

表示HPLC检测效益，

表示生物效价检测值。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。

下述实施例所采用的多粘芽孢杆菌出发菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（编号为CGMCC  NO：4099）。大肠杆菌购自中国药检所（编号为CMCC(B) 44103），其他原料均为市售。

实施例1

a、固体培养：将多粘芽孢杆菌稀释到10^-3个/mL，取0.2 mL均匀涂布的固体培养基上，于28℃-30℃，相对湿度为40%条件下培养72 h，得到单菌落；所述的固体培养基为以L-天门冬氨酸？g、葡萄糖1g、酵母膏1g、蛋白胨0.1g、氯化钠0.1g、琼脂2.2g、水？g的组分，按照常规方法制成、pH6.0-7.0；

b、斜面培养：在含有L-天门冬氨酸的固体培养基上挑取外形规则的单菌落，划线涂布于斜面培养基上，斜面培养基成分与a步骤中的固体培养基一致；培养条件也与a步骤相同。

c、发酵培养：斜面培养基上成熟的斜面菌苔与20%甘油溶液混匀进行冷冻保藏，同时取约0.25 cm²菌苔接种于30 mL发酵培养基中，于28℃-30℃，200 rpm条件下震荡培养96 h，得粘杆菌素发酵液；离心，得发酵上清液；所述发酵培养基为以豆粕粉3g、硫酸铵1g、磷酸二氢钾0.05g、七水硫酸亚铁0.01g、余量为水的组分组成，pH6.0-7.0；

d、制备指示菌液：取-80℃保存的大肠杆菌于37℃-38℃水浴快速化冻，按照2%-3%的接种量接种于LB培养基中；所述LB培养基由酵母提取物0.5g，胰蛋白胨1g，氯化钠1g、水97.5 g，按照常规方法制成，pH7.0-7.2；

e、制备被检测样品：取c步骤中所制备的发酵上清液30 μL加入到 d步骤中所制备的250 μL指示菌液中，于37℃，200 rpm条件下用 96孔板震荡培养2-3 h；

f、高产菌株筛选：取被检测样品，设置酶标仪滤光片波长为660 nm进行吸光度检测，吸光值最低的被检测样品中的菌株即为高产菌株。选择吸光值低的菌株进行保藏；经HPLC方法检测，其中的粘杆菌素效价为1-8万U/mL

实施例2  被检测样品吸光度与菌株效价对应性考察

选取同批次三株菌株进行HPLC效价测定，并绘制平均吸光值、HPLC效价及平均生物效价柱状图（如图1），结果显示，生物效价高的菌株其相应吸光值低、对应的HPLC检测实际效价高；生物效价低的菌株，其相应吸光值高、对应的HPLC检测实际效价低。由图1也可明显看出指示剂吸光度与发酵液效价的对应性良好，相关系数R²达0.99以上。

实施例3：

a、固体培养：将多粘芽孢杆菌稀释到10^-6个/mL，取0.2 mL均匀涂布的固体培养基上，于35℃-37℃，相对湿度为60%条件下培养96 h，得到单菌落；所述的固体培养基为以L-天门冬氨酸0.2mg/mL、葡萄糖3g、酵母膏3g、蛋白胨0.5g、氯化钠0.5g、琼脂2.2g、余量为水的组分，按照常规方法制成、pH6.0-7.0；

b、斜面培养：在含有L-天门冬氨酸的固体培养基上挑取外形规则的单菌落，划线涂布于斜面培养基上，斜面培养基成分与a步骤中的固体培养基一致；培养条件也与a步骤相同；

c、发酵培养：斜面培养基上成熟的斜面菌苔约取0.20 cm²菌苔接种于20 mL发酵培养基中，于32℃-35℃，200 rpm条件下震荡培养72 h，得粘杆菌素发酵液；离心，得发酵上清液；所述发酵培养基为以豆粕粉5g、硫酸铵3g、磷酸二氢钾0.01g、七水硫酸亚铁0.07g、余量为水的组分组成，pH6.0-7.0；

d、制备指示菌液：取-80℃保存的大肠杆菌于37℃-38℃水浴快速化冻，按照2%-3%的接种量接种于LB培养基中；所述LB培养基由酵母提取物0.5g，胰蛋白胨1g，氯化钠1g、水97.5 g，按照常规方法制成，pH7.0-7.2；

e、制备被检测样品：取c步骤中所制备的发酵上清液50 μL加入到 d步骤中所制备的270 μL指示菌液中，于37℃，200 rpm条件下用 96孔板震荡培养2-3 h；

f、高产菌株筛选：取被检测样品，设置酶标仪滤光片波长为660 nm进行吸光度检测，吸光值最低（吸光度为0.198）即为高产菌株。选择吸光值低的菌株进行保藏；经HPLC方法检测，其中的粘杆菌素效价为5.9万U/mL。

实施例4

对实施例3同批次不同生产能力的菌株效价检测值与其吸光度之间进行比较，其结果如图2所示，其均存在良好的对应关系。

Claims (3)

1.一种粘杆菌素菌种筛选方法，包括将多粘芽孢杆菌（Bacillus colistinus）加到含有L-天门冬氨酸的固体培养基中，单菌落成熟后传斜面保存，同时接入发酵培养基中，培养成熟后离心，取上清加入指示菌菌液中培养，制成被检测样品，检测被检测样品的吸光度，选择吸光度低的菌株保藏留用。

2.一种多粘菌素菌种筛选方法，其特征在它包括以下步骤：

a、固体培养：将多粘芽孢杆菌稀释至10^-3-10^-6个/mL，取0.2 mL涂布到含有0.2mg/mL的L-天门冬氨酸的固体培养基中，于28℃-37℃，40%-60%湿度条件下培养72-100 h；所述固体培养基由质量比为0.2mg/mL L-天门冬氨酸、1%-3%葡萄糖、1%-3%酵母膏、0.1%-0.5%蛋白胨、0.1%-0.5%氯化钠、2.2%琼脂、余量为水的组分组成，pH6.0-7.0；

b、斜面培养：在含有L-天门冬氨酸的固体培养基上挑取外形规则的单菌落，划线涂布于斜面培养基上，于28℃-37℃，40%-60%湿度条件下培养72-100 h；所述斜面培养基的成分与a步骤中的固体培养基成分相同；

c、发酵培养：将斜面培养基上成熟的斜面菌苔用接种针转接于发酵培养基中，于28℃-37℃，200 rpm条件下震荡培养72-96 h，离心，得发酵上清液；所述发酵培养基由3%-5%豆粕粉、1%-3%硫酸铵、0.05-0.10%磷酸二氢钾、0.01%-0.07%七水硫酸亚铁、余量为水的组分组成，pH6.0-7.0；

d、制备指示菌菌液：取-80℃保存的大肠杆菌于37℃-38℃水浴快速化冻，按照2%-3%的接种量接种于LB培养基中；所述LB培养基由质量比为0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化钠、余量为水的组分组成，pH7.0-7.2；

e、制备被检测样品：取c步所制发酵上清液30-50 μL加入250-270 μL d步所制指示菌菌液中，于37℃，200 rpm条件下用 96孔板震荡培养2-3 h；

f、高产菌株筛选：取被检测样品200 μL至96孔酶标板中，采用酶标仪进行吸光度检测，选择吸光值最低的菌株进行保藏留用。

3.根据权利要求1或2所述多粘菌素菌种筛选方法，其特征在于所采用的酶标仪，其滤光片波长设置在660 nm进行吸光度检测。

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